CN108588188B - 一种混合微生物发酵过程中微生物定量检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种食醋固态发酵过程中特定微生物活菌数定量检测的方法，属于发酵食品领域。该方法具有结果准确，快速高效，灵敏度高的特点，克服了传统活菌计数法耗时长，操作强度大，不能计数VBNC细菌等不足，并在现有的PMA‑qPCR的基础上进行条件优化。特别地，开发了一种修复亚致死菌体细胞膜的修复液，适用于细胞膜受损细菌的细胞膜修复，减少菌体亚致死性损伤带来的假阴性结果，提高了定量结果的准确性，达到了快速准确定量样品中微生物活菌数的目的。

Description

一种混合微生物发酵过程中微生物定量检测方法

技术领域：

本发明涉及一种食醋固态发酵过程中特定微生物活菌数定量检测的方法，属于发酵食品领域。

技术背景：

食醋、酱油、豆瓣酱、泡菜、黄酒、白酒等传统食品采用开放式的混合微生物发酵的工艺，其发酵过程中微生物组成复杂，种类多样。发酵过程中微生物体系的解析尤为重要，特别是乳酸菌和醋酸菌，它们的丰度占细菌群落总丰度的90％以上。瑞士乳杆菌、植物乳杆菌、发酵乳杆菌和巴氏醋酸菌是重要的功能微生物，在传统食品发酵过程中起主导作用，与发酵过程乳酸、醋酸等有机酸以及乙偶姻、2，3-丁二醇等风味物质代谢密切相关，其活细菌的数目是反映该种菌在生态体系中发挥的实际影响和作用的重要指标。

传统的细菌培养法是细菌检测的“金标准”，但其存在操作繁琐、检测周期长、易受杂菌干扰，难以检测“活的非可培养状态(viable but non-culturable，VBNC)”状态的细菌的缺点，导致漏检现象的发生。此外，基于DNA的菌体检测技术，由于细胞死亡后DNA分子能保留较长时间，难以区分样品中的“死菌”与“活菌”，易造成假阳性结果。叠氮溴化丙锭(PMA)可被活的微生物完整的细胞膜阻止在外，但能渗入膜损伤细胞并插入双链DNA内。PMA分子中具有光敏性的叠氮基团会分解产生高活性的氮稀类化合物，并与DNA结合位点附近的碳氢化合物反应生成稳定的共价交联沉淀物，可抑制后续DNA扩增，排除死细菌的干扰准确定量活细菌。固态发酵过程中较高酸度、盐度、酒精浓度等环境会导致微生物的亚致死性损伤。

通常情况下，致病菌的亚致死损伤转变是可逆的，受损细胞的修复在生长繁殖之前，在修复过程中，磷脂和核酸可再合成，细胞内物质恢复到正常状态。受损的细胞有以下特点：(1)修复的过程要先于增殖的过程；(2)在适宜的培养条件下，受损细胞得到修复；(3)处理方式不同，所需的最优温度和修复时间不同，(4)亚致死损伤的细胞对选择性成分敏感，完全修复的细胞对选择性成分有抵抗性。

本技术采用一种可修复菌体损伤细胞膜的修复液孵育细胞，使亚致死性损伤的细胞自我修复，以减少漏检现象消除计数上的偏差。此外，固态食醋发酵过程中常含有干扰PMA作用的有机物、无机物等，它们不仅能降低染料的浓度，还会干扰PMA与DNA光交联反应，造成假阳性结果，所以为了更准确地定量菌体，需要优化PMA用量，暗处理与曝光时间等，提高本方法的准确率。

发明内容：

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种传统食品发酵过程微生物定量检测的方法，特别地，涉及一种混合微生物固态发酵过程中乳酸菌和醋酸菌活菌定量检测方法。该方法具有结果准确，快速高效，灵敏度高的特点，克服了传统活菌计数法耗时长，操作强度大，不能计数VBNC细菌等不足，并在现有的PMA-qPCR的基础上进行条件优化。特别地，开发了一种修复亚致死菌体细胞膜的修复液，适用于细胞膜受损细菌的细胞膜修复，减少菌体亚致死性损伤带来的假阴性结果，提高了定量结果的准确性，达到了快速准确定量样品中微生物活菌数的目的。

本发明解决技术问题所采用的技术方案如下：

一种同时定量检测混合微生物发酵过程中瑞士乳杆菌、植物乳杆菌、发酵乳杆菌、巴氏醋杆菌活菌数的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)样品预处理：取待检样品1-5g，加入PBS缓冲液(50mmol/L)重悬，纱布过滤去除固体残渣，取上清，得菌悬液，整个过程均为无菌操作；

(2)菌体损伤修复液修复：将上述步骤(1)中得到的菌悬液，在4℃3000-8000r/min离心3-5min，收集菌体，弃上清，加入菌体损伤修复液5-10mL，充分混匀，20-40℃孵育5-15min；

(3)叠氮溴化丙锭(PMA)处理：孵育完成后，加入PMA母液，充分混匀制备PMA-菌悬液，室温避光孵育5-20min，然后将样品置于冰上，卤素灯曝光，在4℃3000-8000r/min离心3-5min收集菌体；

(4)样品DNA提取：对(3)所得的菌体进行DNA提取；

(5)荧光定量PCR确定活菌数，具体如下：

①建立标准曲线：根据目标检测菌设计能够扩增特异性基因片段的特异性引物，以特异性引物扩增其特异性基因片段，并将特异性基因片段连接到pMD-18T载体后转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，筛选阳性克隆菌落，经过PCR及测序后提取质粒DNA获得质粒标准品，测定质粒DNA的浓度并换算成基因拷贝数。将获得的质粒标准品进行十倍梯度稀释后作为标准模板溶液进行荧光定量PCR反应，以标准品浓度的对数作为纵坐标，以荧光定量PCR的Ct值(即每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数)为横坐标，绘制标准曲线；

②实际样本定量：以步骤(4)获得的DNA样品为模板，采用步骤(5)-①设计的特异性引物进行荧光定量PCR反应，将获得的Ct值与步骤(5)-①获得的标准曲线进行对照，确定活菌数。

优选地，所述菌体损伤修复液组成为：蛋白胨1g/L，牛肉浸出粉0.3g/L，氯化钠0.5g/L；吐温80 0.5-1.5g/L、丙酮酸钠0.5-1.5g/L、过氧化氢酶0.1-0.7g/L、MgCl₂ 1-5mmol/L、Na₂HPO₄ 0.05-2mmol/L、MnCl₂ 1-4mmol/L、FeCl₂ 1-4mmol/L，莫西沙星0.03-0.10mg/L，余量为水；

优选地，所述叠氮溴化丙锭(PMA)母液的配置为：取1mg的PMA，加入二甲基亚砜溶解，使母液终浓度为1mg/mL，-20℃避光保存；

所述的PMA-菌悬液的PMA终浓度为15-45μg/mL；

优选地，PMA终浓度为30μg/mL，曝光时间为20min；

优选地，所述室温避光孵育期间可以适当颠倒混匀菌悬液，也可以盖上铝箔纸置于摇床孵育；所述的卤素灯曝光即采用500w的卤素灯，曝光20-60min；

优选地，步骤(5)所述的特异性引物分别是：

①检测瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)的特异性引物：

上游引物Lh-f：5'-ATCGTAGCCAACGGTAAAGG-3'

下游引物Lh-r：5'-TTGCTGGATAGCCAATGTAAGTC-3'；

②检测植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)的特异性引物：

上游引物Lp-f：5'-TCCTCGTTCCGTTGATGC-3'

下游引物Lp-r：5'-AACACCGTCTTCTAACTTGGC-3'；

③检测发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)的特异性引物：

上游引物Lf-f：5'-GGTTTACGGTGCCGATTACG-3'

下游引物Lf-r：5'-CGAGGTCCAGACGGGTTTC-3'；

④检测巴氏醋杆菌(Acetobacter Pasteurianus)的特异性引物：

上游引物Ap-f：5'-GCCCGTTTGAAAATCTGGTAG-3'

下游引物Ap-r：5'-GACTGTTGCTGACATCCTGCTG-3。

有益效果：

(1)与传统活菌计数法相比，本发明能够有效缩短检测时间，提高效率，克服了不能计数VBNC细菌的不足，提高计数的准确率；

(2)本发明创新地在用PMA处理之前加入亚致死细菌修复液，能够避免前处理过程中受伤菌体的PMA侵染，同时优化了PMA处理条件，有效防止假阳性结果的出现，提高定量方法的准确性；

(3)本发明提供的瑞士乳杆菌、植物乳杆菌、发酵乳杆菌、巴氏醋杆菌的特异性引物通过特异性序列可同时定量复杂微生物体系中的乳酸菌和醋酸菌，提高工作效率，同时具有特异性强和灵敏度高的优点。

(4)本发明提供的亚致死细菌修复液在最大程度修复亚致死细菌的同时避免了细菌的增殖作用，保证了细菌技术结果的准确性。

附图说明：

图1完全抑制死菌PCR反应的最低PMA浓度确定

其中，M：DL500泳道1-8浓度依次为0，5，10，15，20，25，30，35μg/mL；

图2不抑制乳酸菌活菌PCR扩增的最大PMA浓度确定

其中，M：DL500泳道1-7浓度依次为0，10，20，30，40，50，60μg/mL；

图3最适光照时间的确定

其中，M：DL500泳道1-7依次为照射0，5，10，15，20，25，30min。

具体实施方式：

下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。

实施例1叠氮溴化丙锭(PMA)处理条件的优化

实验菌株：瑞士乳杆菌AF1-1，植物乳杆菌AF1-9，发酵乳杆菌AF4-5，巴氏醋杆菌CP-A11(本实验室从醋醅中筛选并保存)；

叠氮溴化丙锭母液的制备：取1mg的PMA，加入二甲基亚砜溶解定量至1mL，使母液终浓度为1mg/mL，-20℃避光保存；

醋醅培养基质量分数组成：麸皮30％，稻壳10％，葡萄糖2％，蛋白胨1％，牛肉浸取物1％，酵母提取物0.5％，乙酸钠0.5％，柠檬酸胺0.2％，吐温80 0.1％，磷酸氢二钾0.2％，硫酸镁0.058％，硫酸锰0.025％；

活菌悬液制备：将保存在斜面培养基中的瑞士乳杆菌AF1-1，植物乳杆菌AF1-9，发酵乳杆菌AF4-5，巴氏醋杆菌CP-A11别转接到摇瓶中培养，37℃下恒温培养约12h，取5mL均匀菌液于醋醅培养基中，37℃下恒温培养约12h，取5g样品至50mL无菌离心管中，加入无菌PBS缓冲液至50mL，重悬菌体，无菌纱布过滤，取上清，离心收集菌体，再用无菌PBS重悬两次清洗醋醅杂质，收集菌体，沉淀用灭菌PBS缓冲液悬浮并混匀，备用；

死菌悬液制备：将活菌体用无菌PBS缓冲液重悬，放入90℃的水浴锅，水浴30min。水浴后，放入超声波清洗器进行超声波处理(频率100Hz)，使细胞膜通透，然后5000r/min离心3min，后弃上清，沉淀用灭菌PBS缓冲液悬浮并混匀，备用；

制备7份活细胞悬液样品和8份死细胞悬液样品，分别加入适量的PMA母液，使活菌PMA的终浓度分别为0μg/mL，10μg/mL，20μg/mL，30μg/mL，40μg/mL，50μg/mL，60μg/mL，死菌PMA的终浓度分别为0μg/mL，5μg/mL，10μg/mL，15μg/mL，20μg/mL，25μg/mL，30μg/mL，35μg/mL，PMA与菌液充分混匀后在室温条件下避光反应10min，之后将样品置于冰水上(避免过热)，在距离样品20cm处利用500W的卤素灯曝光时间分别为0min，5min，10min，15min，20min，25min，30min曝光期间每隔30s进行充分混匀。曝光交联后将离心管在5000r/min离心3min，弃上清收集菌体，加入无菌PBS缓冲液重悬菌体，然后再进行5000r/min离心3min，弃上清，收集菌体，提取DNA进行后续PCR实验，确定最优的PMA添加量和曝光时间；结果见图1，图2，图3，终浓度为30μg/mL的PMA，曝光时间为20min时为最优处理条件。

实施例2亚致死细菌修复液条件的优化

亚致死细菌修复液成分：减量肉汤培养基(NB-)+外源物质；

减量肉汤培养基(NB-)组成为：蛋白胨1g/L，牛肉浸出粉0.3g/L，氯化钠0.5g/L；

外源物质包括：吐温80、丙酮酸钠、过氧化氢酶、MgCl₂、Na₂HPO₄、MnCl₂、FeCl₂或莫西沙星；

将活菌体(操作条件见实施例1)用无菌PBS缓冲液重悬，放入75℃的水浴锅，水浴5min，得到含有受伤的细菌、活菌和死菌的损伤菌菌液，6000r/min离心3min，后弃上清，沉淀用灭菌PBS缓冲液悬浮并混匀。

取适量损伤菌菌液离心，去上清液，菌沉淀用等量的修复液(NB-+外源物质)溶解，剧烈震荡15s，使细菌均匀分布。外源添加物质先用超纯水溶解，然后用0.22μm膜过滤后添加到修复液中。菌液于37℃，静置培养，培养15min，后PMA-qPCR计数，统计结果并分析，每组实验平行3次，得到最适浓度的外源添加物，优化条件及结果见表1。

表1细菌修复液成分优化结果

确定菌体损伤修复液组成为：蛋白胨1g/L，牛肉浸出粉0.3g/L，氯化钠0.5g/L；吐温80 0.5-1.5g/L、丙酮酸钠0.5-1.3g/L、过氧化氢酶0.1-0.7g/L、MgCl₂ 1-5mmol/L、Na₂HPO₄ 0.05-2mmol/L、MnCl₂ 1-4mmol/L、FeCl₂ 1-4mmol/L、莫西沙星0.03-0.10mg/L；

取适量损伤菌菌液离心，去上清液，菌沉淀用上述修复液溶解，剧烈震荡15s，使细菌均匀分布。菌液分别置于不同温度下(37℃、32℃、27℃、22℃)下，静置培养，培养15min，后PMA-qPCR计数，统计结果并分析，每组实验平行3次，得到最适修复温度，优化结果见表2。

表2细菌最适修复温度优化结果

确定最适修复温度为20-40℃。

实施例3本发明修复液与对照修复液修复效果的比较

活菌悬液制备：将保存在斜面培养基中的瑞士乳杆菌AF1-1，植物乳杆菌AF1-9，发酵乳杆菌AF4-5，巴氏醋杆菌CP-A11分别转接到摇瓶中培养，37℃下恒温培养约12h,取5mL均匀菌液于醋醅培养基中，37℃下恒温培养约12h，取5g样品至50mL无菌离心管中，加入无菌PBS缓冲液至50mL，重悬菌体，无菌纱布过滤，取上清，离心收集菌体，再用无菌PBS重悬两次清洗醋醅杂质，收集菌体，备用；

对照修复液：NB培养基，LB培养基，外源物质，NB培养基+外源物质B

取适量菌液离心，去上清液，菌沉淀分别用本发明所得修复液(NB-+外源物质)与对照修复液溶解，剧烈震荡15s，使细菌均匀分布。菌液置于27℃下，静置培养，培养15min后PMA-qPCR计数，统计结果并分析，每组实验平行3次，对比结果见表3，由表3可知，本发明修复液相比对照组，减少了活菌假阳性检出。

表3本发明修复液与对照修复液活菌培养对比结果

注：①活菌增长率＝[(修复液孵育后菌体数量-修复液孵育前菌体数量)/修复液孵育前菌体数量]*100％

②本发明修复液组成为：蛋白胨1g/L，牛肉浸出粉0.3g/L，氯化钠0.5g/L；吐温801g/L、丙酮酸钠1g/L、过氧化氢酶0.5g/L、MgCl₂ 3mmol/L、Na₂HPO₄ 1mmol/L、MnCl₂ 2mmol/L、FeCl₂ 2mmol/L、莫西沙星0.05mg/L；

③NB培养基组成为：蛋白胨10g/L，牛肉浸出粉3g/L，氯化钠5g/L；

④LB培养基组成为：胰蛋白胨10g/L；酵母提取物5g/L；氯化钠10g/L

⑤外源物质B组成为：吐温80 1g/L、丙酮酸钠1g/L、过氧化氢酶0.5g/L、MgCl₂3mmol/L、Na₂HPO₄ 1mmol/L、MnCl₂ 2mmol/L、FeCl₂ 2mmol/L；

⑥NB+外源物质B组成为：蛋白胨10g/L，牛肉浸出粉3g/L，氯化钠5g/L；吐温80 1g/L、丙酮酸钠1g/L、过氧化氢酶0.5g/L、MgCl₂ 3mmol/L、Na₂HPO₄ 1mmol/L、MnCl₂ 2mmol/L、FeCl₂ 2mmol/L；

亚致死状态菌悬液制备：将活菌体用无菌PBS缓冲液重悬，放入75℃的水浴锅，水浴10min，6000r/min离心3min，后弃上清，沉淀用灭菌PBS缓冲液悬浮并混匀，备用；

取适量亚致死菌液离心，去上清液，菌沉淀用本发明修复液(NB-+外源物质)与对照修复液溶解，剧烈震荡15s，使细菌均匀分布。菌液置于27℃下，静置培养，培养15min，后PMA-qPCR计数，统计结果并分析，每组实验平行3次，对比结果见表4。

综合表3，表4可知，本发明修复液在最小程度减少修复培养基的增殖作用的同时最大程度的使亚致死菌得到了修复。

表4本发明修复液与对照修复液修复效果对比结果

注：修复率＝[(修复液孵育后菌体数量-亚致死处理后菌体数量)/(亚致死处理前菌体数量-亚致死处理后菌体数量)]*100％

实施例4引物特异性验证

通过比对不同细菌的特异性基因片段，最终设计了瑞士乳杆菌，植物乳杆菌发酵乳杆菌和巴氏醋杆菌的特异性引物，分别是：

瑞士乳杆菌上游引物Lh-f：5'-ATCGTAGCCAACGGTAAAGG-3'

瑞士乳杆菌下游引物Lh-r：5'-TTGCTGGATAGCCAATGTAAGTC-3'；

植物乳杆菌上游引物Lp-f：5'-TCCTCGTTCCGTTGATGC-3'

植物乳杆菌下游引物Lp-r：5'-AACACCGTCTTCTAACTTGGC-3'；

发酵乳杆菌上游引物Lf-f：5'-GGTTTACGGTGCCGATTACG-3'

发酵乳杆菌下游引物Lf-r：5'-CGAGGTCCAGACGGGTTTC-3”；

巴氏醋杆菌上游引物Ap-f：5'-GCCCGTTTGAAAATCTGGTAG-3'

巴氏醋杆菌下游引物Ap-r：5'-GACTGTTGCTGACATCCTGCTG-3；

为验证引物的特异性，对实验菌株进行基因组DNA的提取和荧光定量PCR。

实验菌株：瑞士乳杆菌AF1-1，植物乳杆菌AF1-9，发酵乳杆菌AF4-5，巴氏醋杆菌CP-A11(本实验室从醋醅中筛选并保存)；

活菌悬液制备：将保存在斜面培养基中的瑞士乳杆菌，植物乳杆菌，发酵乳杆菌和巴氏醋杆菌分别转接到摇瓶中培养，37℃下恒温培养约12h，取5mL均匀菌液于醋醅培养基中，37℃下恒温培养约12h，取5g样品至50mL无菌离心管中，加入无菌PBS缓冲液至50mL，重悬菌体，无菌纱布过滤，取上清，离心收集菌体，再用无菌PBS重悬两次清洗醋醅杂质，收集菌体，沉淀用灭菌PBS缓冲液悬浮并混匀，备用；

将以上活菌悬液离心，收集菌体，提取DNA进行后续荧光定量PCR实验，以判断引物的特异性。每组实验重复三次以确保实验结果的重现性。

菌株的编号、采用的引物及验证结果见表5，从表5中可以看出本发明提供的引物具有较高的特异性，即引物Lh-f、Lh-r只能特异性扩增瑞士乳杆菌，引物Lp-f、Lp-r只能特异性扩增植物乳杆菌，引物Lf-f、Lf-r只能特异性扩增发酵乳杆菌，引物Ap-r、Ap-f只能特异性扩增巴氏醋杆菌。

表5引物特异性验证结果

实施例5标准品质粒和标准曲线的建立

以Lh-f和Lh-r为引物，Lactobacillus helveticus的DNA为模板，扩增瑞士乳杆菌特异性基因片段；

以Lp-f和Lp-r为引物，Lactobacillus plantarum的DNA为模板，扩增植物乳杆菌特异性基因片段；

以Lf-f和Lf-r为引物，Lactobacillus fermentum的DNA为模板，扩增发酵乳杆菌特异性基因片段；

以Ap-f和Ap-r为引物，Acetobacter Pasteurianus的DNA为模板，扩增巴氏醋杆菌特异性基因片段；

PCR反应体系为50μL：5μL10×Buffer，4μL dNTP，引物上游和下游各1μL，rTaq酶0.5μL，DNA模板1μL，ddH₂O37.5μL(Takara Taq，10×PCR Buffer，dNTP Mixture购自Takara公司)。

PCR反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性1min，60℃退火45s，72℃延伸1min，30个循环，72℃延伸10min，反应结束后，将扩增产物经3％的琼脂糖凝胶电泳观察。

按照DNA回收试剂盒(Cycle-Pure Kit购自Omega USA公司)的操作说明对PCR产物进行纯化、回收。将纯化产物与PMD-18T载体连接，连接体系为10μL，其反应组分为PMD-18T载体1μL，纯化后的DNA 4μL，SolutionⅠ5μL，将连接体系置于4℃冰箱中过夜后加入到200μL感受态大肠杆菌DH5α中(PMD-18T载体购自Takara公司)，冰浴30min后42℃热击90s，冰浴5min，加入无菌氨苄青霉素的LB液体培养基800μL，37℃摇菌1h，取200μL菌液均匀涂于LB培养基上，过夜培养后挑取单菌落白斑，放入5mL LB液体培养基的试管中，37℃、200r/min，振荡过夜培养。

提取质粒：取出菌液，分别放入8个5mL的离心中,按照EZNATM Plasmid Mini KitⅠ试剂盒的使用说明，在室温离心1min，10000r/min，弃上清，加入250μL试剂盒所配备的溶液solutionⅠ，混匀，再加入250μL solutionⅡ，混匀，最后加入350μL solutionⅢ混匀，则出现白色絮状物。再在室温下离心10min，13000r/min，用移液枪把液体移到制备管里，放入2mL的收集管中，在室温下离心1min，10000r/min。把废液弃去，重新用2mL收集管，加入500μL Buffer HB，清洗制备管，在室温下离心1min，10000r/min，弃去废液，加入700μL DNAWash Buffer，在室温下离心1min，10000r/min，把废液弃去，室温下离心2min，13000r/min干燥。把制备管放在一个干净的1.5mL离心管中，加入60μL ddH2O，室温下放置2min，离心1min，13000r/min，使其DNA溶解获得质粒标准品。

将上述实验获得的质粒标准品用ddH₂O进行10倍系列稀释，分别稀释成10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰个拷贝数/μL的5个梯度，作为模板(稀释的时候用移液枪吹打30次，振荡10s，然后离心，使得溶液充分混匀)，进行荧光定量PCR来建立标准曲线。

20μL荧光定量PCR体系：模板2μL，荧光定量PCR上、下游引物各0.4μL，SYBR GreenMaster Mix 10μL，加ddH₂O至20μL。

PCR反应程序为：预变性95℃反应5min；循环反应95℃反应10s，60℃反应30s，40个循环；生成溶解曲线步骤为：95℃反应15s，60℃反应60s，95℃反应15s。根据荧光值的变化规律，系统将自动生成扩增曲线和溶解曲线。

反应完成时，以阈值循环数Ct(即每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数)作为横坐标，标准品浓度的对数作为纵坐标绘制标准曲线，实验结果见表6。

标准品浓度的计算：

其中：c标为标准品浓度(拷贝数/μL)；OD_260nm为由核酸浓度测定仪3次测定的平均值；A为换算系数0.05，即1OD_260nm＝0.05μg/(μL dsDNA)；N为稀释倍数；6.02×10²³为阿佛加德罗常数。

表6实验菌株标准曲线

实施例6加标定量检测验证引物的特异性

活菌悬液制备：将保存在斜面培养基中的瑞士乳杆菌，植物乳杆菌，发酵乳杆菌和巴氏醋杆菌分别转接到摇瓶中培养，37℃下恒温培养约12h，取5mL均匀菌液于醋醅培养基中，37℃下恒温培养约12h，取5g样品至50mL无菌离心管中，加入无菌PBS缓冲液至50mL，重悬菌体，无菌纱布过滤，取上清，离心收集菌体，再用无菌PBS重悬两次清洗醋醅杂质，收集菌体，备用；

将上述得到的菌体混合提取基因组，分别对其中的瑞士乳杆菌，植物乳杆菌，发酵乳杆菌和巴氏醋杆菌进行定量检测，检测结果如表7所示，另取一份等量上述菌体，同样提取基因组加入以上基因组中，再次对其中的瑞士乳杆菌，植物乳杆菌，发酵乳杆菌和巴氏醋杆菌进行定量检测，定量结果如表7所示，说明本发明设计的引物具有良好的特异性。

表7加标定量检测结果

实施例7本发明的检测方法与传统方检测方法比较

亚致死状态菌悬液制备：将活菌体用无菌PBS缓冲液重悬，分成5份放入75℃的水浴锅，分别水浴1min，5min，10min，15min，20min，4000r/min离心3min，后弃上清，沉淀用灭菌PBS缓冲液悬浮并混匀后制备5份亚致死状态菌悬液样本，备用；

将亚致死状态菌悬液，活菌悬液，死菌悬液(操作条件见实施例1)按照1:1:1的比例混合，得到不同浓度的亚致死菌，活菌，死菌。用四种不同的计数方法计数，具体如下：

第一种：直接提取DNA进行qPCR；

第二种：PMA-qPCR法，PMA母液加入菌悬液中，使PMA的终质量浓度为30μg/mL，混合均匀后，在室温条件下避光培养10min，利用500W的卤素灯曝光20min，光照交联时样品置于冰上(避免过热)，且在距光源20cm处，交联后的悬浮液于5000r/min离心3min，所得沉淀用于DNA的提取后进行qPCR；

第三种：修复液-PMA-qPCR法即为本发明提供的检测方法，先加入细菌亚致死修复液(蛋白胨1g/L，牛肉浸出粉0.3g/L，氯化钠0.5g/L；吐温80 1g/L、丙酮酸钠1g/L、过氧化氢酶0.5g/L、MgCl₂ 3mmol/L、Na₂HPO₄ 1mmol/L、MnCl₂ 2mmol/L、FeCl₂ 2mmol/L、莫西沙星0.05mg/L)，37℃孵育15min，离心收集菌体，加入PBS缓冲液重悬菌体，再加入PMA母液，使PMA的终质量浓度为30μg/mL，混合均匀后，在室温条件下避光培养10min，利用500W的卤素灯曝光20min，光照交联时样品置于冰上(避免过热)，且在距光源20cm处，交联后的悬浮液于6000r/min离心3min，所得沉淀用于DNA的提取后进行qPCR；

第四种：直接进行传统平板计数。

实验结果及统计见表8

表8不同检测方法比较

实施例8本方法在固态食醋发酵中的应用

分别取发酵醋醅0天，2天，5天，7天，9天样本5g放入50mL离心管内，加PBS缓冲液(50mmol/L)至50mL，纱布过滤去除醋醅残渣，取上清，得菌悬液，整过程均为无菌操作；

将上述得到的菌悬液4℃，5000r/min离心5min，收集菌体，弃上清，加入菌体损伤修复液10mL(蛋白胨1g/L，牛肉浸出粉0.3g/L，氯化钠0.5g/L；吐温80 0.5g/L、丙酮酸钠1.5g/L、过氧化氢酶0.1g/L、MgCl₂ 1mmol/L、Na₂HPO₄ 2mmol/L、MnCl₂ 1mmol/L、FeCl₂4mmol/L，莫西沙星0.10mg/L)，混匀，27℃，孵育15min；加入叠氮溴化丙锭(PMA)母液至终浓度为30μg/mL，PMA与菌液充分混匀后在室温条件下避光反应10min，之后将样品置于冰水上(避免过热)，在距离样品20cm处利用500W的卤素灯曝光20min，曝光期间每隔30s进行充分混匀。曝光交联后将离心管在4℃，6000r/min离心3min，弃上清收集菌体，加入无菌PBS缓冲液重悬菌体，然后再进行6000r/min离心3min，弃上清，收集菌体，提取DNA进行后续PCR实验。

以提取的DNA为模板，以Lh-f/Lh-r、Lp-f/Lp-r、Lf-f/Lf-r、Ap-r/Ap-f为引物，以瑞士乳杆菌，植物乳杆菌，发酵乳杆菌和巴氏醋酸杆菌的特异性基因作为靶基因，进行荧光定量PCR扩增反应，输出相应的循环阈值Ct；将所述循环阈值分别与实施例5表6中所得的标准曲线进行对照，获得四种细菌的活菌数，计数结果见表9。

表9不同发酵时期醋醅中乳酸菌和醋酸菌的计数结果

实施例9本发明在泡菜发酵中的应用

分别取发酵泡菜0h，12h，24h，36h，48h样本1g放入50mL离心管内，加PBS缓冲液(50mmol/L)至50mL，纱布过滤去除泡菜残渣，取上清，得菌悬液，整过程均为无菌操作；

将上述得到的菌悬液4℃，4000r/min离心3min，收集菌体，弃上清，加入菌体损伤修复液(蛋白胨1g/L，牛肉浸出粉0.3g/L，氯化钠0.5g/L；吐温80 1.5g/L、丙酮酸钠0.5g/L、过氧化氢酶0.7g/L、MgCl₂ 5mmol/L、Na₂HPO₄ 0.05mmol/L、MnCl₂ 4mmol/L、FeCl₂ 1mmol/L，莫西沙星0.03mg/L)5mL，混匀，40℃，孵育10min；加入叠氮溴化丙锭(PMA)至终浓度为15μg/mL，PMA与菌液充分混匀后在室温条件下避光反应5min，之后将样品置于冰水上(避免过热)，在距离样品20cm处利用500W的卤素灯曝光30min，曝光期间每隔30s进行充分混匀。曝光交联后将离心管在5000r/min离心3min，弃上清收集菌体，加入无菌PBS缓冲液重悬菌体，然后再进行4℃，8000r/min离心5min，弃上清，收集菌体，提取DNA进行后续PCR实验，

以提取的DNA为模板，以Lh-f/Lh-r、Lp-f/Lp-r、Lf-f/Lf-r、Ap-r/Ap-f为引物，瑞士乳杆菌，植物乳杆菌，发酵乳杆菌的特异性基因作为靶基因，进行荧光定量PCR扩增反应，输出相应的循环阈值；将所述循环阈值分别与瑞士乳杆菌标准曲线、植物乳杆菌，发酵乳杆菌标准曲线(实施例5表6所示)进行对照，获得三种细菌的活菌数，计数结果见表10。

表10不同发酵时期泡菜中乳酸菌的计数结果

实施例10本发明在白酒发酵中的应用

分别取发酵酒醅一轮窖、二轮窖、三轮窖样本3g放入50mL离心管内，加PBS缓冲液(50mmol/L)至50mL，纱布过滤去除酒醅残渣，取上清，得菌悬液，整过程均为无菌操作；

将上述得到的菌悬液4℃，5000r/min离心4min，收集菌体，弃上清，加入菌体损伤修复液(蛋白胨1g/L，牛肉浸出粉0.3g/L，氯化钠0.5g/L；吐温80 0.8g/L、丙酮酸钠1.2g/L、过氧化氢酶0.3g/L、MgCl₂ 2mmol/L、Na₂HPO₄ 1mmol/L、MnCl₂ 2mmol/L、FeCl₂ 2mmol/L，莫西沙星0.07mg/L)8mL，混匀，20℃，孵育10min；加入叠氮溴化丙锭(PMA)至终浓度为30μg/mL，PMA与菌液充分混匀后在室温条件下避光反应10min，之后将样品置于冰水上(避免过热)，在距离样品20cm处利用500W的卤素灯曝光40min，曝光期间每隔30s进行充分混匀。曝光交联后将离心管在4℃，6000r/min离心3min，弃上清收集菌体，加入无菌PBS缓冲液重悬菌体，然后再进行7000r/min离心3min，弃上清，收集菌体，提取DNA进行后续PCR实验，

以提取的DNA为模板，以Lh-f/Lh-r、Lp-f/Lp-r、Lf-f/Lf-r、Ap-r/Ap-f为引物，以瑞士乳杆菌，植物乳杆菌，发酵乳杆菌和巴氏醋酸杆菌的特异性基因作为靶基因，进行荧光定量PCR扩增反应，输出相应的循环阈值；将所述循环阈值分别与瑞士乳杆菌标准曲线、植物乳杆菌，发酵乳杆菌和巴氏醋酸杆菌标准曲线(实施例5表6所示)进行对照，获得四种细菌的活菌数，计数结果见表11。

表11不同发酵时期酒醅中乳酸菌和醋酸菌的计数结果

实施例11本发明在酱油发酵中的应用

分别取发酵酱醪0天，12天，39天，74天，120天样本5g放入50mL离心管内，加PBS缓冲液(50mmol/L)至50mL，纱布过滤去除酱醪残渣，取上清，得菌悬液，整过程均为无菌操作；

将上述得到的菌悬液4℃，3000r/min离心5min，收集菌体，弃上清，加入菌体损伤修复液(蛋白胨1g/L，牛肉浸出粉0.3g/L，氯化钠0.5g/L；吐温80 0.8g/L、丙酮酸钠0.8g/L、过氧化氢酶0.5g/L、MgCl₂ 3mmol/L、Na₂HPO₄ 1.5mmol/L、MnCl₂ 3mmol/L、FeCl₂ 2mmol/L，莫西沙星0.04mg/L)10mL，混匀，30℃，孵育15min；加入叠氮溴化丙锭(PMA)至终浓度为30μg/mL，PMA与菌液充分混匀后在室温条件下避光反应20min，之后将样品置于冰水上(避免过热)，在距离样品20cm处利用500W的卤素灯曝光60min，曝光期间每隔30s进行充分混匀。曝光交联后将离心管在4℃，5000r/min离心3min，弃上清收集菌体，加入无菌PBS缓冲液重悬菌体，然后再进行5000r/min离心3min，弃上清，收集菌体，提取DNA进行后续PCR实验，

以提取的DNA为模板，以Lh-f/Lh-r、Lp-f/Lp-r、Lf-f/Lf-r、Ap-r/Ap-f为引物，以瑞士乳杆菌，植物乳杆菌，发酵乳杆菌的特异性基因作为靶基因，进行荧光定量PCR扩增反应，输出相应的循环阈值；将所述循环阈值分别与瑞士乳杆菌、植物乳杆菌，发酵乳杆菌标准曲线(实施例5表6所示)进行对照，获得三种细菌的活菌数，计数结果见表12。

表12不同发酵时期酱醪中乳酸菌的计数结果

实施例12本发明在豆瓣酱发酵中的应用

分别取发酵豆瓣酱0天，15天，30天，45天，60天样本5g放入50mL离心管内，加PBS缓冲液(50mmol/L)至50mL，纱布过滤去除豆瓣酱残渣，取上清，得菌悬液，整过程均为无菌操作；

将上述得到的菌悬液4℃，8000r/min离心5min，收集菌体，弃上清，加入菌体损伤修复液(蛋白胨1g/L，牛肉浸出粉0.3g/L，氯化钠0.5g/L；吐温80 0.5g/L、丙酮酸钠1.2g/L、过氧化氢酶0.7g/L、MgCl₂ 5mmol/L、Na₂HPO₄ 0.08mmol/L、MnCl₂ 1mmol/L、FeCl₂ 2mmol/L，莫西沙星0.05mg/L)10mL，混匀，27℃，孵育10min；加入叠氮溴化丙锭(PMA)至终浓度为30μg/mL，PMA与菌液充分混匀后在室温条件下避光反应10min，之后将样品置于冰水上(避免过热)，在距离样品20cm处利用500W的卤素灯曝光20min，曝光期间每隔30s进行充分混匀。曝光交联后将离心管在4℃，6000r/min离心3min，弃上清收集菌体，加入无菌PBS缓冲液重悬菌体，然后再进行6000r/min离心3min，弃上清，收集菌体，提取DNA进行后续PCR实验，

以提取的DNA为模板，以Lh-f/Lh-r、Lp-f/Lp-r、Lf-f/Lf-r、Ap-r/Ap-f为引物，以瑞士乳杆菌，植物乳杆菌，发酵乳杆菌的特异性基因作为靶基因，进行荧光定量PCR扩增反应，输出相应的循环阈值；将所述循环阈值分别与瑞士乳杆菌、植物乳杆菌，发酵乳杆菌标准曲线(实施例5表6所示)进行对照，获得四种细菌的活菌数，计数结果见表13。

表13不同发酵时期豆瓣酱中乳酸菌的计数结果

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (4)

1.一种混合微生物发酵过程中微生物定量检测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

（1）样品预处理：取待检样品1-5 g，加入PBS缓冲液重悬，纱布过滤去除固体残渣，取上清，得到菌悬液；

（2）菌体损伤修复液修复：将步骤（1）中得到的菌悬液，在4℃3000-8000 r/min离心3-5min，收集菌体，加入菌体损伤修复液5-10 mL，充分混匀，20-40℃孵育5-15min；

所述菌体损伤修复液组成为：蛋白胨1 g/L，牛肉浸出粉0.3 g/L，氯化钠0.5 g/L；吐温80 0.5-1.5 g/L、丙酮酸钠0.5-1.5 g/L、过氧化氢酶0.1-0.7 g/L、MgCl₂ 1-5 mmol/L、Na₂HPO₄ 0.05-2 mmol/L、MnCl₂ 1-4 mmol/L、FeCl₂ 1-4 mmol/L，莫西沙星0.03-0.10 mg/L；

（3）叠氮溴化丙锭处理：孵育完成后，加入叠氮溴化丙锭母液，充分混匀制备叠氮溴化丙锭-菌悬液，室温避光孵育5-20min，然后将样品置于冰上，卤素灯曝光，在4℃ 3000-8000r/min离心3-5 min收集菌体；

叠氮溴化丙锭-菌悬液中叠氮溴化丙锭终浓度为30 μg/mL；

（4）样品DNA提取：对步骤（3）所得的菌体进行DNA提取；

（5）荧光定量PCR确定活菌数：

采用特异性引物对瑞士乳杆菌、植物乳杆菌、发酵乳杆菌、巴氏醋杆菌进行荧光定量PCR检测，所述的特异性引物分别是：

①检测瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus）的特异性引物：

上游引物Lh-f：5'-ATCGTAGCCAACGGTAAAGG-3'

下游引物Lh-r：5'-TTGCTGGATAGCCAATGTAAGTC-3'；

②检测植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）的特异性引物：

上游引物Lp-f：5'-TCCTCGTTCCGTTGATGC-3'

下游引物Lp-r：5'-AACACCGTCTTCTAACTTGGC-3'；

③检测发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）的特异性引物：

上游引物Lf-f：5'-GGTTTACGGTGCCGATTACG-3'

下游引物Lf-r：5'-CGAGGTCCAGACGGGTTTC-3'；

④检测巴氏醋杆菌（Acetobacter Pasteurianus）的特异性引物：

上游引物Ap-f：5'- GCCCGTTTGAAAATCTGGTAG -3'

下游引物Ap-r：5'- GACTGTTGCTGACATCCTGCTG -3'。

2.如权利要求1所述的一种混合微生物发酵过程中微生物定量检测方法，其特征在于，步骤（3）卤素灯曝光时间为20 min。

3.如权利要求1所述的一种混合微生物发酵过程中微生物定量检测方法，其特征在于，所述的卤素灯曝光为采用500 w的卤素灯，曝光20-60min。

4.如权利要求1所述的一种混合微生物发酵过程中微生物定量检测方法，其特征在于，所述荧光定量PCR确定活菌数的方法如下：

①建立标准曲线：以特异性引物扩增特异性基因片段，并将特异性基因片段连接到pMD-18T载体后转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，筛选阳性克隆菌落，经过PCR及测序后提取质粒DNA获得质粒标准品，测定质粒DNA的浓度并换算成基因拷贝数；将获得的质粒标准品进行十倍梯度稀释后作为标准模板溶液进行荧光定量PCR反应，以标准品浓度的对数作为纵坐标，以荧光定量PCR的Ct值，即每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数为横坐标，绘制标准曲线；

②实际样本定量：以步骤（4）获得的DNA样品为模板，采用特异性引物进行荧光定量PCR反应，将获得的Ct值与步骤①获得的标准曲线进行对照，确定活菌数。

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