CN102796730A - 一种从聚丙烯酰胺凝胶中回收核酸分子的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从聚丙烯酰胺凝胶中回收核酸分子的新方法，包括以下步骤：从聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）中分离核酸分子；切下含有目标分子的PAGE胶；将切下的PAGE胶放在琼脂糖胶孔中电泳并显色；从琼脂糖胶中切胶回收目标核酸分子。本发明显著缩短了PAGE胶回收核酸分子的操作时间，降低了回收成本与核酸降解的风险，提高了回收效率，操作也更为简单。

Description

一种从聚丙烯酰胺凝胶中回收核酸分子的方法

技术领域

本发明属于分子生物学领域，公开了一种从聚丙烯酰胺凝胶中回收核酸分子的方法。

背景技术

凝胶电泳是分离目标核酸分子的经典方案，其原理在电场牵引力作用下，不同分子量的核酸分子运动速度不一样，从而将它们分离开来。凝胶电泳分为琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE），前者回收相对简单，但分辨力有限，后者分辨率可达1个碱基差异，但由于PAGE胶中核酸难以溶解出来，回收较为困难。与琼脂糖胶回收方案比较，PAGE胶回收存在的问题如下：（1）胶破碎操作困难；（2）需要在较高温度（60度左右）操作4小时以上才能将核酸从破碎的PAGE胶中将溶解出来，显著延长了操作时间，长时间高温处理也增加了核酸降解的风险；（3）成本是琼脂糖回收的3倍左右；（4）回收效率低于琼脂糖电泳回收。

发明内容

本发明实施例的目的是针对上述现有技术的缺陷，提供一种回收的操作时间短，且回收成本低的从聚丙烯酰胺凝胶中回收核酸分子的方法。

为了实现上述目的本发明采取的技术方案是：

一种从聚丙烯酰胺凝胶中回收核酸分子的方法，包括以下步骤：

（1）从聚丙烯酰胺凝胶中分离核酸；

（2）切下含有目标核酸分子的聚丙烯酰胺胶；

（3）将切下的聚丙烯酰胺胶放在琼脂糖胶孔中电泳并显色；

（4）从琼脂糖胶中切胶并回收目标核酸分子。

本发明更优选的技术方案:一种从聚丙烯酰胺凝胶中回收核酸分子的方法，包括以下步骤：

（1）聚丙烯酰胺凝胶分离核酸：根据需要分离的核酸分子预期的分子量大小，配制相应浓度的聚丙烯酰胺凝胶，在不高于5V/cM的电压下电泳3-10分钟，使不同分子量的核酸分子分离后显色；

（2）切下含有目标核酸分子的聚丙烯酰胺胶：根据所需要的核酸分子大小范围，切下含有目标分子的聚丙烯酰胺胶胶块；

（3）将切下的聚丙烯酰胺胶放在琼脂糖电泳胶孔中电泳并显色：根据切下聚丙烯酰胺胶块中的核酸分子量的大小，配制相应浓度的琼脂糖凝胶，将切下的聚丙烯酰胺胶胶块置于琼脂糖凝胶的点样孔中，在不高于5V/cM的电压下电泳3-10分钟后显色；

（4）从琼脂糖胶中切胶并回收目标核酸分子：在激发光照射下，切下含有核酸分子的琼脂糖胶块，按琼脂糖凝胶回收方案回收目标核酸分子。

本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：

（1）快捷：利用PAGE胶回收，大量时间耗在胶破碎与胶溶解上，至少要4.5小时以上，利用本发明的技术方案，省略了胶破碎与胶溶解，大约只需要0.5小时左右；

（2）便宜：本发明最终采用琼脂糖回收试剂盒,比PAGE胶回收试剂盒价格便宜3倍左右，回收成本低；

（3）方便：本发明避免了破碎PAGE胶的麻烦；

（4）高效：本发明最终是从琼脂糖胶中回收核酸，因此高于PAGE胶回收效率，回收效率高；

（5）安全：本胶发明避免了长时间高温从破碎PAGE中溶解出核酸的程序，因而避免了核酸降解的风险，更为安全。

附图说明

图1是本发明实施例提供的从聚丙烯酰胺凝胶中回收核酸分子方法流程示意图；

图2是本发明实施例提供的从20bp Marker中回收100bp与小RNA文库中回收100-140bp的DNA分子的流程示意图；

图3a和图3b是本发明实施例提供的PAGE胶与琼脂糖胶电泳结果图。

图3a和图3b中：a:PAGE电泳；b:琼脂糖电泳；1，3：20bp Marker；2:小RNA文库；4：从PAGE胶20bp Marker中切取100bp的分子后琼脂糖电泳结果；5：从PAGE胶小RNA文库中切取100-140bp的分子后琼脂糖电泳结果。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明实施方式作进一步地详细描述。

参见图1，一种从聚丙烯酰胺凝胶中回收核酸分子的方法，包括以下步骤：

（1）从聚丙烯酰胺凝胶中分离核酸：根据需要分离的核酸分子预期的分子量大小，配制相应浓度的聚丙烯酰胺凝胶，在不高于5V/cM的电压下电泳3-10分钟，使不同分子量的核酸分子分离后PAGE胶显色；

（2）切下含有目标核酸分子的PAGE胶胶块：根据所需要的核酸分子大小范围，切下含有目标分子的PAGE胶胶块；

（3）将切下的PAGE胶放在琼脂糖电泳胶孔中电泳、显色并切胶：根据切下PAGE胶块中的核酸分子量的大小，配制相应浓度的琼脂糖凝胶，将切下的PAGE胶胶块置于琼脂糖凝胶的点样孔中，在不高于5V/cM的电压下电泳3-10分钟后显色；

（4）从琼脂糖胶中切胶并回收目标核酸分子：在激发光照射下，切下含有核酸分子的琼脂糖胶块，按琼脂糖凝胶回收方案回收琼脂糖胶中目标核酸分子。

本发明提供的更具体的从聚丙烯酰胺凝胶中回收核酸分子的方法，即：

从20bp Marker与小RNA文库中分别回收100bp与100-140bp的DNA分子方法（参见图2）：

（1）从聚丙烯酰胺凝胶中分离核酸（6%PAGE胶电泳分离20bp Marker和小RNA文库，并利用SYBR Gold染料（SYBR Gold是一种染料的名字，对PAGE胶染色）：配制6%的聚丙烯酰胺凝胶，取20bp Marker（货号：D512A，日本TaKaRa公司生产）和小RNA文库（以水稻总RNA为材料，按美国NEB公司的E6160试剂盒操作手册构建）各5ul，用微型电泳槽（型号：DYCZ-24DN，北京六一仪器厂生产）于100V的电压下电泳50分钟。于10ml电泳缓冲液中加入2ul SYBR Gold染料（货号：S-11494，美国Invitrigen公司生产）染色5分钟，254nm的紫外线下观察并照相（参见图3a）；

（2）切下含有目标核酸分子的PAGE胶：于蓝光台下分别切取20bp Marker中100bp的条带和小RNA文库中100-140bp的条带的DNA分子的胶块；

（3）将切下的PAGE胶胶块置于4%琼脂糖胶点样孔中电泳显色并切胶：配制相应4%琼脂糖凝胶，按100ml胶加入5ul染料的比例加入GeneGreen染料（货号：9012-36-6，北京鼎国昌盛生物技术有限公司生产，GeneGreen为一种染料的名称。），将切下的PAGE胶胶块置于琼脂糖凝胶的点样孔中，于水平电泳槽（型号：TY-SPAT，北京君意仪器厂生产）5V/cm电泳10分钟,于254nm紫外线下观察并拍照（参见图3b）。

（4）从琼脂糖胶中回收目标核酸分子（回收20bp Marker中100bp的DNA和小RNA文库中100-140bp的DNA）：在蓝光台下，切下含有核酸分子的琼脂糖胶块，按琼脂糖凝胶回收试剂盒（D6294-01，Omega）操作手册回收纯化目标核酸分子，回收时洗脱离体积为15ul,取1ul于超微量分光光度计（型号：Q5000，美国QuanWell公司生产）检测DNA浓度分别为10ng/ul和5ng/ul。

本发明显著缩短了PAGE胶回收核酸分子的操作时间，降低了回收成本与核酸降解的风险，提高了回收效率，操作也更为简单。采用本发明的方法,能够简单、方便、快捷、便宜、高效的从聚丙烯酰胺凝胶中回收核酸分子。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种从聚丙烯酰胺凝胶中回收核酸分子的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）从聚丙烯酰胺凝胶中分离核酸；

（2）切下含有目标核酸分子的聚丙烯酰胺胶；

（3）将切下的聚丙烯酰胺胶放在琼脂糖胶孔中电泳并显色；

（4）从琼脂糖胶中切胶并回收目标核酸分子。

2.根据权利要求1所述的从聚丙烯酰胺凝胶中回收核酸分子的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）聚丙烯酰胺凝胶分离核酸：根据需要分离的核酸分子预期的分子量大小，配制相应浓度的聚丙烯酰胺凝胶，在不高于5V/cM的电压下电泳3-10分钟，使不同分子量的核酸分子分离后显色；

（2）切下含有目标核酸分子的聚丙烯酰胺胶：根据所需要的核酸分子大小范围，切下含有目标分子的聚丙烯酰胺胶胶块；

（3）将切下的聚丙烯酰胺胶放在琼脂糖电泳胶孔中电泳并显色：根据切下聚丙烯酰胺胶块中的核酸分子量的大小，配制相应浓度的琼脂糖凝胶，将切下的聚丙烯酰胺胶胶块置于琼脂糖凝胶的点样孔中，在不高于5V/cM的电压下电泳3-10分钟后显色；

（4）从琼脂糖胶中切胶并回收目标核酸分子：在激发光照射下，切下含有核酸分子的琼脂糖胶块，按琼脂糖凝胶回收方案回收目标核酸分子。

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