JPH11512746A - 乳漿中の免疫グロブリンの単離方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、乳漿または乳漿濃縮液からの免疫グロブリンの単離方法並びに高度に精製されている濃縮免疫グロブリン生成物を目的とする。本方法は、脂質および非免疫グロブリンタンパク質を荷電ポリマーおよび脂肪酸と同時に共沈殿させすることを特徴とする。

Description

【発明の詳細な説明】 乳漿中の免疫グロブリンの単離方法 発明の技術分野 本発明は、乳漿および乳漿濃縮液からの免疫グロブリンの単離方法、並びに高 度に精製されそして容易に投与される濃縮免疫グロブリン生成物を目的とする。 本発明はまた、（ウシ）ワクチンのための抗原の製造および選択方法、腸毒素産 生性大腸菌（ＥＴＥＣ）によって引き起こされる感染症の治療方法、並びにＥＴ ＥＣ感染症の治療に有効な免疫グロブリン生成物を目的とする。 発明の背景 免疫グロブリンまたは抗体は、外来組成物の存在に応答して高等動物によって 産生される。免疫反応を引き出すことができる、かかる外来組成物は抗原と呼称 される。免疫グロブリンは、抗原に特異的に結合または付着することができる複 合タンパク質である。 免疫グロブリンは、疾病に対する宿主生物の闘争において重要な役割を演じる 。免疫グロブリン（Ｉｇと略記されることが多い）または抗体（ＡＢと略記され る）は、数種の異なった形態で産生される。これらのクラスの免疫グロブリンに は、ＩｇＧ、体内液および一定の乳汁分泌物中に豊富である；ＩｇＡ、漿粘液性 分泌物中に豊富である；ＩｇＭ、有効な凝集剤；ＩｇＤ、リンパ球の表面上に見 出だされる；およびＩｇＥ、アレルギ反応に関与する；がある。ＩｇＧはウシの 乳汁および初乳中の主要な免疫グロブリンであり、一方ＩｇＡはヒトの乳汁分泌 物中の優性 な免疫グロブリンである。乳汁または初乳中に存在する抗原特異性免疫グロブリ ンの水準は、非経口または乳房内免疫感作療法によって増加させることができる 。 ウシの乳汁または初乳に由来する高度免疫性免疫グロブリンは、各種の医薬的 ／医学的適用での使用に提案された。これらの中には、Ｃ．パルビム（Ｃ．ｐａ ｒｖｕｍ）、Ｈ．ピロリ（Ｈ ｐｙｌｏｒｉ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、シゲ ラ種（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐｅｃｉｅｓ）、Ｓ．変異株（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ） およびカンジダ種（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐｅｃｉｅｓ）を含む病原菌によって引 き起こされた感染症の治療または予防のための経口的および局所的適用がある。 腸毒素産生性大腸菌（ＥＴＥＣ）は旅行者の下痢に関連する疾病を引き起こす。 この目的のための免疫グロブリンは、分娩後の最初の４−５回搾乳である初乳 からのもの、または残余の授乳期の間に産生された乳汁からのものであることが できる。免疫グロブリンは、初乳中では、乳汁（０．３〜０．５ｍｇ／ｍｌ）と 比較して比較的に高濃度（２０〜１００ｍｇ／ｍｌ）で存在するが、初乳から商 業的数量の免疫グロブリンを製造することは、供給量が制限されそして個々のウ シから少量を収集し商業的規模で加工するという複雑性によって困難になる。 対象的に、牛乳は供給が豊富でありそして収集および加工のためシステムがよ く確率している。牛乳中の免疫グロブリンの水準は低いが、通常のチーズ製造の 間に、大多数の牛乳免疫グロブリンが乳漿中に流入することはよく知られている 。乳漿はチーズ製造工業の低コストで豊富な副産物であり、そしてＩｇ精製のた めの原材料として容易に入手できる。 牛乳および乳漿中の免疫グロブリンの濃度が比較的に低いことの外に、 精製乳漿免疫グロブリンの商業的数量を製造する際のその他の困難性は、β−ラ クトグロブリンおよびα−アルブミンを含む非免疫グロブリンタンパク質の高濃 度（４〜６ｍｇ／ｍｌ）の存在である。これらのタンパク質の９０％以上を除去 することが、免疫グロブリンが全タンパク質の６０％以上を構成する最終生成物 を製造するために必要である。 免疫グロブリン生成物はヒトのＥＴＥＣの治療のために提案された。しかし、 これらの生成物は、有効投与量の大きい容積、質量またはコストのために不成功 であった。有効投与量の容積および質量が大きいから、典型的にはフードバー、 還元牛乳様製品などの形態で被験者に投与することが制限される。最も望ましい 剤形は、携帯性および便宜性を提供する小さい錠剤またはカプセル剤である。か かる製剤には、高純度の高濃度免疫グロブリン調製物が必要である。免疫グロブ リンを基材とする抗ＥＴＥＣ製品を開発する従来の努力は、ＥＴＥＣに対する高 い特異的活性を有する携帯可能で保存に安定な剤形についての要望を解決するこ とができなかった。 それ故、乳漿から商業的数量の免疫グロブリンを製造するためには、非免疫グ ロブリンタンパク質の簡便でかつ低コストの除去および大量の液体の高度処理を 可能にする加工方法が必要である。 発明の要旨 本発明は、６０重量％を超える免疫グロブリンである最終乳漿タンパク質調製 物を提供する、乳漿、乳漿濃縮液、乳漿フラクションまたは部分的脱タンパク質 乳漿濃縮液からの免疫グロブリンのを精製方法を特徴とする。本方法は乳漿物質 の、荷電ポリマーおよび脂肪酸との混合物を形成することを含んでなる。好適に は、荷電ポリマーはカチオン性ポリ マーである。荷電ポリマーは、沈殿条件を掛けた際に荷電ポリマーが脂質−ポリ マー沈殿物および液相を形成する混合物中の濃度で添加される。 脂肪酸は好適には、式： ＣＨ₃−（ＣＨ₂）_n−ＣＯＯＨ 式中、ｎは４〜１０の全数である、で示される。脂肪酸は、沈殿条件を掛けた際 に脂肪酸がタンパク質沈殿物および液相を生成する濃度で混合物中に存在する。 本方法は、沈殿条件を掛けてタンパク質沈殿物、脂質沈殿物および液相を生成す る工程をさらに含んでなる。液相はタンパク質および脂質−ポリマー沈殿物から 分離される。この液相は免疫グロブリンに富みそしてさらに加工することができ る。 驚くべきことにはまた意外にも、カチオン性ポリマーおよび脂肪酸の組合せに よって、カチオン性ポリマーおよび脂肪酸を連続的に使用する場合よりも大きい 程度で、非免疫グロブリンタンパク質および脂質が同時沈殿させることができる 。残存の溶離液は６０％以上の免疫グロブリンである。かかる純度は初乳の乳漿 中に存在する免疫グロブリンの濃度に匹敵しそして通常の大きさの剤形を達成す るのに必要な濃度および純度に匹敵する。 さらに驚くべきことにはまた意外にも、以下に非常に詳細に記載されるように 、一部本発明の方法の結果として、１ｇまたはそれ以下の単位剤形中に包装され そしてヒト被験者中の病原体による能動感染の予防または治療のための抗体の有 効量をなお含有する免疫グロブリン生成物が製造することができる。 脂質沈殿物およびタンパク質沈殿物は、比較的に低速度の遠心分離（６−１２ ，０００×ｇ）によって同時に分離されて、高濃度の免疫グロブ リンを有する清澄な上澄液を製造することができる。上澄液はさらに濃縮されそ してダイアフィルトレーショされて、７０％を超える免疫グロブリンタンパク質 および０．１乾燥重量％の脂質である組成物を製造することができる。この上澄 液は乾燥することができる。 好適には、脂肪酸およびカチオン性荷電ポリマーは同様な沈殿条件を有するよ うに選ばれる。 好適には、カチオン性荷電ポリマーはポリペプチドおよび荷電多糖を含む群か ら選ばれる。好適な荷電多糖はキトサンである。キトサンは部分的に脱アセチル 化されたキチンから誘導されたカチオン性ポリマーである。キトサンは、４．５ 〜５．０のｐＨで極性脂質とゲル様複合体を生成する。 好適には、式： ＣＨ₃−（ＣＨ₂）_n−ＣＯＯＨ 式中、ｎは６である、の中で、脂肪酸は好適にはカプリル酸である。カプリル酸 は、４．５〜５．０のｐＨで非免疫グロブリンタンパク質とのコロイド様凝集体 を生成する。 カチオン性多糖がキトサンを含んでなる場合には、脂質沈殿物を生成するため の条件は、４．５〜５．０のｐＨ、２０〜２５℃の温度および０．０５〜０．３ 重量容積％の濃度を含んでなることができる。脂肪酸がカプリル酸である場合に は、タンパク質沈殿物を生成するための条件は、４．５〜５．０のｐＨ、２０〜 ２５℃の温度および１．０〜５．０容積％の濃度を含んでなることができる。脂 質およびタンパク質の共沈殿には、一工程のみが必要でありそして個別の工程よ り少ない試薬が必要である。実際に、驚くべきことにはまた意外にも、キトサン −脂質沈 殿物は、サブミクロンの粒径の粒子を有効に除去するための長い高速（＞１５， ０００×ｇ）遠心分離または精密濾過をそれ自体必要とする脂肪酸−タンパク質 沈殿物の除去を助成する。組合せ沈殿物の除去には、「低速度適時間」または「 高速度短時間」遠心分離のみが必要である。この能力によって、大規模の製造が 顕著に促進される。追加の純度が望まれる場合、脂質および非Ｉｇとキトサンお よびカプリル酸との共沈殿は反復することができる。 好適には、Ｉｇ富化上澄液は、低分子量のタンパク質およびペプチドを除去す るために、限外濾過によって濃縮されて、さらなるＩｇ富化保留液を生成する。 好適には、限外濾過は、約１０，０００〜１５０，０００ダルトン、さらに好適 には２０，０００〜５０，０００ダルトンの分子量カットオフを有する膜を用い て行われる。 好適には、Ｉｇ富化保留液は、ペプチド、ミネラルおよびラクトースを除去す るために、ダイアフィルトレーショされて、透析免疫グロブリン濃縮液を生成す る。好適な透析濾過緩衝液はｐＨ６．５のクエン酸カリウム緩衝液である。 免疫グロブリン含有上澄液は好適には、無菌濾過によって加工される。無菌濾 過は、高脂質濃度を有する物質については困難である。無菌濾液は乾燥されて、 乾燥免疫グロブリン富化生成物を生成する。 好適には、透析Ｉｇ濃縮液は凍結乾燥されて粉末を生成する。乾燥免疫グロブ リン生成物は、高脂質水準が乾燥生成物の損傷の主要因子であるから、貯蔵寿命 が改良されている。本方法によって製造された乾燥免疫グロブリン生成物は６． ０％未満の脂質を有する。 一定の態様では、方法は、前記の一種またはそれ以上の抗原に対する 抗体の産生を誘導する一種またはそれ以上の抗原を乳汁産生中の哺乳類にワクチ ン接種し、次いで前記哺乳類から乳汁または初乳を収集し、次いで乳汁または初 乳を加工して、乳漿物質を生成する工程をさらに含んでなる。一つの重要な態様 では、抗原は腸毒素産生性大腸菌に特有である。本発明のさらなる態様によれば 、抗原は一種またはそれ以上の集落形成因子抗原である。 本発明の態様は、火入れ殺菌チーズ乳漿に由来する乳漿を使用することができ る。チーズ乳漿は１６１〜１６３°Ｆ、１５〜１７秒間火入れ殺菌されるか、ま たは１４０°Ｆ〜１４２°Ｆ、３０分間火入れ殺菌される。別法では、乳漿濃縮 液は火入れ殺菌することができる。 好適には、第一混合物中の濃縮乳漿は、火入れ殺菌乳漿を限外濾過することに よって製造される。好適には、限外濾過は、１０，０００〜１５０，０００ダル トンの分子量カットオフ、最も好適には３０，０００ダルトンの分子量カットオ フを有する膜を用いて行われる。 第一混合物の濃縮乳漿は、例えば、火入れ殺菌乳漿のスパイラル状膜または中 空繊維限外濾過によって製造されてもよい。好適には、中空繊維限外濾過は、１ ０，０００〜１５０，０００ダルトン、最も好適には３０，０００ダルトンの分 子量カットオフを有する膜を用いて使用される。好適な中空繊維限外濾過膜はポ リスルフォンの中空繊維状膜である。この膜は５〜１０倍の濃縮倍数を生み出す 。 好適には、濃縮乳漿はさらにイオン交換クロマトグラフィーに付されて、非免 疫グロブリンタンパク質の濃度を低下させる。好適なクロマトグラフィー的イオ ン交換法は、強アニオン性樹脂および６．５〜７．０のｐＨを有する乳漿タンパ ク質濃縮液を使用する。アニオン交換クロマ トグラフィーはこれらの条件下で使用されて、免疫グロブリン水準を著しく変え ることなく、乳漿または乳漿タンパク質濃縮液から非免疫グロブリンタンパク質 の２０〜７０％を除去する。部分的脱タンパク質乳漿または乳漿タンパク質濃縮 液は、上記の組合せ沈殿法による乳漿免疫グロブリンの精製のための好適な出発 物質である。非免疫グロブリンタンパク質水準が低くそして加工容積が小さいか ら、この出発物質の場合、少量の錯形成剤が必要である。 好適には、ＥＴＥＣに向けられた抗原は集落形成因子抗原類（ＣＦＡ）よりな る群から選ばれた抗原を含んでなる。ＣＦＡの好適な群はＣＦＡ／Ｉ、ＣＦＡ／ ＩＩ（ＣＳ１、ＣＳ２、ＣＳ３）および／またはＣＦＡ／ＩＶ（ＣＳ４、ＣＳ５ 、ＣＳ６）ファミリーの抗原を含んでなる。ＣＦＡの最も臨床的に多用されるフ ァミリーは以下の表１中で確認される： 臨床的重要性の低い他のＣＦＡは、ＣＦＡ／ＩＩＩ（１員）、ＣＳ１７、ＰＣ Ｆ０１５９およびＰＣＦ０１６６である。 抗原は上記の抗原のいずれか一種またはそれ以上であることができる。抗原は 、例えば、少なくともＣＦＡ／ＩおよびＣＦＡ／ＩＩ抗原または、さらに詳しく は以下の抗原：ＣＦＡ／Ｉ、ＣＦＡ／ＩＩおよびＣＦＡ／ＩＶのすべての代表物 よりなることができる。好適なＣＦＡ−ＩＩ抗原はＣＳ３抗原よりなる。好適な ＣＦＡ−ＩＶ抗原はＣＳ６抗原である。 本発明のさらなる態様は、目的の免疫グロブリンを産生する抗原で高度免疫感 作された乳汁産生中の哺乳類に由来する免疫グロブリン生成物を特徴とする。本 発明の一つの態様では、哺乳類は、ＥＴＥＣ／ＣＦＡに向けられた抗原で高度免 疫感作されて、腸毒素産生性大腸菌の治療のための免疫グロブリンを産生する。 免疫グロブリン生成物は少なくとも６０重量容積％の抗体、≦５％の脂質、およ び≦２０％の非Ｉｇタンパク質を含んでなる。この生成物はさらに水を除去する ように加工されて、少なくとも７０％の抗体、６．０％または未満の脂質および ２０％未満の非Ｉｇタンパク質を含んでなるＩｇ生成物を産生することができ、 これは疾病の治療のために投与することができる。 免疫グロブリン生成物はまた、他の病原菌に特有の抗原を含むいずれの数の供 源からの抗原にも結合できる抗体を含んでなることができる。かかる病原菌は好 適には、クリプトスポリジウム・パルブム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）、ロタウイルス（Ｒｏｔａｖｉｒｕｓ）、シゲラ・フレキシネリ （Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉ ｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）、クロストリジウム・ジフィキレ（Ｃｌｏｓ ｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、ビブリオ・コレラ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ） 、ストレプトコッカス変異株（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）お よびカンジダ種 バクテリオデス・ギンギバリ（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐｅｃｉｅ ｓ Ｂａｃｔｅｒｉｏｄｅｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、バクテリオデス・メラ ニノゲニクス（Ｂａｃｔｅｒｉｏｄｅｓ ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃｕｓ）、 カプノシトファガ種（Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ ｓｐｅｃｉｅｓ）、アク チノバチルス・アクチノミセテノムコミタンス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）、ポルフィロモナス・ギンギ バリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、ストレプトコ ッカス・ソブリヌス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓ）並びに 腸毒素産生性大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）よりなる一つまたは それ以上の群から選ばれる。 本発明の他の態様によれば、免疫グロブリン生成物は乳汁または初乳から単離 されそしてＥＴＥＣに関連する抗原に結合できる抗体を含んでなる。抗体は、ウ シに腸毒素産生性大腸菌の全抽出物を接種することによって達成される力価の３ 〜５０倍の力価を示す。これらの高力価は、単離ＣＦＡ抗原を含んでなるワクチ ン、好適には大腸菌に結合するかまたは大腸菌の集落形成因子抗原に結合する免 疫グロブリン生成物中の大多数の抗体でウシを高度免疫感作するによって達成す ることができる。 本発明の他の態様によれば、受動免疫療法用生成物が提供される。それは、１ ｇまたはそれ以下の単位剤形中に包装されそして腸毒素産生性大腸菌によるヒト 被験者の感染を予防することによってかまたは予防するためにヒト被験者の能動 感染を治療するのに有効な量で存在する、腸 毒素産生性大腸菌に結合する免疫グロブリンを含んでなる。好適には、免疫グロ ブリンは上記のように集落形成因子抗原に結合する。一つの態様では、抗原は「 精製」される。用語「精製される」とは、本出願の文脈では、実質的に非ＣＦＡ 抗原を含まないことを意味する。即ち、かかる非ＣＦＡ抗原は、存在する場合、 基線の２倍を超える免疫反応を作り出すには十分ではない、即ち非免疫状態とな る。好適なＣＦＡ抗原はＣＦＡ−Ｉ、ＣＦＡ−ＩＩおよびＣＦＡ−ＩＩＩである 。 本発明の免疫グロブリン生成物は、再形成液剤、錠剤、カプセル剤、顆粒剤ま たはフードバーとして被験者に投与することができる。非免疫グロブリンタンパ ク質および脂質を除去してあるので、免疫グロブリンの有効投与量は容易に種々 の形式で投与することができる。一つの態様では、有効投与量は、腸毒素産生性 大腸菌に感染した個人または同大腸菌に感染する危険がある個人に投与され、有 効投与量は腸毒素産生性大腸菌の抗原に結合する抗体を含んでなり、抗体は少な くとも７０％の免疫グロブリン、６％未満の脂質および２０％未満の非Ｉｇタン パク質を含有する生成物として調合されている。 本発明の態様は、残留脂質、チーズ培養バクテリア、変性タンパク質凝集物お よび脂肪酸沈殿した乳漿タンパク質を同時に除去することができる。脂質および タンパク質沈殿物は、キトサンの存在下で比較的に低速の遠心分離によって除去 することができる。タンパク質沈殿物および脂質沈殿物の同時遠心分離によって 、高純度の免疫グロブリンの回収率が改善される。 タンパク質および脂質沈殿物は、脂肪酸・タンパク質沈殿物の多くがサブミク ロンの大きさであるから、通常の精密濾過法によって、免疫グ ロブリンの回収率の低下なしには、容易には除去されない。分離乳漿中の脂質の 濃度は低いが、乳漿は加工中に濃縮されているから、残留脂質は５〜２０乾燥重 量％の水準に達する。 これらの高脂質濃度は、液体Ｉｇ生成物の加工性並びに貯蔵性を低下させる。 高水準の脂質を持つ生成物は無菌濾過することができずそして損傷を受け易い。 これらの問題点は本方法で克服される。本方法に従って製造された生成物は低脂 質かつ低非Ｉｇタンパク質含量を特徴とする。かかる免疫グロブリン富化生成物 は、有効投与量の場合に小容積および小重量を占める。生成物を含んでなるＩｇ フラクションは無菌濾過することができそして長期の保存寿命を有する。 これらのおよび他の特徴は、実施例によって、限定することなく、本発明の好 適な態様を説明する以下の図面および詳細な説明から明らかになる。 図面の簡単な説明 図１は本発明の特徴を実施する方法を説明する工程系統図を示す。 図２および図３は、被験者が本発明の特徴を具体化している生成物を服用する 臨床試験からの結果を図式的に示す。 発明の詳細な説明 本発明は乳漿からの免疫グロブリンの単離方法であり、ＥＴＥＣに向けられた もの、それらに限定されないが、を含む。図１は本方法を工程系統図で説明する 。各工程を実施する装置は該技術分野でよく知られている。 本明細書で使用されるように、用語「乳漿」とは、チーズ製造法中のように、 カードから分離する牛乳の水状部分を指す。「乳漿フラクショ ン」とは、乳漿タンパク質のすべてまたはある部分を含んでなる乳漿の一部を指 す。「部分的脱タンパク質乳漿濃縮液」とは、非免疫グロブリンタンパク質のす べてまたはある部分が除去されている乳漿の一部を指す。本方法は、比較的に少 さい剤形で投与され得る免疫グロブリン生成物を製造するのに使用することがで きる。 図１で説明される工程は、チーズ製造、および乳漿分離および清澄化の生成物 から始まる。濃縮乳漿は好適には、スイス、チェダー、モッツァレッラまたはプ ロボローネ・チーズ製造方法から製造される。乳漿は、ウシ、好適には一種また はそれ以上の抗原をワクチン接種されたウシによって産生された乳汁を原料とす る。本発明の一つの重要な態様では、動物はＣＦＡで免疫感作される。好適なＣ ＦＡは、ＣＦＡ−Ｉ、ＣＦＡ−ＩＩ、およびＣＦＡ−ＩＶから選ばれる。好適に は、すべての３種のＣＦＡファミリーの代表物はワクチン中に存在する。好適な ＣＦＡ−ＩＩはＣＳ１およびＣＳ３であり、最も好適にはＣＳ３である。好適な ＣＦＡ−ＩＶはＣＳ６である。かかるＣＦＡで免疫感作された動物は、それらの 乳汁中に、かかる抗原に向けられる免疫グロブリンを分泌する。種々の抗原で免 疫感作された一匹またはそれ以上の動物からの乳漿は、複数の抗原に向けられる 免疫グロブリンを得るために蓄えることができる。典型的には、すべての動物を すべての抗原で免疫感作する。 好適には、脂肪は、チーズ製造法から得られた未濃縮乳漿から、標準酪農クリ ーム分離機を使用して分離される。 好適には、乳漿は、チーズ製造法から直接に回収された乳漿の５〜１０倍まで 濃縮される。好適には、乳漿は、図１中で番号１５によって一般的に示される中 空繊維状またはスパイラル状膜限外濾過によって濃縮 される。好適な限外濾過法は約３０，０００ダルトンの分子量カットオフを有す る。 好適には、乳漿濃縮液は火入れ殺菌される。典型的には、火入れ殺菌条件は、 １５〜１７秒の期間の１６１〜１６３°Ｆの温度または３０秒の期間の１４０〜 １４２°Ｆの温度を含んでなる。乳漿は、濃縮前または後に、同様の火入れ殺菌 条件を使用して火入れ殺菌することができる。 好適な限外濾過法はポリスルフォン中空繊維状膜を利用する。限外濾過法中は 、２５〜４０ｐｓｉのルーメン供給圧および１０〜１２℃の運転温度の場合、５ 〜１の供給量対透過量比が典型的である。 限外濾過によって製造された濃縮乳漿は、図１で経路Ａとして示された選択的 イオン交換クロマトグラフィー工程に付されてもよい。好適には、選択的交換ク ロマトグラフィー工程は、アニオン性交換樹脂による非免疫グロブリンタンパク 質量の除去を含んでなる。この工程は一般的に数字１７で示される。アニオン交 換法の後、流出液は免疫グロブリン富化フラクションを含んでなる。好適には、 免疫グロブリン富化フラクションは、さらなる限外濾過およびさらなるイオン交 換クロマトグラフィーに付して、追加の非免疫グロブリンタンパク質を除去する 。限外濾過工程は一般的に数字１９で示される。これらのイオン交換クロマトグ ラフィー工程および限外濾過工程は所望に応じて反復することができる。 場合により、脂肪が、乳漿の濃縮前にクリーム分離機の使用によっても除去さ れない場合、Ｉｇフラクションは、最終イオン交換クロマトグラフィーおよび限 外濾過の後、脂肪除去のために遠心分離される。遠心分離の工程は、経路Ｂによ って示されるように、最初の限外濾過工程１５からの濃縮乳漿生成物について行 うことができる。好適には、酪農用 分離機は３，０００〜１２，０００ｒｐｍ（５〜１５，０００×ｇ）で使用され そして遠心分離は１０〜５５℃の温度で行われる。この工程は一般的に図１中で 数字２３によって示される。分離または脱脂質乳漿は、その後の沈殿処理のため の濃縮乳漿の供源を構成する。 カチオン性ポリマーは、所期の脂肪酸と協力して、脂肪酸がタンパク質と反応 するように、脂質の沈殿を受けるように選ばれる。カチオン性ポリマーは好適に は、ポリペプチドまたは多糖を含んでなる群から選ばれる。好適な多糖はキトサ ンである。キトサンの特に好適な種類はＳｅａｃｕｒｅ４４３（Ｐｒｏｎｏｖａ Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．，Ｐｏｒｔｓｍｏｕｔｈ，ＮＨ），小エビ （ｓｈｒｉｍｐ）由来の部分的に脱アセチル化されたポリ−Ｎ−アセチルグルコ サミンである。 沈殿条件を掛けた際に残留脂質の沈殿物を形成するのに有効なキトサン量は約 ０．２容積％である。この混合物のｐＨは、ＮａＯＨ溶液の添加によって、ｐＨ ４．５〜５．０に調節される。次いで、このｐＨ調節混合物はさらに、脂肪酸、 好適にはカプリル酸の添加によって反応させられ、この脂肪酸は、キトサンが脂 質と反応するように、タンパク質と反応する。 好適なポリペプチドは、塩基性ポリアミノ酸、またはＡ型Ｇｅｌａｔｉｎ（ｐ Ｉ ７．０〜９．０）のような酸可溶性塩基性タンパク質よりなる群から選ばれ る。これらのポリペプチドは、４．５〜５．０のｐＨおよび１〜５重量％のポリ ペプチドの濃度で脂質沈殿物を生成することができる。 沈殿条件を掛けた際にタンパク質沈殿物を生成するカプリル酸の有効量は、約 ５重量容積％である。キトサン、カプリル酸および濃縮乳漿の 混合は、撹拌子、パドルまたは該技術分野で既知のその他の混合装置を含んでな ってもよい。キトサンおよび脂質の場合の脂質沈殿条件は、２０〜２５℃の温度 および４．５〜５．０のｐＨを含んでなる。非ＩｇＧタンパク質およびカプリル 酸の場合のタンパク質沈殿条件は、２０〜２５℃の温度および４．５〜５．０の ｐＨを含んでなる。従って、脂質沈殿条件およびタンパク質沈殿条件は同時に掛 けられてもよい。 好適には脂質の沈殿条件およびタンパク質の沈殿条件は、混合物が混合によっ て生成された後、５〜３０分間掛けられる。即ち、５〜３０分の期間は、混合物 が実質的に静置するのに与えられ、１５分間が好適である。 脂質沈殿物およびタンパク質沈殿物を含有する混合物を受容できる適切な遠心 機が、固体および液相を分離するのに使用される。遠心機は混合物に１５〜２０ ，０００×ｇの力を掛けることができるべきであり、そして好適には放出式固体 遠心機である。好適なボール遠心機はＳｈａｒｐｌｅｓ遠心機でありそして好適 な放出式遠心機は自動脱スラッジ式Ｃａｒｒ Ｐ−１２遠心機またはＡｌｆａ− Ｌａｖａｌ遠心機である。好適には、遠心機アセンブリーは２０〜２５℃の温度 に維持される。これらの条件下で、遠心機は免疫グロブリン富化上澄液から脂質 沈殿物およびタンパク質沈殿物を分離する。脂質およびキトサンを含んでなる脂 質沈殿物は、タンパク質沈殿物の除去を助成して、低重力がコロイド状粒子の実 質的にすべてを除去することができる。この沈殿工程はまた、主としてキトサン による汚染微生物の凝集のために、細胞汚染を実質的に減少させる。遠心分離の 後、液体上澄液フラクションのｐＨは６．５に調節される。キトサンおよびカプ リル酸による脂質および非ＩｇＧタ ンパク質の共沈殿並びに遠心分離は所望に応じて反復されてもよい。 免疫グロブリン富化上澄液はさらに濃縮に付すことができる。この濃縮は、図 １中で数字３１によって一般的に示される限外濾過によって行われる。好適には 、限外濾過は、１０，０００〜１５０，０００ダルトン、最も好適には３０，０ ００ダルトンの分子量カットオフを有するポリスルフォン中空繊維状膜を使用し て行われる。この限外濾過工程は、上澄液をさらに１５〜２５倍に濃縮すること ができる。限外濾過によって、低分子量のポリペプチドが膜を透過することが可 能になり、その間免疫グロブリン富化保留液は保持される。典型的には、限外濾 過は５：１の供給量対透過量比、１５〜３０ｐｓｉのルーメン供給圧を有し、そ して１０〜１２℃で維持される。 免疫グロブリン富化保留液はさらに、１０，０００〜１５０，０００ダルトン 、または最も好適には３０，０００ダルトンの公称分子量カットオフを有するポ リスルフォン中空繊維状膜を使用してダイアフィルトレーショすることができる 。保留液は、６．５のｐＨの脱ミネラル水道水中の１５ｍＭクエン酸カリウム緩 衝液を使用してダイアフィルトレーショされる。ダイアフィルトレーショによっ て、さらにポリペプチド、ミネラルおよびラクトースが透過することができる。 ダイアフィルトレーショは、５：１の透過比、１５〜３０ｐｓｉのルーメン供給 圧、および１０〜１２℃の温度で行われる。 ダイアフィルトレーショからの最終保留液は、凍結乾燥または噴霧乾燥によっ て乾燥される。この工程は一般的に図１中で数字３３によって示される。乾燥粉 末は少なくとも８５％のタンパク質を特徴とし、そのタンパク質は７０％の純Ｉ ｇおよび６重量％未満の脂質を表す。 好適な投与方法は、腸溶コーティング錠剤、カプセル剤およびペレット剤を含 んでなる。当業者は、ＩｇＧ生成物を一種またはそれ以上の腸溶コーティング錠 剤、カプセル剤およびペレット剤に製剤することができる。多くの可能な腸溶性 製剤がある。一種の製剤を以下に示す： 上記の製剤では、最初の３種の成分が均一に配合される。第４の成分は水に溶 解され、そして最初の３種の成分の均一な配合物に添加されて、湿潤な顆粒体を 形成する。湿潤な顆粒体は押出され、そして１．０〜２．０ｍｍの顆粒に球状化 される。顆粒は約２％水分まで乾燥される。水中のヒドロキシプロピルメチルセ ルロース（ＨＰＭＣ）の分散液は流動床噴霧乾燥機中で顆粒に塗布される。水中 のＥｕｄｒａｇｉｔ（商標）Ｌ３０Ｄ（Ｒｏｈｍ Ｐｈａｒｍａ，Ｂａｓｅｌ， Ｓｗｉｔｚｌａｎｄ）およびクエン酸トリエチルＮＦ（Ｍｏｒｆｌｅｚｘ Ｉｎ ｃ．，Ｇｒｅ ｅｎｓｂｏｒｏ，ＮＣ）の分散液は、流動床噴霧乾燥機中でＨＰＭＣコーティン グ顆粒に塗布される。 上記の製剤では、牛乳タンパク質は精製ＩｇＧ生成物を含んでなる。上記の製 剤では、Ａｖｉｃｅｌ ＰＨ１０１（ＦＭＣ Ｃｏｒｐ．，Ｎｅｗａｒｋ，ＤＥ ）は結合剤である。Ａｖｉｃｅｌ ＰＨ１０１は微結晶性セルロースである。他 の結合剤は微結晶性セルロースの代わりに用いられてもよい。 上記の製剤では、Ａｃ−Ｄｉ−Ｓｏｌ（ＦＭＣ Ｃｏｒｐ．，Ｎｅｗａｒｋ， ＤＥ）は崩壊剤である。Ａｃ−Ｄｉ−Ｓｏｌは架橋カルボキシメチルセルロース ナトリウムである。他の崩壊剤は上記の製剤中でＡｃ−Ｄｉ−Ｓｏｌの代わりに 用いられてもよい。 上記の製剤では、ポリグリコールＥ４５００ＮＦ（Ｄｏｗ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ，Ｍｉｄｌａｎｄ，ＭＩ）は希釈剤である。ポリグリコールＥ４５００は、４５ ００の平均分子量のポリエチレングリコールである。他の希釈剤がポリグリコー ルＥ４５００の代わりに用いられてもよい。 上記の製剤では、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）（Ｃｏｌ ｏｒｃｏｎ，Ｗｅｓｔ Ｐｏｉｎｔ，ＰＡ）はフィルムコーティング剤である。 Ｅｕｄｒａｇｉｔ（商標）Ｌ３０Ｄは腸溶性ポリマーである。Ｅｕｄｒａｇｉｔ （商標）ポリマーは、メタクリル酸およびアクリル酸エチルのコポリマーまたは メタクリル酸およびメタクリル酸メチルのコポリマーを含んでなる。クエン酸ト リエチルは可塑剤である。他の腸溶性コーティング剤、ポリマーおよび可塑剤も また使用されてもよい。好適には、コーティング剤、ポリマーおよび可塑剤によ って、顆粒は胃酸中で２時間残存することができる。好適には、コーティング剤 、 ポリマーおよび可塑剤によって、５またはそれ以上のｐＨで免疫グロブリン生成 物の溶解および放出が可能になる。 これらおよび他の特徴は、本発明の重要な態様をさらに強調する以下の実施例 から明白である。 実施例実施例１ −ＥＴＥＣ抗原の製造および抗ＥＴＥＣ免疫グロブリンの製造 この実施例は、腸毒素産生性大腸菌（ＥＴＥＣ）に対する活性を有するＩｇＧ 生成物の製造を特徴とする。材料および方法 ワクチン製造のための細菌株 。 この生成物の製造で使用された腸毒素産生性大 腸菌株は、Ｍａｒｙｌａｎｄ大学、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、のワクチン開発センタ ーの保存菌株（ｔｈｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｔ ｔ ｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍａｒｙｌ ａｔ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ） 、ｔｈｅ Ｗａｌｔｅｒ Ｒｅｅｄ Ａｒｍｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ ＲｅｓｅａｒｃｈまたはＴｅｘａｓ大学、Ｈｏｕｓｔｏｎ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔ ｙ ｏｆ Ｔｅｘａｓ ａｔ Ｈｏｕｓｔｏｎ）から入手した。菌株Ｍ４２４Ｃ １（ＣＳ１、ＣＳ３）およびＥ９０３４Ａ（ＣＳ３）（ＵＭ−Ｂａｌｔｉｍｏｒ ｅ）はＣＳ１およびＣＳ３の製造に使用し；菌株Ｈ１０４０７（ＵＭ−Ｂａｌｔ ｉｍｏｒｅ）はＣＦＡ−１の製造に使用した。菌株Ｍ２９５（Ｗ．Ｒ．Ａ．Ｉ． Ｒ．）またはＣＩＤ５５３（ＵＴ−Ｈｏｕｓｔｏｎ）はＣＦＡ−ＩＶの製造に使 用する。ウシ・ワクチンの製造 培養液中の生微生物からのＣＦＡ／Ｉ、ＣＳ３およびＣＳ６の発現 。 保存培養物は−８０℃で凍結状態で維持した。凍結細胞を使用して、ＣＦＡ寒 天プレート（１０ｇ／ｌ カザミノ酸、６ｇ／ｌ 酵母抽出物、５０ｍｇ／ｌ 硫酸マグネシウム、５ｍｇ／ｌ 塩化マグネシウム、１５ｇ／ｌ 寒天）に接種 し、３７℃で一晩培養した。翌日、細胞をプレートから無菌的に掻き取り、リン 酸緩衝食塩水、ｐＨ７．２に再懸濁した。この細胞懸濁液を使用して、発酵のた めに３７℃に予備加温度した無菌のＣＦＡ培養液（１０ｇ／ｌ カザミノ酸、６ ｇ／ｌ 酵母抽出物、５０ｍｇ／ｌ 硫酸マグネシウム、５ｍｇ／ｌ 塩化マグネ シウム）に接種した。好適には、出発培養液の６６０ｎｍの光学密度（Ｏ．Ｄ．₆₆₀ ）を０．０５〜０．０８にするするのに十分量の細胞懸濁液を添加する。接 種後、培養液は、ステンレススチール製の水ジャケット付き発酵槽中で、２０〜 ３０ｐｓｉの空気陽圧下で、５０〜７０ｒｐｍで混合することによって通気した 。細胞増殖は分光光度測定法によって連続的に監視し、そして細胞を初期定常期 増殖の直前、好適にはＯ．Ｄ．₆₆₀＝０．８〜１．２、好適には４〜５時間の増 殖後に収穫した。 細胞を収穫して、そして好適には０．１μｍの孔径で低タンパク質結合性の膜 による接線流動濾過法を使用して、４０〜５０倍に濃縮した。培養液中の生微生物からのＣＦＡ／Ｉ、ＣＳ３およびＣＳ６の精製 。 ＣＦＡを濃縮細胞の表面から、好適には４℃、濃縮液ｌ当たり３０〜４５分間 、１５０〜２００ｍｌ／分の流速を使用する連続流動式音波処理を使用して刈り 取った。 細胞破片を、好適には１０，０００〜１５，０００×ｇ、２０〜３０分間の遠 心分離によって除去した。 硫酸アンモニウムをＣＦＡ富化上澄液に１０〜２０％飽和まで添加し、そして 撹拌しながら４℃で少なくとも３０分間インキュベートした後、好適には１５， ０００〜２０，０００×ｇで２０〜３０分間遠心分離して、非ＣＦＡタンパク質 を除去した。次いで追加の硫酸アンモニウムを上澄液に４０〜５０％飽和まで添 加し、４℃で少なくとも６０分間撹拌した後、好適には１５，０００−２０，０ ００×ｇで２０〜３０分間遠心分離して、ＣＡＦタンパク質を収集した。ＣＦＡ 富化ペレットを、ｐＨ７．５の５０ｍＭリン酸緩衝液（ＰＢ）中に再懸濁した。 硫酸アンモニウムを、ＣＦＡ懸濁液から、好適には４℃で１０，０００〜１４ ，０００ＭＷ Ｓｐｅｃｔｒａｐｏｒ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉ ｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）管状物を使用する、５ ，０００〜１０，０００容積のＰＢに対する透析によって除去した。 透析液をイオン交換クロマトグラフィー（ＣＦＡ／Ｉ）またはサイズ排除クロ マトグラフィー（ＣＳ３または生ＣＳ６）によって精製した。ＣＦＡポリマーの 大きい粒径を利用して、比較的に純粋なＣＦＡが各場合の空隙フラクション中に 溶出する。 ＣＦＡ／Ｉの場合、好適には支持のための架橋されたジメチルアミノエチル置 換（ＤＥＡＥ）セルロースを使用する放射状流動クロマトグラフィーが上等の方 法である。標準法によってカラムをＰＢで平衡させた後、透析液を通塔させ、好 適には、２〜６ｍｌの樹脂当たり１ｍｇのタンパク質を５０〜７０ｍｌ／分の流 速で適用する。ＣＦＡ富化空隙フラクションの溶出は、標準法によってカラム溶 出液の２８０ｎｍの吸光度を測定することによって観察した。 ＣＳ３および生ＣＳ６の場合、好適には軸状カラムを使用して、１０，０００ 〜１，５００，０００の分子サイズ分画範囲を持つアクリルアミド架橋デキスト ラン・ビーズを使用するサイズ排除クロマトグラフィーが上等の方法である。カ ラムを、標準法によって、カオトロピック剤、好適にはＮ−ラウリルサルコシン （１０〜４０ｍＭ）を含有するＰＢで平衡させた。次いで得られた透析液を、好 適には８〜１２ｍｌの樹脂当たり１ｍｇのタンパク質が８〜１２ｍｌ／分の流速 で適用されるように、カラムに通塔した。ＣＦＡ富化空隙フラクションの溶出は 、標準法によって、カラム流出液の２８０ｎｍの吸光度を測定することによって 観察された。培養液中の組換え微生物からのＣＳ６の発現 。 保存培養物は−８０℃で凍結状 態で維持した。凍結細胞を使用してＬｕｒｉａ培地（ＬＢ）寒天（１０ｇ／ｌ トリプトン、５ｇ／ｌ 酵母抽出物、５ｇ／ｌ 塩化ナトリウム、１５ｇ／ｌ 寒天）のプレートに接種し、２４〜２８℃で一晩培養した。好適には、組換えＣ ＦＡをコードする遺伝子は、特定の抗生物質に対する抵抗性を与えるタンパク質 を発現する染色体外因子（プラスミド）上に見出される。プラスミドの安定性を 確保しそしてコピー数を増加させるために、２５〜５０μｇ／ｍｌの適切な抗生 物質をすべての増殖培地中に含ませた。（菌株Ｍ２９５の場合、抗生物質はアン ピシリンである）。翌日、細胞をプレートから無菌的に掻き取り、ｐＨ７．２の リン酸緩衝食塩水中に再懸濁した。この細胞懸濁液を使用して、２５μｇ／ｍｌ のアンピシリンを含有する無菌ＬＢ培地（１０ｇ／ｌ トリプトン、５ｇ／ｌ 酵母抽出物、５ｇ／ｌ 塩化ナトリウム）に接種し、発酵のために２４〜２８℃ まで予備加温した。好適には、出発培地 の６６０ｎｍの光学密度（Ｏ．Ｄ．₆₆₀）を０．０６〜０．１０にするするのに 十分量の細胞懸濁液を添加した。接種後、培養液を、好適にはステンレススチー ル製の水ジャケット付き発酵槽中で、５〜１０ｐｓｉの空気陽圧下で、５０〜７ ０ｒｐｍで混合することによって通気した。細胞増殖を分光光度測定法によって 連続的に監視し、そして細胞を初期定常期増殖の直前、好適にはＯ．Ｄ．₆₆₀＝ ０．８〜１．４、好適には４．５時間の増殖後に収穫した。 細胞を収穫し、そして大多数の組換えＣＳ６抗原が培地中に落とされる時に除 去した。細胞を、好適には０．１μｍの孔径で低タンパク質結合性膜による接線 流動濾過法を使用して除去する。次いで、上澄液を、好適には３０，０００ダル トンの分子量カットオフを有するポリスルフォンを使用する中空繊維濾過システ ムを使用して１００〜２００倍に濃縮した。次いで濃縮液をＰＢに対してダイア フィルトレーショして、培地成分を除去した。典型的には、ダイアフィルトレー ショ液自体は、さらに精製する必要がない程度に純粋である。精製が必要である 場合、ＣＳ３について略記したサイズ排除クロマトグラフィースキームを利用す る。 すべてクーマシーブリリアントブルー染色タンパク質の７０％を超えるものが ＣＦＡである調製物は、ウシワクチンとしての使用に許容されると考えられた。 ＣＦＡを、窒素ガス下で細胞を撹拌してダイアフィルトレーショすることよって 濃縮し、そして０．４５ミクロンのシリンジフィルターを通過させることによっ て滅菌した。すべてのワクチン調製物を、細菌および真菌の無菌性、並びにリム ルス溶解産物検定法（Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ）によって決定して１００， ０００ＥＵ／ｍｌ以下の内毒素の存在について試験した。最終ワクチンは、適切 な投与量 の抗原と合成非ＬＰＳ含有補助剤を１：１（ｖ／ｖ）で混合することによって製 造した。好適な補助剤はＦｒｅｕｎｄ補助剤またはその合成等価物である。ウシのワクチン接種 。 すべてのワクチン接種はＵＳＤＡの承認下で行いそして 有資格の獣医師の指示下で投与した。使用したすべての動物は健康なホルシュタ イン乳牛であった。健康記録を維持し、そして試験には健康な乳腺炎のない動物 のみを含ませた。一連の３回の筋肉内ワクチン接種物を、後足の大腿筋中に深く 投与した。２ｍｌの全量を単一部位に投与し、そして動物を副作用について監視 した。副作用は観察されなかった。ワクチン接種を３週間隔で行い、そして牛乳 は第３回の注射の１週間後から開始して規則的に収集した。牛乳試料をすべての バッチから採取し、ＥＬＩＳＡ分析のためにＩｍｍｕＣｅｌｌ社（Ｐｏｒｔｌａ ｎｄ，ＭＥ）に凍結して発送した。各バッチの抗ＣＦＡ力価は既知であったが、 抗腸毒素産生性大腸菌免疫グロブリン（ＡＥＭＩ）の産生について最高力価の牛 乳のみを使用する試みは行わなかった。連続製造の模擬実験をするために、４週 間に亙って収集した７種のバッチからの牛乳をプールし、本明細書に記載の臨床 試験物質とした。 ワクチン接種はＣＳ１、ＣＳ３およびＣＳ６で単独および組合せで別々に行い 、等しく好結果であった。抗大腸菌ウシ乳汁免疫グロブリンの製造 。 高度免疫性牛乳を標準酪農実施法に よってプロボローネまたはモッツァレッラ・チーズに加工した。免疫グロブリン を含有する水性乳漿フラクションを清澄化し、酪農乳漿の標準酪農乳漿遠心分離 法を使用して分離した。清澄化乳漿を先ず、標準酪農ＨＴＳＴ殺菌機を使用して 、１５９°Ｆで１５秒間加熱すること によって火入れ殺菌した。熱処理乳漿を、３０，０００ダルトンの分子量カット オフを持つ中空繊維状膜を使用して６倍（６×）に濃縮した。濃縮乳漿を、ＩＳ ＥＰ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｓｅ ｐａｒａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｌａｋｅｌａｎｄ，Ｆｌｏｒｉ ｄａ）を使用するアニオン交換クロマトグラフィーによって、経路Ａとして一般 的に示された方法で、免疫グロブリン富化した。図１を参照のこと。この操作法 の乳漿を先ずＮａＯＨ溶液の添加によってｐＨ６．８に調節し、そして第４級ア ンモニウム置換ポリスチレン樹脂を含有する１０×１００ｃｍのカラムに通塔し た。樹脂を先ず洗浄し、そして希緩衝液でｐＨ７．０に予備平衡した。非免疫グ ロブリンタンパク質はこれらの条件下で吸着し、一方流出フラクションは免疫グ ロブリンが富化した。 次いで、流出フラクションを最初に、ポリスルフォン濾過カートリッジ（３０ ，０００ＭＷカットオフ、２４ｍ²表面積）を使用する中空繊維濾過（Ａ／Ｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｎｅｅｄｈａｍ，ＭＡ）によって濃縮した。得られた流 出濃縮液を遠心分離して、過剰の非極性脂質を除去した。 次いで残余のリン脂質および残留非Ｉｇタンパク質を、凝集剤キトサン（Ｓｅ ａ Ｃｕｒｅ ４４３，Ｐｒｏｎｏｖａ Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．， Ｐｏｒｔｓｍｏｕｔｈ，ＮＨ）およびカプリル酸（Ｈｅｎｋｅｌ，Ｅｍｅｒｓｏ ｌ ６３５７）の連続添加によって沈殿させた。沈殿反応は、クロマトグラフィ ー的に脱タンパク質および脱脂肪した乳漿を使用して、２０〜２５℃の温度で行 った。キトサンを０．２％の最終濃度まで添加し、混合物のｐＨをｐＨ４．６に 調節した。カプリ ル酸を５容積％の最終濃度まで添加し、そして混合物を５分間撹拌し、次いで１ ５〜３０分間静止インキュベートした。 得られた沈殿物を、Ｓｈａｒｐｌｅｓ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ（Ｍｏｄｅｌ ＡＳ−１６，Ａｌｆａ Ｌａｖａｌ，Ｗａｒｍｉｎｓｔｅｒ，ＰＡ）で遠心分離 することによって除去し、上澄液をＮａＯＨの添加によってｐＨ６．５に調節し た。遠心分離の上澄液を、中空繊維濾過システムを使用して約５％固体まで濃縮 した。濃縮後、残留ラクトース、牛乳ペプチドおよび他の塩類を、ｐＨ６．５の １５ｍＭクエン酸カリウムの３容量に対する段階的ダイアフィルトレーショによ って除去した。 次いで、緩衝化免疫グロブリンフラクションを凍結乾燥して、最終粉末を生成 した。この操作法によって製造した抗大腸菌免疫グロブリンの代表ロットの分析 によって、凍結乾燥粉末は７８％のタンパク質、５．５の脂肪、１．１％の炭水 化物、添加クエン酸カリウム緩衝液による１０．５％の灰分、２．２％の残留灰 分および２．７％の水分を含有することが明らかになった。Ｉｇは、走査デンシ トメトリーおよびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって示されて７ ９％の全タンパク質を含んでなった。存在する追加の牛乳タンパク質は、ベータ −ラクトグロブリン、アルファ−ラクトアルブミン、血清アルブミン、および痕 跡量のカセインを含んだ。以下の表１に、この精製方法の各段階の免疫グロブリ ン活性の回収率およびＩｇの純度を記載する。 ＥＴＥＣ指向生成物中の抗ＣＦＡ活性のＥＬＩＳＡによる定量。 抗ＣＦＡ力価 は、精製抗原コーティングプレートへの乳汁抗体の結合を、標準法を使用するＥ ＬＩＳＡによって測定することによって決定した。絶対ＥＬＩＳＡ力価またはＯ Ｄは可変であり、そして主として壁をコーティングするために使用された抗原試 料に依存する。従って、複数の試料の最も正確でかつ意味のある比較は、すべて の未知試料の力価が内挿される対照標準を確立することによって行った。抗ＣＦ Ａ牛乳標準の希釈は、未知試料を含有する各プレート上で行い、そして標準曲線 を作成した。次いで未知試料についての力価を標準曲線から内挿した。このこと によって、すべてのＥＬＩＳＡデータが標準化され、そして種々の検定法で行っ た試料間の有意味の比較が可能になった。 精製ＣＦＡで高度免疫感作されたウシに由来する本発明のＥＴＥＣ生成物は、 全細胞抽出物で免疫感作された牛に由来する生成物から誘導された力価の３〜１ ０倍の力価を示した。これらの結果を以下の表２に示す。 志願者試験。 Ｍａｒｙｌａｎｄ大学医学部のワクチン開発センター（ｔｈｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）（Ｕｎｉｖ ｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍａｒｙｌａｎｄ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎ ｅ）で、隔離病棟に入院患者として収容された２５人の健康な成人の志願者を、 不規則に３群に割り当てた。被験者のＩＤ番号を各試験物の測定投与量を含有す る同一に包装した箔小袋に割り当てることによるプラシーボ群（ｎ＝１０）、高 投与量群（ｎ＝１１）および低投与量群（ｎ＝４）。すべての治験者および被験 者は試験を通じてかつ結果の評価の間はこれらの治療群指定を知らされていなか った。各プラシーボ小袋は、一回投与量（１．７ｇ）のＬａｃｔｏｆｒｅｅ（商 標）（Ｍｅａｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ）、ラクトースを含まない幼児用処方を含有し た。生成物の高投与量小袋は１．７ｇ（１ｇのＩｇＧ）を含有し、そして生成物 の低投与量小袋は０．４３ｇ（０．２５ｇのＩｇ）を夫々含有した。 ２５人の全員は、２日間食後に、プラシーボの３回投与量／日を服用するかま たは生成物の２回投与量の一つを服用した。各投与量は、２ｇの重炭酸ナトリウ ムを含有する８オンス（２４０ｍｌ）の水中に溶され た、粉末として指定小袋の生成物からなる。３日目、朝の投与量を消費した２時 間後、すべての志願者は２ｇの重炭酸ナトリウムを含有する４オンス（１２０ｍ ｌ）の水を飲んだ。１分後、各人は、１０⁹のＨ１０４０７（０７８：Ｈ１１） を含有する経口攻撃誘発性接種物重炭酸ナトリウムを含有する１オンス（３０ｍ ｌ）の水中に懸濁させたＣＦＡ／Ｉ産生性ＥＴＥＣ菌株を服用した。１５分後、 生成物またはプラシーボの第二回投与量が与えられ、次いで２回の正常な午後の 投与量が与えられた。４〜７日目に、各食後に、前回と同様に３回投与量／日を 投与した。 志願者は試験中に生じたすべての腸の運動物を収集し、粘性について等級化し 、秤量し、ロッグし、付添看護婦によって一日当たり生じた回数を記録した。毎 日の大便試料を細菌学検査のために採取した。 毎日の医学的ラウンドを行って、いずれの異常な総合的症状の発生をも監視し た。病院から退院する前には、すべての志願者に、攻撃誘発微生物を根絶するた めにシプロフロアキサシン（ｃｉｐｒｏｆｌｏａｘｃｉｎ）（５００ｍｇ，ｂ， ｉ，ｄ．）の３日間コースを与えた。主要有効性変数は、攻撃誘発後の１２０時 間以内のいずれかの４８時間の、３００ｍｌまたはそれ以上の一回の液状便また は全量２００ｍｌの２回の液状便と規定した、下痢の臨床診断であった。臨床 。 ＥＴＥＣ生成物を服用する群の１５人の志願者の内の１人だけと比較し て、プラシーボ群の１０人の志願者の内の７人が、攻撃誘発後に下痢を起こした 。結果を図２にグラフの形態で示す。フェーズＩ／ＩＩ試験からの臨床結果、「 健康な正常志願者における予防用高度免疫性免疫グロブリンを使用する、腸毒素 産生性大腸菌（ＥＴＥＣ）の経口攻撃誘発に対する保護」。上記の試験で規定し た主要有効性変数は、ＥＴ ＥＣによる攻撃誘発の１２０時間内の、３００ｍｌまたはそれ以上の一回の液状 便または２００ｍｌまたはそれ以上の少なくとも２回の液状便と規定した、下痢 の臨床診断であった。全患者数は広い間隔で太いドットをもつバーで示す。プラ シーボ、高投与量および低投与量を服用する患者は、細い間隔で小さいドットを もつバーで示す。各バーはプラシーボ、高投与量および低投与量について別々に 示した。プラシーボ群の攻撃率（７０％）と処理群の攻撃率（６．７％）を比較 すると、ＥＴＥＣ生成物の予防的投与は９０％の保護率をもたらした。下痢のあ る志願者の平均大便量は１３２７ｍｌ（範囲＝２６３−４４２１）であり、大便 の平均回数は７．４（範囲＝２−２１）であった。平均インキュベーション時間 は５８．８時間（範囲＝１９．４−１００．３時間）であった。 下痢の外に、毎日の医学的ラウンドを行って、他の数種の症状の発生を記録し た。食欲不振は、１／５の処理群と比較して６／１０の対照群によって報告され た。倦怠感は、３／１０の対照群および１／１５の処理群に見出された。処理群 についての２／１５と比較して、１０人の対照群の内の５人が胃のゴロゴロ音を 報告した。処理群についての４／１５と比較して、１０人の対照群の内の５人が 頭痛を経験した。最後に、プラシーボを服用している１０人の志願者の全員が腹 痙攣を経験し、ＥＴＥＣ生成物を服用している２／１５の志願者のみが経験した 。副作用はどの志願者にも観察されなかった。これらの結果を図３中にバーグラ フの形態で示す。図３は、２つの対照群中の患者総数に対する、種々の症状を示 す患者数を示す。第一対照群はプラシーボを服用した。第二対照群はＥＴＥＣ生 成物を服用した。全患者数は広い間隔で太いドットのバーで示す。食欲不振の症 状を示す患者は広い間隔で細いドットのバー で示す。痙攣の症状を示す患者は淡いクロスハッチングのバーで示す。ゴロゴロ 音の症状を示す患者は濃いクロスハッチングのバーで示す。細菌学 。 毎日の大便試料を、経時的に排泄を定量するために、攻撃誘発微生物 の存在について分析した。プラシーボを服用している志願者によって最大排泄時 に排泄された大便のグラム当たりの攻撃誘発微生物の平均数は、４．５×１０⁸ ＣＦＵ／ｇであった。ＥＴＥＣ生成物を服用している志願者の場合のピーク平均 値は６．２×１０⁷／ｇであった。志願者が抗原投与微生物を排泄する平均日数 は群間で実質的に同一であった、即ち、ＥＴＥＣ生成物を服用している志願者の 場合の５．４日に対して、対照の場合は５．３日であった（範囲＝４〜６日）。 従って、本方法は、ＣＦＡの大規模な製造および精製、並びに腸毒素産生性大 腸菌症を治療するのに有効な牛乳由来生成物を製造するためのかかるＣＦＡの使 用を提供する。この牛乳由来の免疫グロブリン濃縮液は、精製された集落形成因 子抗原に対する特異的活性を有する。生成物はよく許容されそして副作用は報告 されなかった。ＣＦＡに対する抗体は保護のために十分であり、そして現存する 薬物の介入に代わる代替物である。 実施例２−抗クリプトスポリジウム・パルブム免疫グロブリンの製造 Ｃ．パルブムの死菌ワクチンで免疫感作された雌牛からの高度免疫性牛乳を標 準チーズ製造法によってプロボローネまたはモッツァレッラ・チーズに加工した 。免疫グロブリンを含有する水性乳漿を清澄化し、そして標準乳漿遠心分離法を 使用して分離した。この実施例での抗クリプトスポリジウム免疫グロブリンの精 製のためのスキームを図１に示す。 実施例１で最初の免疫性乳漿の加工について記載した火入れ殺菌法お よび中空繊維限外濾過法を使用して、６×乳漿濃縮液を製造し、そして図１に略 記した直接キトサン／カプリル酸処理（経路Ｂ）に付した。キトサンを０．１５ 重量％の最終濃度まで添加し、その間乳漿濃縮液を撹拌した。この混合物のｐＨ をＮａＯＨ溶液の添加によってｐＨ４．９に調節した後、カプリル酸を混合しな がら４．０容積％の最終濃度まで添加した。キトサンおよびカプリル酸沈殿反応 は断続的に撹拌しながら２３℃で３０分間進行した。 キトサン−脂質およびカプリル酸−タンパク質の沈殿物を、Ｓｏｒｖａｌｌ遠 心機で１０，０００×ｇの遠心分離によって分離し、そして得られた上澄液をＮ ａＯＨの添加によってｐＨ６．５に調節した。抗クリプトスポリジウム抗体活性 の分析を、標準サンドイッチＥＬＩＳＡ法を使用して、マイクロタイター板上に コーティングしたＣ．パルブム抗原を用いて行った。 各工程のＩｇ純度を、ｐＨ８の非還元条件下で展開し、クーマシーブルーで染 色した４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを濃度測定走査することによって決定し た。この精製の結果を下記の表２に示す。 実施例３−ロタウイルス免疫グロブリンの製造 この実施例は、ロタウイルス感染症の予防または治療のためのＩｇ生成物の製 造について記載する。雌牛を、死菌ウイルス、またはヒトに感染性の４種の主要 ロタウイルス型（１−４）を表す精製ウイルス中和抗原（例えば、ＧまたはＰ抗 原）を含有するワクチンで免疫感作する。高度免疫性牛乳を、標準酪農実施法に よってプロボローネまたはモッツァレッラ・チーズに加工する。免疫グロブリン を含有する水性乳漿フラクションを清澄化し、標準酪農乳漿の遠心分離法を使用 して分離する。清澄化乳漿を先ず、標準酪農ＨＴＳＴ殺菌機を使用して、１６１ °Ｆで１５秒間加熱することによって火入れ殺菌する。熱処理乳漿を、３０，０ ００ダルトンの分子量カットオフを持つ中空繊維状膜を使用して６倍（６×）に 濃縮する。濃縮乳漿を、ＩＳＥＰ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｓｙｓｔｅ ｍ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を 使用するアニオン交換クロマトグラフィーによって、図１の経路Ａとして一般的 に示された方法で、免疫グロブリン富化する。この操作法の乳漿を先ずＮａＯＨ 溶液の添加によってｐＨ６．８に調節し、そして第４級アンモニウム置換ポリス チレン樹脂を含有する１０×１００ｃｍのカラムに通塔した。樹脂を先ず洗浄し 、そして希緩衝液でｐＨ７．０に予備平衡した。非免疫グロブリンタンパク質は これらの条件下で吸着し、一方流出フラクションは免疫グロブリンが富化する。 別法では、図１の経路Ｂに示された方法および実施例２に記載した 方法を使用することができる。 次いで、流出フラクションを先ず、ポリスルフォン濾過カセット（３０，００ ０ＭＷカットオフ）を使用する、中空繊維濾過（Ａ／Ｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ）によって濃縮する。得られた流出濃縮液を遠心分離して、過剰の非極性脂質を 除去する。 残余のリン脂質および残留非Ｉｇタンパク質を、凝集剤キトサン（Ｐｒｏｎｏ ｖａ，Ｉｎｃ．）およびカプリル酸の連続添加によって沈殿させる。沈殿反応は 、クロマトグラフィー的に脱タンパク質および脱脂肪した乳漿を使用して、２０ 〜２５℃の温度で行う。キトサンを０．２％の最終濃度まで添加し、混合物のｐ ＨをｐＨ４．６に調節する。カプリル酸を５容積％の最終濃度まで添加し、混合 物を間欠的に３０分間撹拌する。 得られた沈殿物をＳｈａｒｐｌｅｓ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ（Ａｌｆａ Ｌａ ｖａｌ，Ｍｏｄｅｌ ＡＳ−１６）で遠心分離することによって除去し、上澄液 をＮａＯＨの添加によってｐＨ６．５に調節する。遠心分離の上澄液を、中空繊 維濾過システムを使用して約２０％固体まで濃縮する。濃縮後、残留ラクトース 、牛乳ペプチドおよび他の塩類を、ｐＨ６．５の１５ｍＭクエン酸カリウムの３ 容量に対する段階的ダイアフィルトレーショによって除去する。 次いで、緩衝化免疫グロブリンフラクションを凍結乾燥して最終粉末を生成す る。記載の操作法によって乳漿から精製されたかかる抗体は、食物または飲物中 に取り込み、幼い子供および高年の成人のロタウイルス感染症を予防することが できる。実施例４ −シゲラ・フレキシネリ免疫グロブリンの製造 この実施例は、シゲラ・フレキシネリ感染症を予防または治療するＩｇ生成物 の製造について記載する。雌牛を、死菌細胞、または不活性シゲラ毒と一緒に精 製細胞壁を含有するワクチンで免疫感作する。高度免疫性牛乳を標準酪農実施法 によってプロボローネまたはモッツァレッラ・チーズに加工する。免疫グロブリ ンを含有する水性乳漿フラクションを清澄化し、標準酪農乳漿の遠心分離法を使 用して分離する。清澄化乳漿を先ず、標準酪農ＨＴＳＴ殺菌機を使用して、１６ １°Ｆで１５秒間加熱することによって火入れ殺菌する。熱処理乳漿を、３０， ０００ダルトンの分子量カットオフを持つ中空繊維状膜を使用して６倍（６×） に濃縮する。脱脂乳漿を、ＩＳＥＰ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｓｙｓｔ ｅｍ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ） を使用するアニオン交換クロマトグラフィーによって、図１の経路Ａとして一般 的に示された方法で、免疫グロブリン富化する。この操作法の乳漿を先ずＮａＯ Ｈ溶液の添加によってｐＨ６．８に調節し、そして第４級アンモニウム置換ポリ スチレン樹脂を含有する１０×１００ｃｍのカラムに通塔する。樹脂を先ず洗浄 し、そして希緩衝液でｐＨ７．０に予備平衡する。非免疫グロブリンタンパク質 はこれらの条件下で吸着させ、一方流出フラクションは免疫グロブリンが富化し た。別法では、図１に記載の経路Ｂとして示した方法および実施例２に記載した 方法を使用することができる。 次いで、流出フラクションを先ず、ポリスルフォン濾過カセット（３０，００ ０ＭＷカットオフ）を使用する、中空繊維限外濾過（Ａ／ＧＴｅｃｈｎｏｌｏｇ ｙ）によって濃縮する。得られた流出濃縮液を遠心分離して、過剰の非極性脂質 を除去する。 残余のリン脂質および残留非Ｉｇタンパク質を、凝集剤キトサン（Ｐｒｏｎｏ ｖａ，Ｉｎｃ．）およびカプリル酸の連続添加によって沈殿させる。沈殿反応は 、クロマトグラフィー的に脱タンパク質および脱脂肪した乳漿を使用して、２０ 〜２５℃の温度で行う。キトサンを０．２％の最終濃度まで添加し、混合物のｐ ＨをｐＨ４．６に調節する。カプリル酸を５容積％の最終濃度まで添加し、そし て混合物を間欠的に３０分間撹拌する。 得られた沈殿物をＳｈａｒｐｌｅｓ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ（Ａｌｆａ Ｌａ ｖａｌ，Ｍｏｄｅｌ ＡＳ−１６）で遠心分離することによって除去し、上澄液 をＮａＯＨの添加によってｐＨ６．５に調節する。遠心分離の上澄液を、中空繊 維濾過システムを使用して約２０％固体まで濃縮する。濃縮後、残留ラクトース 、牛乳ペプチドおよび他の塩類を、ｐＨ６．５の１５ｍＭクエン酸カリウムの３ 容量に対する段階的ダイアフィルトレーショによって除去する。 次いで、緩衝化免疫グロブリンフラクションを凍結乾燥して最終粉末を生成す る。乳漿中に存在するこれらの抗原に対する抗体を記載の操作法によって精製し 、そして罹患または被爆個人の間のシゲラ感染症の予防のために、食物、飲物ま たはカプセル剤／錠剤の形態で投与することができる。実施例５ −ヘリコバクター・ピロリ免疫グロブリンの製造 この実施例は、ヘリコバクター・ピロリ感染症を予防または治療するためのＩ ｇ生成物の製造について記載する。雌牛を、ウレアーゼ、空胞形成細胞毒および 胃粘膜の細胞感染に重要であると考えられている鞭毛のような仮定的な毒性因子 によって表されるＨ．ピロリの精製抗原で免 疫感作する。高度免疫性牛乳を標準酪農実施法によってプロボローネまたはモッ ツァレッラ・チーズに加工する。免疫グロブリンを含有する水性乳漿フラクショ ンを清澄化し、標準酪農乳漿の遠心分離法を使用して分離する。清澄化乳漿を先 ず、標準酪農ＨＴＳＴ殺菌機を使用して、１６１°Ｆで１５秒間加熱することに よって火入れ殺菌する。熱処理乳漿を、３０，０００ダルトンの分子量カットオ フを持つ中空繊維状膜を使用して６倍（６×）に濃縮する。濃縮乳漿を、ＩＳＥ Ｐ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｓｅｐ ａｒａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用するアニオン交換クロマト グラフィーによって、図１の経路Ａとして一般的に示された方法で、免疫グロブ リン富化する。この操作法の乳漿を先ずＮａＯＨ溶液の添加によってｐＨ６．８ に調節し、そして第４級アンモニウム置換ポリスチレン樹脂を含有する１０×１ ００ｃｍのカラムに通塔する。樹脂を先ず洗浄し、そして希緩衝液でｐＨ７．０ に予備平衡する。非免疫グロブリンタンパク質はこれらの条件下で吸着し、一方 流出フラクションは免疫グロブリンが富化する。別法では、図１中で経路Ｂとし て示された方法および実施例２に記載された方法を使用することができる。 次いで、流出フラクションを先ず、ポリスルフォン濾過カセット（３０，００ ０ＭＷカットオフ）を使用する中空繊維濾過（Ａ／Ｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ） によって濃縮する。得られた流出濃縮液を遠心分離して、過剰の非極性脂質を除 去する。 残余のリン脂質および残留非Ｉｇタンパク質を、凝集剤キトサン（Ｐｒｏｎｏ ｖａ，Ｉｎｃ．）およびカプリル酸の連続添加によって沈殿させる。沈殿反応は 、クロマトグラフィー的に脱タンパク質および脱脂肪 した乳漿を使用して、２０〜２５℃の温度で行う。キトサンを０．２％の最終濃 度まで添加し、混合物のｐＨをｐＨ４．６に調節する。カプリル酸を５容積％の 最終濃度まで添加し、そして混合物を間欠的に３０分間撹拌する。 得られた沈殿物をＳｈａｒｐｌｅｓ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ（Ａｌｆａ Ｌａ ｖａｌ，Ｍｏｄｅｌ ＡＳ−１６）で遠心分離することによって除去し、上澄液 をＮａＯＨの添加によってｐＨ６．５に調節する。遠心分離の上澄液を、中空繊 維濾過システムを使用して約２０％固体まで濃縮する。濃縮後、残留ラクトース 、牛乳ペプチドおよび他の塩類を、ｐＨ６．５の１５ｍＭクエン酸カリウムの３ 容量に対する段階的ダイアフィルトレーショによって除去する。 次いで、緩衝化免疫グロブリンフラクションを凍結乾燥して最終粉末を生成す る。記載の操作法によって乳漿から精製されるこれらの抗原に対する抗体を、食 物、飲物、錠剤またはカプセル剤中に取り込むで、Ｈ．ピロリ感染症の伝染また は蔓延を予防することができる。実施例６ −クロストリジウム・ジフィクレ免疫グロブリンの製造 この実施例はクロストリジウム・ジフィクレ感染症を予防または治療するＩｇ 生成物の製造について記載する。雌牛を、凝集または結腸細胞水準を促進できる 他の細胞壁抗原と一緒にＣ．ジフィキレからの不活性毒素Ａ＆Ｂで免疫感作する 。高度免疫性牛乳を標準酪農実施法によってプロボローネまたはモッツァレッラ ・チーズに加工する。免疫グロブリンを含有する水性乳漿フラクションを清澄化 し、標準酪農乳漿の遠心分離法を使用して分離する。清澄化乳漿を先ず、標準酪 農ＨＴＳＴ殺菌機を使用して、１６１°Ｆで１５秒間加熱することによって火入 れ殺菌す る。熱処理乳漿を、３０，０００ダルトンの分子量カットオフを持つ中空繊維状 膜を使用して６倍（６×）に濃縮する。濃縮乳漿を、ＩＳＥＰ Ｃｈｒｏｍａｔ ｏｇｒａｐｈｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｔ ｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用するアニオン交換クロマトグラフィーによって 、図１の経路Ａとして一般的に示された方法で、免疫グロブリン富化する。この 操作法の乳漿を先ずＮａＯＨ溶液の添加によってｐＨ６．８に調節し、そして第 ４級アンモニウム置換ポリスチレン樹脂を含有する１０×１００ｃｍのカラムに 通塔する。樹脂を先ず洗浄し、希緩衝液でｐＨ７．０に予備平衡する。非免疫グ ロブリンタンパク質はこれらの条件下で吸着し、一方流出フラクションは免疫グ ロブリンが富化する。別法では、図１の経路Ｂとして示された方法および実施例 ２に記載した方法を使用することができる。 次いで、流出フラクションを先ず、ポリスルフォン濾過カセット（３０，００ ０ＭＷカットオフ）を使用する中空繊維濾過（Ａ／Ｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ） によって濃縮する。得られた流出濃縮液を遠心分離して、過剰の非極性脂質を除 去する。 残余のリン脂質および残留非Ｉｇタンパク質を、凝集剤キトサン（Ｐｒｏｎｏ ｖａ，Ｉｎｃ．）およびカプリル酸の連続添加によって沈殿させる。沈殿反応は 、クロマトグラフィー的に脱タンパク質および脱脂肪した乳漿を使用して、２０ 〜２５℃の温度で行う。キトサンを０．２％の最終濃度まで添加し、混合物のｐ ＨをｐＨ４．６に調節する。カプリル酸を５容積％の最終濃度まで添加し、そし て混合物を間欠的に３０分間撹拌する。 得られた沈殿物をＳｈａｒｐｌｅｓ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ（Ａｌｆ ａ Ｌａｖａｌ，Ｍｏｄｅｌ ＡＳ−１６）で遠心分離することによって除去し 、上澄液をＮａＯＨの添加によってｐＨ６．５に調節する。遠心分離の上澄液を 、中空繊維濾過システムを使用して約２０％固体まで濃縮する。濃縮後、残留ラ クトース、牛乳ペプチドおよび他の塩類を、ｐＨ６．５の１５ｍＭクエン酸カリ ウムの３容量に対する段階的ダイアフィルトレーショによって除去する。 次いで、緩衝化免疫グロブリンフラクションを凍結乾燥して最終粉末を生成す る。記載の操作法によって乳漿から精製される抗原に対する抗体を、結腸特異性 送達製剤中に取り込み、そしてＣ．ジフィキレによる結腸炎を予防するために抗 生物質の長期経口投与に付随して投与することができる。実施例７ −ビブリオ・コレラ免疫グロブリンの製造 この実施例は、ビブリオ・コレラ感染症を予防または治療するＩｇ生成物の製 造について記載する。雌牛を、不活性化コレラ毒素（Ａ＆Ｂサブユニット）また は個別のサブユニット並びに腸感染症に対する免疫を与えると考えられるリポ多 糖のような抗原で免疫感作する。高度免疫性牛乳を標準酪農実施法によってプロ ボローネまたはモッツァレッラ・チーズに加工する。免疫グロブリンを含有する 水性乳漿フラクションを清澄化し、標準酪農乳漿の遠心分離法を使用して分離す る。清澄化乳漿を先ず、標準酪農ＨＴＳＴ殺菌機を使用して、１６１°Ｆで１５ 秒間加熱することによって火入れ殺菌する。熱処理乳漿を、３０，０００ダルト ンの分子量カットオフを持つ中空繊維状膜を使用して６倍（６×）に濃縮する。 濃縮乳漿を、ＩＳＥＰ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｄｖ ａｎｃｅｄ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌ ｏｇｉｅｓ）を使用するアニオン交換クロマトグラフィーによって、図１の経路 Ａとして一般的に示された方法で、免疫グロブリン富化する。この操作法の乳漿 を先ずＮａＯＨ溶液の添加によってｐＨ６．８に調節し、そして第４級アンモニ ウム置換ポリスチレン樹脂を含有する１０×１００ｃｍのカラムに通塔した。樹 脂を先ず洗浄し、そして希緩衝液でｐＨ７．０に予備平衡する。非免疫グロブリ ンタンパク質はこれらの条件下で吸着し、一方流出フラクションは免疫グロブリ ンが富化する。別法では、図１の経路Ｂとして示された方法および実施例２に記 載した方法を使用することができる。 次いで、流出フラクションを先ず、ポリスルフォン濾過カセット（３０，００ ０ＭＷカットオフ）を使用する中空繊維濾過（Ａ／Ｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ） によって濃縮する。得られた流出濃縮液を遠心分離して、過剰の非極性脂質を除 去する。 残余のリン脂質および残留非Ｉｇタンパク質を、凝集剤キトサン（Ｐｒｏｎｏ ｖａ，Ｉｎｃ．）およびカプリル酸の連続添加によって沈殿させる。沈殿反応は 、クロマトグラフィー的に脱タンパク質および脱脂肪した乳漿を使用して、２０ 〜２５℃の温度で行う。キトサンを０．２％の最終濃度まで添加し、混合物のｐ ＨをｐＨ４．６に調節する。カプリル酸を５容積％の最終濃度まで添加し、混合 物を間欠的に３０分間撹拌する。 得られた沈殿物を、Ｓｈａｒｐｌｅｓ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ（Ａｌｆａ Ｌ ａｖａｌ，Ｍｏｄｅｌ ＡＳ−１６）で遠心分離することによって除去し、上澄 液をＮａＯＨの添加によってｐＨ６．５に調節する。遠心分離の上澄液を、中空 繊維濾過システムを使用して約２０％固体まで 濃縮する。濃縮後、残留ラクトース、牛乳ペプチドおよび他の塩類を、ｐＨ６． ５の１５ｍＭクエン酸カリウムの３容量に対する段階的ダイアフィルトレーショ によって除去する。 次いで、緩衝化免疫グロブリンフラクションを凍結乾燥して、最終粉末を生成 する。記載の操作法によって乳漿から精製される抗原に対する抗体を、食物、飲 物中で使用するか、または錠剤またはカプセル剤として投与して、経口感染を予 防することができる。実施例８ この実施例は、カチオン性ポリマーがカチオン性繊維状セルロースである免疫 グロブリン生成物の製造について記載する。カチオン性繊維状セルロースを、実 施例１〜７のキトサンの代わりに使用して、リン脂質を沈殿させる、。好適なカ チオン性繊維状セルロースは、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，ＵＳＡのＷｈａｔｍａｎ ，Ｉｎｃ．から、マーク“ＤＥ−２３”で市販されている。実施例９ この実施例は、脂肪酸が式ＣＨ₃−（ＣＨ₂）_n−ＣＯＯＨ（式中、ｎは４〜５ および７〜１０の全整数である）を有する免疫グロブリン生成物の製造について 記載する。ｎが４〜５および７〜１０の全整数である脂肪酸を、実施例１〜７の カプリル酸の代わりに使用して、非Ｉｇタンパク質を沈殿させる。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】１９９７年９月８日 【補正内容】 請求の範囲 １．乳汁産生中の哺乳類に由来する乳漿、濃縮乳漿または乳漿フラクションか ら免疫グロブリンを単離する方法であって、以下の工程： （ａ）乳漿、乳漿濃縮液または乳漿フラクションを含んでなる試料を提供し； （ｂ）工程ａ）の試料およびカチオン性ポリマーを含んでなる混合物を形成し、 混合物中のカチオン性ポリマーの濃度は脂質沈殿に適切であり； （ｃ）工程ｂ）の混合物および脂肪酸を含んでなる第二混合物を形成し、第二混 合物中の脂肪酸の濃度は非免疫グロブリンタンパク質の沈殿に適切であり； （ｄ）工程ｃ）の第二混合物から脂質および非免疫グロブリンタンパク質を沈殿 させて、免疫グロブリン富化上澄液並びに脂質および非免疫グロブリンタンパク 質の沈殿物を形成し； （ｅ）免疫グロブリン富化上澄液を工程ｄ）の混合物から単離する； を順番に含んでなる単離方法。 ２．乳汁産生中の哺乳類がウシまたはヤギである請求の範囲１に記載の方法。 ３．乳汁産生中の哺乳類が抗原で前免疫感作されて、抗原に特異的に結合する 免疫グロブリンの産生を刺激する請求の範囲１に記載の方法。 ４．抗原が腸毒素産生性大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に関連 する請求の範囲３に記載の方法。 ５．前記抗原がＣＦＡ−Ｉ、ＣＦＡ−ＩＩおよびＣＦＡ−ＩＶ抗原よりなる群 から選ばれる請求の範囲３に記載の方法。 ６．乳汁産生中の哺乳類が、ＣＦＡ−Ｉ、ＣＦＡ−ＩＩおよびＣＦＡ−ＩＶ抗 原よりなる群の各々からの抗原で前免疫感作される請求の範囲３に記載の方法。 ７．前記ＣＦＡ−ＩＩ抗原が、ＣＳ１およびＣＳ３よりなる群から選ばれた少 なくとも一種の抗原を含んでなる請求の範囲５に記載の方法。 ８．前記ＣＦＡ−ＩＶ抗原がＣＳ６である請求の範囲５に記載の方法。 ９．前記カチオン性ポリマーが、ポリペプチドおよび多糖よりなる群から選ば れる請求の範囲１に記載の方法。 １０．前記カチオン性ポリマーがキトサンである請求の範囲９に記載の方法。 １１．前記脂肪酸が式ＣＨ₃−（ＣＨ₂）_n−ＣＯＯＨ（式中、ｎは４〜１０の 全整数である）を有する請求の範囲１に記載の方法。 １２．前記脂肪酸がカプリル酸である請求の範囲１２に記載の方法。 １３．前記脂質および非免疫グロブリンタンパク質沈殿物が前記免疫グロブリ ン富化上澄液から遠心分離によって分離される請求の範囲１に記載の方法。 １４．ポリペプチドおよびラクトースを除去するために、約２０，０００〜約 １５０，０００ダルトンの分子量カットオフを有する膜で限外濾過することによ って免疫グロブリン富化上澄液を濃縮し、保留液を形成することをさらに含んで なる請求の範囲１３に記載の方法。 １５．前記保留液がダイアフィルトレーショされて透析免疫グロブリン濃縮液 を形成する請求の範囲１４に記載の方法。 １６．前記透析免疫グロブリン濃縮液が凍結乾燥または噴霧乾燥されて粉末を 生成する請求の範囲１５に記載の方法。 １７．乳汁産生中の哺乳類に由来する乳漿、濃縮乳漿または乳漿フラクション から免疫グロブリンを単離する方法であって、以下の工程： （ａ）乳漿、乳漿濃縮液または乳漿フラクションを含んでなる試料を提供し； （ｂ）工程ａ）の試料およびキトサンを含んでなる混合物を形成し、混合物中の キトサンの濃度は脂質沈殿に適切であり； （ｃ）工程ｂ）の混合物およびカプリル酸を含んでなる第二混合物を形成し、第 二混合物中のカプリル酸の濃度は非免疫グロブリンタンパク質の沈殿に適切であ り； （ｄ）脂質および非免疫グロブリンタンパク質を工程ｃ）の第二混合物から沈殿 させて、免疫グロブリン富化上澄液並びに脂質および非免疫グロブリンタンパク 質の沈殿物を形成し； （ｅ）免疫グロブリン富化上澄液を工程ｄ）の混合物から単離する； を順番に含んでなる単離方法。 １８．乳汁産生中の哺乳類がウシまたはヤギである請求の範囲１７に記載の方 法。 １９．乳汁産生中の哺乳類が抗原で前免疫感作されて、抗原に特異的に結合す る免疫グロブリンの産生を刺激する請求の範囲１７に記載の方法。 ２０．抗原が腸毒素産生性大腸菌に関連する請求の範囲１９に記載の方法。 ２１．前記抗原がＣＦＡ−Ｉ、ＣＦＡ−ＩＩおよびＣＦＡ−ＩＶ抗原よりなる 群から選ばれる請求の範囲２０に記載の方法。 ２２．乳汁産生中の哺乳類が、ＣＦＡ−Ｉ、ＣＦＡ−ＩＩおよびＣＦ Ａ−ＩＶ抗原よりなる群の各々からの抗原で前免疫感作される請求の範囲２０に 記載の方法。 ２３．前記ＣＦＡ−ＩＩ抗原が、ＣＳ１およびＣＳ３よりなる群から選ばれた 少なくとも一種の抗原を含んでなる請求の範囲２１に記載の方法。 ２４．前記ＣＦＡ−ＩＶ抗原がＣＳ６である請求の範囲２１に記載の方法。 ２５．１ｇまたはそれ以下の単位剤形中に包装されそして腸毒素産生性大腸菌 によるヒト被験者の感染を予防することによってかまたは予防するためにヒト被 験者の能動感染を治療するのに有効な量で存在する、腸毒素産生性大腸菌に結合 する免疫グロブリンを含んでなる受動免疫療法用生成物。 ２６．前記免疫グロブリンが集落形成（Ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ）因子抗原 に結合する請求の範囲２５に記載の生成物。 ２７．集落形成因子抗原がＣＦＡ−Ｉ、ＣＦＡ−ＩＩおよびＣＦＡ−ＩＶより なる群から選ばれる請求の範囲２６に記載の生成物。 ２８．前記免疫グロブリンが群、ＣＦＡ−Ｉ、ＣＦＡ−ＩＩおよびＣＦＡ−Ｉ ＶからのすべてのＣＦＡ抗原に集合的に結合する請求の範囲２７に記載の生成物 。 ２９．免疫グロブリンがＣＳ３に結合する請求の範囲２６に記載の生成物。 ３０．免疫グロブリンがＣＳ６に結合する請求の範囲２６に記載の生成物。 ３１．前記免疫グロブリンが腸溶コーティングされる請求の範囲２５ に記載の生成物。 ３２．腸毒素産生性大腸菌に結合する抗体を含んでなりそして前記抗体が腸毒 素産生性大腸菌の全細胞抽出物をウシに接種することにによって達成される力価 の３〜５０倍の力価を示す、乳汁産生中の哺乳類の乳汁または初乳から単離され た免疫グロブリン生成物。 ３３．大腸菌に結合する免疫グロブリン生成物中の大多数の抗体が大腸菌の集 落形成因子抗原に結合する請求の範囲３２に記載の免疫グロブリン生成物。 ３４．腸毒素産生性大腸菌に関連する抗原に結合する抗体を含んでなり、少な くとも７０％の免疫グロブリン、６％未満の脂質および２０％未満の非Ｉｇタン パク質を含んでなる生成物の有効投与量を投与する工程を含んでなる、腸毒素産 生性大腸菌に感染した個人または抗体腸毒素産生性大腸菌に感染する危険のある 個人を治療する方法。 ３５．単離抗原を含んでなる、乳汁産生中の動物を過免疫感作するためのワク チンであって、前記抗原がＣＦＡ−Ｉ、ＣＦＡ−ＩＩおよびＣＦＡ−ＩＶよりな る集落形成因子抗原（ＣＦＡ）の各々から選ばれるワクチン。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 1/32 Ｃ０７Ｋ 1/32 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，Ｈ Ｕ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ， ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，Ｐ Ｔ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 アツカー，エリザベス・エイ アメリカ合衆国メイン州04260ニユーグロ スター・グロスターヒル359

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．（ａ）乳漿、乳漿濃縮液、乳漿フラクションまたは部分的脱タンパク質乳 漿濃縮液並びにカチオン性ポリマーおよび脂肪酸の第一混合物を提供し、前記カ チオン性ポリマーは前記混合物中で沈殿条件を掛けた際に脂質−ポリマー沈殿物 を形成する濃度を有しそして前記脂肪酸は前記混合物中で前記沈殿条件を掛けた 際にタンパク質沈殿物を形成する濃度を有し、 （ｂ）前記混合物に前記沈殿条件を掛けて、免疫グロブリン富化上澄液並びに、 タンパク質沈殿物および脂質−ポリマー沈殿物の両方を含む沈殿物を形成し、そ して （ｃ）前記免疫グロブリン富化上澄液を前記沈殿物から分離する、 諸工程を含んでなる免疫グロブリンの単離方法。 ２．（ａ）最初に乳汁産生中の哺乳類に一種またはそれ以上の抗原をワクチン 接種し、前記抗原は前記抗原に結合するＩｇの産生を誘導し、（ｂ）前記哺乳類 から乳汁または初乳を収集し、そして第一混合物を提供する前に、前記乳汁また は初乳を加工して、乳漿、乳漿濃縮液、乳漿フラクションまたは部分脱タンパク 質乳漿濃縮液を形成する、 諸工程をさらに含んでなる請求の範囲１に記載の方法。 ３．免疫グロブリン富化上澄液が、腸毒素産生性大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ ｉａ ｃｏｌｉ）に関連する一種またはそれ以上の抗原に結合することができる 免疫グロブリンを含有する請求の範囲１に記載の方法。 ４．前記の一種またはそれ以上の抗原がＣＦＡ−Ｉ、ＣＦＡ−ＩＩおよびＣＦ Ａ−ＩＶ抗原よりなる群から選ばれる請求の範囲３に記載の方法。 ５．前記の一種またはそれ以上の抗原がＣＦＡ−Ｉ、ＣＦＡ−ＩＩおよびＣＦ Ａ−ＩＶ抗原よりなる群の各々からの抗原を含んでなる請求の範囲３に記載の方 法。 ６．前記ＣＦＡ−ＩＩ抗原がＣＳ１およびＣＳ３よりなる群から選ばれた少な くとも一種の抗原を含んでなる請求の範囲３に記載の方法。 ７．前記ＣＦＡ−ＩＶ抗原がＣＳ６である請求の範囲３に記載の方法。 ８．前記カチオン性ポリマーがポリペプチドおよび多糖よりなる群から選ばれ る請求の範囲１、２、３、４、５、６または７に記載の方法。 ９．前記カチオン性ポリマーがキトサンである請求の範囲１、２、３、４、５ 、６または７に記載の方法。 １０．前記脂肪酸が式ＣＨ₃−（ＣＨ₂）_n−ＣＯＯＨ（式中、ｎは４〜１０の 全整数である）を有する請求の範囲１、２、３、４、５、６または７に記載の方 法。 １１．前記脂肪酸がカプリル酸である請求の範囲１、２、３、４、５、６また は７に記載の方法。 １２．前記カチオン性ポリマーがキトサンでありそして前記脂肪酸がカプリル 酸である請求の範囲１、２、３、４、５、６または７に記載の方法。 １３．前記タンパク質および脂質沈殿物が前記免疫グロブリン富化上澄液から 遠心分離によって分離される請求の範囲１に記載の方法。 １４．前記免疫グロブリン富化上澄液が、ポリペプチドおよびルラクトースを 除去するために、１０，０００〜１５０，０００ダルトンの分子量カットオフを 有する膜で限外濾過することによって濃縮され、保留液を形成する請求の範囲１ または１３に記載の方法。 １５．前記保留液がダイアフィルトレーショされてて、透析免疫グロブリン濃 縮液を形成する請求の範囲１４に記載の方法。 １６．前記透析免疫グロブリン濃縮液が凍結乾燥または噴霧乾燥されて粉末を 形成する請求の範囲１５に記載の方法。 １７．１ｇまたはそれ以下の単位剤形中に包装されそして腸毒素産生性大腸菌 によるヒト被験者の感染の予防によってまたは予防のためにヒト被験者の能動感 染を治療するのに有効な量で存在する、腸毒素産生性大腸菌に結合する免疫グロ ブリンを含んでなる受動免疫療法用生成物。