CN113186335B - 用于鉴定甜瓜抗细菌性果斑病性状的Indel分子标记及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于鉴定甜瓜抗细菌性果斑病性状的Indel分子标记及方法,该Indel标记MIndel89与甜瓜抗细菌性果斑病QTL紧密连锁，位于甜瓜第12号染色体第23878689碱基处，标记MIndel89上游核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明获得的分子标记可用于辅助育种，鉴定甜瓜材料是否抗细菌性果斑病，从而减少田间筛选工作量，降低育种成本，加快育种进程，具有很高的实际应用价值。与同类分子标记技术相比，本发明具有操作简单，不需要酶切等优点。

Description

用于鉴定甜瓜抗细菌性果斑病性状的Indel分子标记及方法
技术领域
本发明属于蔬菜抗病分子标记开发和分子标记辅助育种技术领域，具体涉及用于鉴定甜瓜抗细菌性果斑病性状的Indel分子标记及方法。
背景技术
甜瓜（Cocumis melo L.）属葫芦科（Cucurbiaceae）甜瓜属（Cucumis Linn）异花授粉植物，又名香瓜、哈密瓜等，其口感独特，气味清香，被列为世界十大水果之一。细菌性果斑病是一种危害甜瓜、西瓜、黄瓜等葫芦科作物的世界性检疫病害，在露地和保护地栽培中均有发生。近年来，细菌性果斑病已成为危害甜瓜产业的病害之一，20世纪70年代，在美国佛罗里达州首次报道了该病害，随后在中国、韩国、日本等14个国家和地区被发现，发病严重时细菌性果斑病引起的损失超过90%，甚至绝收。目前，化学防治是控制甜瓜细菌性果斑病的主要措施，常用抗生素和铜制剂类药剂，但长期使用化学试剂，不仅导致病原菌对化学试剂产生抗药性，而且污染环境、威胁人类的健康。因此，培育抗性品种是预防细菌性果斑病最为经济有效的措施。
关于甜瓜果斑病抗性及其相关分子标记研究已有少量报道，虽然国内外科研工作者对甜瓜抗果斑病种质资源鉴定做出了很大贡献，但仍然没有筛选出绝对抗性的甜瓜品种。在分子标记方面，2012 年Garcia-Mas运用全基因组测序的方法对甜瓜作图群体DHL进行遗传连锁图的构建，此连锁图由SNP标记构成。2018年，俞志杰等利用抗果斑病品系辽宁神帅为母本，感病品系皮山奎瑞克为父本，以120个F2分离群体作为试验材料，最终从288对SSR引物组合中筛选出一对与抗性基因连锁的标记BCM184，距离抗性基因的遗传距离为12.4CM，最终将抗性基因初步定位到连锁群（linkgroup，简称LG）Ⅳ上。2019年，鲁思梦等对抗病品种“MR-1”和感病品种“伽师瓜”构建的F2群体进行抗性鉴定，利用全基因组范围内288个SSR分子标记检测抗果斑病、感果斑病基因池，筛选出15个具有多态性的标记分别位于LG5、LG6、LG12，随后将果斑病抗性数量性状位点(quantitative trait locus, QTL)初步定位于LG12；最后再利用具有多态的分子标记构建LG12的遗传连锁图，进一步将bfb-QTL12.1定位于CMMS35-4 与DE1851之间，两标记间物理距离约3.4 Mb，遗传距离为9.1 cM。Md. Rafiqul Islam等利用抗病品种（PI 353814）和感病品种（PI 614596）构建了分离群体，开发了一个抗性基因相关的Indel标记MB157-2，该抗性基因MELO3C022157位于甜瓜第9号染色体上。开发与甜瓜果斑病抗性基因连锁的分子标记，可以为早期抗病性选择提供依据, 使选育抗病品种的过程变得更加简单、便捷。但是现有的技术方案,有的操作复杂,有的筛选准确率较低。
发明内容
本发明的目的在于利用抗感不同的2份甜瓜材料进行全基因组测序，根据抗感序列之间的差异在第12染色体上开发Indel标记，最终获得1个与抗性位点bfb-QTL12.1连锁的Indel标记MIndel89，其与田间果斑病接种检测的吻合度达到90%以上，可以用来甜瓜抗果斑病分子标记辅助育种。
我们报道了新开发的MIndel89标记，其与甜瓜果斑病抗性位点bfb-QTL12.1连锁，具有将感病品种和抗病品种准确分开的能力，与田间接种果斑病菌结果吻合度达到90%以上。为了这一目标，选择抗感不同的甜瓜材料进行全基因组测序，在染色体12上开发了2006份Indel标记，随机选择300份标记对48份甜瓜材料进行基因型分析，同时将48份甜瓜材料定植到田间，接种果斑病菌，进行田间表现鉴定，通过基因型与田间表型吻合度的分析，发现MIndel89吻合度均高于标记CMMS35-4与DE1851标记，且MIndel89标记位于已初步定位的bfb-QTL12.1连锁的CMMS35-4 与DE1851之间。我们提出了该标记可用于鉴定甜瓜抗细菌性果斑病品种或种质及其后代的辅助选择育种，为今后的果斑病抗性基因的精细定位、克隆和抗性种质资源应用于甜瓜品种的改良奠定基础。
本发明公开了一种用于鉴定甜瓜抗细菌性果斑病性状的Indel分子标记,所述分子标记所述标记包括引物MIndel89的上游引物MIndel89-F和下游引物MIndel89-R，所述上游引物 CISSR18153-F 的序列如SEQ ID NO.1 所示，所述下游引物MIndel89-R的序列如SEQ ID NO.2 所示。
进一步地,所述标记MIndel89对抗果斑病的甜瓜材料M17050-5-1扩增片段测序的核苷酸序列为SEQ ID NO.3。
进一步地,所述标记MIndel89对感果斑病的甜瓜材料28-1-2-1-1扩增片段测序的核苷酸序列为SEQ ID NO.4。
一种用于鉴定甜瓜抗细菌性果斑病性状的方法，包括以下步骤：
(1)提取甜瓜的基因组DNA, 琼脂糖凝胶电泳和分光光度计检测DNA的质量与浓度;
(2)采用上述任一一项Indel分子标记MIndel89对提取的甜瓜基因组DNA进行PCR扩增；
(3)在8％聚丙烯酰胺凝胶电泳上分离步骤（2）中的PCR扩增的片段
(4)对步骤(3)电泳的产物进行银染，并在白光下显现。
进一步地,所述步骤（2）中，PCR扩增的反应体系为15μL，包括7.5μL 2×TaqMasterMix，1μLDNA提取物，10μM的正反向引物各1μL，4.5μLddH2O。
进一步地,所述步骤（2）中，PCR扩增的反应程序为94℃预变性2min，35个循环， 72℃延伸2min，然后反应保持在4℃。
进一步地,所述94℃预变性2min具体为包括94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s。
本发明根据抗果斑病品系M17050-5-1全基因组序列与不抗果斑病品系28-1-2-1-1全基因组序列，利用两序列之间存在的插入/缺失碱基序列设计引物，在甜瓜12号染色体开发了2006份Indel标记，随机选择300份标记用抗感材料进行标记验证，从中筛选到96对多态性强、带型清晰的标记用于后续的实验。
在田间对130份甜瓜材料进行果斑病菌接种实验，进行表型分析，筛选其中极感极抗的材料48份。用96份具有多态性的标记对已知抗性的48份材料进行基因型分析，发现MIndel89标记PCR扩增的基因型结果与田间表型吻合度达到90%以上。在抗果斑病的甜瓜材料中，标记MIndel89扩增出了284的序列（SEQ ID NO.3）；在感病品种中扩增出了188的序列（SEQ ID NO.4）。此外， 也出现了PCR扩增结果与田间表型鉴定不一致的情况，可能是由于该连锁标记MIndel89与抗病位点bfb-QTL12.1存在一定的距离。
本发明获得了1个多态性高、稳定的果斑病抗性位点bfb-QTL12.1连锁标记MIndel89，可用于甜瓜抗果斑病育种。与同类分子标记技术相比，本发明具有操作简单，不需要酶切等优点。
附图说明
图1表示利用标记MIndel89扩增的48份甜瓜材料电泳图谱，其中M表示Marker，28-1-2-1-1感果斑病的甜瓜材料，M17050-5-1为抗果斑病的材料。
具体实施方式
本发明所述的甜瓜果斑病抗性位点连锁标记MIndel89，在抗病品种中扩增出284的片段大小，在感病品种中扩增出188片段。
上述甜瓜果斑病抗性位点连锁标记MIndel89引物序列为： 上游引物序列MIndel89-F：5'- TGGAGAACTATGGAATATGGAGGA-3'（SEQ ID NO.1）
下游引物序列MIndel89-R：5'- GCTTACGGATGAATTTGGACTTGA-3'（SEQ ID NO.2）
本发明根据抗果斑病品系M17050-5-1全基因组序列与不抗果斑病品系28-1-2-1-1全基因组序列，利用两序列之间存在的插入/缺失碱基序列设计引物，在甜瓜12号染色体开发了2006份Indel标记，随机选择300份标记用抗感材料进行标记验证，从中筛选到96对多态性强、带型清晰的标记用于后续的实验。
在田间对130份甜瓜材料进行果斑病菌接种实验，进行表型分析，筛选其中极感极抗的材料48份。用96份具有多态性的标记对已知抗性的48份材料进行基因型分析，发现MIndel89标记PCR扩增的基因型结果与田间表型吻合度达到90%以上。在抗果斑病的甜瓜材料中，标记MIndel89扩增出了284的序列（SEQ ID NO.3）；在感病品种中扩增出了188的序列（SEQ ID NO.4）。此外， 也出现了PCR扩增结果与田间表型鉴定不一致的情况，可能是由于该连锁标记MIndel89与抗病位点bfb-QTL12.1存在一定的距离。
本发明获得了1个多态性高、稳定的果斑病抗性位点bfb-QTL12.1连锁标记MIndel89，可用于甜瓜抗果斑病育种。
标记MIndel89对抗果斑病的甜瓜材料M17050-5-1扩增片段测序的核苷酸序列SEQID NO.3为：
TGGAGAACTATGGAATATGGAGGAGTAGTTAGGAATTTGAATTACCTTATGTAGAAACATAACGATGTATTTATGACAAAATTGTGACCTAGGTTCATCTTAATCTCACTAAGATTAGGATACAAATTTTATCCTAATCTCAAATAAGTTATAACTAAATCTATTGAATCAATAATGGTTTGTTGACATGTAAAAGCTAAATTCACTTTATTTTGTATTTATCTTTTTCTTAATATTTTTCATGTTTTTGGCTTATTTCTTCAAGTCCAAATTCATCCGTAAGC
标记MIndel89对感果斑病的甜瓜材料28-1-2-1-1扩增片段测序的核苷酸序列SEQID NO.4为：
TGGAGAACTATGGAATATGGAGGAGTAGTTAGGAATTTGAATTACCTTATGTAGAAACATAACGATGTATTTATGACAAAATTGTGACCTAGGTTCATCTTAATCTCACTTTATTTTGTATTTATCTATTTTTTTAATATTTTTCATGTTTTTGGCTTATTTCTTCAAGTCCAAATTCATCCGTAAGC
（一）材料与方法
1. 植物材料
本研究使用48份不同类型的甜瓜种质资源为实验材料，根据江苏绿港现代农业发展股份有限公司（绿港）的作物栽培管理标准体系进行栽培管理。
2. DNA的提取与检测
使用植物基因组DNA试剂盒（CWO531M）（北京康为世纪生物科技有限公司）从30天的新鲜植物叶片中提取甜瓜基因组DNA。
琼脂糖凝胶电泳和分光光度计检测DNA的质量与浓度。
3. 引物设计
分析2份抗感不同甜瓜材料全基因组测序的结果，利用抗感两序列的差异，在染色体12上开发Indel标记，最终获得1个与抗性位点bfb-QTL12.1连锁的Indel标记MIndel89，用Primer 5.0软件设计引物。新标记MIndel89在抗病品种中扩增出284bp的多态性DNA片段，而在感病品种中扩增出188bp的片段
4. PCR扩增与检测
PCR扩增在中国华盛公司LY96G ThermocyclerTM扩增仪上进行，反应体系为15μL，包括7.5μL 2×Taq MasterMix，1μLDNA提取物，10μM的正反向引物各1μL，4.5μLddH2O。 反应程序为94℃预变性2min，[94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s]，35个循环， 72℃延伸2min，然后反应保持在4℃。在8％聚丙烯酰胺凝胶电泳上分离PCR扩增的片段，进行银染，并在白光下显现。
5. 甜瓜材料抗性鉴定
将甜瓜细菌性果斑病菌LG08在NB液体培养基中摇菌48h，待摇浑后，将菌株稀释成1*108CFU/mL的菌悬液。用48份不同种类的甜瓜材料做接种试验，每份材料播种7粒，两叶一心定植，甜瓜缓苗结束后，在苗龄为4～6叶期时，将菌悬液用喷雾法接种到甜瓜叶片上，以无菌水喷雾作对照。接种后加大棚内的温湿度，隔3-7天观察记录发病情况。
（二）结果与分析
1. 所选材料的基因组DNA的检测分析
使用超微量紫外可见分光光度计（DeNovix DS-11）对本研究所提取的147个番茄叶片基因组DNA进行浓度检测，发现提取的DNA浓度均高于100ng/μl，而且OD260/OD280基本都在1.8~2.0之间。取不同浓度DNA用 2%的琼脂糖电泳检测，电泳图清晰明亮，无明显拖尾，说明提取的DNA质量较好。所以，提取到的高质量番茄叶片基因组DNA，适用于PCR扩增、SSR等分子标记的生物学试验。
2. PCR扩增与田间验证
应用本发明的甜瓜果斑病连锁标记MIndel89分别对48个甜瓜材料进行PCR扩增，从图1可以看出标记MIndel89在9份感病材料中扩增出188bp的条带，而在39份抗病品种中扩增出284bp大小的片段。2020年种植甜瓜材料，采用喷雾法对130份材料进行果斑病接种，筛选其中48份极感极抗的材料进行下一步分析。结果表明：在调查的48份甜瓜材料中，8份材料极度感病，40份表现为抗病。经测验，分子标记结果与田间接种鉴定结果吻合度达到90%。抗感品种条带的明显分离，说明标记MIndel89可以准确可靠的检测甜瓜材料是否抗细菌性果斑病菌。
序列表
<110> 江苏绿港现代农业发展股份有限公司
<120> 用于鉴定甜瓜抗细菌性果斑病性状的Indel分子标记及方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tggagaacta tggaatatgg agga 24
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcttacggat gaatttggac ttga 24
<210> 3
<211> 284
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tggagaacta tggaatatgg aggagtagtt aggaatttga attaccttat gtagaaacat 60
aacgatgtat ttatgacaaa attgtgacct aggttcatct taatctcact aagattagga 120
tacaaatttt atcctaatct caaataagtt ataactaaat ctattgaatc aataatggtt 180
tgttgacatg taaaagctaa attcacttta ttttgtattt atctttttct taatattttt 240
catgtttttg gcttatttct tcaagtccaa attcatccgt aagc 284
<210> 4
<211> 188
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tggagaacta tggaatatgg aggagtagtt aggaatttga attaccttat gtagaaacat 60
aacgatgtat ttatgacaaa attgtgacct aggttcatct taatctcact ttattttgta 120
tttatctatt tttttaatat ttttcatgtt tttggcttat ttcttcaagt ccaaattcat 180
ccgtaagc 188

Claims (5)

1.一种用于鉴定甜瓜抗细菌性果斑病性状的Indel分子标记,其特征在于,所述分子标记包括引物MIndel89的上游引物MIndel89-F和下游引物MIndel89-R，所述上游引物MIndel89-F的序列如SEQ ID NO.1 所示，所述下游引物MIndel89-R的序列如SEQ IDNO.2所示,所述分子标记对抗果斑病的甜瓜材料M17050-5-1扩增片段测序的核苷酸序列为SEQIDNO.3，所述分子标记对感果斑病的甜瓜材料28-1-2-1-1扩增片段测序的核苷酸序列为SEQ IDNO.4。
2.一种用于鉴定甜瓜抗细菌性果斑病性状的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)提取甜瓜的基因组DNA, 琼脂糖凝胶电泳和分光光度计检测DNA的质量与浓度;
(2)采用权利要求1所述的Indel分子标记对提取的甜瓜基因组DNA进行PCR扩增；
(3)在8％聚丙烯酰胺凝胶电泳上分离步骤（2）中的PCR扩增的片段；
(4)对步骤(3)电泳的产物进行银染，并在白光下显现。
3.根据权利要求2所述的用于鉴定甜瓜抗细菌性果斑病性状的方法，其特征在于：所述步骤（2）中，PCR扩增的反应体系为15μL，包括7.5μL 2×Taq MasterMix，1μLDNA提取物，10μM的正反向引物各1μL，4.5μLddH2O。
4.根据权利要求2所述的用于鉴定甜瓜抗细菌性果斑病性状的方法，其特征在于：
所述步骤（2）中，PCR扩增的反应程序为94℃预变性2min，35个循环， 72℃延伸2min，然后反应保持在4℃。
5.根据权利要求4所述的用于鉴定甜瓜抗细菌性果斑病性状的方法，其特征在于：所述94℃预变性2min具体为包括94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s。
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