CN111518936A - 用于检测产毒铜绿微囊藻的荧光定量pcr方法及相应的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于检测产毒铜绿微囊藻的荧光定量PCR方法及相应的试剂盒。本发明巧妙的应用了特异性的基因检测区分铜绿微囊藻与其它微囊藻属，以及产毒和非产毒的铜绿微囊藻属，通过综合判断，得出准确的菌属信息。本发明与现有的主流检测试剂盒相比，本发明用于检测产毒铜绿微囊藻的试剂盒具有灵敏度高、快捷方便、特异型好、判断严谨准确等优势，具有良好的应用前景和市场价值。
Description
技术领域
本发明属于分子检测技术领域，具体涉及一种通过特异性基因对产毒铜绿微囊藻进行荧光定量PCR检测的方法和相应的检测试剂盒。
背景技术
“水华”是淡水中的一种自然生态现象，涉及到的藻类有蓝藻(即蓝细菌)、绿藻、硅藻等。自然形成的水华现象会很快消失，并不会带来环境影响。而人为的往水体中排放氮盐(主要是铵盐、硝酸盐和亚硝酸盐)和磷盐(主要是正磷酸盐和各种形态的磷酸盐)，使得淡水富营养化。当水中磷化物过高，会有利于蓝绿藻的生长。而当这些营养物超出环境容量和自净能力，会令“水华”频繁出现，面积逐年扩散，持续时间逐年延长。中国的太湖、滇池、巢湖、洪泽湖都有水华现象，这可能与含磷的清洁剂不断被排放到水体有关。“水华”造成的最大危害是：饮用水源受到威胁，藻类毒素通过食物链影响人类健康。例如蓝藻的次生代谢产物能损害肝脏，有致癌可能性。
微囊藻属(Microcystis)是蓝藻中一个很重要的类群。随着世界范围内水体富营养化的发展，微囊藻在世界各地不仅产生严重的“水华”，而且形成藻毒素及异味物质，直接影响水生态环境的安全，威胁人类的健康；因此关于微囊藻的研究备受关注，成为世界水环境问题的一个焦点。铜绿微囊藻是微囊藻属中的重要成员之一，它是一种出现在淡水中的蓝菌，携带微囊藻毒素的藻种会产生有害藻华，对水环境和人畜饮水安全造成严重危害，具有一定的生态学与经济重要性。铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)是在富营养化淡水中最主要的产毒素蓝菌藻华的来源，在自然水体中呈常态流行。温暖季节水温在28～32℃时，铜绿微囊藻繁殖快，生长旺盛，使水体呈灰绿色，形成水华，肉眼可见，其浮膜似铜绿色油漆，有臭味。
藻毒素对人类或动物造成严重的伤害，轻则导致中毒，重则诱发严重疾病而导致死亡。国内外已经报道了大量关于藻毒素中毒事件，引起科研工作者的广泛关注。因此，对蓝藻毒素进行定性定量检测在藻毒素危害的预防预警上尤为重要。数据库中海量的生物信息，为我们建立以基因为检测对象的快速、高效的检测方法提供了可能。在自然水体中，同一藻种的产毒藻株和非产毒藻株二者往往同时存在，且其种群动态变化规律存在时空差异，产毒藻群落组成及其动态变化直接影响到水体中藻毒素浓度。使用常规显微镜观察无法有效区分和鉴别产毒与非产毒两类藻细胞，而各种藻毒素合成酶基因的分离和功能研究，使我们可以利用PCR(polymerase chain reaction)技术、荧光定量PCR技术等分子生物学技术检测藻毒素合成的关键基因，进而检测铜绿微囊藻产毒情况。Mcy(microcystinsynthesis gene)基因是微囊藻毒素的合成酶基因，也是目前研究较多的藻类毒素合成基因。从基因的角度来定性检测水体中是否含有产毒能力的蓝藻存在，以及定量检测产毒蓝藻的含量，在藻毒素释放前，对其危害起到预警作用。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种用于检测产毒铜绿微囊藻的荧光定量PCR方法。
具体地，上述方法包括如下步骤：
S1、收集样品；
S2、提取基因组DNA；
S3、检测铜绿微囊藻属特异性基因rpoB、gene1以及产毒特异性基因gene2；
S4、读取扩增Ct值；当所述铜绿微囊藻属特异性基因中至少1个基因和所述产毒特异性基因的Ct值均小于35时，产毒铜绿微囊藻的检测结果为阳性；当所述铜绿微囊藻属特异性基因rpoB、gene1的Ct值大于35和/或所述产毒特异性基因gene2的Ct值大于35时，产毒铜绿微囊藻的检测结果为阴性。
作为一种优选技术方案，所述铜绿微囊藻属特异性基因rpoB(NCBI AccessionNumber：EU151907.1)的检测引物如SEQ ID NO:1～2所示：
SEQ ID NO:1(5'-TTCCCACGTCGATGCTAACC-3')；
SEQ ID NO:2(5'-GCGATTTCTCCTCCTTCGGT-3')。
所述铜绿微囊藻属特异性基因gene1(NCBI Accession Number：GCE61639.1)的检测引物如SEQ ID NO:3～4所示：
SEQ ID NO:3：(5'-GCGAGTATTAAAGCCGGGG-3')；
SEQ ID NO:4：(5'-TGTCTGAACCAGCACTCCTC-3')。
所述产毒特异性基因gene2(NCBI Accession Number：BAA83993.1)的检测引物如SEQ ID NO:5～6所示：
SEQ ID NO:5：(5'-CTAATGCTGCCAATACGCCG-3')；
SEQ ID NO:6：(5'-GGATGAGGACTGTATGCCCC-3')。
本发明另一目的是提供一种用于检测产毒铜绿微囊藻的荧光定量PCR试剂盒，其包含上述的铜绿微囊藻属特异性基因rpoB、gene1的检测引物和产毒特异性基因gene2的检测引物。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明通过前期对铜绿微囊藻属和其他微囊藻属，产毒和非产毒铜绿微囊藻属的微生物的大量研究数据中，挖掘出能够区分铜绿微囊藻属和其他微囊藻属，产毒和非产毒微囊藻属的特异性的孤儿基因，通过对特异性基因的检测，准确的判断出菌类样品和环境样品中是否含有产毒的铜绿微囊藻，具有前期大数据的挖掘和不同种属之间比对基础，选择的特异性基因具有物种和菌属的特异性。
(2)本发明中，通过对设计条件和实验条件的优化，选取针对于每个基因检测扩增条件处于最优化的引物作为检测引物，提高引物扩增的效率，能够达到稳定、高效、高灵敏度和重现性的检测引物，实现微量样品的正确检出。
(3)本发明检测方法与市面上其他的检测方法相比，本发明的两部分检测策略，能够分步判断铜绿微囊藻属和其他微囊藻属、产毒和非产毒微囊藻属，判断必须两项同时阳性检出才最终判断为产毒铜绿微囊藻，结果更加严谨和准确。
(4)本发明能够实现从10个阳性菌到10000个阳性菌的检测范围，灵敏度高，应用范围广，更高浓度的样品可以通过稀释折算同样被检测出来，检测结果稳定，具有很好的重现性。
(5)本发明检测方法能够应用于对于环境的水体样品、淤泥样品、水质抽检等各个领域来源样品筛查和检测，精准地判断出样品中是否含有产毒铜绿微囊藻，操作方便、快速、灵敏。本发明检测试剂盒能够应用于水产养殖，生活用水监控，食品安全等各个方面的快速检验，无需额外进行微生物培养，使基因检验在日常民生中得到应用，具有灵敏度高、操作性强、快速、高效等优点。
附图说明
图1是rpoB基因检测引物标准曲线。
图2的gene1基因检测引物标准曲线。
图3是gene2基因检测引物标准曲线。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例结合附图详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
本发明所用的以下试剂可通过常规途径购买得到。
表1
在一些实施方案中，使用扩增产物构建阳性标准品质粒，并进行引物的扩增标准曲线检测和绘制，得到每对检测引物的扩增效率，本发明所提供的引物序列其扩增效率和置信程度均在最优化的水平。
在一些实施方案中，通过对不同的阳性菌株检测特异性的基因，能够正确的区分出铜绿微囊藻属和其他微囊藻属，产毒和非产毒微囊藻属，从而准确检测并判断出产毒铜绿微囊藻。
在一些实施方案中，通过对10个、100个、1000个和10000个阳性菌进行提取和检测，能够精确区分出铜绿微囊藻属和其他微囊藻属，产毒和非产毒微囊藻属，从而准确检测并判断出产毒铜绿微囊藻。并且能够保证低至10个阳性菌仍然能够准确检出，而更高滴度的微生物样品可以通过稀释至检测区间，同样可以准确检出。
在一些实施方案中，采集湖水、湖水底泥、生活污水、过滤水的样品，通过对特异性基因的检测，能够快速和准确的检验出样品中是否含有产毒铜绿微囊藻，方便快捷。
本领域技术人员应能理解，本方法中检测的基因和设计的特异性引物，同样可以通过相同检测对象的其他区段的设计达到相应的检测目的。
本发明所描述的用于检测产毒铜绿微囊藻荧光定量PCR的方法及试剂盒可以广泛应用于水体监控、饮用水监控等多个检验检疫范畴，能够为日常民生提供方便、快捷、准确、高效的基于基因检测的监控产品。
实施例1检测引物扩增标准曲线
1.微囊藻属培养
使用BG11培养基培养微囊藻属，把商品化的BG11培养基浓缩液稀释500倍。培养的铜绿微囊藻到达生长稳定期时的藻细胞数可达9×106个/mL。选取处于生长旺盛的微生物样品进行后续的实验。。
2.基因组DNA提取
按照Qiagen的QIAamp DNA Mini Kit说明书指示进行基因组DNA的提取。
3.扩增产物标准品质粒制作
使用源自微囊藻属提取的DNA，分别以rpoB基因、gene1基因、gene2基因的引物进行扩增，扩增产物经过加A处理后，使用T4连接酶连入T载体，并且通过转导感受态细胞后，质粒得到大规模扩增。3个基因的引物序列如SEQ ID NO:1～6所示，具体如表2。
表2
4.质粒的提取和标准曲线梯度的配置
分别涂板扩增rpoB基因、gene1基因、gene2基因对应的引物扩增产物的标准品克隆菌，收集单克隆的菌斑，并通过LB培养摇菌过夜扩增，最后得到5ml指数生长期的质粒阳性菌株，按照QIAGEN Plasmid Midi Kit说明书指示进行质粒DNA的提取。提取后检测质粒DNA的浓度，并通过10倍稀释的方法，配置6个浓度梯度的标准品，浓度梯度分别为1μg/μL，100ng/μL，10ng/μL，1ng/μL，100pg/μL，10pg/μL。
5.检测引物标准曲线绘制
按照BioRad iQ SYBR Green SuperMix说明书指示进行浓度梯度标准曲线的qPCR扩增，并且绘制对应的扩增曲线，得到每对引物的扩增效率。每一个qPCR的反应设置3个生物学重复及3个技术重复，qPCR反应体系和扩增反应条件如表3所示。
表3
6.结果分析
检测引物扩增标准曲线结果显示，rpoB基因、gene1基因、gene2基因对应的引物均为经过优化的引物设计和反应体系。其中线性的标准曲线可信度R2>0.980，高扩增效率在90-105％，证明引物设计和反应体系是最优状态。分析3个基因的扩增曲线的相关性系数和可信度，以及多个浓度梯度下的扩增效率，均达到最优状态的要求，3对引物在该反应条件下能够满足检测要求。
表4
实施例2阳性及阴性样品检测情况
1.微囊藻属培养
同实施例1。
2.基因组DNA提取
同实施例1。
3.3个目标基因的qPCR检测
按照BioRad iQ SYBR Green SuperMix说明书指示进行样品的qPCR扩增，并且得到每对引物对应的Ct值读数。每一个qPCR的反应设置3个生物学重复及3个技术重复，qPCR反应体系和扩增反应条件如表5所示。
表5
4.结果分析
3对引物的qPCR扩增结果显示，铜绿微囊藻属呈现rpoB基因和/或gene1基因的阳性结果，而其他微囊藻属均显示阴性结果。因此，对于铜绿微囊藻属和其他微囊藻属，进行rpoB基因、gene1基因的检测，能够较好的区分铜绿微囊藻属和其他微囊藻属。同时，gene2基因的检测结果，产毒的铜绿微囊藻属呈现检测结果阳性，而其他非产毒铜绿微囊藻属和其他微囊藻属呈现阴性。因此，进行gene2基因的检测，能够较好的区分产毒和非产毒的微囊藻属。综上所述，rpoB基因、gene1基因的对应引物，能够满足微囊藻属中铜绿微囊藻属的检测判断，gene2基因的对应引物，能够满足产毒和非产毒微囊藻属的检测判断。
表6
实施例3检测体系的灵敏度
1.微生物培养
使用BG11作为铜绿微囊藻的培养基，把商品化的BG11培养基浓缩液稀释500倍。培养的铜绿微囊藻到达生长稳定期时的藻细胞数可达9×106个/mL。选取处于生长旺盛的微生物样品进行后续的实验，收集藻体后进行浓度计算，并且10稀释得到10个藻/ml，100个藻/ml，1000个藻/ml，和10000个藻/ml，对不同浓度梯度的菌液进行后续的DNA提取实验。
2.基因组DNA提取
同实施例1。
3.3个目标基因的qPCR检测
同实施例2。
4.结果分析
3对引物的qPCR扩增结果显示，从10个菌至10000个菌的范围内，铜绿微囊藻属呈现rpoB基因和gene1基因的一个或两个基因的阳性结果。因此，通过进行rpoB基因、gene1基因的检测，能够较好的达到从10个菌至10000个菌的范围内铜绿微囊藻属的检出。同时，从10个菌至10000个菌的范围内，gene2基因的检测结果，产毒的铜绿微囊藻属呈现检测结果阳性，而其他非产毒铜绿微囊藻属呈现阴性。因此，进行gene2基因的检测，能够较好的达到从10个菌至10000个菌的范围内产毒和非产毒的微囊藻属的检测和区分。综上所述，可以通过rpoB基因、gene1基因、gene2基因的搭配检测，较好的完成产毒铜绿微囊藻的检测，检测范围可以从10个菌株至10000个菌株，更高的菌株浓度也可以通过稀释的方法稀释至最佳检测范围内，能够达到预期的检测要求。
表7
实施例4环境样品的检测
1.环境样品收集和基因组DNA的提取
分别收集不同区域不同程度水华的湖水及对应的底泥，以及生活污水和过滤水，按照Qiagen的QIAamp DNA Mini Kit说明书指示进行基因组DNA的提取。
2.3个目标基因的qPCR检测
同实施例2。
3.结果分析
3对引物的qPCR扩增结果显示，除了个别湖水、底泥和过滤水样品外，其他样品均检出rpoB基因和gene1中的1个及以上阳性结果，证明相应的样品来源中含有铜绿微囊藻。只有部分的水华湖水和对应的底泥样品均检出gene2，证明对应的样品来源中含有产毒的铜绿微囊藻。最终判断为产毒铜绿微囊藻阳性的准则为，rpoB基因、gene1基因中的1个或2个检测得到Ct值小于35个循环，同时gene2基因检测得到Ct值小于35个循环。如果rpoB基因、gene1基因、均检测得到Ct值大于35个循环，或者，gene2基因检测得到Ct值大于35个循环，则判断为产毒铜绿微囊藻阴性未检出。
表8
以上实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 广州微芯生物科技有限公司
<120> 用于检测产毒铜绿微囊藻的荧光定量PCR方法及相应的试剂盒
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttcccacgtc gatgctaacc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcgatttctc ctccttcggt 20
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcgagtatta aagccgggg 19
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tgtctgaacc agcactcctc 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ctaatgctgc caatacgccg 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggatgaggac tgtatgcccc 20
Claims (5)
1.一种用于检测产毒铜绿微囊藻的荧光定量PCR方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、收集样品；
S2、提取基因组DNA；
S3、检测铜绿微囊藻属特异性基因rpoB、gene1，以及产毒特异性基因gene2；
S4、读取扩增Ct值；当所述铜绿微囊藻属特异性基因中至少1个基因和所述产毒特异性基因的Ct值均小于35时，产毒铜绿微囊藻的检测结果为阳性；当所述铜绿微囊藻属特异性基因rpoB、gene1的Ct值大于35和/或所述产毒特异性基因gene2的Ct值大于35时，产毒铜绿微囊藻的检测结果为阴性。
2.根据权利要求1所述的用于检测产毒铜绿微囊藻的荧光定量PCR方法，其特征在于，所述铜绿微囊藻属特异性基因rpoB的检测引物如SEQ ID NO:1～2所示。
3.根据权利要求1所述的用于检测产毒铜绿微囊藻的荧光定量PCR方法，其特征在于，所述铜绿微囊藻属特异性基因gene1的检测引物如SEQ ID NO:3～4所示。
4.根据权利要求1所述的用于检测产毒铜绿微囊藻的荧光定量PCR方法，其特征在于，所述产毒特异性基因gene2的检测引物如SEQ ID NO:5～6所示。
5.一种用于检测产毒铜绿微囊藻的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，包含权利要求2～4所述的铜绿微囊藻属特异性基因rpoB、gene1的检测引物和产毒特异性基因gene2的检测引物。
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2019
- 2019-09-02 CN CN201910847555.2A patent/CN111518936A/zh active Pending
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| PB01 | Publication | ||
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |