CN112048454B - 一种用于评价浆水质量的微生物组合物、试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种用于评价浆水质量的微生物组合物、试剂盒及方法。本发明具体公开了利用qPCR技术快速检测浆水中标志性微生物并进行质量评估的应用，通过灰度关联分析模型来整合高通量测序结果的绝对OUT数目与理化指标pH，获取综合评分方程。构建标准曲线，结合综合评分方程后对浆水的优劣进行评价，该方法具有检测准确率高，特异性强、成本低，检测方便，速度快的优点，彻底解决了平板计数法无法直接评价浆水质量且评价结果不准确的缺陷，可以广泛用于浆水的安全性及等级评估。
Description
技术领域
本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种用于评价浆水质量的微生物组合物、试剂盒及方法。
背景技术
浆水是中国北方(如：甘肃，宁夏，山西和河南等)最受欢迎和常见的一种发酵食品，它有3000多年的悠久历史，夏季和秋季经常在家中生产和食用，可用多种蔬菜制成，例如白菜，芹菜和萝卜等。其独特的风味和丰富的营养使其成为解渴和降温的绝佳选择。而且，研究证明，浆水有益于消化，降低胆固醇和降低血压，使其适合日常食用。
作为一种发酵食品，浆水的口味和品质与氨基酸，各种有机酸和碳水化合物等代谢产物有关，而这些都与浆水中的微生物密不可分。然而，一方面，浆水在家庭水平上产生导致彼此不同，甚至包含一些病原细菌(大肠杆菌(E.coli))。另一方面，特别是生产过程中微生物评估的质量控制严重滞后，这对人们的健康和食品安全构成潜在威胁。因此，迫切需要建立一种高效且快速的技术来检测浆水中的微生物并结合关键理化指标来进行质量评估。
现有技术一般通过检测微生物的含量来评估浆水的质量，其中常用平板计数法，但是平板计数法耗时、分辨率低、且只能间接评定，并不能精准量化。定量PCR由于其快速，准确的功能而在食品质量控制研究中发挥着重要作用，也成为了目前最常用的方法之一。但是，不同的发酵食品含有不同的微生物。同样，与泡菜、酸菜等其他发酵蔬菜食品不同，浆水是天然发酵的蔬菜食品，它不需要盐以及各种调味料，形成了其独特的酸味和特殊的微生物多样性和组成，因此单独的定量PCR检测在用于浆水质量的评价过程中也仅仅只是更准确的获得浆水中微生物的含量，依据不同微生物的含量确定浆水的质量，并不能准确、科学的评定浆水质量。
浆水中含量较多的微生物主要包括乳杆菌、醋酸杆菌、大肠杆菌、小球菌、念珠菌，孢子皮癣、棘孢菌等。本发明选择益生菌中的乳杆菌属、醋酸杆菌属以及有害细菌大肠杆菌属为浆水质量评定的微生物组合物，并通过利用qPCR技术快速检测浆水中标志性微生物并进行质量评估的应用，通过灰度关联分析模型来整合高通量测序结果的绝对OUT数目与理化指标pH，获取综合评分方程。构建标准曲线，结合综合评分方程后对浆水的优劣进行评价，该方法具有检测准确率高，特异性强、成本低，检测方便，速度快的优点，彻底解决了平板计数法无法直接评价浆水质量且评价结果不准确的缺陷，可以广泛用于浆水的安全性及等级评估。
发明内容
针对上述技术问题，本发明的目的在于提供一种用于评价浆水质量的微生物组合物，所述微生物组合物包括选自大肠杆菌属中的任一种、乳杆菌属中的任一种、醋酸杆菌属中的任一种。
本发明的另一目的在于提供一种用于评价浆水质量的试剂盒，所述试剂盒包括测定所述微生物组合物的量化试剂和标准曲线。
优选地，所述量化试剂包括qPCR扩增引物对，所述PCR扩增引物对用于qPCR扩增获得所述微生物组合物中的每一组分的循环数Ct值。
优选地，所述量化试剂为qPCR定量试剂。
优选地，所述qPCR定量试剂包括扩增引物对，所述扩增引物对包括如SEQ ID NO：1-2所示引物对、SEQ ID NO：3-4所示引物对、SEQ ID NO：5-6所示引物对、SEQ ID NO：7-8所示引物对、SEQ ID NO：9-10所示引物对、SEQ ID NO：11-12所示引物对和SEQ ID NO：13-14所示引物对中的至少一对，如SEQ ID NO：15-16所示引物对、SEQ ID NO：17-18所示引物对、SEQ ID NO：19-20所示引物对、SEQ ID NO：21-22所示引物对中的至少一对，如SEQ ID NO：23-24所示引物对、SEQ ID NO：25-26所示引物对、SEQ ID NO：27-28所示引物对、SEQ IDNO：29-30所示引物对、SEQ ID NO：31-32所示引物对、SEQ ID NO：33-34所示引物对和SEQID NO：35-36所示引物对中的至少一对。
优选地，所述标准曲线分别根据所述微生物组合物的标准菌菌落数CFU和扩增循环数Ct值绘制。
本发明的另一目的在于提供一种快速评价浆水质量的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)根据标准菌菌落数CFU和扩增循环数Ct值分别绘制标准曲线，所述标准菌包括大肠杆菌属任一种菌、乳杆菌属任一种菌和醋酸杆菌属任一种菌；
(2)分别获得待测浆水中微生物组合物中每一组分的qPCR扩增循环数Ct值，所述微生物组合物包括选自大肠杆菌属中的任一种菌、乳杆菌属中的任一种菌、醋酸杆菌属中的任一种菌；
(3)分别将步骤(2)所得的Ct值代入到步骤(1)所述对应的标准曲线中，计算获得微生物组合物中每一组分的菌落数CFU；
(4)根据下式①-③获得的微生物组合物中每一组分的相对菌落数：
式① Lactobacillus＝XLc-Xs1，
式② Acetobacter＝Xaab-Xs2，
式③ Enterobacter＝XEc-Xs3；
所述Xs1＝4(log(CFU/mL))，所述Xs2＝3(log(CFU/mL))，所述Xs3＝3(log(CFU/mL))；所述XLc为检测获得的乳杆菌属的菌落数CFU，所述Xaab为检测获得的醋酸杆菌属的菌落数CFU，所述XEc为检测获得的大肠杆菌属的菌落数CFU；
(5)将上式①-③代入综合评分公式④计算获得待测浆水的质量评分：
式④ Z＝a×Lactobacillus+b×Acetobacter+c×Enterobacter；
所述a、b、c根据灰色关联分析法分析获得；其中，所述评分越高表示待测浆水的质量越好。
优选地，所述步骤(1)中的标准菌为大肠杆菌(Escherichia coli DH5α)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)和醋酸杆菌(Acetobacterpasteurianus)。
优选地，所述步骤(2)中qPCR扩增涉及的扩增引物对包括如SEQ ID NO：1-2所示引物对、SEQ ID NO：3-4所示引物对、SEQ ID NO：5-6所示引物对、SEQ ID NO：7-8所示引物对、SEQ ID NO：9-10所示引物对、SEQ ID NO：11-12所示引物对和SEQ ID NO：13-14所示引物对中的至少一对，如SEQ ID NO：15-16所示引物对、SEQ ID NO：17-18所示引物对、SEQ ID NO：19-20所示引物对、SEQ ID NO：21-22所示引物对中的至少一对，如SEQ ID NO：23-24所示引物对、SEQ ID NO：25-26所示引物对、SEQ ID NO：27-28所示引物对、SEQ ID NO：29-30所示引物对、SEQ ID NO：31-32所示引物对、SEQ ID NO：33-34所示引物对和SEQ ID NO：35-36所示引物对中的至少一对。
优选地，所述步骤还包括根据下式⑤计算获得待测浆水的相对pH值，并根据下式⑥计算获得待测浆水的质量评分：
式⑤ pH＝-[XpH-(Xs4+Xs5)/2]；
式⑥ Z＝a×Lactobacillus+b×Acetobacter+c×Enterobacter+d×pH；
所述Xs4＝3，所述Xs5＝5；所述XpH为待测浆水的pH值；所述a、b、c、d根据灰色关联分析法分析获得，其中，所述评分越高表示待测浆水的质量越好。
优选地，所述式⑥为：Z＝0.2220×Lactobacillus+0.2043×Acetobacter+0.2192×Enterobacter+0.2239×pH。
本发明的有益效果是：本发明选择益生菌中的乳杆菌属、醋酸杆菌属以及有害细菌大肠杆菌属为浆水质量评定的微生物组合物，公开了利用qPCR技术快速检测浆水中标志性微生物并进行质量评估的应用，通过灰度关联分析模型来整合高通量测序结果的绝对OUT数目与理化指标pH，获取综合评分方程。构建标准曲线，结合综合评分方程后对浆水的优劣进行评价，该方法具有检测准确率高，特异性强、成本低，检测方便，速度快的优点，彻底解决了平板计数法无法直接评价浆水质量且评价结果不准确的缺陷，可以广泛用于浆水的安全性及等级评估。
具体实施方式
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。但本发明的保护范围并不局限于以下实施例所述。
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。
术语“量化”是指量化样本中的特定核酸序列的量的能力，用于测定目标核酸序列的量的分子生物学方法包括但不限于终点PCR、竞争PCR、逆转录酶PCR(PT-PCR)、定量PCR(qPCR)、逆转录酶qPCR(RT-qPCR)、PCR-ELISA、DNA微阵列等。
术语“量化水平”可以是浓度(每单位体积的DNA量)，每细胞数量的DNA量，循环值(Ct值)。在以下一个优选的实施例中，所述细菌序列的量化通过qPCR进行；在以下一个更优选的实施例中，所述细菌序列的定量是通过qPCR进行，且量化等级是Ct值。Ct值是指每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的qPCR循环数。Ct水平与样本中的目标核酸的量化成反比，即，Ct水平越低，样本中目标核酸的量越大。
样本中目标核酸序列丰度的定量可以是绝对或相对的。相对定量是基于一个或多个内部参照基因，即来自参照菌株的16S rRNA基因，如使用通用引物测定总细菌数并将该目标核酸序列的丰度表达为细菌百分比；绝对定量通过与DNA标准比较得到目标分子的确切数目。
术语“引物对”是指可在扩增方法例如聚合酶链式反应(PCR)中使用以扩增核苷酸序列的寡核苷酸。引物对是基于特定目标序列的多核苷酸序列对。
实施例1一种快速检测浆水中微生物含量的试剂盒
一种快速检测浆水中微生物含量的试剂盒，所述试剂盒包括测定所述微生物组合物的量化试剂和标准曲线，所述微生物组合物包括选自大肠杆菌属中的任一种、选自乳杆菌属中的任一种，选自醋酸杆菌属中的任一种；所述量化试剂优选为qPCR定量试剂，包括用于扩增微生物组合物任一组分的引物对：
所述扩增乳杆菌的引物对可以为下述任一对：
(1)上游序列5’-GCAGCAGTAGGGAATCTTCCA-3’(SEQ ID NO:1)，
下游序列5’-GCATTCCACCGCTACACATG-3’(SEQ ID NO:2)；
(2)上游序列5'-AGCAGTAGGGAATCTTCCA-3’(SEQ ID NO:3)，
下游序列5'-ATTYCACCGCTACACATG-3'(SEQ ID NO:4)；
(3)上游序列5’-GTTAATACCTTTGCTCATTGA-3’(SEQ ID NO:5)，
下游序列5’-ACCAGGGTATCTAATCCTGTT-3’(SEQ ID NO:6)；
(4)上游序列5’-TCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGA-3’(SEQ ID NO:7)，
下游序列5’-TCGAATTAAACCACATGCTCCA-3’(SEQ ID NO:8)；
(5)上游序列5’-AGAACACCAGTGGCGAAGG-3’(SEQ ID NO:9)，
下游序列5’-CAGGCGGAGTGCTTAATGC-3’(SEQ ID NO:10)；
(6)上游序列5’-AGAACACCAGTGGCGAAGG-3’(SEQ ID NO:11)，
下游序列5’-CAGGCGGAGTGCTTAATGC-3’(SEQ ID NO:12)；
(7)上游序列5’-TGGAAACAGRTGCTAATACCG-3(SEQ ID NO:13)，
下游序列5’-GTCCATTGTGGAAGATTCCC-3’(SEQ ID NO:14)。
所述扩增醋酸杆菌的引物对可以为下述任一对：
(8)上游序列5’-CGCAAGGGACCTCTAACACA-3(SEQ ID NO:15)，
下游序列5’-ACCTGATGGCAACTAAAGATAGGG-3’(SEQ ID NO:16)；
(9)上游序列5'-TCAAGTCCTCATGGCCCTTATG-3’(SEQ ID NO:17)，
下游序列5'-TACACACGTGCTACAATGGCG-3'(SEQ ID NO:18)；
(10)上游序列5’-TGAGAGGATGATCAGCCACACT-3’(SEQ ID NO:19)，
下游序列5’-TCACACACGCGGCATTG-3’(SEQ ID NO:20)；
(11)上游序列5’-GCTGGCGGCATGCTTAACACAT-3’(SEQ ID NO:21)，
下游序列5’-GGAGGTGATCCAGCCGCAGGT-3’(SEQ ID NO:22)。
所述扩增大肠杆菌的引物对可以为下述任一对：
(12)上游序列5’-GGTGCTCGTGCTGATATGAGTA-3’(SEQ ID NO:23)，
下游序列5’-GCCCAATAACCTAATGCTCCTTC-3’(SEQ ID NO:24)；
(13)上游序列5'-ATGGCTGTCGTCAGCTCGT-3’(SEQ ID NO:25)，
下游序列5'-CCTACTTCTTTTGCAACCCACTC-3'(SEQ ID NO:26)；
(14)上游序列5’-GTTAATACCTTTGCTCATTGA-3’(SEQ ID NO:27)，
下游序列5’-ACCAGGGTATCTAATCCTGTT-3’(SEQ ID NO:28)；
(15)上游序列5’-ATGGAATTTCGCCGATTTTGC-3’(SEQ ID NO:29)，
下游序列5’-ATTGTTTGCCTCCCTGCTGC-3’(SEQ ID NO:30)；
(16)上游序列5’-CATGCCGCGTGTATGAAGAA-3’(SEQ ID NO:31)，
下游序列5’-CGGGTAACGTCAATGAGCAAA-3’(SEQ ID NO:32)；
(17)上游序列5’-GTATGTCCAATCGAAACCCCT-3’(SEQ ID NO:33)，
下游序列5’-GGTAGTGAATTTCGTCAGTTACA-3’(SEQ ID NO:34)；
(18)上游序列5’-CAACGAACTGAACTGGCAGA-3’(SEQ ID NO:35)，
下游序列5’-CATTACGCTGCGATGGAT-3’(SEQ ID NO:36)。
所述标准曲线分别根据所述微生物组合物的标准菌菌落数CFU和扩增循环数Ct值绘制。
为了检测方便，所述试剂盒还包括DNA提取试剂，用于提取浆水的基因组DNA。
实施例2一种快速评价浆水质量的方法
(1)方法1
1.标准曲线的构建
(1)选择Escherichia coli DH5α,Lactobacillus plantarum和Acetobacterpasteurianus作为大肠杆菌，乳酸菌，和醋酸菌的标准菌株，分别在LB液体培养基，MRS液体培养基，GYC液体培养基中震荡培养24-48h，温度为37℃，37℃，30℃。培养结束时分别在伊红美蓝培养基，MRS固体培养基，GYC固体培养基恒温培养48h后，取3mL菌悬液，以10倍梯度稀释8个梯度，进行平板计数，获得不同浓度菌悬液中的菌落数(CFU值)；
(2)分别取上述菌悬液3mL，提取基因组DNA，提取步骤如下：
取菌悬液3mL，10,000rpm离心1min，尽量吸净上清；
加入110μL缓冲液(20mM Tris,pH 8.0；2mM Na2-EDTA；1.2％Triton)，和70μL溶菌酶溶液(50mg/ml)，37℃处理30min以上；加入4μLRNase A(100mg/ml)溶液，振荡15sec，室温放置5min。
向管中加入20μLProteinase K溶液，混匀；
加入220μL缓冲液GB，振荡15sec，70℃放置10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠；
加220μL无水乙醇，充分振荡混匀15sec，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠；
将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中；
向吸附柱中加入500μL缓冲液GD，12,000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中；
向吸附柱中加入600μL漂洗液PW，12,000rpm离心30sec，倒掉废液，吸附柱放入收集管中；重复操作；
将吸附柱放回收集管中，12,000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；
将吸附柱转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μL洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12,000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中；
基因组DNA用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行完整性验证，然后用Nanodrop 2000测定浓度，保存在-20℃。
(3)将所述基因组DNA以10倍梯度稀释8个梯度，按照10μL的体系进行qPCR实验，具体操作如下：
溶解2×SuperReal PreMix Plus，50×ROX Reference Dye，模板，引物和RNase-Free ddH2O，并将所有试剂在室温下平衡并彻底混匀；
置于冰上进行Real Time PCR反应液的配制，反应体系：2×SuperReal PreMixPlus为1×，正向引物为0.3μM，反向引物为0.3μM，DNA模板为梯度稀释样本，50×ROXReference Dye，加RNase-free ddH2O至10μL。
反应条件如下：95℃预变性15min，PCR反应40个循环95℃变性10/15sec，58℃/62℃退火25/60sec，72℃延伸30/0sec，熔解曲线分析(95℃15sec，58℃60sec，95℃15sec)；
盖上反应管，轻柔混匀。可短暂离心，确保所有组分均在管底；将反应体系置于荧光定量PCR仪中，开始反应，获得循环数(Ct值)。
(4)标准曲线绘制：将(3)中所得循环数(Ct值)与(1)中相应的CFU值对应，构建标准曲线，获得换算标准曲线的方程等式6，并按照E＝10(-1/slope)-1计算扩增效率。
2.定量PCR检测待测浆水中大肠杆菌、乳杆菌、醋酸杆菌的循环数
取待测浆水1mL，分别在伊红美蓝培养基，MRS固体培养基，GYC固体培养基上恒温培养48h，获得菌悬液；
取菌悬液3mL，按照上述(2)中所述方法提取DNA，基因组DNA用2.5％琼脂糖凝胶电泳进行完整性验证，然后用Nanodrop 2000测定浓度，保存在-20℃；
所述DNA用RNase-Free ddH2O稀释至10-100倍，按照上述(3)所述步骤进行定量PCR，获得循环数(Ct值)，所述扩增引物如实施例1所述；
3.获得待测浆水中大肠杆菌、乳杆菌、醋酸杆菌的相对菌落数
将所述Ct值分别代入上述(4)绘制的标准曲线中，获得大肠杆菌属、乳杆菌属、醋酸杆菌属相对的菌落数CFU；
根据下式①-③对获得的菌落数CFU和pH进行转换：
式① Lactobacillus＝XLc-Xs1，
式② Acetobacter＝Xaab-Xs2，
式③ Enterobacter＝XEc-Xs3；
其中，所述Xs1为乳杆菌属的标准菌落数，所述XLc为检测获得的乳杆菌属的菌落数CFU；所述Xs2为醋酸杆菌属的标准菌落数，所述Xaab为检测获得的醋酸杆菌属的菌落数CFU；所述Xs3为大肠杆菌属的标准菌落数，所述XEc为检测获得的大肠杆菌属的菌落数CFU；所述Xs1＝4(log(CFU/mL))，所述Xs2＝3(log(CFU/mL))，所述Xs3＝3(log(CFU/mL))。
4.浆水质量评价计算公式
根据上述结果，得到综合评估方程④，计算获得浆水质量评分：
式④ Z＝a×Lactobacillus+b×Acetobacter+c×Enterobacter，
所述综合评分方程④中的的系数a、b、c由灰色关联分析法分析获得，具体如下：
首先根据式⑦对数据进行无量纲处理：
式⑦ 
然后根据式⑧和式⑨对计算灰色关联系数：
式⑧ 
其中k＝1,…,m；ρ∈(0,1)。
式⑨ 
然后根据式⑩计算相关相关系数矩阵：
式⑩ 
(2)方法2
在上述方法1的基础上，为了提高评价结果的准确度，在综合评价过程中加入pH评价因素，具体如下：
检测获得待测浆水的pH值，根据下式⑤获得相对pH值：
式⑤ pH＝-[XpH-(Xs4+Xs5)/2]，
其中所述Xs4与Xs5为pH值标准值，所述XpH为待测浆水的pH值，所述Xs4＝3，所述Xs5＝5。
根据综合评分方程⑥，计算获得浆水质量评分
式⑥ Z＝a×Lactobacillus+b×Acetobacter+c×Enterobacter+d×pH，
所述综合评分方程⑥中的的系数a、b、c、d由灰色关联分析法分析获得，具体如下：
首先根据式⑦对数据进行无量纲处理：
式⑦ 
然后根据式⑧和式⑨对计算灰色关联系数：
式⑧ 
其中k＝1,…,m；ρ∈(0,1)。
式⑨ 
然后根据式⑩计算相关相关系数矩阵：
式⑩ 
最后计算相关系数平均值作为指标的权重，得到上式⑥中的系数a、b、c和d，得到综合评分方程如下：
Z＝0.2220×Lactobacillus+0.2043×Acetobacter+0.2192×Enterobacter+0.2239×pH。
根据综合评分方程的计算结果，Z值越高，浆水质量越好。并可根据Z值对待测浆水的质量进行分级。
实施例3待测浆水的质量评定
市售购买6份浆水，编号为J1-J6，分别检测每份浆水的pH值；
各取上述浆水5mL，按照实施例2中所述方法提取基因组DNA，基因组DNA用2％琼脂糖凝胶电泳进行完整性验证，然后用Nanodrop 2000测定浓度，保存在-20℃；
根据实施例2所述方法进行定量PCR，获得循环数(Ct值)；
将所述Ct值分别代入实施例2制备的标准曲线，获得相对的CFU数值即菌落数，所述菌落数计算结果如下表1所示：
表1菌落数计算结果
| 项目 | J1 | J2 | J3 | J4 | J5 | J6 |
| AAB(logCFU) | 5.4340 | 5.2932 | 5.3639 | 5.2908 | 6.5304 | 5.0264 |
| Lc(logCFU) | 6.3734 | 5.8416 | 6.4779 | 6.1177 | 6.5064 | 5.1180 |
| Ec(logCFU) | 0 | 0 | 1.5732 | 0 | 0 | 0 |
| pH | 3.73 | 3.58 | 4.19 | 3.42 | 3.35 | 4.27 |
依据实施例2所述的公式①-③和⑤，进行数据转换，结果如下表2所示：
表2数据转换结果
| 项目 | J1 | J2 | J3 | J4 | J5 | J5 |
| Acetobacter | 2.3734 | 1.8416 | 2.4779 | 2.1177 | 2.5064 | 1.1180 |
| Lactobacillus | 2.4340 | 2.2932 | 2.3639 | 2.2908 | 3.5304 | 2.0264 |
| Enterobacter | 1.0000 | 1.0000 | 0.5732 | 1.0000 | 1.0000 | 1.0000 |
| pH | 0.2700 | 0.4200 | -0.1900 | 0.5800 | 0.6500 | -0.2700 |
依据实施例2所述的综合评分方程⑥，计算Z值，并根据Z值进行浆水质量的评价，结果如下表3所示：
表3浆水质量综合评分结果
| 结果 | J1 | J2 | J3 | J4 | J5 | J6 |
| 评分(Z值) | 1.3039 | 1.1906 | 1.1162 | 1.2872 | 1.6425 | 0.8210 |
选择益生菌中的乳杆菌属、醋酸杆菌属以及有害细菌大肠杆菌属为浆水质量评定的微生物组合物，通过灰度关联分析模型来整合高通量测序结果的绝对OUT数目与理化指标pH，获取综合评分方程。根据综合评分方程获得浆水的质量评分，浆水评分(Z值)越高，表示浆水的质量越好，可根据获得的Z值对浆水质量进行分级。
以上所述仅为本发明的个别示范性实施案例的细节，对于本领域的技术人员来说，本发明在实际应用过程中根据具体的制备条件可以有各种更改和变化，并不用于限制本发明。凡在本发明的精神和原则之内，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 兰州大学
<120> 一种用于评价浆水质量的微生物组合物、试剂盒及方法
<160> 36
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcagcagtag ggaatcttcc a 21
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcattccacc gctacacatg 20
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agcagtaggg aatcttcca 19
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
attycaccgc tacacatg 18
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gttaatacct ttgctcattg a 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
accagggtat ctaatcctgt t 21
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cattacgctg cgatggat 18
Claims (5)
1.一种快速评价浆水质量的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)根据标准菌菌落数CFU和扩增循环数Ct值分别绘制标准曲线，所述标准菌包括大肠杆菌属任一种菌、乳杆菌属任一种菌和醋酸杆菌属任一种菌；
(2)分别获得待测浆水中微生物组合物中每一组分的qPCR扩增循环数Ct值，所述微生物组合物包括选自大肠杆菌属中的任一种菌、乳杆菌属中的任一种菌、醋酸杆菌属中的任一种菌；
(3)分别将步骤(2)所得的Ct值代入到步骤(1)所述对应的标准曲线中，计算获得微生物组合物中每一组分的菌落数CFU；
(4)根据下式①-③获得的微生物组合物中每一组分的相对菌落数：
式①Lactobacillus＝XLc-Xs1，
式②Acetobacter＝Xaab-Xs2，
式③Enterobacter＝XEc-Xs3；
所述Xs1＝4(log(CFU/mL))，所述Xs2＝3(log(CFU/mL))，所述Xs3＝3(log(CFU/mL))；所述XLc为检测获得的乳杆菌属的菌落数CFU，所述Xaab为检测获得的醋酸杆菌属的菌落数CFU，所述XEc为检测获得的大肠杆菌属的菌落数CFU；
(5)将上式①-③代入综合评分公式④计算获得待测浆水的质量评分：
式④Z＝a×Lactobacillus+b×Acetobacter+c×Enterobacter；
所述a、b、c根据灰色关联分析法分析获得；其中，所述评分越高表示待测浆水的质量越好。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的标准菌为大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)和醋酸杆菌Acetobacterpasteuri anus。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中qPCR扩增涉及的扩增引物对包括如SEQ ID NO：1-2所示引物对、SEQ ID NO：3-4所示引物对、SEQ ID NO：5-6所示引物对、SEQ ID NO：7-8所示引物对、SEQ ID NO：9-10所示引物对和SEQ ID NO：13-14所示引物对中的至少一对，如SEQ ID NO：15-16所示引物对、SEQ ID NO：17-18所示引物对、SEQ IDNO：19-20所示引物对、SEQ ID NO：21-22所示引物对中的至少一对，如SEQ ID NO：23-24所示引物对、SEQ ID NO：25-26所示引物对、SEQ ID NO：29-30所示引物对、SEQ ID NO：31-32所示引物对、SEQ ID NO：33-34所示引物对和SEQID NO：35-36所示引物对中的至少一对。
4.如权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，所述步骤还包括：根据下式⑤计算获得待测浆水的相对pH值，并根据下式⑥计算获得待测浆水的质量评分：
式⑤pH＝-[XpH-(Xs4+Xs5)/2]；
式⑥Z＝a×Lactobacillus+b×Acetobacter+c×Enterobacter+d×pH；
所述Xs4＝3，所述Xs5＝5；所述XpH为待测浆水的pH值；所述a、b、c、d根据灰色关联分析法分析获得，其中，所述评分越高表示待测浆水的质量越好。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述式⑥为：Z＝0.2220×Lactobacillus+0.2043×Acetobacter+0.2192×Enterobacter+0.2239×pH。
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