CN114272908A

CN114272908A - 一种超大孔琼脂糖亲和层析凝胶及其制备方法

Info

Publication number: CN114272908A
Application number: CN202111657426.0A
Authority: CN
Inventors: 薛长湖; 郑洪伟; 魏发奕; 王长云
Original assignee: Qingdao Marine Food Nutrition And Health Innovation Research Institute; Ocean University of China
Current assignee: Qingdao Marine Food Nutrition And Health Innovation Research Institute; Ocean University of China
Priority date: 2021-12-31
Filing date: 2021-12-31
Publication date: 2022-04-05
Anticipated expiration: 2041-12-31
Also published as: CN114272908B

Abstract

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种超大孔琼脂糖亲和层析凝胶及其制备方法。通过双乳液法制备超大孔琼脂糖亲和层析凝胶及其系列复合凝胶，制备得到的大孔琼脂糖微球可以应对复杂生物体系样品的分离，避免因样品杂质而堵塞；同时结合刷状功能化聚合物提高琼脂糖空隙内部与样品的接触面积，实现对目标物的高效率富集。该方法基本将大孔琼脂糖高通透性和基质耐受性及小颗粒高柱效和亲和效果结合起来，实现了基质耐受性及样品富集效果的有效结合。

Description

一种超大孔琼脂糖亲和层析凝胶及其制备方法

技术领域：

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种超大孔琼脂糖亲和层析凝胶及其制备方法。

背景技术：

随着生物技术的迅猛发展，琼脂糖凝胶色谱介质已成为下游生物产品纯化的关键技术之一，其在亲和、疏水、排阻色谱等领域均占据广阔的市场。琼脂糖微球具有开放性的网络结构，作为色谱介质在生化领域中具有异质性影响低、生物相容性高、易于操作等优势。目前市售及已报道的琼脂糖凝胶颗粒微球，其粒径范围主要集中于45μm～165μm(平均～90μm)，内部只存在单一类型的扩散孔，孔径在数纳米到几十纳米之间，对于以蛋白、细胞等为主要产物的现代生物技术下游工业而言，其局限性日益突出。对于蛋白等大分子生物物质，其较小的空隙导致孔内被停滞的流动相传质阻力很大，严重制约了其分离效率，尤其在大规模生产需要较高流速的情况下，大分子溶质来不及扩散进入琼脂糖微球内部，绝大多数仅与介质表面基团产生识别作用，进而导致琼脂糖介质的分辨率大大降低，无法满足快速分离的需求。因此开发新型色谱介质及方案，仍旧是目前解决生物技术下游产品瓶颈性问题的一个最佳方案。

生物技术对高性能琼脂糖介质的增长需求往往意味着介质颗粒越来越小。较小的颗粒可有效提高分离介质与目标物的识别效果，但基于Darcy规律，较小的颗粒也会导致更大的压强，进而引起层析介质塌陷，增加纯化成本；这就导致现有琼脂糖层析介质只能局限于增强结构强度及基团修饰等方式简单提高其基质样品耐受性及吸附效果，在面对高速发展的生物技术体系难以有质的提升。而制备大孔琼脂糖将会是提高层析琼脂糖性能和分离效率的有效措施，理论上其可以通过表面多孔结构提高通过率、降低传质阻力。同时大孔琼脂糖可以整合小颗粒高吸附量、快速识别平衡，以及大颗粒低柱压和易于大体系操作等优势，在生物领域的下游技术应用具有广阔的前景。然而，大孔体系下的高流速，在一定程度上也降低了琼脂糖凝胶高吸附量的优势，如何提高大孔琼脂糖的吸附效果仍旧是一个难题。同时大孔琼脂糖微球往往意味着结构强度的下降，如何在提高大孔琼脂糖结构强度的前提下进一步提高其吸附量，是解决目前生物制备领域对高性能亲和层析介质需求的有效解决措施之一。

目前已有研究进行大孔琼脂糖凝胶的制备，马光辉等报道了一种基于胶团溶胀法制备大孔琼脂糖微球的工艺(CN 103055773 A)，通过添加并调节添加表面活性剂的量来改变大孔琼脂糖结构及空隙大小，但获得琼脂糖孔径较小；同样孙彦等利用碳酸钙为致空剂，通过调节碳酸钙的粒度和用量实现介孔孔径和孔隙率的控制(CN1472002A)，但是该方法涉及到盐酸反复浸泡洗脱易于破坏凝胶的构架，进而影响凝胶的物理结构剂寿命。徐伟等(CN1868578A)等利用金属氧化物为致孔剂成功的实现了大孔琼脂糖的制备工艺。但是固体致孔法普遍存在操作复杂，层析介质钟残存较多闭合孔，孔径之间的贯穿性较差的问题，且大体系中致孔剂难以去除的劣势一直困扰其批量化生产。

因此开发一种高性能、方法简单并具备良好机械强度的大孔琼脂糖制备工艺并构建其性能提高措施具有显著的意义。

发明内容：

本发明要解决的技术问题是如何提高大孔琼脂糖的吸附效果以及如何在提高大孔琼脂糖结构强度的前提下进一步提高其吸附量。

为解决上述问题，本发明通过双乳液法制备，利用刷状功能化聚合物方法实现多位点亲和识别，显著提升了亲和凝胶的吸附效果及吸附量；结构强度利用环氧化修饰及交联完成琼脂糖内部结构的固定化，同时功能化聚合物也具备结构强化功能。

为达到上述目的，本发明通过以下技术方案实现，一种超大孔琼脂糖亲和层析凝胶的制备方法，包括以下步骤：

(1)100mL2～8％的琼脂糖溶液加热至溶液透明，优选为微波加热；

(2)待温度下降至油相的沸点时，将步骤(1)的琼脂糖溶液与50mL油相溶液混合，然后在1000rpm转速下搅拌1h得到乳液；其中，油相中含3-6mL Tween 80，Tween80可以实现油相与水相的充分混合乳化；曲拉通等也具备类似效果；其中，待温度下降至油相的沸点时混合，可以防止添加的油相爆沸损失。琼脂糖本身的溶液与油相混合之后，在Tween80的作用下，会变成均一的乳液；Tween80与搅拌转速影响琼脂糖颗粒孔径的大小，高转速及高比例Tween80下，琼脂糖颗粒的孔径会变小，但是太少的时候不利于水相和油相混合。

(3)将步骤(2)的乳液倒入300mL相同油相试剂中，在机械搅拌状态下600rpm(搅拌速度越高，形成的琼脂糖粒径越小)搅拌40min，随后在持续搅拌状态下冷却至室温；其中，油相中含20mL Span 80或85，Span 80或者85目的是实现大体系油相与琼脂糖乳液的有效混合；此时琼脂糖颗粒包裹油相形成均一的液滴，待温度冷却后形成微球。

(4)将步骤(3)的混合物通过3000rpm离心3min分离得到微球，然后将获得的微球依次用石油醚、异丙醇、乙醇及去离子水冲洗干净，抽滤备用；清洗干净之后，琼脂糖微球内部的油相(Tween 80及油)被去除，形成大孔琼脂糖微球。

(5)称取40g步骤(4)制备的琼脂糖微球分散在120mL 0.9M NaOH溶液中并持续机械搅拌30min，随后加入64mL二甲基亚砜，12mL乙醇及20mL季戊四醇缩水甘油醚或20mL环氧氯丙烷或20mL 2,3-二溴-1-丙醇，随后将体系于40℃条件下搅拌反应6h；获得的交联琼脂糖凝胶分别用乙醇及去离子水冲洗干净，得到超大孔琼脂糖亲和层析凝胶AG。利用季戊四醇缩水甘油醚或环氧氯丙烷或2,3-二溴-1-丙醇交联，实现琼脂糖微球的结构强化；显著特点是交联之后的琼脂糖微球加热煮沸不会出现溶解。

进一步的，所述油相为液体石蜡，步骤(2)待温度下降至85℃时与油相混合，并在85℃条件下搅拌。

进一步的，所述油相为环己烷，步骤(2)待温度下降至75℃时与油相混合，并在75℃条件下搅拌。

一种利用上述大孔琼脂糖亲和层析凝胶AG环氧化层析凝胶的方法，包括以下步骤：40g AG分散在60mL 0.9M NaOH溶液中，机械搅拌10min后添加60mL环氧氯丙烷及75mg硼氢化钠，随后于40℃条件下振荡反应6h，获得的琼脂糖凝胶用80％乙醇水溶液及去离子水充分冲洗干净后备用，得到环氧化层析凝胶AG@epoxy。琼脂糖内部引入环氧基，且环氧氯丙烷的修饰也会实现二次的交联内部结构状态变化变化不大，但是出现新的交联及表面环氧基基团。

一种利用上述环氧化层析凝胶AG@epoxy制备氨基化层析凝胶的方法，包括以下步骤：

20gAG@epoxy分散在50mL碳酸盐缓冲液(0.1M,pH 9.0)，随后加入2mL聚乙烯亚胺(Mw＝10000)；混合物于摇床上充分振荡反应24h后获得的琼脂糖微球用去离子水充分冲洗并抽滤后，得到氨基化层析凝胶AG@NH₂。表面引入大量氨基化基团，结构颗粒未变化。

一种利用上述氨基化层析凝胶AG@NH₂制备引发剂功能化层析凝胶的方法，包括以下步骤：取10gAG@NH₂分散在40mL四氢呋喃或N,N-二甲基甲酰胺中，随后添加1.83mL三乙胺；混合物在-20℃冷却15min，随后逐滴滴加1.86mL 2-溴异丁酰溴；随后混合物于室温下机械搅拌反应12h，随后用无水乙醇及去离子水充分清洗去除残留试剂，得到引发剂功能化层析凝胶AG@Br。表面引入引发剂，用于引入功能化刷状聚合物，没有结构变化。

一种利用上述引发剂功能化层析凝胶AG@Br制备聚合物复合凝胶的方法，其特征在于包括以下步骤：取10gAG@Br，共聚物及1.47mL甲基丙烯酸缩水甘油酯分散在60mL异丙醇中，随后添加50.4mg CuBr及7.8mg CuBr2；混合物在冰浴条件下氮气鼓泡脱气15min，随后添加98μL三(2-二甲氨基乙基)胺，混合物继续在冰浴条件下氮气鼓泡15min；随后密封并于40～75℃条件下搅拌反应24h。最后制备的复合琼脂糖颗粒分别用5％EDTA,无水乙醇及去离子水冲洗，得到聚合物复合凝胶AG@poly(NIPAm-co-GMA)。琼脂糖表面会形成柔软聚合物层，在水溶液中扩散为聚合物刷。

进一步的，所述共聚物为2.38gN-异丙基丙烯酰胺。

一种利用上述环氧化层析凝胶AG@epoxy或聚合物复合凝胶AG@poly(NIPAm-co-GMA)制备含IDA或NTA基团的复合凝胶的方法，包括以下步骤：取10g亚氨基二乙酸或NΑ,NΑ-二(羧甲基)-L-赖氨酸，5g NaOH溶解于100mL 0.6M碳酸盐缓冲液(pH 11.0)中，随后10gAG@poly(NIPAm-co-GMA)或AG@epoxy分散到上述溶液中并于室温下搅拌24h；反应之后获得的复合琼脂糖颗粒用去离子水充分清洗干净，得到复合凝胶AG@poly(NIPAm-co-GMA)@IDA(NTA)或复合凝胶AG@IDA(NTA)(其中，由AG@poly(NIPAm-co-GMA)制备得到AG@poly(NIPAm-co-GMA)@IDA；由AG@epoxy得到AG@IDA(NTA)。引入IDA后聚合物刷水溶性会急剧升高，扩散能力大幅扩大；同时亲和效果会显著增强；具备了螯合重金属离子的作用。但表面结构变化不大。

一种利用上述复合凝胶AG@poly(NIPAm-co-GMA)@IDA(NTA)或复合凝胶AG@IDA(NTA)制备含Ni²⁺基团的复合凝胶的方法，包括以下步骤：上述获得的AG@poly(NIPAm-co-GMA)@IDA(NTA)或AG@IDA(NTA)分散在10％含Ni²⁺的水溶液中(w/v)，(可以是NiCl₂，二价铜、钴、锌等)随后室温下振荡摇晃6h；获得的样品用去离子水充分清洗之后保存在20％乙醇水溶液中备用，得到含Ni²⁺基团的复合凝胶AG@IDA(NTA)-Ni或AG@poly(NIPAm-co-GMA)@IDA(NTA)-Ni(其中，由AG@poly(NIPAm-co-GMA)@IDA(NTA)得到AG@poly(NIPAm-co-GMA)@IDA(NTA)-Ni；由AG@IDA(NTA)得到AG@IDA(NTA)-Ni)。微球因为螯合Ni²⁺离子颜色出现改变，AG@poly(NIPAm-co-GMA)@IDA(NTA)因为螯合Ni²⁺浓度较高变为深绿色，AG@IDA(NTA)-Ni因为螯合较低，变为淡蓝色。

本发明的有益效果在于：制备大孔琼脂糖微球以应对复杂生物体系样品的分离，避免因样品杂质而堵塞；同时结合刷状功能化聚合物提高琼脂糖空隙内部与样品的接触面积，实现对目标物的高效率富集。该方法基本将大孔琼脂糖高通透性和基质耐受性及小颗粒高柱效和亲和效果结合起来，实现了基质耐受性及样品富集效果的有效结合。

附图说明

图1是本发明的红外图谱；图中，AG(a)，AG@epoxy(b)，AG@IDA(c)，AG@NH2(d)，AG@Br(e)，AG@poly(NIPAm-co-GMA)(f)，AG@poly(NIPAm-co-GMA)@IDA(g)。

图2是本发明的SEM图；图中AG大孔琼脂糖微球(A)，AG@poly(NIPAm-co-GMA)@IDA(B)，AG大孔琼脂糖微球内部截面(C)，AG大孔琼脂糖微球内表面积(D)。

图3是标准模拟样品尾丝蛋白Gp10(A)及Lys84(B)在AG@poly(NIPAm-co-GMA)@IDA-Ni亲和凝胶表面动力学结合图。

图4为AG@poly(NIPAm-co-GMA)@IDA-Ni亲和凝胶处理样品SDS PAGE分析结果图。其中，Lane M：蛋白标准样品；Lane a1：尾丝蛋白Lys360大肠杆菌表达液；Lane a2：亲和凝胶处理后上清液；Lane(a3,a4,a5,a6)分别为20mM,50mM,100mM,200mM咪唑磷酸盐缓冲液洗脱液。Lane b1：尾丝蛋白Lys84大肠杆菌表达液；Lane b2：亲和凝胶处理后上清液；Lane(b3,b4,b5,b6)分别为50mM,100mM,200mM,500mM咪唑磷酸盐缓冲液洗脱液。Lane c1：壳寡糖酶大肠杆菌表达液；Lane c2：亲和凝胶处理后上清液；Lane(c3,c4,c5,c6,c7)分别为20mM,600mM,80mM,100mM,150mM咪唑磷酸盐缓冲液洗脱液。Lane d1:壳聚糖酶大肠杆菌表达液；Lane d2：亲和凝胶处理后上清液；Lane(d3,d4,d5,d6,d7)分别为20mM,40mM,60mM,80mM,100mM咪唑磷酸盐缓冲液洗脱液。

图5是本发明的亲和材料制备模拟图及其结合目标蛋白的原理图。首先制备表面刻蚀大孔琼脂糖颗粒，随后在其表面引入功能化聚合物及识别基团(A)；利用制备的功能化琼脂糖颗粒可以有效实现对蛋白的选择性分离及吸附(B)。

具体实施方式：

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：

一种超大孔琼脂糖亲和层析凝胶的制备方法，包括以下步骤：

100mL 2～8％的琼脂糖溶液利用微波加热方法至溶液透明，待温度下降至85℃或75℃(与有机体系的沸点一致)时与50mL油相溶液(液体石蜡、环己烷等油相，含3-6mLTween80)混合后，于85℃(液体石蜡)或75℃(环己烷)条件下搅拌1h(1000rpm转速)形成均一的乳液。随后乳液倒入300mL相同油相试剂(含20mL Span 80，并提前预热到乳液相同温度)，混合物在机械搅拌状态下(600rpm)搅拌40min，随后在持续搅拌状态下冷却至室温。获得的大孔琼脂糖微球通过3000rpm离心3min分离微球，获得的微球依次用石油醚、异丙醇、乙醇及去离子水冲洗干净，抽滤备用。

40g制备的琼脂糖微球分散在120mL 0.9M NaOH溶液中并持续机械搅拌30min，随后加入64mL二甲基亚砜，12mL乙醇及20mL季戊四醇缩水甘油醚或20mL环氧氯丙烷或20mL2,3-二溴-1-丙醇，随后样品体系于40℃条件下搅拌反应6h。获得的交联琼脂糖凝胶分别用乙醇及去离子水冲洗干净，命名为AG。

实施例2：

一种利用实施例1中AG制备氨基化层析凝胶的方法，包括以下步骤：

(1)40g交联琼脂糖微球AG分散在60mL 0.9M NaOH溶液中，机械搅拌10min后添加60mL环氧氯丙烷及75mg硼氢化钠，随后于40℃条件下振荡反应6h，获得的琼脂糖凝胶用80％乙醇水溶液及去离子水充分冲洗干净后备用，命名为AG@epoxy。

(2)20g环氧化琼脂糖微球分散在50mL碳酸盐缓冲液(0.1M,pH 9.0)，随后加入2mL聚乙烯亚胺(Mw＝10000)；混合物于摇床上充分振荡反应24h后获得的琼脂糖微球用去离子水充分冲洗并抽滤后命名为AG@NH₂。

实施例3：

一种利用实施例2中氨基化层析凝胶AG@NH₂制备引发剂功能化层析凝胶的方法，包括以下步骤：氨基化琼脂糖微球AG@NH2(10g)分散在40mL四氢呋喃或N,N-二甲基甲酰胺中，随后添加1.83mL三乙胺；混合物在-20℃冷却15min，随后逐滴滴加1.86mL 2-溴异丁酰溴。随后混合物于室温下机械搅拌反应12h，随后用无水乙醇及去离子水充分清洗去除残留试剂，并命名为AG@Br。

实施例4：

一种利用实施例3中引发剂功能化层析凝胶AG@B制备聚合物复合凝胶的方法，其包括以下步骤：AG@Br(10g)，N-异丙基丙烯酰胺(NIPAm,2.38g)及甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA,1.47mL)(GMA是必选试剂，NIPAm为共聚物，可以用其他物质代替)分散在60mL异丙醇中，随后添加50.4mg CuBr及7.8mg CuBr2。混合物在冰浴条件下氮气鼓泡脱气15min，随后添加98μL三(2-二甲氨基乙基)胺，混合物继续在冰浴条件下氮气鼓泡15min；随后密封并于40～75℃条件下搅拌反应24h。最后制备的复合琼脂糖颗粒分别用5％EDTA,无水乙醇及去离子水冲洗，并命名为AG@poly(NIPAm-co-GMA)。

实施例5：

一种利用实施例2中AG@epoxy或实施例4中聚合物复合凝胶AG@poly(NIPAm-co-GMA)制备含IDA或NTA基团的复合凝胶的方法，包括以下步骤：10g亚氨基二乙酸或NΑ,NΑ-二(羧甲基)-L-赖氨酸，5g NaOH溶解于100mL 0.6M碳酸盐缓冲液(pH 11.0)中，随后10gAG@poly(NIPAm-co-GMA)或AG@epoxy分散到上述溶液中并于室温下搅拌24h。反应之后获得的复合琼脂糖颗粒用去离子水充分清洗干净，并命名为AG@poly(NIPAm-co-GMA)@IDA(NTA)及AG@IDA(NTA)。

实施例6：

一种利用实施例5中复合凝胶AG@poly(NIPAm-co-GMA)@IDA(NTA)或复合凝胶AG@IDA(NTA)制备含Ni²⁺基团的复合凝胶的方法，包括以下步骤：上述获得的AG@poly(NIPAm-co-GMA)@IDA(NTA)或AG@IDA(NTA)分散在10％NiCl₂水溶液中(w/v)，随后室温下振荡摇晃6h；获得的样品用去离子水充分清洗之后保存在20％乙醇水溶液中备用，得到含Ni²⁺基团的复合凝胶AG@IDA(NTA)-Ni或AG@poly(NIPAm-co-GMA)@IDA(NTA)-Ni(其中，由AG@poly(NIPAm-co-GMA)@IDA(NTA)得到AG@poly(NIPAm-co-GMA)@IDA(NTA)-Ni；由AG@IDA(NTA)得到AG@IDA(NTA)-Ni)。

蛋白吸附验证：将上述AG@poly(NIPAm-co-GMA)@IDA-Ni 1mL装柱到6mL SPE固相萃取管中，随后用磷酸盐缓冲液(pH 8.0，50mM磷酸氢二钠，300mM氯化钠及1％甘油)活化，蛋白样品缓慢通过凝胶柱，以重力柱方式流过。随后用磷酸盐缓冲液冲洗去除残留蛋白及杂质，并用梯度浓度咪唑缓冲液洗脱，收集洗脱液SDS PAGE验证分离净化效果。

材料表征：

从红外图谱(图1)看出，853及872cm^-1处的吸收峰表明琼脂糖微球表面环氧基修饰成功；环氧基密度经化学计量为250μm/g。对于AG@IDA,1470及1660cm^-1处吸收峰为羟基面内震动及羰基的伸缩振动(图1，曲线c)，表明AG@IDA制备成功。1488cm^-1处信号表明氨基修饰成功(图1，曲线d)。引入引发剂Br之后，1538及1664cm^-1处吸收峰表明2-溴异丁酰溴修饰成功(图1，曲线e)。吸收峰1345及1456cm^-1处信号表明琼脂糖表面刷状聚合物修饰成功(图1，曲线f)，同时841cm^-1处信号为环氧基信号，表明聚合物中含有大量甲基丙烯酸缩水甘油酯，聚合物修饰成功。1466及1660cm^-1处信号增强表明亚氨基二乙酸基团引入到聚合物表面，材料制备成功(图1，曲线g)。

由图2的SEM结果显示，制备的琼脂糖微球表面含有大量微孔(图2.A)，内部孔径分布均匀，且孔径均分布在4-6μm之间(图2.C)；修饰完毕聚合物之后，表面出现大量柔软的聚合物状态，符合刷状聚合物的状态，且聚合物分布均匀(图2.B)；其内表面积仍具备传统琼脂糖的孔隙结构，微结构空隙在1μm左右(图2.D)。

从图3可知，亲和凝胶对目标蛋白的结合是基于亲和识别的平衡识别关系，其在25℃条件下对Gp10及Lys结合量分别为0.94和0.69mg/mL，在37℃条件下对Gp10及Lys结合量分别为0.81和0.58mg/mL。高温下较低的结合量于聚合物中嵌入的N-异丙基丙烯酰胺片段提供的温度相应特性有关。

实际样品蛋白纯化验证：

以含组氨酸标签尾丝蛋白Lys360，Lys84及壳聚糖酶、壳寡糖酶大肠杆菌表达液为样品，验证亲和凝胶纯化效果，结果如图4所示，制备的亲和凝胶对四种样品体系中目标蛋白均有良好的纯化效果，灰度分析目标物纯度均>90％。

Claims

1.一种超大孔琼脂糖亲和层析凝胶的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)100mL2～8％的琼脂糖溶液加热至溶液透明；

(2)待温度下降至油相的沸点时，将步骤(1)的琼脂糖溶液与50mL油相溶液混合，然后在1000rpm转速下搅拌1h得到乳液；其中，油相中含3-6mLTween 80或曲拉通X100；

(3)将步骤(2)的乳液倒入300mL相同油相试剂中，在机械搅拌状态下600rpm搅拌40min，随后在持续搅拌状态下冷却至室温；其中，油相中含20mL Span 80或85；

(4)将步骤(3)的混合物通过3000rpm离心3min分离得到微球，然后将获得的微球依次用石油醚、异丙醇、乙醇及去离子水冲洗干净，抽滤备用；

(5)称取40g步骤(4)制备的琼脂糖微球分散在120mL 0.9M NaOH溶液中并持续机械搅拌30min，随后加入64mL二甲基亚砜，12mL乙醇及20mL季戊四醇缩水甘油醚或20mL环氧氯丙烷或20mL 2,3-二溴-1-丙醇，随后将体系于40℃条件下搅拌反应6h；获得的交联琼脂糖凝胶分别用乙醇及去离子水冲洗干净，得到超大孔琼脂糖亲和层析凝胶AG。

2.如权利要求1所述的超大孔琼脂糖亲和层析凝胶的制备方法，其特征在于：所述油相为液体石蜡，步骤(2)待温度下降至85℃时与油相混合，并在85℃条件下搅拌。

3.如权利要求1所述的超大孔琼脂糖亲和层析凝胶的制备方法，其特征在于：所述油相为环己烷，步骤(2)待温度下降至75℃时与油相混合，并在75℃条件下搅拌。

4.一种利用权利要求1-3中任一超大孔琼脂糖亲和层析凝胶AG制备环氧化层析凝胶的方法，其特征在于包括以下步骤：40gAG分散在60mL 0.9M NaOH溶液中，机械搅拌10min后添加60mL环氧氯丙烷及75mg硼氢化钠，随后于40℃条件下振荡反应6h，获得的琼脂糖凝胶用80％乙醇水溶液及去离子水充分冲洗干净后备用，得到环氧化层析凝胶AG@epoxy。

5.一种利用权利要求4中环氧化层析凝胶AG@epoxy制备环氧化层析凝胶的方法，其特征在于包括以下步骤：20gAG@epoxy分散在50mL碳酸盐缓冲液，随后加入2mL聚乙烯亚胺；混合物于摇床上充分振荡反应24h后获得的琼脂糖微球用去离子水充分冲洗并抽滤后，得到氨基化层析凝胶AG@NH₂。

6.一种利用权利要求5中氨基化层析凝胶AG@NH₂制备引发剂功能化层析凝胶的方法，其特征在于包括以下步骤：取10gAG@NH₂分散在40mL四氢呋喃或N,N-二甲基甲酰胺中，随后添加1.83mL三乙胺；混合物在-20℃冷却15min，随后逐滴滴加1.86mL 2-溴异丁酰溴；随后混合物于室温下机械搅拌反应12h，随后用无水乙醇及去离子水充分清洗去除残留试剂，得到引发剂功能化层析凝胶AG@Br。

7.一种利用权利要求6中引发剂功能化层析凝胶AG@Br制备聚合物复合凝胶的方法，其特征在于包括以下步骤：取10gAG@Br，共聚物及1.47mL甲基丙烯酸缩水甘油酯分散在60mL异丙醇中，随后添加50.4mg CuBr及7.8mg CuBr2；混合物在冰浴条件下氮气鼓泡脱气15min，随后添加98μL三(2-二甲氨基乙基)胺，混合物继续在冰浴条件下氮气鼓泡15min；随后密封并于40～75℃条件下搅拌反应24h。最后制备的复合琼脂糖颗粒分别用5％EDTA,无水乙醇及去离子水冲洗，得到聚合物复合凝胶AG@poly(NIPAm-co-GMA)。

8.一种利用权利要求4中环氧化层析凝胶AG@epoxy或权利要求7中聚合物复合凝胶AG@poly(NIPAm-co-GMA)制备含IDA或NTA基团的复合凝胶的方法，其特征在于包括以下步骤：取10g亚氨基二乙酸或NΑ’,NΑ’-二(羧甲基)-L-赖氨酸，5g NaOH溶解于100mL 0.6M碳酸盐缓冲液中，随后10gAG@poly(NIPAm-co-GMA)或AG@epoxy分散到上述溶液中并于室温下搅拌24h；反应之后获得的复合琼脂糖颗粒用去离子水充分清洗干净，得到复合凝胶AG@poly(NIPAm-co-GMA)@IDA(NTA)或复合凝胶AG@IDA(NTA)。

9.一种利用权利要求8中的复合凝胶AG@poly(NIPAm-co-GMA)@IDA(NTA)或复合凝胶AG@IDA(NTA)制备含Ni²⁺基团的复合凝胶的方法，其特征在于包括以下步骤：将AG@poly(NIPAm-co-GMA)@IDA(NTA)或AG@IDA(NTA)分散在10％含Ni²⁺的水溶液中，随后室温下振荡摇晃6h；获得的样品用去离子水充分清洗之后保存在20％乙醇水溶液中备用，得到含Ni²⁺基团的复合凝胶AG@IDA(NTA)-Ni或AG@poly(NIPAm-co-GMA)@IDA(NTA)-Ni。

10.利用权利要求1-10方法制备的层析凝胶。