CN101223915A

CN101223915A - 含抗幽门螺杆菌及其毒素特异性免疫球蛋白的牛初乳蛋白

Info

Publication number: CN101223915A
Application number: CNA2008100561994A
Authority: CN
Inventors: 崔治中
Original assignee: Shandong Yishengzhong Livestock & Poultry Co Ltd
Current assignee: Shandong Yishengzhong Livestock & Poultry Co Ltd
Priority date: 2008-01-15
Filing date: 2008-01-15
Publication date: 2008-07-23

Abstract

本发明涉及一种抗幽门螺杆菌及其毒素的牛初乳蛋白，其制备方法是将培养纯化的人幽门螺杆菌菌体及其毒素蛋白抗原与佐剂混合乳化后免疫注射怀孕乳牛，可诱发针对幽门螺杆菌及其毒素的特异性免疫球蛋白分泌到乳牛乳汁中，收集牛初乳，经过检测并根据现有技术加工成各型乳制品，人服用后可以减弱幽门螺杆菌在胃粘膜表面的繁殖并中和其在粘膜表面产生的毒素。

Description

含抗幽门螺杆菌及其毒素特异性免疫球蛋白的牛初乳蛋白

技术领域

本发明申请涉及含抗幽门螺杆菌及其毒素特异性免疫球蛋白的牛初乳蛋白，属于保健食品领域。

背景技术

1982年，澳大利亚学者巴里·马歇尔和罗宾·沃伦发现了幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，HP)，并证明该细菌感染胃部会导致人的胃炎、胃溃疡和十二指肠溃疡，从而赢得了2005年诺贝尔医学奖。目前，许多医院都可以通过内窥镜检查和呼气试验等诊断患者是否有幽门螺杆菌感染。大量的临床研究报告表明，该菌在人群中的感染率很高，普通人群40％都有这种细菌感染。虽然细菌感染以后不一定都得胃炎或者是胃溃疡，但大量研究表明，有90％以上的十二指肠溃疡和80％左右的胃溃疡，都是由幽门螺杆菌感染引起的。研究还发现，有幽门螺杆菌感染的人的胃癌的发病率比没有幽门螺杆菌感染的人高20倍。幽门螺杆菌主要存在于胃粘膜的表层或浅层，并在那里繁殖。该菌可产生空泡毒素、热休克蛋白、尿素酶等蛋白质，这些蛋白质作为毒素可在螺杆菌繁殖的局部呈现致病作用，促发胃炎、胃溃疡和十二指肠溃疡甚至胃癌的发生。可幸的是，在临床应用中，抗生素的治疗方法已被证明能够有效治疗幽门螺杆菌感染引发的胃炎、胃溃疡和十二指导肠溃疡等疾病。因马歇尔和沃伦的发现，彻底改变了世人对胃病的认识，大幅度提高了胃溃疡等患者获得彻底治愈的机会。

然而，如同其它细菌可产生抗药性一样，在病人常期服用抗菌素后幽门螺杆菌也能产生抗药性，从而使一些抗生素在一部分病人丧失治疗作用。因此，为了更有效地治疗和预防幽门螺杆菌感染，国内外已有不少实验室在研究针对该菌感染的疫苗。特别是研制含有不同毒素蛋白抗原的亚单位疫苗，这些研究还仍在初步阶段。

发明内容及具体实施方式

本发明申请的主要发明内容是：

将培养纯化的人幽门螺杆菌菌体及其毒素蛋白抗原与佐剂混合乳化后免疫注射怀孕乳牛，可诱发针对幽门螺杆菌及其毒素的特异性免疫球蛋白分泌到乳牛乳汁中，收集牛初乳，经过检测并根据现有技术加工成各型乳制品。由于本制品含“抗幽门螺杆菌及其毒素的牛初乳蛋白”，服用后可以减弱幽门螺杆菌在胃粘膜表面的繁殖并中和其在粘膜表面产生的毒素。

本发明申请中所称毒素是幽门螺杆菌培养物离心后的上清液用能截留分子量1万左右超滤膜(如天津通海净水设备厂的TH-30-1超滤膜)分级过滤，除去小分子量的内毒素，保留并浓缩分子量大于1万的各种毒素蛋白质抗原的混合物，该混合物含有空泡毒素、热休克蛋白、尿素酶等蛋白质，并以纯化的在大肠杆菌中表达的重组热休克蛋白作为指示抗原进行检测。

1菌种

所选幽门螺杆菌只要经过鉴定、符合以下幽门螺杆菌生物学特性并具有可诱导针对幽门螺杆菌的保护性免疫应答的VacA、CagA、HspA、HspB、尿素酶和过氧化氢酶等多种抗原的菌株，如：幽门螺杆菌悉尼(SS1)株(张延龄，张辉主编.疫苗学.科学出版社，2004年3月704-733)、H.pyloriATCC 43504株(简称43504株)、Hp Y06株(中华微生物血和免疫学杂志，2003，25(10)：301-302)、Hp 27株(中华微生物血和免疫学杂志，2007，27(4)：362)等均可用于本项发明。

(1)形态染色

幽门螺杆菌染色体大小为1.60～1.72mb。G+C含量为34.1％～37.5％。它是有4～6根鞭毛的螺杆状细菌、革兰氏染色阴性、宽0.5～1.0μm、长2.5～4.0μm、鞭毛长2～5μm。在胃粘膜中，幽门螺杆菌常常为弯曲、S形或弧形，在胃粘液层中常呈鱼群样排列。经传代培养后，细菌往往会失去特有弯曲状而成杆状。在细菌菌体表面有一层多糖蛋白复合物。若周围环境不利细菌生长，如延长培养，暴露空气中，遇抗生素或细菌在不利环境中等，幽门螺杆菌会变成圆球体，一般认为这是细菌一种静止状态。

(2)培养特性

幽门螺杆菌属于微需氧菌。

该菌营养要求高，常用气体培养条件有：①85％N₂，10％CO₂和5％O₂；②5％～10％CO₂；③厌氧袋；袋内置有化学药品(枸橼酸、碳酸氢钠、硼氢钠、氯化钴)，加水激活发生反应，产生一定比例的H₂和CO₂(袋内不加钯)。固体培养基可选用脑心浸液、血琼脂2号、Wilkins-Chalgren和哥伦比亚等。以上述培养基为基础，加5％羊血、马血或人血，有报告人血优于其他种类血源。液体培养基可选用脑心浸液加0.4％酵母浸液和10％马血清。幽门螺杆菌培养时间较长需3～7天。细菌菌落1～2mm，开始呈针尖样透明，以后菌落稍大呈灰白色，无明显溶血。在液体培养基中，幽门螺杆菌生长呈细颗粒状，2～3天后可见细菌明显生长，易与其他细菌区别。幽门螺杆菌最适培养温度为35～37℃。

(3)生化反应

幽门螺杆菌产生大量尿素酶，能迅速分解尿素，这是幽门螺杆菌的一个重要特性。

尿毒酶、氧化酶和过氧化氢酶阳性，这三项试验是鉴定幽门螺杆菌最主要生化反应。其他生化反应包括：不还原硝酸盐，马尿酸水解阴性，产生碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、组氨酸氨基肽酶、亮氨酸氨基肽酶、DNA酶及一些脂酶(C₄～C₁₂)。

2免疫怀孕乳牛用幽门螺杆菌菌体及其毒素疫苗的制备

(1)幽门螺杆菌悬液的制备：将幽门螺杆菌菌种接种于幽门螺杆菌用肉汤培养基，置于分别含85％氮气、10％二氧化碳及5％氧气的混合气体的厌氧培养箱中于35～37℃培养3～4天后，于3000×g的离心力下将培养液离心30min。将细菌沉淀物再悬浮于含0.5％福马林的生理盐水中灭活细菌并洗去培养液中的内毒素，再按10⁹菌落形成单位(cfu)/mL浓度将其悬浮于pH 7.2 PBS中重新制成悬液备用。

(2)幽门螺杆菌毒素蛋白的制备：将以上1)项中幽门螺杆菌菌培养液离心后的上清液用能截留分子量1万左右超滤膜(如天津通海净水设备厂的TH-30-1超滤膜)分级过滤，除去小分子量的内毒素，保留并浓缩分子量大于1万的毒素蛋白质，浓缩至总蛋白量10mg/mL，备用。

(3)幽门螺杆菌菌体和幽门螺杆菌毒素蛋白混合疫苗的制备：将上述1份幽门螺杆菌菌体悬液和1份按(2)制备的幽门螺杆菌多种毒素蛋白的混合悬液(细菌培养上清液经超滤纯化和浓缩产物)等量混合后，再分别与等量的弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂混合并用超声波乳化后制备成疫苗A和疫苗B用于免疫乳牛。

3怀孕乳牛的免疫注射程序

第一次免疫：怀孕后4～5月，分二点颈部皮下注射疫苗A，每点各3mL。

第二次免疫：第一次免疫后一个月，分二颈部皮下注射疫苗B，每点3mL。

第三次免疫：在分娩前一个月分2点皮下注射疫苗B，每点3mL。

4初乳的采集、加工

(1)分娩后1～3天内的初乳作为有效初乳采集保存。每头乳牛每次采集初乳用前，均应洗净乳头和乳房，再用常规消毒剂消毒后人工或机械采集初乳。每头乳牛每次采集的初乳在检测前于4℃保存。检测后，将合格的初乳尽快制作干份或冰冻保存。

(2)初乳的加工

将抗幽门螺杆菌凝集抗体及抗毒素沉淀抗体效价合格的初乳样品按现有常规技术制成干粉制剂。初乳蛋白干粉分装后用同位素CO⁶⁰照射灭菌。

(3)对同位素CO⁶⁰照射后的成品抽样做灭菌检验及特异性抗体的再检测。

5初乳中特异性抗体的检测

(1)幽门螺杆菌基因工程毒素的制备，在大肠杆菌中表达幽门螺杆菌的热休克蛋白，从重组菌的培养物的裂解物中提取、纯化和浓缩该热休克蛋白，达10mg/mL(纯度70％～80％)(热休克蛋白基因工程产物的制备见：李明峰等，幽门螺杆菌热休克蛋白A基因的克隆、表达及免疫原性研究，生物化学与生物物理学报，1999，31(3)：264-26)，作为检测初乳中抗幽门螺杆菌毒素抗体的水平的指示性抗原(代表性抗原)。该重组热休克蛋白也仅用于检测初乳中抗幽门螺杆菌毒素抗体水平诊断用指示抗原。

(2)测定将每份初乳取3mL分置于二个eppedoff离心管中，在15000r/min下离心20min，分离乳脂和乳清。取乳清分别检测对幽门螺杆菌的凝集抗体及对毒素蛋白的沉淀抗体。

1)菌体试管凝集反应每份样品取10只凝集反应用玻璃试管(100mm×8mm)，每管加入0.25mL幽门螺杆菌菌悬液(3×10⁹菌/mL)。悬液用pH 7.2的PBS液配制。将待试乳清样品分别用pH7.2 PBS做1∶2连续稀释，分别在1～9号管中加入0.25mL不同稀释度的待检乳清，第10管加入0.25mL PBS作为无自凝对照。

每次检测设一对照系列10只管，将4头非免疫乳牛产后1～2日初乳乳清混合后作为阴性对照。

将凝集管在室温(25℃左右)静置60min，观察试管管底细菌凝集状态，如果菌体呈伞状均匀沉积于整个管底，且在轻轻摇震后呈絮状物飘起，判为凝集阳性。如体呈点状集中沉积于管底中央，摇振后菌体均匀散开，判为为阴性。

如能产生50％菌体凝集的最大乳清稀释度为凝集价。

在同一试验中，将待试样品的凝集价与非免疫乳牛乳清的凝集价比确定为有效特异性凝集价。如≥1∶4为合格。

2)初乳中抗毒素琼脂扩沉淀抗体效价的测定用pH 7.2的PBS配制1％的琼酯糖悬液，在100mm平皿中倾入20mL，在室温下冷却自然形成凝胶后，置于4℃冰箱保存备用(可保存一周)。

用标准的琼脂扩散沉淀反应打孔器在凝胶上打孔。于中央孔中加入100μL重组热休克蛋白悬液(10mg/mL)，在5个外周孔中分别加入用pH 7.2PBS的作1∶2连续稀释的乳清样品。另1个孔加入未经稀释的未免疫乳牛初乳乳清做为阴性对照。

结果判定：在阴性对照乳清不产生沉淀线的条件下，以针对重组热休克蛋白产生沉淀线的最大稀释度作为乳清样品对重组热休克蛋白的琼扩沉淀反应抗体效价。出现沉淀线时判为阳性。并以此代表初乳中对幽门螺杆菌多种毒素特异性抗体的平均水平。

3)经测定得知：经用本发明所制备幽门螺杆菌菌体和幽门螺杆菌毒素混合疫苗免疫后的乳牛所诱发的特异性免疫球蛋白可不断分泌到乳牛乳汁中，特别是分娩后5天内的初乳中，初乳中免疫球蛋白浓度可达3％～6％比常乳高30～60倍；1～3日内初乳乳清中对幽门螺杆菌抗体的试管凝集效价分别为1∶8，1∶4，1∶2；对重组菌表达的热休克蛋白(纯度80％，10mg/mL)抗原的琼扩沉淀抗体效价分别为1∶4，1∶2，1∶1。

附图说明

附图1：初乳中抗毒素琼脂扩沉淀抗体效价的测定结果。

图1中：中央孔为重组菌表达的幽门螺杆菌热休克蛋白悬液(10mg/mL，纯度为80％)，外周孔除一个孔加入未免疫牛初乳乳清作为阴性对照外，其余5孔加入的是在分娩后1～3天内采分别5次采集的初乳乳清，均出现沉淀线。

本发明的优点

吃入的牛初乳中的针对幽门螺杆菌及其毒素的特异性免疫球蛋白可直接作用于在胃粘膜表面的幽门螺杆菌特别是其毒素，以此减弱该菌的繁殖力从而强化抗菌素的抗菌效果，特别是可直接中和胃黏膜表面由该菌产生的毒素，减弱其致病作用。

实施例1

将幽门螺杆菌SS1株菌种接种于幽门螺杆菌用肉汤培养基，置于分别含85％氮气、10％二氧化碳及5％氧气的混合气体的厌氧培养箱中于35～37℃培养3～4天后，于3000×g的离心力下将培养液离心30min。将细菌沉淀物再悬浮于含0.5％福马林的生理盐水中灭活细菌并洗去培养液中的内毒素，再按109菌落形成单位(cfu)/mL浓度将其悬浮副pH 7.2 PBS中重新制成悬液。

将以上幽门螺杆菌SS1株菌培养液离心后的上清液用能截留分子量1万左右超滤膜(如天津通海净水设备厂的TH-30-1超滤膜)分级过滤，除去小分子量的内毒素，保留并浓缩分子量大于1万的毒素蛋白质抗原，浓缩至总蛋白量10mg/mL。

将上述1份幽门螺杆菌43504株菌体悬液和1份幽门螺杆菌43504株毒素蛋白质抗原(细菌培养上清液经超滤纯化和浓缩产物)等量混合后，再分别与等量的弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂混合并用超声波乳化后制备成疫苗A和疫苗B用于免疫乳牛。

实施例2

用幽门螺杆菌Hp Y06株替代实施例1中的幽门螺杆菌SS1株制备成疫苗A和B用于免疫乳牛。

实施例3

用幽门螺杆菌Hp 27株替代实施例1中的幽门螺杆菌SS1株制备成疫苗A和B用于免疫乳牛。

实施例4

用幽门螺杆菌43504株替代实施例1中的幽门螺杆菌SS1株制备成疫苗A和B用于免疫乳牛。

实施例5

免疫怀孕乳牛注射程序

第二次免疫：第一次免疫后一个月，与颈部两侧各皮下注射疫苗B，每侧3mL。

实施例6

分娩后1～3天内的初乳作为有效初乳采集保存。每头乳牛每次采集初乳用前，均应洗净乳头和乳房，再用常规消毒剂消毒后人工或机械采集初乳。经检验合格的初乳按现有常规技术制成干粉制剂。初乳蛋白干粉分装后用同位素CO⁶⁰照射灭菌。

实施例7

初乳中特异性抗体的检测

将每份初乳取3mL分置于二个eppedoff离心管中，在15000r/min下离心20min，分离乳脂和乳清。取乳清分别检测对幽门螺杆菌的凝集抗体及对毒素的沉淀抗体。

如能产生50％菌体凝集的最大乳清稀释度为凝集价。

Claims

1.一种乳牛的初乳制品，其特征在于含有针对幽门螺杆菌菌体及其毒素蛋白的特异性免疫球蛋白的乳牛初乳蛋白，作为有幽门螺杆菌感染人群的保健营养品。

2.一种乳牛的初乳制品的制备方法，其特征在于：将培养纯化的可诱导针对幽门螺杆菌的保护性免疫应答的VacA、CagA、HspA、HspB、尿素酶和过氧化氢酶等多种抗原的人幽门螺杆菌菌体及其毒素蛋白抗原与佐剂混合乳化后免疫注射怀孕乳牛，诱发针对幽门螺杆菌及其毒素的特异性免疫球蛋白分泌到乳牛乳汁中，收集牛初乳，经过检测并根据现有技术加工成各型乳制品。

3.如权利要求2所述的一种乳牛初乳制品的制备方法，其特征在于用每毫升含3×10⁹菌体细胞的幽门螺杆菌菌悬液对待检乳牛初乳乳清应用试管凝集试验，测定乳牛初乳中抗幽门螺杆菌菌体凝集抗体效价。

4.如权利要求2所述的一种乳牛初乳制品的制备方法，其特征在于以经纯化和浓缩的幽门螺杆菌的重组热休克蛋白为指示抗原，用琼脂扩散沉淀反应测定乳牛初乳中抗幽门螺杆菌外毒素蛋白抗体的效价。