CN105363417B - 一种交联羧甲基化琼脂糖基凝胶微球的制备方法 - Google Patents

一种交联羧甲基化琼脂糖基凝胶微球的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种制备交联羧甲基化琼脂糖基凝胶微球的方法，是将琼脂糖羧甲基化，然后利用悬浮分散法制得羧甲基化琼脂糖基凝胶微球，然后利用环氧氯丙烷与羧甲基化琼脂糖基凝胶微球发生交联反应，进而制得交联羧甲基化琼脂糖基凝胶微球。应用本发明方法每一步骤都易于控制，解决了通常制备交联羧甲基化琼脂糖基凝胶微球时，羧甲基化反应对微球机械强度和孔径影响不易控制的缺点，为羧甲基化琼脂基糖凝胶微球层析介质分离性能的稳定性提供了保障。实验证实：本发明方法制备的凝胶微球对牛血清蛋白具有良好的吸附能力，在0.1M的盐酸和0.1M NaOH溶液中浸泡24小时，其形状没有发生明显的变化。预示本发明方法具有良好的应用前景。

Description

一种交联羧甲基化琼脂糖基凝胶微球的制备方法
技术领域
本发明涉及一种生物大分子分离介质的制备方法，尤其涉及一种交联羧甲基化琼脂糖基凝胶微球的制备方法。
背景技术
近年来,生物技术的发展非常迅速。运用基因工程、蛋白质工程、发酵工程等生物技术，已能设计、制造、生产人们急需的多种蛋白质。和其它生物产品的生产过程一样，蛋白质的生产过程一般也分为上、中、下游过程。上、中游过程是运用生物技术生产目标产物，下游过程是指对含有目标产物的物料进行处理、分离、纯化、加工目标产物，涉及到二十多个单元操作，占整个生产成本的70-80％，其中，层析是一门关键技术。由于层析技术具有分离效率高、过程易于放大、易于自动化的特点，其应用也最为广泛。
根据不同的保留机制，层析介质分为：凝胶过滤介质、离子交换介质、疏水作用层析介质、亲和层析介质等。良好的蛋白分离层析介质一般需满足以下几个条件：(1)高度的亲水性。以便蛋白能够与之发生可逆性的吸附；(2)适宜孔径结构。便于大分子量的活性蛋白扩散进出,通过表面作用或体积排阻实现蛋白质的分离；(3)适宜功能基团密度。使其具有较高的吸附容量。
现在广泛应用的蛋白质层析分离介质的骨架一般琼脂糖、葡聚糖、聚丙烯酰胺等亲水材料的凝胶微球。对于离子交换型层析介质，交联羧甲基化琼脂糖基凝胶微球是应用最为广泛的分离材料之一。出于商业上的考虑，国内外文献中有关其羧甲基化琼脂糖凝胶微球的制备技术的报道并不多，且语焉不详。其一般制备步骤是：(1)首先制备琼脂糖微球；(2)将微球交联，以提高其机械强度和获得适宜的孔径结构；(3)在交联微球上键联羧甲基功能基团。但是上述制备方法中，由于羧甲基化反应须在强碱性条件下完成，使得交联微球的机械强度和孔径结构易于发生变化，进而影响羧甲基化琼脂糖基凝胶微球分离性能和机械强度。因此，在利用该方法制备交联羧甲基化琼脂糖基凝胶微球时，存在生产过程中羧甲基化反应对微球机械强度和孔径影响不易控制的缺点，且产品分离性能的稳定性差。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种交联羧甲基化琼脂糖基凝胶微球的制备方法。
本发明所述交联羧甲基化琼脂糖基凝胶微球的制备方法，步骤是：
(1)将琼脂糖和95％的乙醇按1g:3～8ml的比例加入反应器中，然后按琼脂糖和NaOH为1g:1.4～2g的比例加入NaOH，室温下搅拌12±1h，再按氯乙酸和NaOH为1g：1.4～2.0g的比例滴加氯乙酸溶液，并使氯乙酸与总反应液的体积为1g:3～12ml的比例，在温度20～45℃下反应2～4h；然后升温至60～65℃反应8±1h，完毕后，用滤纸过滤，收集的沉淀物用95％乙醇洗涤并在80±2℃下干燥24h以上，得到羧甲基化琼脂糖；其中，所述氯乙酸溶液是按氯乙酸与95％乙醇为1g:1～4ml的比例配制；
(2)按设定量称取羧甲基化琼脂糖，加入水中并加热溶解，配成浓度以g/ml计为3～6％的羧甲基化琼脂糖溶液，在90±2℃温度条件下保温备用；
(3)将含有Span 80的大豆油作为油相加入反应器，其中所述Span 80在大豆油的含量以体积百分比计为4～9％，在90±2℃下以800r·min-1转速搅拌0.5～1h后将步骤(2)制得的羧甲基化琼脂糖溶液与油相按体积比为1:4～1:10的比例加入油相中，继续在800r·min-1转速下搅拌45±5min，然后用冰水浴将反应液冷却至10～30℃，再在200r·min-1转速下搅拌20±3min，完毕后，用250目的滤布过滤，收集的沉淀物用95％乙醇洗涤去残余的油相，沉淀为羧甲基化琼脂糖基凝胶微球；按凝胶微球与50％乙醇按体积比为1:10的比例将所述微球置于50％乙醇中贮存，备用；
(4)取步骤(3)贮存的羧甲基化琼脂糖基凝胶微球用滤纸过滤去除液体，再按羧甲基化琼脂糖基凝胶微球与50％乙醇积比为1:1～4的比例配成反应体系，并按NaOH与反应体系为1g:10～30ml的比例向该体系中加入NaOH，搅拌反应5～10h；然后按NaOH与环氧氯丙烷为1g:1.2～2.0ml的比例在20～45℃下向该体系中缓慢滴加环氧氯丙烷溶液，并使环氧氯丙烷的加入量以体积比计为总反应液体积的4-15％，其中所述环氧氯丙烷溶液是按环氧氯丙烷与95％乙醇为1ml:1～3ml的比例配制；滴加完毕后，在45℃温度条件下反应2～4h，然后升温至65±5℃反应6～10h，当反应液降至室温后，用250目的滤布过滤，收集微球并用蒸馏水洗净，用分样筛筛分出120～250目的微球样品，即获得交联羧甲基化琼脂糖基凝胶微球，将所述微球置于20％乙醇中贮存。
上述交联羧甲基化琼脂糖基凝胶微球的制备方法中：所述反应器优选是三口反应瓶。
上述交联羧甲基化琼脂糖基凝胶微球的制备方法中：步骤(1)所述氯乙酸和NaOH优选按1g：1.4～1.7g的比例滴加氯乙酸溶液，并使氯乙酸与总反应液的体积优选为1g:6～9ml的比例。
上述交联羧甲基化琼脂糖基凝胶微球的制备方法中：步骤(3)所述Span 80在大豆油的含量以体积百分比计优选为5～8％；所述羧甲基化琼脂糖溶液与油相的体积比为1:5～1:8，最优选为1:5；其中羧甲基化琼脂糖溶液浓度以g/ml计优选为4～6％。
上述交联羧甲基化琼脂糖基凝胶微球的制备方法中：步骤(4)所述NaOH与环氧氯丙烷优选按1g:1.2～2.0ml的比例在30～45℃下向反应体系中缓慢滴加环氧氯丙烷溶液，并使环氧氯丙烷的加入量以体积比计优选为总反应液体积的6～12％。
本发明公开的交联羧甲基化琼脂糖基凝胶微球的制备方法对通常制备交联羧甲基化琼脂糖基凝胶微球的步骤进行了重新组合和调整，产生了意想不到的效果。涉及的技术方案是将琼脂糖羧甲基化，然后再将羧甲基化琼脂糖加工成微球，继而用环氧氯丙烷和微球发生交联反应，进而制得交联羧甲基化琼脂糖基凝胶微球。应用本发明公开的方法，每一步骤都易于控制，解决了通常制备交联羧甲基化琼脂糖基凝胶微球时，羧甲基化反应对微球机械强度和孔径影响不易控制的缺点，为羧甲基化琼脂基糖凝胶微球层析介质分离性能的稳定性提供了保障。实验证实：本发明方法制备的交联羧甲基化琼脂糖基凝胶微球对牛血清蛋白(BSA)具有良好的吸附能力，在0.1M的盐酸和0.1M NaOH溶液中浸泡24小时，其形状没有发生明显的变化。预示本发明方法在规模化生产高品质羧甲基化琼脂基糖凝胶微球产品中具有良好的应用前景。
附图说明
图1：羧甲基化琼脂糖基凝胶微球实物照片。
图2：交联羧甲基化琼脂糖基凝胶微球。
具体实施方式
实施例1
(1)在500ml的三口烧瓶中，加入25g琼脂糖和150ml 95％乙醇和40g NaOH，室温下搅拌12h，然后缓慢滴加氯乙酸25g(先将其溶于50ml 95％乙醇中)，保持反应液的温度不高于45℃，耗时约90min。然后升温至65℃反应8h，完毕后,用滤纸过滤，收集的沉淀物用95％乙醇洗涤并在80℃下干燥24h以上，得到羧甲基化琼脂糖；
(2)称取4g羧甲基化琼脂糖，加入100ml水中并加热溶解，配成浓度为4％(g/ml)的羧甲基化琼脂糖溶液，在90℃温度条件下保温备用；
(3)在1000ml三口烧瓶中，加入500ml 6％(v/v)Span 80的大豆油，800r·min-1转速搅拌，升温至90℃，然后中加入100ml 90℃的4％羧甲基化琼脂糖(步骤(2)制备)溶液，保持搅拌转速800r·min-145min。然后用冰水浴，将反应液迅速冷却至室温，再保持转速200r·min-1搅拌20min。完毕后，用250目的滤布过滤，收集的沉淀物用95％乙醇洗涤去残余的油相，沉淀为羧甲基化琼脂糖基凝胶微球；按凝胶微球与50％乙醇按体积比为1:10的比例将所述微球置于50％乙醇中贮存，备用；
(4)在250ml三口烧瓶中，加入50ml羧甲基化琼脂糖基凝胶微球，100ml 50％乙醇和6g NaOH，室温下，搅拌反应6h。然后缓慢滴加9ml环氧氯丙烷(先将其9ml溶于9ml95％乙醇中)，保持反应液的温度不高于45℃，耗时约30min。环氧氯丙烷加入完毕后，45℃下反应2h，然后升温至65℃反应8h。反应液降至室温后，用250目的滤布过滤，收集微球并用蒸馏水洗净，用分样筛筛分出120～250目的微球样品，即获得交联羧甲基化琼脂糖基凝胶微球，将所述微球置于20％乙醇中贮存。
1、交联羧甲基化琼脂糖基凝胶微球对BSA吸附量测定
取1ml制得的微球样品加入10ml离心管中内，然后加入5ml 20mg/ml BSA乙酸-乙酸钠缓冲液(50mM HAc-NaHc；pH4.5)。室温下，置于摇床中震荡12h，摇床转速60转/分。然后测量上清中BSA的浓度C(mg/ml)。按方程(1)计算交联羧甲基化琼脂糖基凝胶微球对BSA离子吸附量。
Q＝100-6C(mg/ml) (1)
测量结果：吸附量为106mg/ml。
2、交联羧甲基化琼脂糖基凝胶微球酸碱稳定性
为了检测交联羧甲基化琼脂糖基凝胶微球酸碱稳定性。我们利用如下的方法进行了简易测量。
取交联羧甲基化琼脂糖基凝胶微球1ml，加入10ml 0.1M的HCl或NaOH溶液，室温下，摇床上震荡12h，摇床转速60转/分。观察交联剩余污泥吸附剂的形状变化。
结果表明，样品形状没有明显的变化。
实施例2
(1)在500ml的三口烧瓶中，加入25g琼脂糖和150ml 95％乙醇和40g NaOH，室温下搅拌12h，然后缓慢滴加氯乙酸25g(先将其溶于50ml 95％乙醇中)，保持反应液的温度不高于45℃，耗时约90min。然后升温至65℃反应8h，完毕后,用滤纸过滤，收集的沉淀物用95％乙醇洗涤并在80℃下干燥24h以上，得到羧甲基化琼脂糖；
(2)称取4g羧甲基化琼脂糖，加入100ml水中并加热溶解，配成浓度为4％(g/ml)的羧甲基化琼脂糖溶液，在90℃温度条件下保温备用；
(3)在1000ml三口烧瓶中，加入500ml 6％Span 80的大豆油，800r·min-1转速搅拌，升温至90℃，然后中加入100ml 90℃的4％羧甲基化琼脂糖(步骤(2)制备)溶液，保持搅拌转速800r·min-145min。然后用冰水浴，将反应液迅速冷却至室温，再保持转速200r·min-1搅拌20min。完毕后，用250目的滤布过滤，收集的沉淀物用95％乙醇洗涤去残余的油相，沉淀为羧甲基化琼脂糖基凝胶微球；按凝胶微球与50％乙醇按体积比为1:10的比例将所述微球置于50％乙醇中贮存，备用；
(4)在250ml三口烧瓶中，加入50ml羧甲基化琼脂糖基凝胶微球，100ml 50％乙醇和8g NaOH，室温下，搅拌反应6h。然后缓慢滴加12ml环氧氯丙烷(先将其溶于12ml 95％乙醇中)，保持反应液的温度不高于45℃，耗时约30min。环氧氯丙烷加入完毕后，45℃下反应2h，然后升温至65℃反应8h。反应液降至室温后，用250目的滤布过滤，收集微球并用蒸馏水洗净，用分样筛筛分出120～250目的微球样品，即获得交联羧甲基化琼脂糖基凝胶微球，将所述微球置于20％乙醇中贮存。
1、交联羧甲基化琼脂糖基凝胶微球对BSA吸附量测定
测量方法同实施例1。
测量结果：吸附量为122mg/ml。
2、交联羧甲基化琼脂糖基凝胶微球酸碱稳定性
测量方法同实施例1。
结果表明，样品的形态没有明显的变化。
实施例3
(1)在500ml的三口烧瓶中，加入25g琼脂糖和150ml 95％乙醇和40g NaOH，室温下搅拌12h，然后缓慢滴加氯乙酸25g(先将其溶于50ml 95％乙醇中)，保持反应液的温度不高于45℃，耗时约90min。然后升温至65℃反应8h，完毕后,用滤纸过滤，收集的沉淀物用95％乙醇洗涤并在80℃下干燥24h以上，得到羧甲基化琼脂糖；
(2)称取4g羧甲基化琼脂糖，加入100ml水中并加热溶解，配成浓度为4％(g/ml)的羧甲基化琼脂糖溶液，在90℃温度条件下保温备用；
(3)在1000ml三口烧瓶中，加入500ml 6％Span 80的大豆油，800r·min-1转速搅拌，升温至90℃，然后中加入100ml 90℃的4％羧甲基化琼脂糖(步骤(2)制备)溶液，保持搅拌转速800r·min-145min。然后用冰水浴，将反应液迅速冷却至室温，再保持转速200r·min-1搅拌20min。完毕后，用250目的滤布过滤，收集的沉淀物用95％乙醇洗涤去残余的油相，沉淀为羧甲基化琼脂糖基凝胶微球；按凝胶微球与50％乙醇按体积比为1:10的比例将所述微球置于50％乙醇中贮存，备用；
(4)在250ml三口烧瓶中，加入50ml羧甲基化琼脂糖基凝胶微球，100ml 50％乙醇和10g NaOH，室温下，搅拌反应6h。然后缓慢滴加15ml环氧氯丙烷(先将其溶于15ml 95％乙醇中)，保持反应液的温度不高于45℃，耗时约30min。环氧氯丙烷加入完毕后，45℃下反应2h，然后升温至65℃反应8h。反应液降至室温后，用250目的滤布过滤，收集微球并用蒸馏水洗净，用分样筛筛分出120～250目的微球样品，即获得交联羧甲基化琼脂糖基凝胶微球，将所述微球置于20％乙醇中贮存。
1、交联羧甲基化琼脂糖基凝胶微球对BSA吸附量测定
测量方法同实施例1。
测量结果：吸附量为135mg/ml。
2、交联羧甲基化琼脂糖基凝胶微球酸碱稳定性
测量方法同实施例1
结果表明，样品的形态没有明显的变化。
实施例4
(1)在500ml的三口烧瓶中，加入25g琼脂糖和150ml 95％乙醇和40g NaOH，室温下搅拌12h，然后缓慢滴加氯乙酸25g(先将其溶于50ml 95％乙醇中)，保持反应液的温度不高于45℃，耗时约90min。然后升温至65℃反应8h，完毕后,用滤纸过滤，收集的沉淀物用95％乙醇洗涤并在80℃下干燥24h以上，得到羧甲基化琼脂糖；
(2)称取3g羧甲基化琼脂糖，加入100ml水中并加热溶解，配成浓度为3％(g/ml)的羧甲基化琼脂糖溶液，在90℃温度条件下保温备用；
(3)在1000ml三口烧瓶中，加入500ml 6％Span 80的大豆油，800r·min-1转速搅拌，升温至90℃，然后中加入100ml 90℃的3％羧甲基化琼脂糖(步骤(2)制备)溶液，保持搅拌转速800r·min-145min。然后用冰水浴，将反应液迅速冷却至室温，再保持转速200r·min-1搅拌20min。完毕后，用250目的滤布过滤，收集的沉淀物用95％乙醇洗涤去残余的油相，沉淀为羧甲基化琼脂糖基凝胶微球；按凝胶微球与50％乙醇按体积比为1:10的比例将所述微球置于50％乙醇中贮存，备用；
(4)在250ml三口烧瓶中，加入50ml羧甲基化琼脂糖基凝胶微球，100ml 50％乙醇和6g NaOH，室温下，搅拌反应6h。然后缓慢滴加9ml环氧氯丙烷(先将其溶于9ml 95％乙醇中)，保持反应液的温度不高于45℃，耗时约30min。环氧氯丙烷加入完毕后，45℃下反应2h，然后升温至65℃反应8h。反应液降至室温后，用250目的滤布过滤，收集微球并用蒸馏水洗净，用分样筛筛分出120～250目的微球样品，即获得交联羧甲基化琼脂糖基凝胶微球，将所述微球置于20％乙醇中贮存。
1、交联羧甲基化琼脂糖基凝胶微球对BSA吸附量测定
测量方法同实施例1。
测量结果：吸附量为95mg/ml。
2、交联羧甲基化琼脂糖基凝胶微球酸碱稳定性
测量方法同实施例1
结果表明，样品的形态没有明显的变化。
实施例5
(1)在500ml的三口烧瓶中，加入25g琼脂糖和150ml 95％乙醇和40g NaOH，室温下搅拌12h，然后缓慢滴加氯乙酸25g(先将其溶于50ml 95％乙醇中)，保持反应液的温度不高于45℃，耗时约90min。然后升温至65℃反应8h，完毕后,用滤纸过滤，收集的沉淀物用95％乙醇洗涤并在80℃下干燥24h以上，得到羧甲基化琼脂糖；
(2)称取3g羧甲基化琼脂糖，加入100ml水中并加热溶解，配成浓度为3％(g/ml)的羧甲基化琼脂糖溶液，在90℃温度条件下保温备用；
(3)在1000ml三口烧瓶中，加入500ml 6％Span 80的大豆油，800r·min-1转速搅拌，升温至90℃，然后中加入100ml 90℃的3％羧甲基化琼脂糖(步骤(2)制备)溶液，保持搅拌转速800r·min-145min。然后用冰水浴，将反应液迅速冷却至室温，再保持转速200r·min-1搅拌20min。完毕后，用250目的滤布过滤，收集的沉淀物用95％乙醇洗涤去残余的油相，沉淀为羧甲基化琼脂糖基凝胶微球；按凝胶微球与50％乙醇按体积比为1:10的比例将所述微球置于50％乙醇中贮存，备用；
(4)在250ml三口烧瓶中，加入50ml羧甲基化琼脂糖基凝胶微球，100ml 50％乙醇和10g NaOH，室温下，搅拌反应6h。然后缓慢滴加15ml环氧氯丙烷(先将其溶于15ml 95％乙醇中)，保持反应液的温度不高于45℃，耗时约30min。环氧氯丙烷加入完毕后，45℃下反应2h，然后升温至65℃反应8h。反应液降至室温后，用250目的滤布过滤，收集微球并用蒸馏水洗净，用分样筛筛分出120～250目的微球样品，即获得交联羧甲基化琼脂糖基凝胶微球，将所述微球置于20％乙醇中贮存。
1、交联羧甲基化琼脂糖基凝胶微球对BSA吸附量测定
测量方法同实施例1。
测量结果：吸附量为117mg/ml。
2、交联羧甲基化琼脂糖基凝胶微球酸碱稳定性
测量方法同实施例1
结果表明，样品的形态没有明显的变化。
实施例6
(1)在500ml的三口烧瓶中，加入25g琼脂糖和150ml 95％乙醇和40g NaOH，室温下搅拌12h，然后缓慢滴加氯乙酸25g(先将其溶于50ml 95％乙醇中)，保持反应液的温度不高于45℃，耗时约90min。然后升温至65℃反应8h，完毕后,用滤纸过滤，收集的沉淀物用95％乙醇洗涤并在80℃下干燥24h以上，得到羧甲基化琼脂糖；
(2)称取6g羧甲基化琼脂糖，加入100ml水中并加热溶解，配成浓度为6％(g/ml)的羧甲基化琼脂糖溶液，在90℃温度条件下保温备用；
(3)在1000ml三口烧瓶中，加入500ml 6％Span 80的大豆油，800r·min-1转速搅拌，升温至90℃，然后中加入100ml 90℃的6％羧甲基化琼脂糖(步骤(2)制备)溶液，保持搅拌转速800r·min-145min。然后用冰水浴，将反应液迅速冷却至室温，再保持转速200r·min-1搅拌20min。完毕后，用250目的滤布过滤，收集的沉淀物用95％乙醇洗涤去残余的油相，沉淀为羧甲基化琼脂糖基凝胶微球；按凝胶微球与50％乙醇按体积比为1:10的比例将所述微球置于50％乙醇中贮存，备用；
(4)在250ml三口烧瓶中，加入50ml羧甲基化琼脂糖基凝胶微球，100ml 50％乙醇和10g NaOH，室温下，搅拌反应6h。然后缓慢滴加15ml环氧氯丙烷(先将其溶于15ml 95％乙醇中)，保持反应液的温度不高于45℃，耗时约30min。环氧氯丙烷加入完毕后，45℃下反应2h，然后升温至65℃反应8h。反应液降至室温后，用250目的滤布过滤，收集微球并用蒸馏水洗净，用分样筛筛分出120～250目的微球样品，即获得交联羧甲基化琼脂糖基凝胶微球，将所述微球置于20％乙醇中贮存。
1、交联羧甲基化琼脂糖基凝胶微球对BSA吸附量测定
测量方法同实施例1。
测量结果：吸附量为75mg/ml。
2、交联羧甲基化琼脂糖基凝胶微球酸碱稳定性
测量方法同实施例1
结果表明，样品的形态没有明显的变化。
从上述实施例1～3和4～5可以看出，步骤(2)的琼脂糖浓度为4％和3％时，随交联度增加，羧甲基化琼脂糖基凝胶微球的吸附能力增大。这可能是由于交联度增大，微球较为密实，单位体积的功能团增多的缘故。
从实施例6可以看出，当琼脂糖浓度和交联度过高时，羧甲基化琼脂糖基凝胶微球的吸附能力急剧降低。这可能是：该条件下，羧甲基化琼脂糖基凝胶微球过于密实，内部孔径过小，使得BSA不能有效地扩散到微球内部，因而许多与蛋白有结合能力羧甲基不能有效利用。

Claims (4)

1.一种交联羧甲基化琼脂糖基凝胶微球的制备方法，步骤是：
(1)将琼脂糖和95％的乙醇按1g:3～8mL的比例加入反应器中，然后按琼脂糖和NaOH为1g:1.4～2.0g的比例加入NaOH，室温下搅拌12±1h，再按氯乙酸和NaOH为1g：1.4～2.0g的比例滴加氯乙酸溶液，并使氯乙酸与总反应液的体积为1g:3～12mL的比例，在温度20～45℃下反应2～4h；然后升温至60～65℃反应8±1h，完毕后，用滤纸过滤，收集的沉淀物用95％乙醇洗涤并在80±2℃下干燥24h以上，得到羧甲基化琼脂糖；其中，所述氯乙酸溶液是按氯乙酸与95％乙醇为1g:1～4mL的比例配制；
(2)按设定量称取羧甲基化琼脂糖，加入水中并加热溶解，配成浓度以g/mL计为3～6％的羧甲基化琼脂糖溶液，在90±2℃温度条件下保温备用；
(3)将含有Span 80的大豆油作为油相加入反应器，其中所述Span 80在大豆油的含量以体积百分比计为4～9％，在90±2℃下以800r·min-1转速搅拌0.5～1h后将步骤(2)制得的羧甲基化琼脂糖溶液与油相按体积比为1:4～1:10的比例加入油相中，继续在800r·min-1转速下搅拌45±5min，然后用冰水浴将反应液冷却至10～30℃，再在200r·min-1转速下搅拌20±3min，完毕后，用250目的滤布过滤，收集的沉淀物，用95％乙醇洗涤去残余的油相，沉淀为羧甲基化琼脂糖基凝胶微球；按羧甲基化琼脂糖基凝胶微球与50％乙醇按体积比为1:10的比例将所述羧甲基化琼脂糖基凝胶微球置于50％乙醇中贮存，备用；
(4)取步骤(3)贮存的羧甲基化琼脂糖基凝胶微球用滤纸过滤去除液体，再按羧甲基化琼脂糖基凝胶微球与50％乙醇体积比为1:1～4的比例配成反应体系，并按NaOH与反应体系为1g:10～30mL的比例向该体系中加入NaOH，搅拌反应5～10h；然后按NaOH与环氧氯丙烷为1g:1.2～2.0mL的比例在20～45℃下向该体系中缓慢滴加环氧氯丙烷溶液，并使环氧氯丙烷的加入量以体积比计为总反应液体积的4-15％，其中所述环氧氯丙烷溶液是按环氧氯丙烷与95％乙醇为1mL:1～3mL的比例配制；滴加完毕后，在45℃温度条件下反应2～4h，然后升温至65±5℃反应6～10h，当反应液降至室温后，用250目的滤布过滤，收集微球并用蒸馏水洗净，用分样筛筛分出120～250目的微球样品，即获得交联羧甲基化琼脂糖基凝胶微球，将所述交联羧甲基化琼脂糖基凝胶微球置于20％乙醇中贮存。
2.根据权利要求1所述交联羧甲基化琼脂糖基凝胶微球的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述氯乙酸和NaOH按1g：1.4～1.7g的比例滴加氯乙酸溶液，并使氯乙酸与总反应液的体积为1g:6～9mL的比例。
3.根据权利要求1所述交联羧甲基化琼脂糖基凝胶微球的制备方法，其特征在于：步骤(3)所述Span 80在大豆油的含量以体积百分比计为5～8％；所述羧甲基化琼脂糖溶液与油相的体积比为1:5～1:8，其中羧甲基化琼脂糖溶液浓度以g/mL计为4～6％。
4.根据权利要求1所述交联羧甲基化琼脂糖基凝胶微球的制备方法，其特征在于：步骤(4)所述NaOH与环氧氯丙烷按1g:1.2～2.0mL的比例在30～45℃下向反应体系中缓慢滴加环氧氯丙烷溶液，并使环氧氯丙烷的加入量以体积比计为总反应液体积的6～12％。
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