CN103060311A - 一种油菜单粒种子基因组dna高通量快捷提取方法 - Google Patents

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张洁夫
戚存扣
陈松
浦慧明
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Abstract

本发明提供一种油菜单粒种子基因组DNA高通量快捷提取方法，属于生物技术领域。该方法包括：发芽；取材；裂解；提取；沉淀；离心；干燥；溶解；保存等步骤，用PCR仪代替水浴，提取全程使用96孔PCR板，配合多通道移液器操作。用本发明方法提取油菜种子基因组DNA时间短、陈本低、操作简便、高通量、后续DNA吸取方便，提取的DNA产量和质量完全满足PCR反应的需要。

Description

一种油菜单粒种子基因组DNA高通量快捷提取方法
技术领域
    本发明涉及一种油菜单粒种子基因组DNA提取方法，属于生物技术领域。
背景技术
随着现代分子生物学研究的深入发展，各种生物技术方法日益成熟，尤其是基于PCR的分子标记技术，在种子纯度鉴定、种子转基因检测、种质资源多样性研究等领域广泛应用。DNA是生物遗传信息的载体，无论是分子标记技术还是遗传转化和鉴定，前提都是基因组DNA的提取。
目前用于油菜 DNA 提取的方法有SDS法、CTAB法、高盐法和试剂盒法，提取方法已被很多研究人员优化，但大多针对油菜叶片进行，取材时需要油菜生长到一定的阶段，这个过程需要较长的时间，所以利用油菜叶片提取DNA的方法不利于在种子快速检测中推广使用。如何快速简便的从油菜种子中提取出基因组DNA，科研人员一直在做着探索。张富丽等（农业科学与技术(英文版)，2012年第13卷第3期485-488）将多粒种子混合，打磨成粉,取100mg粉末加入高盐提取液抽提基因组DNA，该方法虽然省去了油菜成苗，避免了液氮研磨，但使用了苯酚、氯仿等有毒有机溶剂，步骤仍然比较繁琐；谢景梅等（作物杂志，2012年第1期17-21）直接以油菜干种子和发芽种子提取基因组DNA，采用改良的CTAB法，提取效果较好，但该方法仍然需要液氮研磨、氯仿抽提等步骤，并未有多大改进。
综上所述，目前提取油菜基因组DNA的方法普遍存在着操作繁琐、提取时间长、陈本较高等不足之处。另外，以油菜单粒种子为材料的基因组DNA提取报道较少，但油菜杂交种为了保证纯度，从田间收获到包装之前有限的时间内，必须进行杂种纯度鉴定，需要快速提取油菜单粒种子的基因组DNA，之前的DNA提取方法不适应这种需要。
发明内容
技术问题
本发明所要解决的技术问题是提供一种油菜单粒种子基因组DNA快捷提取方法，用该方法提取油菜种子基因组DNA时间短、陈本低、操作简便、高通量、后续DNA吸取方便，提取的DNA产量和质量完全满足PCR反应的需要。
技术方案
本发明提供的技术方案是：一种油菜单粒种子基因组DNA高通量快捷提取方法，其特征在于包括以下步骤：
(1) 发芽：在培养皿内铺滤纸，加水至完全湿润滤纸，将油菜种子均匀撒在滤纸上，盖上培养皿盖，放入培养箱中，37℃暗培养12-16小时至根长3-5mm；
(2) 取材：将破皮萌发的油菜种子去种皮，放入0.2mL 96孔PCR板，每孔一粒；
(3) 裂解：每孔加20μL 0.25mol/L NaOH，在PCR仪上99.9℃ 1min；
(4) 提取：每孔加5μL 1mol/L HCl中和，再加入25μL 0.5mol/L Tris-HCl(pH8.0)，在PCR仪上99.9℃ 3min；
(5) 沉淀：待PCR板自然冷却，用镊子取出提取液中油菜种子，加入100μL 预冷无水乙醇，盖上PCR板封口膜，上下摇匀20次；
(6) 离心：板式离心机离心PCR板，3000rpm，10min，弃上清；
(7) 干燥：将PCR板置入真空干燥仪，35℃真空干燥5min；
(8) 溶解：每管加入50μL灭菌ddH2O，37℃完全溶解DNA，4℃保存。
有益效果 
本发明以油菜芽种为材料，快速基因组DNA的方法，次方法具有如下优点：
(1) 所需用于提取基因组DNA的材料为油菜单粒种子，只需将种子发芽，省去成苗的步骤，节省了材料准备时间，为油菜种子质量的快速鉴定以及油菜种质资源分子水平上的多样性研究提供了高效可行的技术途径。
(2) 简化了操作步骤，使用0.2mL 96孔PCR板，配合多通道移液器，用PCR仪加温代替水浴，提取全程操作简便迅速，能在短时间内提取大量样品DNA，一个熟练的科研人员在8小时工作时间内至少能完成10×96个单粒种子DNA的提取，具有高通量提取的优点，比常用的CTAB、SDS等方法的提取效率高5倍以上。
(3) 提取的基因组DNA质量较高，琼脂糖凝胶检测电泳条带清晰，降解少，紫外分光广度计测得浓度在90-125ng/μL之间，可以直接用于PCR反应，完全满足PCR扩增的需要。
(4) 相对其他方法，无需液氮研磨，无需种子粉碎，无需氯仿抽提，所用试剂显著减少，节本高效。
附图说明
图1为本发明方法提取的油菜单粒种子基因组DNA 的电泳图，其中，M：5kb DNA Marker；其他：油菜单粒种子基因组DNA。
图2为以本发明方法提取的油菜单粒种子基因组DNA为模板的SSR-PCR扩增图。M：50bb DNA Marker；其他：以4个单粒种子DNA为模板，9对SSR引物的扩增电泳图。
具体实施方式
下面通过具体的实施方式的详细描述来进一步阐述本发明，但并不是对本发明的限制，仅作实例说明。
提取油菜单粒种子基因组DNA的方法如下：
一、材料
甘蓝型油菜“宁杂27”为江苏省审定的油菜杂交品种，提取基因组DNA种子为“宁杂27”制种大棚收获的杂交种子。
二、试剂
0.25mol/L NaOH；1mol/L HCl；0.5mol/L Tris-HCl(pH8.0)；无水乙醇。
三、提取基因组DNA
提取基因组DNA的具体步骤如下：
(1) 发芽：在培养皿内铺滤纸，加水至完全湿润滤纸，将油菜种子均匀撒在滤纸上，盖上培养皿盖，放入培养箱中，37℃暗培养16小时（过夜）至根长3-5mm；
(2) 取材：将破皮萌发的油菜种子去种皮，放入0.2mL 96孔PCR板，每孔一粒；
(3) 裂解：每孔加20μL 0.25mol/L NaOH，在PCR仪上99.9℃ 1min；
(4) 提取：每孔加5μL 1mol/L HCl中和，再加入25μL 0.5mol/L Tris-HCl(pH8.0)，在PCR仪上99.9℃ 3min；
(5) 沉淀：待PCR板自然冷却，用镊子取出提取液中油菜种子，加入100μL 预冷无水乙醇，盖上PCR板封口膜，上下摇匀20次；
(6) 离心：板式离心机离心PCR板，3000rpm，10min，弃上清；
(7) 干燥：将PCR板置入真空干燥仪，35℃真空干燥5min；
(8) 溶解：每管加入50μL灭菌ddH2O，37℃完全溶解DNA，4℃保存。
四、对上述提取的DNA的检测
1、紫外分光光度计检测浓度和纯度
将溶解的DNA稀释50倍（吸取40μL DNA，加灭菌ddH2O至2mL），以灭菌ddH2O为零对照，用紫外分光广度计测OD260和OD280，结果OD260值在0.090-0.125之间，OD280值在0.053-0.074之间，OD260/OD280比值为1.7左右。用本方法提取的种子基因组DNA的纯度较好，污染少。
根据OD260＝1时，dsDNA浓度约为50μg /ml的标准换算，所提取的种子基因组DNA的浓度为90-125ng/μL；OD260/OD280比值为1.7，根据纯DNA的OD260/OD280≈1.8（OD260/OD280＞1.9,表明有RNA污染；OD260/OD280＜1.6，表明有蛋白质、多糖等污染）的标准。
2、琼脂糖凝胶电泳检测
取提取的油菜单粒种子基因组DNA样品5μL进行1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，8V/cm，电泳20min，EB染色，在凝胶成像系统拍照记录。结果如图1所示，用本方法所提取DNA样品的电泳条带清晰，降解少，所有DNA浓度较一致。 
3、SSR-PCR扩增检测所提取DNA质量
直接以本方法提取的DNA为模板，用李海渤等（中国油料作物学报，2010年第32卷第3期329-336）筛选的多对甘蓝型油菜SSR核心引物进行PCR扩增。反应体系为DNA模板1ul、上下游引物各0.2μmol/L、1×PCR Buffer、2.0 mmol/L MgCl2、200μmol/L dNTPs、0.5U Taq 酶，ddH2O补足10μL。PCR程序为：94℃预变性4min；94℃变性40s，60℃(-0.5℃/循环)退火30s，72℃延伸40s，10个循环；94℃变性40s，55℃退火30s，72℃ 延伸40s，25个循环；72℃延伸7min；Hold 12℃结束。扩增产物用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳，8V/cm，电泳90min，银染染色（张洁夫等，江苏农业学报，2004年第20卷第4期 225-229）。结果如图2所示，每对SSR引物均能成功扩增，扩增产物电泳条带清晰，片段大小与预期一致，表明用本方法提取的油菜种子基因组DNA能够满足基于PCR等分子生物学试验的需要。
本发明方法也为适用于油菜多粒种子混合提取基因组DNA，只需将反应容器和反应体积相应放大；该方法也为其他材料提取DNA提供了新思路。

Claims (1)

1.一种油菜单粒种子基因组DNA高通量快捷提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1) 发芽：在培养皿内铺滤纸，加水至完全湿润滤纸，将油菜种子均匀撒在滤纸上，盖上培养皿盖，放入培养箱中，37℃暗培养12-16小时至根长3-5mm；
(2) 取材：将破皮萌发的油菜种子去种皮，放入0.2mL 96孔PCR板，每孔一粒；
(3) 裂解：每孔加20μL 0.25mol/L NaOH，在PCR仪上99.9℃ 1min；
(4) 提取：每孔加5μL 1mol/L HCl中和，再加入25μL 0.5mol/L Tris-HCl(pH8.0)，在PCR仪上99.9℃ 3min；
(5) 沉淀：待PCR板自然冷却，用镊子取出提取液中油菜种子，加入100μL 预冷无水乙醇，盖上PCR板封口膜，上下摇匀20次；
(6) 离心：板式离心机离心PCR板，3000rpm，10min，弃上清；
(7) 干燥：将PCR板置入真空干燥仪，35℃真空干燥5min；
(8) 溶解：每管加入50μL灭菌ddH2O，37℃完全溶解DNA，4℃保存。
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