CN113373247B - 一种快速、同时检测食品中大肠杆菌o157:h7和鼠伤寒沙门氏菌的方法 - Google Patents

一种快速、同时检测食品中大肠杆菌o157:h7和鼠伤寒沙门氏菌的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种快速、同时检测食品中大肠杆菌O157:H7和鼠伤寒沙门氏菌的方法，以待检测食品样本为模板直接进行扩增，利用ddPCR同时检测食品中的大肠杆菌O157:H7和鼠伤寒沙门氏菌；待检测食品样本中菌液浓度换算公式为cfu/mL=copies/μL×20μL/加样量×1000μL。相比现有技术，本发明所述方法省略了DNA的提取步骤，直接以细菌为模板进行ddPCR检测，提高了食品中致病菌检测的效率；并且通过实验数据证实，直接加入完整的细菌而非提取的DNA也能够具有很强的抗干扰能力和极高的灵敏度。

Description

一种快速、同时检测食品中大肠杆菌O157:H7和鼠伤寒沙门氏 菌的方法
技术领域
本发明属于微生物检测技术领域，特别涉及一种快速、同时检测食品中大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)O157:H7和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)的方法。
背景技术
微滴式数字聚合酶链式反应技术(droplet digital polymerase chainreaction,dd PCR)，又称为“第三代PCR技术”，是一种能够对目标核酸进行定性定量的新型检测方法。ddPCR技术可分为三个步骤：微滴的生成、微滴PCR扩增、微滴荧光信号判读。首先将带有荧光标记的样品反应体系进行稀释，通过液滴生成卡生成上万个油包水的微小液滴，每个液滴中至少包含一个待检核酸分子，或者不存在待检核酸分子；在PCR反应过程中，每一个微滴可以视为一个独立的反应体系进行PCR扩增，可以将待检核酸分子的信号值放大，PCR扩增结束后，利用微滴分析仪对每个微滴进行逐一检测，有荧光信号的判读为“1”，无荧光信号的判读为“0”，代表目标核酸的存在与否。最后，基于泊松分布原理和阳性微滴的比例，便可以计算出待检核酸分子的起始拷贝数，从而实现对原始反应体系中核酸靶分子数的绝对定量。
相比于传统的PCR技术和qPCR技术，ddPCR的检测不需要标准品，能够直接建立阳性微滴与原始浓度之间的函数关系，从而实现对目标核酸的绝对定量。与此同时，通过对样品的有限稀释和微滴化处理，能够有效降低背景DNA的干扰，提高检测的灵敏度和抗干扰性。
近年来，ddPCR的应用也在不断扩大，包括检测各类病原体、监测食品安全和水质、鉴别食源性成分掺假、转基因成分的检测和评估等等。在食源性致病菌检测领域，目前利用ddPCR技术进行检测的方法包括：细菌培养、设计特异性荧光PCR引物、人工污染食品样本、DNA提取与分离，以及ddPCR的检测等步骤。该方法需要从食品中提取致病菌DNA，在细菌DNA的提取过程中，会造成基因片段的断裂和部分基因的损失，不仅检测时间长、效率低，而且对于低浓度致病菌的检测，会影响检出结果的精确度；另外，该方法需要用高浓度的致病菌纯培养物人工污染食品样本，经过人工富集步骤后再提取DNA，无法直接对低浓度的污染样本直接进行取样。
因此，如何能够利用ddPCR技术快速、准确的检测食品中的致病菌，进一步提高检测精度，是目前急需解决的问题。
发明内容
为解决现有技术中的上述问题，本发明的目的在于简化ddPCR食源性致病菌的检测步骤、提高检测精度，提供一种快速、同时检测食品中大肠杆菌O157:H7和鼠伤寒沙门氏菌的方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种快速、同时检测食品中大肠杆菌O157:H7和鼠伤寒沙门氏菌的方法，其中，以待检测食品样本为模板直接进行扩增，利用ddPCR同时检测食品中的大肠杆菌O157:H7和鼠伤寒沙门氏菌；
所述待检测食品样本为经过离心或浸泡处理后，提取获得的待测食品中的菌体样本；
待检测食品样本中菌液浓度换算公式为cfu/mL＝copies/μL×20μL/加样量×1000μL。
进一步的，所述ddPCR中的扩增体系为：
Figure BDA0002958813000000021
进一步的，对目标菌为大肠杆菌O157:H7的引物对为：
上游引物：5’-GCACTAAAAGCTTGGAGCAGTTC-3’；
下游引物：5’-AACAATGGGTCAGCGGTAAGGCTA-3’；
FAM通道探针：5’-FAM-CGTTGGCGAGGACC-BHQ1-3’；
VIC通道探针：5’-VIC-CGTTGGCGAGGACC-BHQ1-3’。
进一步的，对目标菌为鼠伤寒沙门氏菌的引物对为：
上游引物：5’-GCTTTCTCTACTTAACAGTGCTC-3’；
下游引物：5’-CAGTGCGATCAGGAAATCAAC-3’；
FAM通道探针：
5’-FAM-CCTGAATTACTGATTCTGGTACTAATGGTGATG-BHQ1-3’；
VIC通道探针：
5’-VIC-CCTGAATTACTGATTCTGGTACTAATGGTGATG-BHQ1-3’。
进一步的，所述ddPCR的反应程序为：
(1)微滴生成：通过微滴发生器进行滴化处理，生成微滴；
(2)PCR扩增程序为：预变性10min,95℃；95℃20s变性，60℃25s退火,72℃60s延伸，40个循环；98℃10min热失活；4℃保存。
进一步的，所述食品包括苹果汁、牛奶和鸡肉。当待测样品中致病菌含量低于检测限时，可在检测前对待检测食品样本进行浓缩处理，从而提高检测的准确度。
本发明相比现有技术的有益效果为：
1、本发明所述方法省略了DNA的提取步骤，直接以细菌为模板进行ddPCR检测，提高了食品中致病菌检测的效率；并且通过实验数据证实，直接加入完整的细菌而非提取的DNA，也不会受到其它背景菌的干扰，即使在较高背景菌存在的情况下，依然能够具有很强的抗干扰能力和极高的灵敏度；
2、本发明所述方法利用ddPCR基因拷贝数推断出的细菌浓度，这与平板计数法所得结果基本一致，但ddPCR所用时间仅为3-5h，大大缩短了检测时间；
3、利用本发明所述方法检测苹果汁、鲜牛奶和鸡肉表面致病菌——大肠杆菌O157:H7和鼠伤寒沙门氏菌，检测范围在106cfu/mL—102cfu/mL之间，准确性较高。
附图说明
图1为qPCR和ddPCR梯度稀释大肠杆菌O157:H7和鼠伤寒沙门氏菌直接检测完整细胞灵敏度的比较结果图；
图2为不同背景条件下利用ddPCR单独检测大肠杆菌O157:H7细胞纯培养物的比较结果图；
图3为不同背景条件下利用ddPCR单独检测鼠伤寒沙门氏菌细胞纯培养物的比较结果图；
图4为ddPCR单独检测苹果汁、鲜牛奶中大肠杆菌O157:H7和鼠伤寒沙门氏菌的结果图；
图5为利用本发明所述方法双通道同时检测大肠杆菌O157:H7和鼠伤寒沙门氏菌的结果图；
图6为本发明所述完整细菌ddPCR检测与DNA提取ddPCR检测E.coli O157:H7、Salmonella typhimurium的比较结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐释本发明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限值本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件是实验方法，通常按照常规条件中的条件，或按照制造厂商的建议条件，实施例中涉及的菌株均属于现有技术，本领域的技术人员可很容易的从公开的商业渠道获取。
细菌培养和计数：分别将E.coli O157:H7、E.coli DH5α、E.coli MG1655、E.coliAW1.7、鼠伤寒沙门氏菌接种在25mL LB肉汤中(37℃，200r/min)过夜培养16-18h，并进行平板计数确定菌悬液浓度
引物探针设计：针对E.coli O157:H7，选择其独有的遗传标志性基因Z3276设计引物和探针；针对鼠伤寒沙门氏菌，选择invA基因设计引物和探针，分别利用荧光PCR和ddPCR，通过直接加入不同浓度菌悬液的方法检验探针特异性和仪器灵敏度。
Figure BDA0002958813000000041
实施例1
本实施例比较了qPCR和ddPCR两种方法检测菌悬液中大肠杆菌O157:H7和鼠伤寒沙门氏菌的检测灵敏度，以及不同背景菌条件下的检测准确度。
ddPCR反应体系及条件：ddPCR扩增体系配制如下：
Figure BDA0002958813000000051
为了避免液滴转移过程中产生气泡，每个样品孔中加入22μL反应体系。配制好的反应体系移至微滴生成卡中，加70μL微滴生成专用油，在微滴生成器中将微滴生成卡中的样品生成微滴。取40μL生成的样品微滴至96孔板中，封膜。在PCR仪中进行扩增。扩增程序为：预变性10min，95℃；95℃20s变性，60℃25s退火，72℃60s延伸，40个循环；98℃10min热失活；4℃保存。升温速度2℃/s。扩增结束，将96孔板放置在微滴读取仪中读数。
推算菌液浓度换算公式为cfu/mL＝copies/μL×20μL/加样量×1000μL。
菌悬液中致病菌的检测：首先以10倍梯度稀释菌悬液，将单一菌株以不同浓度(108cfu/mL～102cfu/mL)单独接入ddPCR反应体系中，确定检出范围和最低检出限。然后，将2种目标菌株同时接入一个反应体系中，进行双通道检测(FAM/VIC)，同时检测两种目标菌，观察检出范围、灵敏度和最低检出限有无变化。
如图1所示，qPCR针对E.coli O157:H7ORF Z3276区域扩增所得的结果，稀释梯度为108～102cfu/mL，未污染的纯培养液作为阴性对照(a)。ddPCR针对E.coli O157:H7在相同条件下扩增所得的结果(b)。qPCR针对Salmonella typhimuriuminvA区域扩增所得的结果，稀释梯度为109cfu/mL～103cfu/mL，未污染的纯培养液作为阴性对照(c)。ddPCR针对Salmonella typhimurium在相同条件下扩增所得的结果(d)。
通过上述结果可知，qPCR的Ct值超过35时细胞浓度低于106cfu/mL已无法检测到，但ddPCR可以检测到102cfu/mL～103cfu/mL。
高浓度背景菌存在下，菌悬液中致病菌的检测：在FAM单通道检测中，将105cfu/mL的E.coli DH5α和E.coli MG1655作为背景菌，E.coli O157:H7以10倍浓度梯度与背景菌混合，使其终浓度为108cfu/mL—102cfu/mL左右，背景菌浓度始终保持在105cfu/mL。进行ddPCR检测。在FAM/VIC双通道检测中，将105cfu/mL的E.coli DH5α、E.coli MG1655、E.coliAW1.7作为背景菌，E.coli O157:H7和Salmonella typhimurium以10倍浓度梯度与背景菌混合，使其终浓度为108cfu/mL—102cfu/mL左右，观察在高背景菌株干扰的情况下，检出范围、灵敏度和最低检出限有无变化。
如图2，ddPCR单独检测E.coli O157:H7细胞纯培养物(a)。在其他E.coli存在的情况下，ddPCR单独检测E.coli O157:H7细胞纯培养物，体系中同时存在的Escherichia coli有E.coli MG1655、E.coli DH5α、E.coli O157:H7(b)。在Salmonella typhimurium存在的情况下ddPCR对E.coli O157:H7de的检测情况(c)。在Salmonella typhimurium和其他Escherichia coli存在的情况下ddPCR对E.coli O157:H7的检测情况，体系中同时存在E.coli MG1655、E.coli DH5α、E.coli AW1.7、E.coli O157:H7、Salmonella typhimurium(d)。图中，黑色柱状为平板计数，灰色柱状为Escherichia coli为背景菌时ddPCR拷贝数推算浓度，黑白条柱状为Salmonella typhimurium存在时ddPCR拷贝数推算浓度。
通过上述结果可知，在有Escherichia coli为背景菌的情况下，背景菌的种类和浓度不会影响ddPCR对E.coli O157:H7计数的准确性(a,b)；在有Salmonella typhimurium为背景菌的情况下，当Salmonella typhimurium的细胞计数低于102cfu/mL时，从ddPCR检测到E.coli O157:H7拷贝数高于平板计数(c,d)。
如图3，ddPCR单独检测Salmonella typhimurium细胞纯培养物(a)。在Escherichia coli存在的情况下，ddPCR单独检测Salmonella typhimurium(b)。在Salmonella typhimurium和其他Escherichia coli存在的情况下ddPCR对Salmonellatyphimurium的检测情况，体系中同时存在E.coli MG1655、E.coli DH5α、E.coli AW1.7、E.coli O157:H7和Salmonella typhimurium。图中，黑色柱状为平板计数，灰色柱状为ddPCR拷贝数推算浓度。
通过上述结果可知：当Salmonella typhimurium的细胞计数低于102cfu/mL时，从ddPCR检测到拷贝数高于平板计数，且背景菌越复杂，误差越大。
实施例2
本实施例为测定苹果汁中大肠杆菌O157:H7和鼠伤寒沙门氏菌的检出限，取不同浓度梯度的致病菌100μL，加入到900μLNFC苹果汁中进行人工污染，使得苹果汁中致病菌的最终浓度梯度为106cfu/mL～102cfu/mL，将苹果汁离心(12000rpm，15min)，弃上清，用1mLPW溶液重悬，取2μL作为DNA模板进行如实施例1所述的ddPCR检测。
图4中，(a)ddPCR单独检测苹果汁中的E.coli O157:H7，(b)Salmonellatyphimurium；图中，黑色柱状为平板计数，灰色柱状为ddPCR对E.coli O157:H7拷贝数推算浓度，斜条纹柱状为ddPCR对Salmonella typhimurium拷贝数推算浓度。结果为，E.coliO157:H7在苹果汁中的最低检出限为102cfu/mL～103cfu/mL，且与平板计数结果一致；Salmonella typhimurium在苹果汁中的最低检出限为102cfu/mL～103cfu/mL，但拷贝数要高于平板计数。
图5中，双通道同时检测苹果汁中Salmonella typhimurium和E.coli O157:H7时，苹果汁中的FAM通道E.coli O157:H7的拷贝数(a)和VIC通道Salmonella typhimurium的拷贝数(b)。图中，黑色柱状为平板计数，灰色柱状为FAM通道E.coli O157:H7拷贝数推算浓度，斜条纹柱状为VIC通道Salmonella typhimurium拷贝数推算浓度。得到的结论是，E.coli O157:H7在鲜牛奶中的最低检出限为102cfu/mL～103cfu/mL，但拷贝数要高于平板计数；Salmonella typhimurium在鲜牛奶中的最低检出限为102cfu/mL～103cfu/mL，但拷贝数要高于平板计数。
实施例3
本实施例为测定巴氏杀菌鲜牛奶中大肠杆菌O157:H7和鼠伤寒沙门氏菌的检出限：取不同浓度梯度的致病菌100μL，加入到900μL牛奶中进行人工污染，使得牛奶中致病菌的最终浓度梯度为106cfu/mL～102cfu/mL，将牛奶离心(12000rpm，15min)，弃上层脂肪层，用无菌棉棒擦拭管壁上残留的蛋白，并用1mLPW溶液冲洗管壁2～3次，待管壁无蛋白残留，重新用1m LPW溶液重悬，取2μL作为DNA模板进行如实施例1所示的ddPCR检测。
图4中，(c)ddPCR单独检测鲜牛奶中的E.coli O157:H7和(d)Salmonellatyphimurium；图中，黑色柱状为平板计数，灰色柱状为ddPCR对E.coli O157:H7拷贝数推算浓度，斜条纹柱状为ddPCR对Salmonella typhimurium拷贝数推算浓度。结果为，E.coliO157:H7在鲜牛奶中的最低检出限为102cfu/mL～103cfu/mL，且与平板计数结果一致；Salmonella typhimurium在鲜牛奶中的最低检出限为102cfu/mL～103cfu/mL，但拷贝数要高于平板计数。
图5中，双通道同时检测鲜牛奶中Salmonella typhimurium和E.coli O157:H7时，鲜牛奶中的FAM通道E.coli O157:H7的拷贝数(c)和VIC通道Salmonella typhimurium的拷贝数(d)。图中，黑色柱状为平板计数，灰色柱状为FAM通道E.coli O157:H7拷贝数推算浓度，斜条纹柱状为VIC通道Salmonella typhimurium拷贝数推算浓度。得到的结论是，E.coli O157:H7在鲜牛奶中的最低检出限为102cfu/mL～103cfu/mL，但拷贝数要高于平板计数；Salmonella typhimurium在鲜牛奶中的最低检出限为102cfu/mL～103cfu/mL，但拷贝数要高于平板计数。
实施例4
本实施例为测定鸡肉块表面的大肠杆菌O157:H7和鼠伤寒沙门氏菌的检出限：在无菌环境下，将鸡肉分割为质量为0.2000g～0.4000g左右的长方体，分别记录重量，依次浸入到108cfu/mL～103cfu/mL的菌悬液中，停留2～3s后取出，放入含有1mLPW溶液的EP管中，涡旋振荡5～10s，取出肉块。取2μL重悬液作为DNA模板进行实施例1所示的ddPCR检测。
如下表所示，ddPCR单独或同时检测鸡肉表面E.coli O157:H7和Salmonellatyphimurium的灵敏度和检出限，用10倍梯度稀释的细菌纯培养物人工污染的鸡肉样品(每块鸡肉约为一个长方体，重量为0.2g～0.4g)。
Figure BDA0002958813000000081
**ddPCR未检出或者与背景信号一致
单独检测E.coli O157:H7时，最低检出限为103cfu/g～104cfu/g，ddPCR结果高于平板计数；单独检测或Salmonella typhimurium时，最低检出限为103cfu/g～104cfu/g，ddPCR结果与平板计数一致。同时检测E.coli O157:H7和Salmonella typhimurium时，E.coli O157:H7检出限升高，为104cfu/g，且拷贝数低于平板计数；Salmonellatyphimurium检出限不变，为103cfu/g～104cfu/g，ddPCR结果高于平板计数。
实施例5
本实施例对比了纯培养物中完整细菌ddPCR和DNA提取ddPCR两种方法，检测其中E.coli O157:H7和Salmonella typhimurium。
(1)将两种细菌的纯培养物过夜培养后，首先利用平板计数法对菌悬液中的细菌浓度进行准确计数。
(2)利用DNA提取试剂盒Invitrogen PureLink Genomic DNA Mini Kit(Fisher)对两种致病菌的DNA进行提取纯化，试剂盒具体操作步骤如下：
(3)取1mL细菌纯培养物离心后弃上清液，将细菌沉淀重悬于180微升PureLink基因组消化缓冲液中(
Figure BDA0002958813000000091
Genomic Digestion Buffer)。加入20微升蛋白酶K(随试剂盒提供)溶解细胞。通过短暂涡流充分混合，放入55℃烘箱中孵育30min-4h，直到溶液变得清澈视为裂解完成。向裂解液中加入20微升RNase A(随试剂盒提供)，通过短暂涡旋充分混合，并在室温下孵育2分钟。加入200微升PureLink基因组裂解/结合缓冲液(GenomicLysis/Binding Buffer)，通过涡旋充分混合，获得均质溶液。向裂解液中加入200微升96–100％乙醇。涡旋5秒，充分混合，得到均匀的溶液。
(4)从包装中取出收集管中的纯链接旋转柱。将用PureLink基因组裂解/结合缓冲液和乙醇制备的裂解液(～640微升)加入PureLink旋转柱。室温下以10000×g离心1分钟。丢弃收集管，并将旋转柱放入套件附带的干净的PureLink收集管中。向柱中加入用乙醇制备的500微升洗涤缓冲液1。室温下以10000×g离心1分钟。丢弃收集管，并将旋转柱放入套件附带的干净PureLink收集管中。向柱中加入用乙醇制备的500微升洗涤缓冲液2，室温下以最大速度离心柱3分钟。丢弃收集管。
(5)将旋转柱置于1.5毫升无菌微量离心管中。向柱中加入200微升PureLink基因组洗脱缓冲液。室温孵育1分钟。室温下以最大速度离心色谱柱1分钟。试管含有纯化的基因组DNA。室温下，以最大速度离心柱1.5分钟。将试管中的DNA转移至1.5mL EP管于-20℃保存待用。
分别以提取后的DNA和完整细菌的菌悬液作为样品模板，进行如实施例1所述的ddPCR，得到的结果如图6所示，完整细菌ddPCR检测E.coli O157:H7(a)，Salmonellatyphimurium(b)；DNA提取ddPCR检测E.coli O157:H7(c)，Salmonella typhimurium(d)。
得到的结论为：免提DNA的方法相比于DNA提取方法，液滴的分层会出现一定程度的下雨现象，但不影响阳性液滴的判读和分布，也不影响ddPCR的准确性，且相比于DNA提取，直接的细菌ddPCR方法假阳性出现的概率更小。

Claims (2)

1.一种快速、同时检测食品中大肠杆菌O157:H7和鼠伤寒沙门氏菌的方法，其特征在于，以待检测食品样本为模板直接进行扩增，利用ddPCR同时检测食品中的大肠杆菌O157:H7和鼠伤寒沙门氏菌；
待检测食品样本中菌液浓度换算公式为cfu/mL=copies/μL×20μL/加样量×1000μL；
所述ddPCR中的扩增体系为：
试剂 体积 浓度
2×ddPCR Supermix for Probes 10.4μL
上游引物 1μL 10μM
下游引物 1μL 10μM
引物探针 0.5μL 10μM
样品模板 2μL
PCR级去离子水 补足体系至20μL；
对目标菌为大肠杆菌O157:H7的引物对为：
上游引物：5’ -GCACTAAAAGCTTGGAGCAGTTC-3’；
下游引物：5’ -AACAATGGGTCAGCGGTAAGGCTA-3’；
FAM通道探针：5’ -FAM-CGTTGGCGAGGACC-BHQ1-3’；
VIC通道探针：5’ -VIC-CGTTGGCGAGGACC-BHQ1-3’；
对目标菌为鼠伤寒沙门氏菌的引物对为：
上游引物：5’ -GCTTTCTCTACTTAACAGTGCTC-3’；
下游引物：5’ -CAGTGCGATCAGGAAATCAAC-3’；
FAM通道探针：
5’ -FAM-CCTGAATTACTGATTCTGGTACTAATGGTGATG-BHQ1-3’；
VIC通道探针：
5’ -VIC-CCTGAATTACTGATTCTGGTACTAATGGTGATG-BHQ1-3’；
所述食品包括苹果汁、牛奶和鸡肉。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述ddPCR的反应程序为：
（1）微滴生成：通过微滴发生器进行滴化处理，生成微滴；
（2）PCR扩增程序为：预变性10 min,95℃；95℃20s变性，60℃25s退火,72℃60s延伸，40个循环；98℃10 min热失活；4℃保存。
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