CN105039516A - 一种艰难梭状芽孢杆菌毒素基因的荧光pcr检测方法及其引物，以及试剂盒 - Google Patents

一种艰难梭状芽孢杆菌毒素基因的荧光pcr检测方法及其引物，以及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一种艰难梭状芽孢杆菌毒素基因的荧光PCR检测方法及其引物，以及试剂盒，本发明的基因引物具有相应的特异性能好，长度合适，转录高效，不会形成二级结构，引物自身少于连续4个碱基的互补，采用本发明引物测试的符合率高达98.6%，测灵敏度可以达到100copies/mL。本发明检测方法，能够简单方便地提取出标本中的艰难梭菌DNA，如粪便标本，并对艰难梭状芽孢杆菌毒素A和艰难梭状芽孢杆菌毒素B基因进行检测，该方法使用特异性的扩增引物和荧光探针，使得检测的灵敏度和特异性得到很大程度的增强，从而避免了抗体及培养检测方法特异性不足，避免了误测的问题。

Description

一种艰难梭状芽孢杆菌毒素基因的荧光PCR检测方法及其引物，以及试剂盒
技术领域
本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一种艰难梭状芽孢杆菌毒素基因的荧光PCR检测方法及其引物，以及试剂盒。
背景技术
艰难梭菌(Clostridiumdifficile)是梭菌属的一种专性厌氧菌，对氧十分敏感，很难分离培养，故而得名。该菌发现于1935年，但直到1977年发现本菌与临床长期使用某些抗生素(氨苄青霉素、头孢霉素、红霉素、氯林可霉素等)引起的伪膜性肠炎有关，方被重视。
艰难梭菌广泛分布于自然生境中，如土壤、干草、沙、一些大型动物(牛、驴和马)的粪便，及狗、猫、啮齿动物和人的粪便，除此之外还大量存在于水和动物的肠道中。婴儿的粪便中常含有艰难梭菌，为新生儿肠道中正常菌群，大约50％12月龄婴儿的肠道中有艰难梭菌，2岁以上儿童的带菌率大约为3％，但此菌在健康成人中出现频率较低，无症状带菌的成人在瑞典是1.9％，在日本为15.4％。
由于服用抗生素后，打破了肠内菌群的平衡，从而导致艰难梭菌累计了大量的数量，产生大量的外毒素A和B。外毒素A由肠道毒素和细胞毒素组成。外毒素可绑定黏膜细胞从而导致出血。而外毒素B是一种细胞毒素，在体内外毒素B不能与黏膜细胞直接绑定，因为外毒素B只能与破坏的细胞绑定，导致更大的破坏。大多数艰难梭菌种属都产生这两种毒素，从而在不同时期产生不同的作用，在初期外毒素A首先与黏膜细胞绑定，造成初级的破坏，然后外毒素B进而发挥更大的破坏。
基于Taqman探针法的一步法荧光定量实时PCR(RealtimeFluorescenceRT-PCR)可以快速、灵敏、特异地检出目的RNA片段，已经逐渐成为RNA病毒检测的一个重要发展方向。通过实时记录探针标记基团受激发产生的荧光，实现了对PCR扩增过程实时监测，无需电泳检测，有效减少了PCR产物的气溶胶污染和EB对环境的污染。而配合适当的buffer、引物、探针，可以使灵敏度达到低至10个以内拷贝的检测。
发明内容
本发明的第一个目的在于：提供一种艰难梭状芽孢杆菌毒素基因的荧光PCR检测方法的引物。
为了实现上述目的，本发明采用的方案如下：
一种艰难梭状芽孢杆菌毒素基因的荧光PCR检测方法的引物，所述的艰难梭状芽孢杆菌毒素包括艰难梭状芽孢杆菌毒素A和艰难梭状芽孢杆菌毒素B，所述艰难梭状芽孢杆菌毒素A基因的荧光PCR检测方法的上游引物核苷酸序列SEQIDNO.1，其下游引物核苷酸序列SEQIDNO.2，其荧光探针引物核苷酸序列SEQIDNO.3；
上游引物：tcdA-F：5’-GCAGTCGGATTGCAAGTAATTG-3’(SEQIDNO.1)；
下游引物：tcdA-R：5’-GTCTGCCAACCTTTTGAGATGAT-3’(SEQIDNO.2)；
荧光探针：tcdA-P：5’-VIC-ATTTCAATCCTGACACTGC-MGB-3’(SEQIDNO.3)
所述艰难梭状芽孢杆菌毒素B基因的荧光PCR检测方法的上游引物核苷酸序列SEQIDNO.4，其下游引物核苷酸序列SEQIDNO.5，其荧光探针引物核苷酸序列SEQIDNO.6；
上游引物：tcdB-F：5’-TGCAGCCAAAGTTGTTGAATTAGT-3’(SEQIDNO.4)；
下游引物：tcdB-R：5’-CTGCACCTAAACTTACACCATCTATAATAGT-3’(SEQIDNO.5)；
荧光探针：tcdB-P：5’-VIC-TCAACTGCATTAGATGAAA-MGB-3’(SEQIDNO.6)。
相对于现有技术，本发明的基因引物具有相应的特异性能好，长度合适，转录高效，不会形成二级结构，引物自身少于连续4个碱基的互补，采用本发明引物测试的符合率高达98.6％，测灵敏度可以达到100copies/mL。
本发明的第二个目的在于，提供一种艰难梭状芽孢杆菌毒素基因的荧光PCR检测方法，为实现本发明目的，采用以下技术方案，
本技术方案包括以下步骤，
S1、提取待测样本中的DNA，即标本DNA；
S2、以标本DNA为模板，使用艰难梭状芽孢杆菌毒素A基因的上游引物、下游引物、荧光探针引物进行PCR扩增；
和艰难梭状芽孢杆菌毒素B基因的上游引物、下游引物、荧光探针引物进行PCR扩增，
S3、对扩增产物分别进行荧光定量PCR检测；
S4、结果分析：反应结束后，根据待测样品的荧光循环阈值(Ct)判断待测样品是否为艰难梭状芽孢杆菌毒素A、艰难梭状芽孢杆菌毒素B阳性。
作为本发明一种艰难梭状芽孢杆菌毒素基因的荧光PCR检测方法的一种改进，所述的标本DNA提取，具体步骤为用棉拭子沾取适量艰难梭状芽孢杆菌核酸提取液，加入艰难梭状芽孢杆菌DNA提取液快速搅动4-5秒，振荡混匀，100度水浴10分钟，12000rpm离心5分钟。
作为本发明一种艰难梭状芽孢杆菌毒素基因的荧光PCR检测方法的一种改进，还包括阳性质控品的制备，以提取的艰难梭状芽孢杆菌阳性标本DNA为模版，进行扩增，将产物挑取进行TA克隆，其中PCR扩增使用AmpliTaq360MasterMix，按说明书推荐反应程序完成
具体为：反应后取5μlPCR扩增产物用2％的琼脂糖凝胶进行检测，将切胶纯化的PCR产物与载体连接，重组质粒涂布于培养皿上，转化感受态细胞，挑取阳性菌落抽提质粒，按比例稀释，作为荧光定量PCR检测的阳性质控品。
作为本发明一种艰难梭状芽孢杆菌毒素基因的荧光PCR检测方法的一种改进，所述的PCR扩增，具体为：
对于每个样本，需同时检测艰难梭状芽孢杆菌毒素A基因以及艰难梭状芽孢杆菌毒素B基因，即分别用艰难梭状芽孢杆菌毒素A基因反应液或艰难梭状芽孢杆菌毒素B基因反应液，加入混合的酶液(含1U/μL的Taq酶、1U/μL的UDG酶)1μL，然后加入阳性质控品DNA4μl；将各反应管放入定量PCR仪器的反应槽内，设置各检测的名称和荧光基团种类(target选择VIC，淬灭基团选择NFQ-MGB)，设定循环条件：50℃5分钟；95℃10分钟；95℃15秒，52℃30秒，63度60s(此步骤采集荧光信号)，各40个循环。
作为本发明一种艰难梭状芽孢杆菌毒素基因的荧光PCR检测方法的一种改进，所述艰难梭状芽孢杆菌毒素A基因反应液组成如下：艰难梭状芽孢杆菌毒素AqPCRMix20μl、聚合酶(Taq酶)和尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG酶)混合液1μl(含Taq酶和UDG酶各1U)，以及提取的标本DNA4μl；其中艰难梭状芽孢杆菌毒素AqPCRMix中还含有qPCR缓冲液、三磷酸脱氧尿甘(dUTP)；
所述的所述艰难梭状芽孢杆菌毒素B基因反应液组成如下：艰难梭状芽孢杆菌毒素AqPCRMix20μl、聚合酶(Taq酶)和尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG酶)混合液1μl(含Taq酶和UDG酶各1U)，以及提取的标本DNA4μl；其中艰难梭状芽孢杆菌毒素BqPCRMix中还含有qPCR缓冲液、三磷酸脱氧尿甘(dUTP)。
作为本发明一种艰难梭状芽孢杆菌毒素基因的荧光PCR检测方法的一种改进，所述的结果分析为
S1、设置基线：根据机型不同，设置3-15循环，6-15循环，特殊情况可对基线适当调整。
S2、设置阈值：以阈值线刚超过阴性对照扩增曲线(无规则的噪音线)的最高点。
S3、结果判断
阳性：检测样本Ct值小于等于35.0，且曲线有明显的指数增长期；
可疑：检测样本Ct值大于35.0且小于40.0，重复一次实验，如果Ct值仍小于40.0，且曲线有明显的指数增长期，为阳性，否则为阴性；
阴性：检测不到样本Ct值或Ct值为40。
相对于现有技术，本发明方法能够简单方便地提取出标本中的艰难梭菌DNA，如粪便标本，并对艰难梭状芽孢杆菌毒素A和艰难梭状芽孢杆菌毒素B基因进行检测，该方法使用特异性的扩增引物和荧光探针，使得检测的灵敏度和特异性得到很大程度的增强，从而避免了抗体及培养检测方法特异性不足，避免了误测的问题。
本发明的第三个发明目的在于，提供一种艰难梭状芽孢杆菌毒素基因的荧光PCR检测方法的试剂盒，
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案
该技术方案包括以下试剂
所述的TcdAqPCR缓冲液、TcdBqPCR(实时荧光定量核酸扩增检测系统)缓冲液先配制成浓度为2mol，含有以下成分：
64mMHEPES(pH7.8)(单一组成)、
8mMMgCl2、
100mMKCl
0.2mM甜菜碱
0.2mg/mL海藻糖
所述qPCR实时荧光定量核酸扩增检测系统组成为：
所述检测试剂盒的提取试剂的方案是，DNA提取液含有：
现对于现有技术本发明结果证实本试剂盒检测灵敏度可以达到100copies/mL，将该试剂盒检测出的阳性用传统的培养法进行鉴定，仅检出其中2/3的标本，由此，该荧光定量PCR的方法敏感度远远高于普通的方法。本发明选择确定核酸为阳性的沙门氏菌、志贺氏菌标本以及用life公司生产的艰难梭菌荧光定量PCR检测试剂盒(M105en_LyraDirectC.diffAssay，通过FDA认证)验证过的72例阴性标本，沙门氏菌、志贺氏菌检测结果均为阴性，72例标本仅一例(弱阳性)与life试剂盒(阴性)结果不符，符合率为98.6％。
附图说明
图1为本发明艰难梭状芽孢杆菌毒素A基因检测的敏感性实验图。
图2为本发明艰难梭状芽孢杆菌毒素B基因检测的敏感性实验图。
具体实施方式
下面将结合具体实施方式和说明书附图对本发明及其有益效果作进一步详细说明，但是，本发明的具体实施方式并不局限于此。
本发明具体实施方式如下：
1、特异性引物及探针的设计
2、根据从Genbank上检索到的艰难梭菌(C.diff)的核酸序列，设计用于检测艰难梭状芽孢杆菌毒素A和艰难梭状芽孢杆菌毒素B基因的引物和探针，其序列如下：
艰难梭状芽孢杆菌毒素A基因的
上游引物：tcdA-F：5’-GCAGTCGGATTGCAAGTAATTG-3’(SEQIDNO.1)；
下游引物：tcdA-R：5’-GTCTGCCAACCTTTTGAGATGAT-3’(SEQIDNO.2)；
荧光探针：tcdA-P：5’-VIC-ATTTCAATCCTGACACTGC-MGB-3’(SEQIDNO.3)
和
艰难梭状芽孢杆菌毒素B基因的
上游引物：tcdB-F：5’-TGCAGCCAAAGTTGTTGAATTAGT-3’(SEQIDNO.4)；
下游引物：tcdB-R：5’-CTGCACCTAAACTTACACCATCTATAATAGT-3’(SEQIDNO.5)；
荧光探针：tcdB-P：5’-VIC-TCAACTGCATTAGATGAAA-MGB-3’(SEQIDNO.6)
在lifetechnology公司合成如上的引物、探针；
3、标本采集和预处理
本方法及试剂盒适用标本类型包括腹泻病人的粪便(soft或liquid)。采集的标本应该尽快(2小时内)送检，或者保存于-20℃。
4、标本DNA提取
以如上所述艰难梭菌核酸提取液进行核酸提取，步骤为：
用棉拭子沾取适量样本，插入艰难梭状芽孢杆菌DNA提取液快速搅动4-5秒；
拧上盖子，振荡混匀，100度水浴10分钟；
12000rpm离心5分钟(使用sigma3K30冷冻高速离心机)。
5、阳性质控品的制备
以提取的艰难梭菌阳性标本DNA为模版，进行扩增，将产物挑取TA克隆，其中PCR扩增使用AmpliTaq360MasterMix，按说明书推荐反应程序完成。
反应后取5μlPCR扩增产物用2％的琼脂糖凝胶(购自promega)进行检测，将切胶纯化的PCR产物与载体连接，重组质粒涂布于培养皿上，转化感受态细胞，挑取阳性菌落抽提质粒(购自Qiagen)。按一定比例稀释，作为荧光定量PCR检测的阳性质控品。
6、荧光定量PCR扩增
对于每个样本，需同时检测TcdA以及TcdB基因，即分别用TcdA反应液或TcdB反应液，加入混合的酶液(含1U/μL的Taq酶、1U/μL的UDG酶)1μL，然后加入用上述方法提取好的的DNA4μl；同样按照上述体系设置阳性和阴性对照，加入阳性质控品或阴性质控品4μl进行扩增。
将各反应管放入定量PCR仪器(ABI7500)的反应槽内，设置各检测的名称和荧光基团种类(target选择VIC，淬灭基团选择NFQ-MGB)，设定循环条件：50℃5分钟；95℃10分钟；95℃15秒，52℃30秒，63度60s(此步骤采集荧光信号)，40个循环。
7、结果分析和判定
7.1结果分析条件设定
1)设置基线(baseline)：根据机型不同，设置3-15循环，6-15循环，特殊情况可对基线适当调整。
2)设置阈值(threshold):以阈值线刚超过阴性对照扩增曲线(无规则的噪音线)的最高点。
7.2结果判断
1)阳性：检测样本Ct值小于等于35.0，且曲线有明显的指数增长期；
2)可疑：检测样本Ct值大于35.0且小于40.0，重复一次实验，如果Ct值仍小于40.0，且曲线有明显的指数增长期，为阳性，否则为阴性；
3)阴性：检测不到样本Ct值或Ct值为40。
8、特异度实验
选择确定核酸为阳性的沙门氏菌、志贺氏菌标本以及用life公司生产的艰难梭菌荧光定量PCR检测试剂盒(M105en_LyraDirectC.diffAssay，通过FDA认证)验证过的72例阴性及阳性标本，沙门氏菌、志贺氏菌、C型魏氏梭菌检测结果均为阴性，72例临床标本仅一例(弱阳性)与life试剂盒(阴性)结果不符，符合率为98.6％。
9、敏感度实验
选择标定好的标准品，
TcdA基因检测的敏感性实验，见图1，TcdB基因检测的敏感性实验，见图2。分别将滴定好的标准品稀释成1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102拷贝/μl进行扩增。
结果证实本试剂盒检测灵敏度可以达到100copies/mL，将该试剂盒检测出的阳性用传统的培养法进行鉴定，仅检出其中2/3的标本，由此，该荧光定量PCR的方法敏感度远远高于普通的方法。

Claims (8)

1.一种艰难梭状芽孢杆菌毒素基因的荧光PCR检测方法的引物，其特征在于：
所述的艰难梭状芽孢杆菌毒素包括艰难梭状芽孢杆菌毒素A和艰难梭状芽孢杆菌毒素B，所述艰难梭状芽孢杆菌毒素A基因的荧光PCR检测方法的上游引物核苷酸序列SEQIDNO.1，其下游引物核苷酸序列SEQIDNO.2，其荧光探针引物核苷酸序列SEQIDNO.3；
所述艰难梭状芽孢杆菌毒素B基因的荧光PCR检测方法的上游引物核苷酸序列SEQIDNO.4，其下游引物核苷酸序列SEQIDNO.5，其荧光探针引物核苷酸序列SEQIDNO.6。
2.一种艰难梭状芽孢杆菌毒素基因的荧光PCR检测方法，其特征在于：包括以下步骤，
S1、提取待测样本中的DNA，即标本DNA；
S2、以标本DNA为模板，使用艰难梭状芽孢杆菌毒素A基因的上游引物、下游引物、荧光探针引物进行PCR扩增；
和艰难梭状芽孢杆菌毒素B基因的上游引物、下游引物、荧光探针引物进行PCR扩增，
S3、对扩增产物分别进行荧光定量PCR检测；
S4、结果分析：反应结束后，根据待测样品的荧光循环阈值(Ct)判断待测样品是否为艰难梭状芽孢杆菌毒素A、艰难梭状芽孢杆菌毒素B阳性。
3.根据权利要求2所述的一种艰难梭状芽孢杆菌毒素基因的荧光PCR检测方法，其特征在于：所述的标本DNA提取，具体步骤为用棉拭子沾取适量艰难梭状芽孢杆菌核酸提取液，加入艰难梭状芽孢杆菌DNA提取液快速搅动4-5秒，振荡混匀，100度水浴10分钟，12000rpm离心5分钟。
4.根据权利要求2所述的一种艰难梭状芽孢杆菌毒素基因的荧光PCR检测方法，其特征在于：还包括阳性质控品的制备，以提取的艰难梭状芽孢杆菌阳性标本DNA为模版，进行扩增，将产物挑取进行TA克隆，
具体为：反应后取5μlPCR扩增产物用2％的琼脂糖凝胶进行检测，将切胶纯化的PCR产物与载体连接，重组质粒涂布于培养皿上，转化感受态细胞，挑取阳性菌落抽提质粒，按比例稀释，作为荧光定量PCR检测的阳性质控品。
5.根据权利要求4所述的一种艰难梭状芽孢杆菌毒素基因的荧光PCR检测方法，其特征在于：所述的PCR扩增，具体为：
对于每个样本，需同时检测艰难梭状芽孢杆菌毒素A基因以及艰难梭状芽孢杆菌毒素B基因，即分别用艰难梭状芽孢杆菌毒素A基因反应液或艰难梭状芽孢杆菌毒素B基因反应液，加入混合的酶液(含1U/μL的Taq酶、1U/μL的UDG酶)1μL，然后加入阳性质控品DNA4μl；将各反应管放入定量PCR仪器的反应槽内，设置各检测的名称和荧光基团种类(target选择VIC，淬灭基团选择NFQ-MGB)，设定循环条件：50℃5分钟；95℃10分钟；95℃15秒，52℃30秒，63度60s(此步骤采集荧光信号)，各40个循环。
6.根据权利要求5所述的一种艰难梭状芽孢杆菌毒素基因的荧光PCR检测方法，其特征在于：所述艰难梭状芽孢杆菌毒素A基因反应液组成如下：艰难梭状芽孢杆菌毒素AqPCRMix20μl、聚合酶(Taq酶)和尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG酶)混合液1μl(含Taq酶和UDG酶各1U)，以及提取的标本DNA4μl；其中艰难梭状芽孢杆菌毒素AqPCRMix中还含有qPCR缓冲液、三磷酸脱氧尿甘(dUTP)；
所述的所述艰难梭状芽孢杆菌毒素B基因反应液组成如下：艰难梭状芽孢杆菌毒素AqPCRMix20μl、聚合酶(Taq酶)和尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG酶)混合液1μl(含Taq酶和UDG酶各1U)，以及提取的标本DNA4μl；其中艰难梭状芽孢杆菌毒素BqPCRMix中还含有qPCR缓冲液、三磷酸脱氧尿甘(dUTP)。
7.根据权利要求6所述的一种艰难梭状芽孢杆菌毒素基因的荧光PCR检测方法，其特征在于：所述的结果分析为
S1、设置基线：根据机型不同，设置3-15循环，6-15循环，特殊情况可对基线适当调整。
S2、设置阈值(Ct值)：以阈值线刚超过阴性对照扩增曲线(无规则的噪音线)的最高点。
S3、结果判断
阳性：检测样本Ct值小于等于35.0，且曲线有明显的指数增长期；
可疑：检测样本Ct值大于35.0且小于40.0，重复一次实验，如果Ct值仍小于40.0，且曲线有明显的指数增长期，为阳性，否则为阴性；
阴性：检测不到样本Ct值或Ct值为40。
8.一种艰难梭状芽孢杆菌毒素基因的荧光PCR检测方法的试剂盒，其特征在于：包括以下试剂
TcdAqPCR缓冲液、TcdBqPCR(实时荧光定量核酸扩增检测系统)缓冲液先配制成浓度为2mol，含有以下成分：
64mMHEPES(pH7.8)(单一组成)、
8mMMgCl2、
100mMKCl
0.2mM甜菜碱
0.2mg/mL海藻糖
所述qPCR实时荧光定量核酸扩增检测系统组成为：
脱氧核糖核苷酸dUTPs(10mMdATP、dCTP、dGTP，20mMdUTP)0.7μl
ddH2O补足20μl
所述检测试剂盒的提取试剂的方案是，DNA提取液含有：
调节PH为8。
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