CN104178574A - 一种直接对脐血、羊水或外周血进行扩增的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种直接对脐血、羊水或外周血进行扩增的方法。以脐血样本、羊水样本或外周血样本作为起始材料，不进行DNA提取，加入核酸扩增所需反应体系，直接进行PCR扩增，测定扩增产物；其中所述的反应体系中含有中性盐、Tris溶液、镁离子、扩增引物、dNTP混合物以及扩增用酶。本发明所提供的PCR扩增方法，不经过核酸的分离和提取过程，不经过任何核酸扩增前预处理步骤，直接从脐血、羊水或外周血中高效扩增目的核酸片段或全基因组核酸。本发明在产前基因诊断及染色体病快速诊断中具有很大的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于基因工程与产前诊断领域，涉及一种直接对脐血、羊水或外周血进行扩增的方法。
背景技术
在产前诊断中，高危、高龄以及具有不良孕产史、遗传病家族史的孕妇来说，羊膜腔穿刺结合胎儿染色体核型分析和脐带穿刺结合脐血染色体核型分析是全世界最经典的诊断方法，但该方法需经过细胞培养富集特定的胎儿细胞，非常耗时耗力，病人等待报告的周期长。因此，临床上需要不经过细胞培养直接进行遗传病诊断的方法，如全基因组测序技术、比较基因组杂交技术(arrayCGH)，但相对于检测方法所需样本量来说，羊水及脐血中胎儿遗传物质较少，需要对遗传物质进行放大。另外，遗传病诊断前需对家系中的先症者或父母双方进行致病位点的寻找及确定，因此常抽取家系成员的外周血进行分析，同样需要对遗传物质进行扩增。聚合酶链式反应(PCR)技术是一种有效的体外扩增目的基因技术，它能在短时间内将少量的胎儿遗传物质进行扩增放大，即将靶DNA扩增百万倍，直接或者与其它技术结合后用于基因诊断和染色体病诊断。但一般步骤是从1‐3ml脐血样本或外周血样本、10‐20ml羊水样本中提取DNA后，再进行PCR扩增，DNA提取的方法有酚氯仿法、尿素法、柱提取法等，提取过程中通常要用到一些特定的试剂和复杂的步骤，尽管现在一些商品化的DNA纯化试剂盒大大地简化了这个过程，但仍然费时、费力，难于自动化，费用也增高，同时也容易产生核酸之间的交叉污染，更重要的是羊水以及血液样品中可能存在的各种致病菌，甚至病毒等，对操作人员的健康会造成很大的威胁。当孕妇由于多种原因，如羊水量少、脐带位置不好或胎儿不配合，导致获取的脐血或羊水样本量少，或者由于新生儿抽血困难获得血量较少等，这种提取DNA后再扩增的方法更是不方便或不可行。如不经DNA提取直接利用脐血、羊水或外周血进行扩增，可大大节约实验时间和检测成本，也可避免样本间的交叉污染，将会有很广阔的应用前景。
由于体液中存在一些成分干扰了细胞的裂解，抑制了DNA聚合酶的活性，因此给直接运用脐血、羊水或外周血进行PCR扩增带来了难度，另外，脐血或外 周血中的抗凝剂也影响PCR扩增。Al‐soud研究小组发现血液中对PCR扩增的主要抑制物质是免疫球蛋白G(IgG)【Al‐Soud WA,Jonsson LJ,Radstrom P.Identification and characterization of immunoglobulin G in blood as a major inhibitor of diagnostic PCR.J Clin Microbiol,2000,38:345‐50】，将纯化的IgG(PIgG)与模板DNA一起加热后发现PCR扩增受到阻碍。之后研究又发现红细胞中的血红蛋白和白细胞中的乳铁蛋白也是人血细胞中的两种主要的PCR抑制剂【Al‐Soud WA,Radstrom P.Purification and characterization of PCR‐inhibitory components in blood cells.J Clin Microbiol 2001；39:485‐93.】。抑制剂与基因组DNA之间的相互作用阻止了DNA聚合酶与DNA模板之间的结合和延伸反应的发生，影响了PCR的扩增，给直接利用脐血或外周血进行PCR扩增带来了难度。
本研究小组曾提出了不经过核酸提取，直接对羊水进行高温处理后加入HpH buffer中进行扩增用于快速诊断脊肌萎缩症【黄欢等，羊水直接PCR法快速诊断脊肌萎缩症的实验研究，现代生物医学进展，2013，13(25):6845‐7】，其中HpH buffer的成分为高pH值的Tris‐HCl溶液(pH 8.81‐9.90)【Huang et al,Direct polymerase chain reaction(PCR)from human whole blood and filter‐paper‐dried blood by using a PCR buffer with a higher pH,Analytical Biochemistry,2008,375,370‐372】。羊水中含有的蛋白质样本经过高温变性，空间结构发生变化而导致溶解度降低，沉淀，另外，高温处理羊水使得羊水中的胎儿细胞破裂，DNA释放入溶液中参与PCR扩增。但该方法也存在一些缺点，如需在PCR扩增前对羊水进行开盖离心，去上清后，高温处理，之后再次开盖取处理后的羊水样本加入HpH buffer中，虽然与羊水DNA提取相比简化了扩增前处理步骤，节省了成本，但仍然存在反复开盖产生污染的风险，也同样存在一些扩增前处理的操作步骤。然而，羊水不经过高温处理直接加入HpH buffer中却无法实现有效的扩增。
发明内容
本发明的目的是提供一种直接对脐血、羊水或外周血进行扩增的方法。
本方法的目的是通过下列技术措施实现的：
一种直接对脐血、羊水或外周血进行扩增的方法，以脐血、羊水或外周血作为起始材料，不进行浓缩，也不进行DNA提取，加入核酸扩增反应体系的所需 物质构成反应体系，直接进行PCR扩增，测定扩增产物(包括凝胶电泳、芯片电泳、测序等)；其中最终的反应体系中含有中性盐、0.04‐0.09mol/L的Tris溶液、1.5‐3.0mmol/L镁离子及扩增引物，反应体系pH为8.0‐10.0。
所述的直接对脐血、羊水或外周血进行扩增的方法中，脐带血样本或外周血样本加到扩增用反应管的底部，羊水样本加到扩增用反应管中，不对反应管进行任何搅动，直接加入核酸扩增所需反应体系进行PCR扩增。羊水加入量优选1‐5μl，进一步优选2μl。
所述的直接对脐血或外周血进行扩增的方法中，脐血样本选自含抗凝剂的抗凝脐血、不含抗凝剂的干燥滤纸脐血、含抗凝剂的干燥滤纸脐血。
所述的血样为肝素钠抗凝血或滤纸血时，所述的核酸扩增所需反应体系中还包括甘油，甘油的终浓度在0.5％‐25％(V/V)。
所述的羊水为羊膜腔穿刺抽取的胎儿羊水。
所述的中性盐优选硫酸铵、乙酸铵、乙酸钠、硝酸铵、硝酸钠、硫酸钾、草酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化铵、氯化钠、磷酸钠中的任意一种，进一步优选硫酸铵；所述的中性盐在核酸扩增反应体系中的浓度为5mmol/L‐20mmol/L。当中性物质为硫酸铵时，其在核酸扩增反应体系中的浓度优选6mmol/L～16mmol/L，进一步优选10mmol/L。
所述的直接对脐血、羊水或外周血进行扩增的方法中，扩增对象为脐血或外周血时，控制反应体系的pH为8.5‐10.0；扩增对象为羊水时，控制反应体系的pH为8.0‐10.0。
所述的直接对脐血、羊水或外周血进行扩增的方法中，反应体系中还包含PCR反应所需的特异性引物和Taq DNA聚合酶，特异性引物的浓度为0.8‐1.6pmol/μl，扩增对象为脐血或外周血时，Taq DNA聚合酶的浓度为0.04‐0.15U/μl。扩增对象为羊水时，Taq DNA聚合酶的浓度为0.15‐0.2U/μl。
所述的反应体系中，所述的Tris溶液浓度优选0.06mol/L；镁离子浓度优选2.0mmol/L；dNTP浓度优选0.2mmol/L，特异性引物的浓度优选0.8‐1.6pmol/μl。扩增对象为脐血或外周血时，每条特异性引物浓度进一步优选1.0pmol/μl；Taq DNA聚合酶浓度优选0.05U/μl；扩增对象为羊水时，每条特异性引物浓度进一步优选1.2pmol/μl；Taq DNA聚合酶浓度优选0.20U/μl。
一种用于直接对脐血或外周血进行扩增的试剂组合物，包括5mmol/L‐20mmol/L中性盐、0.04‐0.09mol/L Tris溶液、1.5‐3.0mmol/L镁离子溶液、0.1～0.3mmol/L dNTP混合物、0.04～0.2U/μl Taq DNA聚合酶及灭菌蒸馏水，pH为8.0‐10.0。
所述的中性盐优选硫酸铵、乙酸铵、乙酸钠、硝酸铵、硝酸钠、硫酸钾、草酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化铵、氯化钠、磷酸钠中的任意一种，进一步优选硫酸铵。
本发明通过有效抑制蛋白质与基因组DNA之间的静电作用，实现直接以脐血、羊水或外周血为模板进行PCR扩增。脐血、羊水及外周血中含有的蛋白质类PCR抑制剂在水溶液中的溶解度取决于蛋白质分子表面离子周围的水分子数目，亦即主要是由蛋白质分子外周亲水基团与水形成水化膜的程度以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的。在含蛋白质类抑制剂的PCR反应液中加入中性盐后，由于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化层减弱乃至消失。同时，中性盐加入蛋白质溶液后由于离子强度发生改变，蛋白质表面的电荷大量被中和，更加导致蛋白质溶解度降低，蛋白质分子之间聚集而沉淀，消除蛋白质对PCR扩增的抑制。肝素钠抗凝血中的肝素钠成分以及滤纸血中的滤纸成分对PCR扩增有抑制作用，导致扩增失败，使用甘油实现肝素钠抗凝血以及滤纸血直接作为扩增的起始材料。EDTA抗凝血以及枸橼酸钠抗凝血直接PCR时，加入甘油提高EDTA抗凝血以及枸橼酸钠抗凝血的扩增产量。
本发明的有益效果：
(1)提高了检测效率
通常分子生物学实验室进行脐血样本、羊水样本及外周血样本中DNA检测时，在PCR扩增前，均需要对脐血、羊水或外周血中的DNA进行提取。以常规使用的酚氯仿提取法为例，整个DNA提取过程耗时近2h；如果使用商品化的DNA提取试剂盒，一个提取过程也需花费1h左右的时间。而利用本发明进行脐血、羊水或外周血扩增，省略了DNA提取这一繁琐的过程，从收到样本到上机扩增、电泳、检测出结果，整个过程可控制在2h以内，极大地提高了检测效率，节约了实验时间。
(2)降低了检测成本
DNA提取除了各种试剂以外，还需要配备一些仪器设备，如恒温水浴锅，高速离心机等。如果使用商品化试剂盒进行DNA提取，则成本还要提高。而使用本发明直接进行脐血样本、羊水样本及外周血样本扩增，无需提取DNA。其配制的试剂成本低，全部检测成本与普通PCR扩增基本相同。
(3)减少了交叉污染
常规的DNA提取过程需要反复打开管盖，吸去弃液，加入新的试剂，最后还需要将上清转移至另外的试管中。人工操作步骤多且繁琐。平行提取多份样本时，交叉污染的几率更大。即使不提取核酸而使用高温前处理步骤释放羊水中DNA，也存在浓缩及开管等易引起交叉污染的步骤，与起始模板为DNA的PCR反应相比，直接对羊水原液、脐血或外周血进行扩增，不需浓缩，也不许进行DNA提取，仅在PCR反应液配制时将样本加入即可，大大降低了污染的可能。
(4)产前基因诊断及染色体病快速诊断中的临床应用前景广阔
脐血、羊水或外周血直接扩增法操作简便易行，省略了传统的DNA提取步骤，节约了检测成本，降低了样本的需要量，血液样本仅需5μL以内，羊水样本仅需1‐4μL即可，较之直接扩增减少了交叉污染的可能，缩短了检测时间，提高了检测效率。该发明无需特殊仪器设备，仅需PCR实验室最基本的仪器即可开展检测。因此，在基于核酸扩增测定的产前基因诊断及染色体病快速诊断中具有较好的应用前景。
附图说明
图1是对比不同类型的脐血样本直接PCR扩增的效果。A图为经纯化后的DNA PCR扩增结果图；B图为添加2Na·EDTA抗凝剂的脐血直接PCR扩增结果图；C图为添加肝素钠抗凝剂的脐血直接PCR扩增结果图；D图为添加枸橼酸钠抗凝剂的脐血直接PCR扩增结果图；E图为未添加抗凝剂的滤纸脐血直接PCR扩增结果图；F图为添加肝素钠抗凝剂的滤纸脐血直接PCR扩增结果图，其中左侧的泳道添加了甘油，右侧泳道未添加甘油。
图2是在PCR反应体系中直接加入脐血或外周血样本后搅拌与不搅拌对扩增 结果的影响。泳道2，3，6及7不进行搅拌；泳道4，5，8及9进行搅拌。泳道2，4，6及8为一个胎儿的脐血样本，泳道3，5，7及9为另一个成人的外周血样本。
图3是缓冲液中不同中性盐硫酸铵浓度对扩增的影响。硫酸铵浓度分别为100mmol/L(泳道1)，80mmol/L(泳道2)，60mmol/L(泳道3)，40mmol/L(泳道4)，16mmol/L(泳道5)，13mmol/L(泳道6)，12mmol/L(泳道7)，10mmol/L(泳道8)，8mmol/L(泳道9)，6mmol/L(泳道10)和0mmol/L(泳道11)。
图4脐血或外周血直接PCR在产前诊断单基因遗传病检测中的应用。A：脐带血软骨发育不全基因检测；B：脐带血软骨发育低下基因检测；C：外周血软骨发育不全基因检测；D：外周血软骨发育低下基因检测。
图5是不同扩增体系对羊水直接PCR扩增效果的影响。泳道1：TaKaRa rTaq DNA聚合酶扩增体系，加入2μl羊水原液扩增；泳道2：Promega Taq DNA聚合酶体系，加入2μl羊水原液扩增；泳道3：HpH buffer体系，加入2μl羊水原液扩增；泳道4：本发明中核酸扩增反应体系，加入2μl羊水原液扩增；泳道5：本发明中核酸扩增反应体系中去除中性盐，加入2μl羊水原液扩增；泳道6：本发明中核酸扩增反应体系，加入2μl高温浓缩处理后的羊水。
图6是羊水直接PCR扩增时加入的不同量羊水量考察及效果评价。泳道1：2μl羊水原液；泳道2：5μl羊水原液；泳道3：10μl羊水原液；泳道4：19μl羊水原液。
图7是考察酶的不同加入量以及引物的不同加入量对扩增效率的影响。泳道1：0.05U/μl Promega Taq DNA聚合酶，0.4pmol/μl每条引物；泳道2：0.10U/μl Promega Taq DNA聚合酶，0.4pmol/μl每条引物；泳道3：0.15U/μl Promega Taq DNA聚合酶，0.4pmol/μl每条引物；泳道4：0.20U/μl Promega Taq DNA聚合酶， 0.4pmol/μl每条引物；泳道5：0.10U/μl Promega Taq DNA聚合酶，0.8pmol/μl每条引物；泳道6：0.10U/μl Promega Taq DNA聚合酶，1.2pmol/μl每条引物。核酸扩增反应体系pH 8.0‐10.0，含浓度0.06mol/L Tris溶液，浓度在2.0mmol/L的镁离子，浓度为10mmol/L的中性盐，浓度为0.2mmol/L的dNTP混合物。
图8羊水直接PCR在产前诊断单基因遗传病检测中的应用。A：进行性肌营养不良基因检测；B：Y染色体微缺失基因检测。
具体实施方式
实施例1
1)脐血DNA的提取：对收集的脐血标本，每份取0.5ml，按酚/氯仿法提取，再以TE缓冲液溶解而得。实验用DNA模板均用紫外分光光度法测定其浓度及纯度，以TE缓冲液调整终浓度为20～100ng/μl备用。
2)脐血样本的准备：脐静脉穿刺抽取孕妇的脐带血，一部分加入一定量的抗凝剂，本实验采用的抗凝剂分别是枸橼酸钠、2Na·EDTA和肝素钠，留取部分抗凝血置于4℃待用，同时取几滴肝素钠抗凝血滴于干净滤纸上干燥室温保存，其余血样放在‐35℃冷冻保存。另一部分血液不加入抗凝剂，直接滴到干净的滤纸上，并置于干燥器中室温保存。
3)PCR反应及产物检测：
以纯化的DNA为模板进行PCR，反应体系25μl，组成为：1×Taq buffer(不含Mg2+)，每条引物0.4pmol/μl，1.5mmol/L MgCl2，0.2mmol/L dNTP混合物，0.04U/μl Taq DNA聚合酶，用灭菌水补充至25μl。
以脐血为模板进行PCR，直接取抗凝脐血模板0.5μl或适量滤纸血，加入含中性盐硫酸铵的buffer(Tris 0.06mol/L,MgCl22mmol/L,硫酸铵10mmol/L,pH9.3)，0.2mmol/L dNTP混合物，0.05U/μl Taq DNA聚合酶，两条引物(序列分别为：F1：5’‐ACC RCT GTA CTG ACT GTG ATT ACA C‐3’(SEQ ID NO.1)以及R1：5’‐GCA CYT CTT TGG TAT CYG AGA AAG T‐3’(SEQ ID NO.2))各1pmol/μl，灭菌蒸馏水加至25μl。在肝素钠抗凝血、无抗凝剂滤纸血及肝素钠抗凝滤纸血扩增体系中分别加入10％(v/v，以整个反应体系的总体积为基准)的甘油。放入PCR仪中， 96℃，3分钟；(96℃，30秒；55℃，30秒；72℃，1分钟)35个循环；72℃，7分钟；4℃保存。用2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。结果如图1所示，各种抗凝血与DNA扩增相比，所有的血样都成功得到了高效扩增。含中性盐的扩增体系能适用于临床各种血样的直接扩增，甘油能提高肝素钠抗凝滤纸血的扩增效率，实现快速基因检测。
本实施例中PCR反应体系中各物质的浓度均为在反应体系中的终浓度。
实施例2
利用实施例1的方法对向脐带血样本或外周血样本中加入反应体系后搅动与不搅动反应管进行扩增效率考察。结果如图2所示，泳道2，3，6及7完全参照实施例1流程进行，泳道4，5，8及9在实施例1流程中扩增前加入搅动反应管的步骤，搅动反应管后扩增效率明显降低，扩增产量极大的较少，结果在扩增两份不同的血样(泳道2，4，6及8为一个胎儿的脐血样本，泳道3，5，7及9为另一个成人的外周血样本)，每份血样扩增两个基因片段(泳道2‐5扩增片段的大小为539bp，扩增引物为上游引物F2：5’‐TCA ACT GCA CAA CGA TTG TCA‐3’(SEQ ID NO.3)与下游引物R2：5’‐TCC CTT AGC ACC TAG TTG TAA‐3’(SEQ ID NO.4)；泳道6‐9扩增片段的大小为338bp，扩增引物为F3：5’‐CAT CAG ACT TTG ACC GTA‐3’(SEQ ID NO.5)与R3：5’‐AGA ATT AGC AAG CTG CCA‐3’(SEQ ID NO.6))，都得到了相似的扩增效率，搅动含有血样的反应管确实会降低脐血直接PCR的扩增效率。进一步实验发现通过增加DNA聚合酶的用量能够提高PCR管搅拌后的扩增效率，因此认为搅拌引起的低扩增效率有可能是由于悬浮的絮状物抓住了PCR混合物中的DNA聚合酶，而在不搅动的情况下絮状物只形成在PCR管底的血样周围的局部区，不会与溶液中分散的大量DNA聚合酶结合，因此也就不会对扩增产生明显的抑制。因此在脐血或外周血扩增的实验操作中，在加入脐血样本或外周血样本后不搅动PCR管直接进行PCR扩增。
实施例3
利用实施例1的方法对血样扩增缓冲液中中性盐硫酸铵浓度进行研究，在其它PCR条件和成分不变的情况下，改变硫酸铵的加入量，分别为0mmol/L，6 mmol/L，8mmol/L，10mmol/L，12mmol/L，13mmol/L，16mmol/L，40mmol/L，60mmol/L，80mmol/L和100mmol/L，进行PCR扩增和电泳检测。结果如图3所示，硫酸铵的加入量在很宽范围内(6mmol/L‐16mmol/L)均能得到较好的扩增结果(泳道5‐10)。与硫酸铵加入量为0(泳道11)的阴性做对照，显示硫酸铵的加入对PCR的成功起到了重要作用。硫酸铵加入量最适范围在8mmol/L‐13mmol/L(泳道6‐9)之间，硫酸铵的最佳加入量为10mmol/L(泳道8)。过多的硫酸铵对反应有抑制作用(泳道1‐4)。不加入中性盐硫酸铵也无明显扩增产物。
实施例4
单基因遗传病指由于单个基因的突变而引起的遗传病，其遗传方式符合孟德尔定律，所以又称孟德尔遗传病。人类大约有3万个基因，目前约有2000个单基因病的致病基因被鉴定。多数单基因病目前尚无有效的治疗，给家庭带来沉重的负担。对于一些严重的单基因病可通过基因诊断和产前诊断的方法，避免再生育患儿。在本实施例中检测了两种单基因遗传病，分别为软骨发育不全(脐血或外周血直接PCR诊断)以及软骨发育低下(脐血或外周血直接PCR诊断)，具体方法和结果分析如下：
1)软骨发育不全(ACH)致病基因为FGFR3基因，位于4p16.3，包含19个外显子和18个内含子，全长16.5kb，由806个氨基酸残基编码组成。FGFR3受体蛋白包括三部分：胞外区为3个免疫球蛋白样的配体结合区(IgⅠ、IgⅡ和IgⅢ)；跨膜区；胞内区为酪氨酸激酶区(TK1和TK2)。目前已知，ACH患者基因突变的同质性与其临床表型的同质性相一致，所有ACH患者都是由于FGFR3跨膜区突变引起。其中98％为G380R突变，还有个别为G375C或G346E突变。FGFR3发生G380R突变，产生ACH表型，是由于在受体高度疏水的跨膜区引入一个亲水残基，影响跨膜区α‐螺旋的形成。FGFR3基因G375C突变，是由于在受体跨膜区引入1个大的疏水性Cys，可以形成二硫键，从而改变FGFR3分子的高级结构，产生ACH表型。ACH是一种常染色体显性遗传病。95％以上的患者是由于FGFR3基因跨膜区1138位核苷酸G→A的突变，少数为G→C的颠换，导致380位密码子的错义突变，即精氨酸替代了甘氨酸，而致病。该实施例中建立的方法为脐血或外周血直接PCR后电泳测序。扩增用引物序列为：F4：5'‐AGG AGC TGG TGG AGG CTG A‐3’(SEQ ID NO.7)以及R4：5’‐GGA GAT CTT GTG CAC GGT GG‐3’(SEQ ID NO.8)。结果如图4A及图4C所示，该胎儿及患儿均发生了1138位核苷酸G→A的突变，即均诊断为软骨发育不全。
2)软骨发育低下(HCH)和ACH一样，都是遗传性侏儒，呈常染色体显性遗传。HCH和ACH均以身材矮小为特征，表现为四肢过短、椎骨茎缩短。虽然常见的HCH症状较ACH轻，但二者仅存在细微的表型差异。因此，临床上很难将HCH从此类疾病中鉴别出来。60％～65％的HCH患者被检测到FGFR3基因的N540K突变。该突变影响了胞内区酪氨酸激酶的活性，或者在无配体结合时，调节FGFR3形成二聚体，引起受体的异位表达或暂时异常表达。该实施例中所用方法为脐血或外周血直接PCR后电泳测序。扩增用引物序列为：F5：5'‐ACT GAC AAG GAC CTG TCG GAC C‐3'(SEQ ID NO.9)以及R5：5'‐TTG CAG GTG TCG AAG GAG TAG TC‐3'(SEQ ID NO.10)。结果如图4B及4D所示，该胎儿(图4B)发生了N540K突变，即核苷酸C→A的突变，该胎儿诊断为软骨发育低下。该患者(图4D)未发生N540K突变，不诊断为N540K突变引起的软骨发育低下。
实施例5
实验流程：
1)羊水样本处理：经过羊膜腔穿刺抽取的羊水样本，分成两份，一份直接贮存于4℃冰箱备用，另一份取100μl于0.2ml PCR管中，短暂离心30秒后，去除上清90μl，将剩余的10μl样本置于PCR仪上95℃处理2‐10分钟，结束后取出备用。
2)PCR扩增：使用四种不同扩增体系进行羊水直接PCR扩增考察，扩增体系25μl(含样本)分为四种：(1)TaKaRa公司的rTaq DNA聚合酶，及对应buffer体系成分；(2)Promega公司的Taq DNA聚合酶，及对应buffer体系成分；(3)HpH buffer体系：pH为9.0的Tris‐HCl溶液【Huang et al,Direct polymerase chain reaction(PCR)from human whole blood and filter‐paper‐dried blood by using a PCR buffer with a higher pH,Analytical Biochemistry,2008,375,370‐372】，每条浓度为1.2pmol/μl的引物，浓度为0.2U/μl的扩增用酶，浓度为0.2mmol/L的dNTP混合物；(4)本发明中核酸扩增反应体系(pH9.3)，含浓度0.06mol/L Tris溶液，浓 度在2.0mmol/L的MgCl2，浓度为10mmol/L的中性盐硫酸铵，每条浓度为1.2pmol/μl的引物，浓度为0.2U/μl的扩增用酶，浓度为0.2mmol/L的dNTP混合物；(5)除不含中性盐外，其他同(4)中的反应体系。
引物序列分别为：上游引物：F1：5’‐ACC RCT GTA CTG ACT GTG ATT ACA C‐3’(SEQ ID NO.1)以及下游引物：R1：5’‐GCA CYT CTT TGG TAT CYG AGA AAG T‐3’(SEQ ID NO.2)。
在PCR单管中加入备用羊水原液样本或浓缩后高温处理的羊水样本2μl。在94℃预变性3分钟后，于94℃20秒、55℃25秒以及72℃20秒的条件下扩增35个循环，最后于72℃延伸5分钟。
3)电泳检测：取PCR产物3μl与上样缓冲液混合后，点样于2％琼脂糖凝胶，在100V电压电泳15min。凝胶成像仪800ms曝光，根据扩增片段的有无来判断是否扩增成功。由图5的结果可以看出，使用商品化的Promega体系，TaKaRa体系以及HpH buffer体系(泳道1‐3)，均无明显的扩增产物出现，而使用本发明中核酸扩增反应体系进行羊水直接PCR扩增，扩增效果较好，电泳图上出现明显的扩增产物(泳道4)，能达到与浓缩及高温处理羊水扩增(泳道6)相似的扩增强度。在本发明中核酸扩增反应体系去除中性盐成分，扩增强度有所减弱(泳道5)，说明中性盐成分能提高羊水直接扩增的效率。
实施例6
经过羊膜腔穿刺抽取的羊水样本，分别取2μl、5μl、10μl以及19μl加入实施例5的核酸扩增反应体系中进行PCR扩增，扩增用引物及程序同实施例5。结果如图6所示，扩增效果(即扩增产物量)：泳道1>泳道2>泳道3>泳道4。加入的羊水样本量越大，对PCR扩增的抑制成分越多，扩增效率越差。加入量大于10μl扩增效率急剧下降，19μl的加入量导致无明显扩增产物。因此，羊水的适合加入量小于等于5μl。
实施例7
利用实施例6的方法对核酸扩增反应体系中酶的加入量以及引物的加入量进行扩增效率的考察，羊水样本的加入量为2μl。结果如图7所示，随着酶的加 入量增大，扩增效率提高，浓度达到0.15U/μl时，扩增效率到达高点(扩增效果：泳道1>泳道2>泳道3以及泳道4)，再增加酶量，扩增效率变化不明显(泳道3以及泳道4扩增效率相似)；随着引物量的增加，扩增效率提高(扩增效果：泳道6>泳道5>泳道2)，考虑到引物二聚体的产生，本发明优选引物量为1.2pmol/μl。
实施例8
在本实施例中检测了两种单基因遗传病，分别为进行性肌营养不良(羊水直接PCR诊断)，Y染色体微缺失(羊水直接PCR诊断)，具体方法和结果分析如下：1)进行性肌营养不良诊断：进行性肌营养不良简称DMD，是一种X染色体连锁隐性遗传病。DMD主要由dystrophin基因的缺失突变，重复突变，点突变和微小插入/缺失引起。最多见的突变是基因内部的缺失，占总突变类型的65％。dystrophin基因共有79个外显子，通过测定79个外显子中的19个热点缺失区域，可以测到90％的缺失突变。在DMD基因的突变中，约有30％是新发突变，而非遗传所致。本实施例通过羊水直接PCR扩增结合电泳的方法来检测DMD基因19对外显子3，4，6，8，12，13，17，19，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52和60，结果如图8A所示，正常胎儿所有的片段都获得明显的扩增产物，患者胎儿缺失了3，4及6号外显子，诊断为DMD。
2)Y染色体微缺失诊断：该病的诊断为男性不育的常规检查项目。如果男性不育患者存在Y染色体微缺失，一般的药物治疗无效。不同的位点缺失或者是否存在缺失其治疗方法是不一样的。Y染色体长臂无精子因子AZF区域的微缺失是导致精子发生障碍的重要遗传学因素，目前分为AZFa，AZFb和AZFc区域的微缺失。AZFc缺失患者可能存精子生成能力，其他类型的缺失均为无精子症患者，对精子生成的影响更为严重。检测的结果将指导医生是否采用卵细胞浆内单精子注射技术辅助生育；同时为是否选择性移植女性胚胎依据，因为男性后代将遗传父亲的不育缺陷。建立方法为羊水直接多重PCR扩增+电泳用于检测14个位点片段，AZFa:sY84，sY86；AZFb:sY127，sY134，SY124，SY132；AZFc:sY254，sY255，SY157，SY239，SY242，SY152，选择位于Y染色体短臂的睾丸决定基因(SRY)和锌指蛋白基因(ZFX/ZFY)为对照。ZFX/ZFY既存在于X染色体短臂，也存在于Y染色体短臂，其与SRY一起构成2个目前推荐使用的参照基因。具有性染色体相关遗传病家族史的病人需进行产前胎儿性别诊断，该检测方法也可用 于产前胎儿性别诊断，实现快速性别判定。结果如图8B所示，女胎仅出现ZFX/ZFY片段，而正常男胎14条片段均出现。
Claims (10)
1.一种直接对脐血、羊水或外周血进行扩增的方法，其特征在于以脐血、羊水或外周血作为起始材料，不进行浓缩，也不进行DNA提取，加入核酸扩增反应体系的所需物质构成反应体系，直接进行PCR扩增，测定扩增产物；其中最终的反应体系中含有中性盐、0.04‐0.09mol/L的Tris溶液、1.5‐3.0mmol/L镁离子、特异性扩增引物、dNTP混合物和Taq DNA聚合酶。
2.根据权利要求1所述的直接对脐血、羊水或外周血进行扩增的方法，其特征在于脐血样本、外周血样本加到扩增用反应管的底部，羊水样本加到扩增用反应管中，不对反应管进行任何搅动，直接加入核酸扩增所需反应体系进行PCR扩增；羊水的加入量为1‐5μl。
3.根据权利要求2所述的直接对脐血、羊水或外周血进行扩增的方法，其特征在于血样选自含抗凝剂的抗凝血、不含抗凝剂的干燥滤纸血、含抗凝剂的干燥滤纸血。
4.根据权利要求3所述的直接对脐血、羊水或外周血进行扩增的方法，其特征在于所述的血样为肝素钠抗凝血或滤纸血时，所述的核酸扩增所需反应体系中还包括甘油，甘油的终浓度在0.5％‐25％(V/V)。
5.根据权利要求1所述的直接对脐血、羊水或外周血进行扩增的方法，其特征在于所述的羊水为羊膜腔穿刺抽取的胎儿羊水。
6.根据权利要求1所述的直接对脐血、羊水或外周血进行扩增的方法，其特征在于所述的中性盐选自硫酸铵、乙酸铵、乙酸钠、硝酸铵、硝酸钠、硫酸钾、草酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化铵、氯化钠、磷酸钠中的任意一种；所述的中性盐在核酸扩增反应体系中的浓度为5mmol/L‐20mmol/L。
7.根据权利要求1所述的直接对脐血、羊水或外周血进行扩增的方法，其特征在于扩增对象为脐血或外周血时，控制反应体系的pH为8.5‐10.0；扩增对象为羊水时，控制反应体系的pH为8.0‐10.0。
8.根据权利要求1所述的直接对脐血、羊水或外周血进行扩增的方法，其特征在于反应体系中特异性引物的浓度为0.8‐1.6pmol/μl，扩增对象为脐血或外周血时，Taq DNA聚合酶的浓度为0.05‐0.15U/μl；扩增对象为羊水时，Taq DNA聚合酶的浓度为0.15‐0.2U/μl。
9.一种用于直接对脐血、羊水或外周血进行扩增的试剂组合物，其特征在于包括5mmol/L‐20mmol/L中性盐、0.04‐0.09mol/L Tris溶液、1.5‐3.0mmol/L镁离子溶液、0.1～0.3mmol/L dNTP混合物、0.04～0.2U/μl Taq DNA聚合酶及灭菌蒸馏水，pH为8.0‐10.0。
10.根据权利要求9所述的试剂组合物，其特征在于所述的中性盐选自硫酸铵、乙酸铵、乙酸钠、硝酸铵、硝酸钠、硫酸钾、草酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化铵、氯化钠、磷酸钠中的任意一种。
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