CN113046451B - 一种菌群的活菌定量方法及其用途 - Google Patents

一种菌群的活菌定量方法及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明的目的在于提供一种菌群的活菌定量方法及其用途，这种方法包括，配制菌群：取菌群溶解于0.9％NaCl溶液中，经过分析前处理仪及配套耗材处理去除残渣，得到菌群；菌群PMA处理：将得到的粪菌用含有0.05％L‑半胱氨酸盐酸盐的PBS缓冲液稀释，然后加入PMA使得体系最终浓度为30‑80μM，然后进行暗反应，时长30min，然后光照20min，然后提取基因组DNA，进行qPCR检测分析，本发明提供的方法通过限定粪菌的浊度、PMA的溶度及光照时间保证PMA‑qPCR方法中区分死活菌准确度，解决了区别死菌活菌不够准确的问题，本发明的方法用途为对人体肠道菌群的活菌定量。

Description

一种菌群的活菌定量方法及其用途
技术领域
本发明涉及微生物检测领域，具体涉及一种菌群的活菌定量方法及其用途。
背景技术
PMA(propidiummonoazide)是一种对核酸具有高度亲和力的光敏反应染料，能够进入具有不完整细胞壁或细胞膜的细菌死细胞中，选择性地交联死菌DNA。将其与DNA扩增检测技术相结合，可有效地抑制死菌细胞DNA的扩增，从而实现活菌的检测。目前，这一方法多用于单菌或混合微生物中某几个菌的活菌定量，如专利CN103509860A中公开了一种针对食品中大肠杆菌O157:H7活菌的定量检测方法；专利CN102816850B中公开了一种同时检测鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7、单核增生李斯特菌的方法；专利CN108588188A描述了一种食醋固态发酵过程中利用PMA-qPCR法对瑞士乳杆菌、植物乳杆菌、发酵乳杆菌、巴氏醋杆菌进行定量检测的方法。然而将PMA-qPCR方法用于肠道菌群活菌定量检测的可行性尚未得到系统的研究且存在一定的技术难点，直接操作往往会出现区别死菌活菌不够准确等问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于人体肠道菌群的活菌定量方法，这种方法解决了区别死菌活菌不够准确的问题。
为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：
一种用于人体肠道菌群的活菌定量方法包括以下步骤：
配制菌群：取样品溶解于0.9％NaCl溶液中，进过粪便分析前处理仪及配套耗材处理去除残渣，得到菌群；
菌群PMA处理：将得到的菌群用含有0.05％L-半胱氨酸盐酸盐的PBS缓冲液稀释，然后加入PMA使得体系最终浓度为30-80μM，然后进行暗反应，时长30min，然后光照20min，然后提取基因组DNA，进行qPCR检测分析。
优选地，述菌群PMA处理中，加入PMA使得体系最终浓度为50μM。
优选地，所述菌群PMA处理具体包括以下步骤：
配制PMA母液：将PMA溶于ddH2O，获得溶度为2mM的PMA母液，PMA母液在-20℃条件下避光保存；
配制PMA菌悬液：取部分菌群，向粪菌中加入PMA母液直至体系的最终浓度为100μM，充分混匀得到PMA菌悬液；
PMA菌悬液处理：将得到PMA菌悬液在室温下避光孵育30min，然后将样品置于冰上，使用卤素灯光照20min，光照后在4℃条件下以5000r/min转速离心3-5min，收集菌体进行DNA提取，进行qPCR检测分析。
优选地，所述PMA菌悬液处理具体为：将得到PMA菌悬液在室温下避光孵育30min，然后将样品置于冰上，使用500w卤素灯距离20cm处光照20min，光照后在4℃条件下以5000r/min转速离心3-5min，收集菌体进行DNA提取，进行qPCR检测分析。
优选地，所述菌群PMA处理在光照20min之后，使用试剂盒法提取基因组DNA。
所述菌群的活菌定量方法应用于人体肠道的活菌定量。
有益效果：
本发明菌群的活菌定量方法，建立了一种菌群活性的定量检测技术，通过控制PMA菌群体系的溶度，控制菌群的稀释倍数，控制光照时间，保证qPCR检测分析时DNAqPCR扩增的CT值，通过限定样品的浊度、PMA的浓度及光照时间保证PMA-qPCR方法中区分死活菌准确度。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明一种菌群的活菌定量方法具体实施方式中样品样本不同稀释度对qPCR的影响的柱状图；
图2为本发明一种菌群的活菌定量方法具体实施方式中PMA浓度对qPCR的影响的柱状图；
图3为本发明一种用于人体肠道菌群的活菌定量方法具体实施方式中光照时间对qPCR的影响的柱状图；
图4为本发明不同拷贝数标准品DNA对qPCR反应体系中Ct值的影响的折线图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
菌群的制备
将收集的健康供体100-200g粪便溶解于750mL-1L的0.9％NaCl溶液中，经承葛生物科技有限公司生产的粪便分析前处理仪TG-01(专利号CN201930312740.2)及配套耗材处理去除残渣，得到粪菌30-40g；
用含有0.05％L-半胱氨酸盐酸盐的PBS缓冲液梯度稀释10倍、100倍、500倍、1000倍，并于115℃条件下灭菌10min制备热灭活粪菌悬液，分别吸取500μL至1.5ml离心管中，按照步骤1.2.1进行PMA处理，以未进行PMA处理作对照，随后用试剂盒法(QIAamp Fast DNAStool Mini Kit)提取基因组DNA，进行qPCR检测，以Ct值作为指标进行结果分析。
实验结果见图1，由图1可见，未稀释的样本中，未观察到PMA处理的样品与对照样品之间的扩增差异，可能是粪便样本中的某些物质抑制了样本中DNA的扩增；与100倍稀释的粪便样本相比，未稀释及10倍稀释的粪便样本均降低了PMA处理的效果，可能与样本中颗粒物质较多影响PMA光照的效果有关；虽然在100倍、500倍、1000倍稀释条件下，与未PMA组相比，PMA处理后DNA扩增减少，但500倍与1000倍稀释后样本量过少，PMA处理后Ct值与100倍稀释条件下差别不大，即将粪便100倍稀释效果最佳。
取上述制备的粪菌，于115℃条件下灭菌10min制备热灭活粪菌悬液，用含有0.05％L-半胱氨酸盐酸盐的PBS缓冲液梯度稀释100倍，将粪便悬液分为五份，每份500μL，分别添加一定体积的PMA母液，使反应体系的PMA终浓度为0、25、50、75、100μM，进行PMA反应，随后用试剂盒法提取基因组DNA，进行qPCR检测，以Ct值作为指标进行结果分析。
实验结果见图2，由图2可见，随着反应体系中PMA浓度的增大，灭活粪菌DNA qPCR扩增的Ct值明显升高，当PMA浓度超过50μM时，反应体系的Ct值几乎不再发生变化，50μM为PMA处理的溶度效果最佳。
取上述制备的粪菌，于115℃条件下灭菌10min制备热灭活粪菌悬液，用含有0.05％L-半胱氨酸盐酸盐的PBS缓冲液梯度稀释至100倍，加入PMA使体系终浓度为50μM，进行暗反应30min后，分别光照0、5、10、15、20、25、30min，每个样本三个重复试验。随后用试剂盒法提取基因组DNA，进行qPCR检测分析，以Ct值作为指标进行结果分析，结果见图3；
由图3可见，随着光照时间的延长，qPCR反应体系的Ct值随之变大，当光照时间达到20min后，体系的Ct值变化不大，光照20min效果最佳。
通过qPCR以不同拷贝数的已知标准品DNA的CT值与其拷贝数的对数绘制标准曲线，结果见图4，由图4可见在DNA拷贝数为104ˉ108范围内线性关系良好(R2＝0.9969)，x轴代表Ct值，y轴代表样本拷贝数的对数值。
实施例1
菌群的活菌定量方法包括以下步骤：
配制菌群，将收集的样品溶解于0.9％NaCl溶液中，经承葛生物科技有限公司生产的粪便分析前处理仪TG-01(专利号CN201930312740.2)及配套耗材处理去除残渣，得到菌群，样品包括粪便、泥土、淤泥等等；
配制PMA母液：将PMA溶于ddH2O，获得溶度为2mM的PMA母液，PMA母液在-20℃条件下避光保存；
配制PMA菌悬液：取部分菌群，用含有0.05％L-半胱氨酸盐酸盐的PBS缓冲液梯度稀释100倍，加入PMA使体系终浓度为50μM，充分混匀得到PMA菌悬液；
PMA菌悬液处理：将得到PMA菌悬液在室温下避光孵育30min，然后将样品置于冰上，使用500W卤素灯距离50cm光照20min，光照后在4℃条件下以5000r/min转速离心5min，收集菌体进行DNA提取，进行qPCR检测分析。
实施例2
使用实施例1得到的粪菌；
配制PMA母液：将PMA溶于ddH2O，获得溶度为2mM的PMA母液，PMA母液在-20℃条件下避光保存；
配制PMA菌悬液：取部分菌群，用含有0.05％L-半胱氨酸盐酸盐的PBS缓冲液梯度稀释100倍，加入PMA使体系终浓度为50μM，充分混匀得到PMA菌悬液；
PMA菌悬液处理：将得到PMA菌悬液在室温下避光孵育30min，然后将样品置于冰上，使用500w卤素灯距离20cm处光照20min，光照后在4℃条件下以5000r/min转速离心3-5min，收集菌体进行DNA提取，进行qPCR检测分析。
实施例3
使用实施例1得到的菌群；
配制PMA母液：将PMA溶于ddH2O，获得溶度为2mM的PMA母液，PMA母液在-20℃条件下避光保存；
配制PMA菌悬液：取部分菌群，用含有0.05％L-半胱氨酸盐酸盐的PBS缓冲液梯度稀释100倍，加入PMA使体系终浓度为30μM，充分混匀得到PMA菌悬液；
PMA菌悬液处理：将得到PMA菌悬液在室温下避光孵育30min，然后将样品置于冰上，使用500w卤素灯距离20cm处光照20min，光照后在4℃条件下以5000r/min转速离心3-5min，收集菌体进行DNA提取，进行qPCR检测分析。
实施例4
使用实施例1得到的菌群；
配制PMA母液：将PMA溶于ddH2O，获得溶度为2mM的PMA母液，PMA母液在-20℃条件下避光保存；
配制PMA菌悬液：取部分菌群，用含有0.05％L-半胱氨酸盐酸盐的PBS缓冲液梯度稀释100倍，加入PMA使体系终浓度为80μM，充分混匀得到PMA菌悬液；
PMA菌悬液处理：将得到PMA菌悬液在室温下避光孵育30min，然后将样品置于冰上，使用500w卤素灯距离20cm处光照20min，光照后在4℃条件下以5000r/min转速离心3-5min，收集菌体进行DNA提取，进行qPCR检测分析。
对比例1
对比例1与实施例1的区别仅在于PMA菌悬液体系终浓度为20μM。
对比例2
对比例2与实施例1的区别仅在于PMA菌悬液体系终浓度为90μM。
对比例3
对比例3与实施例1的区别仅在于PMA菌悬液处理中光照时间为15min。
对比例4
对比例4与实施例1的区别仅在于PMA菌悬液处理中光照时间为25min。
使用实施例1-4及对比例1-4的方法进行活菌定量检测试验，每次检测三个重复，取平均值，同时用流式细胞仪对同一实施例或对比例进行计数分析，两种方法测量结果如表1。
Figure BDA0002984105200000071
由表1可见实施例1-实施例4两种方法计算的结果在数量级上基本一致，即本发明提供的菌群的活菌定量方法实现了PMA-qPCR方法准确检测菌群活菌数量的效果，由对比例2及对比例4与实施例1对比可见，在本发明中PMA菌悬液体系终浓度50μM，光照时间达到20min即可保证准确检测肠道菌群活菌数量，由对比例1及对比例3与实施例1对比可见，当PMA菌悬液体系终浓度不足50μM或光照时间不足20min时，通过PMA-qPCR法检测出的活细胞数量明显偏高，检测准度与实施例1对比明显降低，而PMA菌悬液体系终浓度为90μM或光照时间为25min时，通过PMA-qPCR法检测出的活细胞数量明显偏低，即在本申请中当光照时间为20min，PMA菌悬液体系终浓度在50-80μM时使用PMA-qPCR法检测才能取得准确的检测结果。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (1)

1.一种菌群的活菌定量方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
配制菌群：取样品溶解于0.9%NaCl溶液中，经过分析前处理仪及配套耗材处理去除残渣，得到菌群；
配制PMA母液：将PMA溶于ddH2O，获得浓度为2mM的PMA母液，PMA母液在-20℃条件下避光保存；
配制PMA菌悬液：取部分菌群，用含有0.05%L-半胱氨酸盐酸盐的PBS缓冲液梯度稀释100倍，加入PMA使体系终浓度为50μM，充分混匀得到PMA菌悬液；
PMA菌悬液处理：将得到PMA菌悬液在室温下避光孵育30min，然后将样品置于冰上，使用500w卤素灯距离20cm处光照20min，光照后在4℃条件下以5000r/min转速离心3-5min，使用试剂盒法提取基因组DNA，进行qPCR检测分析；所述的菌群的活菌定量方法，用途为对肠道菌群的活菌定量。
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