CN108048547A - 血液直接PCR进行Taqman分型的方法 - Google Patents

血液直接PCR进行Taqman分型的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种血液直接PCR进行Taqman分型的方法，包括如下步骤：血液粗处理，制得样品—PCR扩增—Taqman分型鉴定。本发明的方法直接PCR进行Taqman分型，节省了提取DNA的步骤。

Description

血液直接PCR进行Taqman分型的方法
技术领域
本发明涉及Taqman分型方法，尤其涉及一种血液直接PCR进行Taqman分型的方法。
背景技术
单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphisms)，是由于单个核苷酸改变而导致的核酸序列多态。SNP在人类基因组中的发生频率比较高，大约平均每1000个碱基中就有一个多态位点。有些SNP位点还会影响基因的功能，导致生物性状改变甚至致病。单核苷酸多态性是研究人类家族和动植物品系遗传变异的重要依据，因此被广泛用于群体遗传学研究(如生物的起源、进化及迁移等方面)和疾病相关基因的研究，在药物基因组学、诊断学和生物医学研究中起重要作用。目前所涉及检测SNP的技术中，无一例外的是以DNA为模板。由于样品之间的巨大差异，DNA与RNA的分离提取过程也千差万别，这项工作对于操作人员的技术熟练程度要求颇高。传统分离提取技术由于要使用一些毒性较强的化学试剂，长期接触，将对操作人员的身体造成不可逆的伤害，甚至在实验过程中造成直接的损害。同时，对于有大量样品需要研究的人员，分离提取核酸则是一项劳动量极大的工作。现在市场上核酸分离提取试剂盒已经成熟，品牌众多，但大致都相同。无论是硅胶膜柱离心式试剂盒还是磁珠法试剂盒，都需要大量的时间，且成本高昂。除试剂盒成本外，更是对实验室仪器设备有特殊要求，磁珠法所采用的自动化工作站就是非常典型的大型高价值设备，对实验室而言，是一项巨大的费用支出。综上，本发明以独特的细胞裂解液对血液样本进行粗处理，进行简单的离心除杂后，便可进行SNP分型。本发明实验过程中所用聚合酶为强耐受性DNA聚合酶，其余试剂、耗材与正常SNP分型无异，所发明通用于所有使用TaqMan探针法进行SNP分型的技术领域。
Taqman探针PCR反应体系中含有一对双标记的探针和一对PCR引物,用两种荧光染料Fam，Hex(Vic)分别标记这两种探针，TaqMan探针上有一个荧光发光基团(reporter dye简称R基团)和一个荧光猝灭基团(quencher简称Q基团)，完整的探针上的这两个基团靠的很近，R基团发出的荧光在Q基团的吸收波长范围内，则会被Q基团吸收，因此不会产生荧光，当探针与模板结合，上游引物(5’端的)延伸到探针结合的地方时，利用聚合酶(Taqpolymerase)的5’-3’的外切酶活性把探针降解，同时把R基团从探针上游离下来，使它和猝灭集团分开，这时就会产生荧光，最后通过终点读板检测信号来确定是否存在SNP位点。
发明内容
本发明提供了一种血液直接PCR进行Taqman分型的方法，本发明以细胞裂解液对血液进行粗处理，进行简单的离心除杂后，便可进行Taqman分型，避免了提取DNA的繁琐步骤，本发明实验过程中所用聚合酶为强耐受性DNA聚合酶。
本发明的目的是通过以下方案实现：
一种血液直接PCR进行Taqman分型的方法，包括如下步骤：血液粗处理，制得样品—PCR扩增—Taqman分型鉴定；所述PCR扩增中采用强耐受性DNA聚合酶。
优选地，所述血液粗处理的方法为向10μl全血中加入90μl细胞裂解液后室温裂解30min；将裂解后的细胞液转移到1.5ml离心管中，95℃加热15min后，12，000×g，离心10min，取上清液至96孔板中作为样品备用。
优选地，所述细胞裂解液为50mmol/LTris-Cl PH8.0，150mmol/LNaCl。
优选地，所述强耐受性DNA聚合酶选自选自
上述中的一种。
优选地，所述PCR的体系如下：
。
优选地，所述探针和引物包括如下3个位点的探针和引物，具体如下：
SNP位点1：
上游引物：AAAAGAAAACTGAGTGGGAGCAGTA
下游引物：TGCCCCAGCCTCTGCTT
探针1：TAGTATGGAAGAAATC
探针2：TAGTAGTATGGCAGAAAT
SNP位点2：
上游引物：TTAAAATGTGGTGGATGCACTGT
下游引物：CTGTCATGCACTTATATTTATCTAGTTTGAAG
探针1：AGATGCCACGTAGAAG
探针2：AGATGCCATGTAGAAGT
SNP位点3：
上游引物：ACAGGGCTGTGGGACAAGTC
下游引物：GGCGTTACAATTAAAGAGAGAGAGAGA
探针1：CATTCCGGTAAGCAG
探针2：ATTCCGGTAGGCAGC。
优选地，所述引物、探针均由擎科生物技术有限公司(北京)合成。
优选地，所述PCR条件如下：
①预变性：95℃，5min；
②变性：95℃，10s；
退火-延伸：60+1℃，60s，40个循环；
③12℃，forever；
退火温度为：常规退火温度+1℃；所述常规退火温度是指本申请中所述引物在常规PCR下的温度。
优选地，所述Taqman分型鉴定是指使用Bio-tek读取荧光值，利用Klustercaller软件分析荧光数据，根据对照扩增结果，分型产生三种基因型。
实验数据表明，PCR反应的灵敏度极高，只需要以少量模板便可完成扩增过程。以往的过程当中通过提取DNA，以高纯度的DNA为模板进行扩增，而这个过程中所用DNA通常是过量的。那么，当细胞被裂解后释放出的DNA的含量则完全可以满足PCR过程。但是，此时的DNA中往往掺杂了大量杂质，这些杂质会严重影响后续的分型鉴定。为了消除杂质的影响，我们将血液进行高速离心，借此来降低血液中的杂质含量。此时，DNA中杂质的量被大大减少，而DNA含量也可以满足扩增过程。此外，在PCR反应当中，虽然杂质的含量被大大降低，但是一般的DNA聚合酶仍然会在一定程度上受到杂质的影响。为了尽可能的消除影响，我们以强耐受性DNA聚合酶进行PCR扩增，这种酶具有很强的PCR反应抑制物耐受性，能以待测样本的裂解液为模板，进行高效特异性扩增。
附图说明
图1是实施例1的Taqman分型图；
图2是实施例2的Taqman分型图；
图3是实施例3的Taqman分型图；
其中，1为水对照，2(SNP位点1)、3(SNP位点2)、4(SNP位点3)为分型后的样品；根据Fam和VIC两种的荧光强度的比值进行分型，1(水)中两种荧光值基本为0，2中VIC荧光值>Fam，3中VIC≈Fam，4中VIC<Fam。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明进行详细的解释。
实施例1
一种血液直接PCR进行Taqman分型的方法，包括如下步骤：血液粗处理，制得样品—PCR扩增—Taqman分型鉴定；所述PCR扩增中采用强耐受性DNA聚合酶。所述血液粗处理的方法为向10μl全血中加入90μl细胞裂解液后室温裂解30min；将裂解后的细胞液转移到1.5ml离心管中，95℃加热15min后，12，000×g，离心10min，取上清液至96孔板中作为样品备用。所述细胞裂解液为50mmol/LTris-Cl PH8.0，150mmol/LNaCl。所述强耐受性DNA聚合酶为2XT5FAST qPCR MIX(Probe)、TSTNGKE。
所述PCR的体系如下：
。
所述PCR中的探针和引物包括如下3个位点的探针和引物，具体如下：
SNP位点1：
上游引物：AAAAGAAAACTGAGTGGGAGCAGTA
下游引物：TGCCCCAGCCTCTGCTT
探针1：TAGTATGGAAGAAATC
探针2：TAGTAGTATGGCAGAAAT
SNP位点2：
上游引物：TTAAAATGTGGTGGATGCACTGT
下游引物：CTGTCATGCACTTATATTTATCTAGTTTGAAG
探针1：AGATGCCACGTAGAAG
探针2：AGATGCCATGTAGAAGT
SNP位点3：
上游引物：ACAGGGCTGTGGGACAAGTC
下游引物：GGCGTTACAATTAAAGAGAGAGAGAGA
探针1：CATTCCGGTAAGCAG
探针2：ATTCCGGTAGGCAGC。
所述引物、探针均由擎科生物技术有限公司(北京)合成。
所述PCR条件如下：
①预变性：95℃，5min；
②变性：95℃，10s；
退火-延伸：60+1℃，60s，40个循环；
③12℃，forever；
退火温度为：常规退火温度+1℃；所述常规退火温度是指本申请中所述引物在常规PCR下的温度。所述Taqman分型鉴定是指使用Bio-tek读取荧光值，利用Klustercaller软件分析荧光数据，根据对照扩增结果，分型产生三种基因型，如附图1所示。
其中，1为水对照，2、3、4为分型后的样品；根据Fam和VIC两种的荧光强度的比值进行分型，1(水)中两种荧光值基本为0。2中VIC荧光值>Fam，3中VIC≈Fam，4中VIC<Fam。
实施例2
一种血液直接PCR进行Taqman分型的方法，包括如下步骤：血液粗处理，制得样品—PCR扩增—Taqman分型鉴定；所述PCR扩增中采用强耐受性DNA聚合酶。所述血液粗处理的方法为向10μl全血中加入90μl细胞裂解液后室温裂解30min；将裂解后的细胞液转移到1.5ml离心管中，95℃加热15min后，12，000×g，离心10min，取上清液至96孔板中作为样品备用。所述细胞裂解液为50mmol/LTris-Cl PH8.0，150mmol/LNaCl。所述强耐受性DNA聚合酶为2XTransDirect PCR SuperMix、TransGen Biotech。
所述PCR的体系如下：
。
所述PCR中的探针和引物包括如下3个位点的探针和引物，具体如下：
SNP位点1：
上游引物：AAAAGAAAACTGAGTGGGAGCAGTA
下游引物：TGCCCCAGCCTCTGCTT
探针1：TAGTATGGAAGAAATC
探针2：TAGTAGTATGGCAGAAAT
SNP位点2：
上游引物：TTAAAATGTGGTGGATGCACTGT
下游引物：CTGTCATGCACTTATATTTATCTAGTTTGAAG
探针1：AGATGCCACGTAGAAG
探针2：AGATGCCATGTAGAAGT
SNP位点3：
上游引物：ACAGGGCTGTGGGACAAGTC
下游引物：GGCGTTACAATTAAAGAGAGAGAGAGA
探针1：CATTCCGGTAAGCAG
探针2：ATTCCGGTAGGCAGC。
所述引物、探针均由擎科生物技术有限公司(北京)合成。
所述PCR条件如下：
①预变性：95℃，5min；
②变性：95℃，10s；
退火-延伸：60+1℃，60s，40个循环；
③12℃，forever；
退火温度为：常规退火温度+1℃；所述常规退火温度是指本申请中所述引物在常规PCR下的温度。所述Taqman分型鉴定是指使用Bio-tek读取荧光值，利用Klustercaller软件分析荧光数据，根据对照扩增结果，分型产生三种基因型，如附图2所示。
其中，1为水对照，2、3、4为分型后的样品；根据Fam和VIC两种的荧光强度的比值进行分型，1(水)中两种荧光值基本为0。2中VIC荧光值>Fam，3中VIC≈Fam，4中VIC<Fam。
实施例3
一种血液直接PCR进行Taqman分型的方法，包括如下步骤：血液粗处理，制得样品—PCR扩增—Taqman分型鉴定；所述PCR扩增中采用强耐受性DNA聚合酶。所述血液粗处理的方法为向10μl全血中加入90μl细胞裂解液后室温裂解30min；将裂解后的细胞液转移到1.5ml离心管中，95℃加热15min后，12，000×g，离心10min，取上清液至96孔板中作为样品备用。所述细胞裂解液为50mmol/LTris-Cl PH8.0，150mmol/LNaCl。所述强耐受性DNA聚合酶为2×Phire Hot Start II PCR Master Mix、Thermo Scientific。
所述PCR的体系如下：
。
所述PCR中的探针和引物包括如下3个位点的探针和引物，具体如下：
SNP位点1：
上游引物：AAAAGAAAACTGAGTGGGAGCAGTA
下游引物：TGCCCCAGCCTCTGCTT
探针1：TAGTATGGAAGAAATC
探针2：TAGTAGTATGGCAGAAAT
SNP位点2：
上游引物：TTAAAATGTGGTGGATGCACTGT
下游引物：CTGTCATGCACTTATATTTATCTAGTTTGAAG
探针1：AGATGCCACGTAGAAG
探针2：AGATGCCATGTAGAAGT
SNP位点3：
上游引物：ACAGGGCTGTGGGACAAGTC
下游引物：GGCGTTACAATTAAAGAGAGAGAGAGA
探针1：CATTCCGGTAAGCAG
探针2：ATTCCGGTAGGCAGC。
所述引物、探针均由擎科生物技术有限公司(北京)合成。
所述PCR条件如下：
①预变性：95℃，5min；
②变性：95℃，10s；
退火-延伸：60+1℃，60s，40个循环；
③12℃，forever；
退火温度为：常规退火温度+1℃；所述常规退火温度是指本申请中所述引物在常规PCR下的温度。所述Taqman分型鉴定是指使用Bio-tek读取荧光值，利用Klustercaller软件分析荧光数据，根据对照扩增结果，分型产生三种基因型，如附图3所示。
其中，1为水对照，2、3、4为分型后的样品；根据Fam和VIC两种的荧光强度的比值进行分型，1(水)中两种荧光值基本为0。2中VIC荧光值>Fam，3中VIC≈Fam，4中VIC<Fam。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应该涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。
<110> 美因健康科技（北京）有限公司
<120> 血液direct PCR进行SNP分型
<130>
<160> 12
<170> Primer Express 3.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
aaaagaaaactgagtgggagcagta
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tgccccagcctctgctt
<210> 3
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tagtatggaagaaatc
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tagtagtatggcagaaat
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ttaaaatgtggtggatgcactgt
<210> 6
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ctgtcatgcacttatatttatctagtttgaag
<210> 7
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
agatgccacgtagaag
<210> 8
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
agatgccatgtagaagt
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
acagggctgtgggacaagtc
<210> 10
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
ggcgttacaattaaagagagagagaga
<210> 11
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
cattccggtaagcag
<210> 12
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
attccggtaggcagc

Claims (9)

1.一种血液直接PCR进行Taqman分型的方法，其特征在于，包括如下步骤：血液粗处理，制得样品—PCR扩增—Taqman分型鉴定；所述PCR扩增中采用强耐受性DNA聚合酶。
2.根据权利要求1所述的血液直接PCR进行Taqman分型的方法，其特征在于，所述血液粗处理的方法为向10μl全血中加入90μl细胞裂解液后室温裂解30min；将裂解后的细胞液转移到1.5ml离心管中，95℃加热15min后，12，000×g，离心10min，取上清液至96孔板中作为样品备用。
3.根据权利要求2所述的血液直接PCR进行Taqman分型的方法，其特征在于，所述细胞裂解液为50mmol/LTris-Cl PH8.0，150mmol/LNaCl。
4.根据权利要求1所述的血液直接PCR进行Taqman分型的方法，其特征在于，所述强耐受性DNA聚合酶选自
上述中的一种。
5.根据权利要求1所述的血液直接PCR进行TaqmanN分型的方法，其特征在于，所述PCR的体系如下：
。
6.根据权利要求5所述的血液直接PCR进行Taqman分型的方法，其特征在于，所述探针和引物包括如下3个位点的探针和引物，具体如下：
SNP位点1：
上游引物：AAAAGAAAACTGAGTGGGAGCAGTA
下游引物：TGCCCCAGCCTCTGCTT
探针1：TAGTATGGAAGAAATC
探针2：TAGTAGTATGGCAGAAAT
SNP位点2：
上游引物：TTAAAATGTGGTGGATGCACTGT
下游引物：CTGTCATGCACTTATATTTATCTAGTTTGAAG
探针1：AGATGCCACGTAGAAG
探针2：AGATGCCATGTAGAAGT
SNP位点3：
上游引物：ACAGGGCTGTGGGACAAGTC
下游引物：GGCGTTACAATTAAAGAGAGAGAGAGA
探针1：CATTCCGGTAAGCAG
探针2：ATTCCGGTAGGCAGC。
7.根据权利要求6所述的血液直接PCR进行Taqman分型的方法，其特征在于，所述引物、探针均由擎科生物技术有限公司(北京)合成。
8.根据权利要求5所述的血液直接PCR进行Taqman分型的方法，其特征在于，所述PCR条件如下：
①预变性：95℃，5min；
②变性：95℃，10s；
退火-延伸：60+1℃，60s，40个循环；
③12℃，forever；
退火温度为：常规退火温度+1℃；所述常规退火温度是指本申请中所述引物在常规PCR下的温度。
9.根据权利要求1所述的血液直接PCR进行Taqman分型的方法，其特征在于，所述Taqman分型鉴定是指使用Bio-tek读取荧光值，利用Klustercaller软件分析荧光数据，根据对照扩增结果，分型产生三种基因型。
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