CN109628391A - 一种脐带间质干细胞外泌体分离方法 - Google Patents

一种脐带间质干细胞外泌体分离方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种脐带间质干细胞外泌体分离方法，包括以下步骤：将人脐带间质干细胞在培养基中培养2～3天，在细胞培养基中添加干扰素、EPO和PDGF‑BB；收集培养基的上清液，对上清液进行离心，收集上层液，得到人脐带间质干细胞外泌体粗液；将人脐带间质干细胞外泌体粗液经超滤浓缩离心，得到浓缩液；将浓缩液移至质量浓度为30％的蔗糖重水密度垫上，在4℃条件下，80000～160000g密度梯度离心120min，收集底部缓冲垫；将底部缓冲垫经PBS溶液洗涤后置于超滤离心管中洗涤，收集浓缩液，得到人脐带间质干细胞外泌体。相对现有技术，本发明能提升人脐带间质干细胞的存活率，以及降低破损率，分离纯化方法操作简便，适合工业化生产。

Description

一种脐带间质干细胞外泌体分离方法
技术领域
本发明涉及细胞分离技术领域，特别涉及一种脐带间质干细胞外泌体分离方法。
背景技术
目前进行外泌体提取的方式和途径也多种多样，如：骨髓中提取、外周血中提取等，这些外泌体获取的途径均需要有创伤性的细胞或组织来源。外泌体提取方法主要采用超速离心法或昂贵的试剂盒过柱子法，然而超速离心法所获取的外泌体质量不均一、不能保证外泌体所获取量、逐级离心时间冗长，有时甚至离心时间或者离心速度原因而最终无法分离得到，浪费时间及成本。而试剂盒过柱子法通常只能适用于较小量的外泌体获取，并且成本昂贵。
现有技术中从胎盘、脐带血、骨髓、脂肪培养间充质干细胞时，均采用这些MSC的培养基上清来提取外泌体，这些方面均存在产量偏低且所得外泌体纯度偏低的不足。
发明内容
本发明的目的是提供一种脐带间质干细胞外泌体分离方法，所要解决的技术问题是：MSC的培养基上清来提取外泌体，这些方面均存在产量偏低且所得外泌体纯度偏低的不足。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种脐带间质干细胞外泌体分离方法，包括以下步骤：
将人脐带间质干细胞在培养基中培养2～3天，在细胞培养基中添加干扰素、EPO和PDGF-BB；收集培养基的上清液，对上清液进行离心，收集上层液，得到人脐带间质干细胞外泌体粗液；
将人脐带间质干细胞外泌体粗液经超滤浓缩离心，得到浓缩液；
将浓缩液移至质量浓度为30％的蔗糖重水密度垫上，在4℃条件下，80000～160000g密度梯度离心120min，收集底部缓冲垫；
将底部缓冲垫经PBS溶液洗涤后置于超滤离心管中洗涤，收集浓缩液，得到人脐带间质干细胞外泌体。
进一步，在细胞培养基中添加干扰素、EPO和PDGF-BB具体包括以下步骤：培养基的培养温度为36～38℃；首先加入重组人干扰素、PDGF-BB，在37℃，5％的CO2条件下培养24小时；然后，再加入EPO，在37℃，5％的CO2条件下培养72小时。
进一步，其中干扰素的浓度为15U/ml～500U/ml、PDGF-BB的浓度为3ng/ml～50ng/ml，EPO的浓度为0.5IU/ml～4IU/ml。
进一步，收集培养基的上清液，对上清液进行离心的具体步骤为：
收集培养基的上清液，进行离心处理，去除细胞碎片；然后将上清液滤膜过滤处理，去除凋亡小体，得到预处理后的上清液。
进一步，对上清液进行离心的离心转速为1800～2000g；所述离心的时间为8～12min。
进一步，超滤用超滤膜；所述离心速度为1000～2000g；所述离心时间为15～20min。
进一步，还包括对浓缩液进行过滤除菌；过滤用滤膜的孔径为0.22μm。
本发明的有益效果是：用无血清培养基培养人脐带间质干细胞，添加干扰素、EPO和PDGF-BB能提升人脐带间质干细胞的存活率，以及降低破损率，分离纯化方法操作简便，外泌体的蛋白纯度高，重复性好，适合工业化生产。所述人脐带间质干细胞外泌体的纯度达到92％～94％。
附图说明
图1为本发明一种脐带间质干细胞外泌体分离方法的流程图。
具体实施方式
以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1：
如图1所示，一种脐带间质干细胞外泌体分离方法，包括以下步骤：
将人脐带间质干细胞在培养基中培养3天，在细胞培养基中添加干扰素、EPO和PDGF-BB；收集培养基的上清液，对上清液进行离心，收集上层液，得到人脐带间质干细胞外泌体粗液；
将人脐带间质干细胞外泌体粗液经超滤浓缩离心，得到浓缩液；
将浓缩液移至质量浓度为30％的蔗糖重水密度垫上，在4℃条件下，160000g密度梯度离心120min，收集底部缓冲垫；
将底部缓冲垫经PBS溶液洗涤后置于超滤离心管中洗涤，收集浓缩液，得到人脐带间质干细胞外泌体。
上述实施例中，在细胞培养基中添加干扰素、EPO和PDGF-BB具体包括以下步骤：培养基的培养温度为38℃；首先加入重组人干扰素、PDGF-BB，在37℃，5％的CO2条件下培养24小时；然后，再加入EPO，在37℃，5％的CO2条件下培养72小时。其中干扰素的浓度为500U/ml、PDGF-BB的浓度为50ng/ml，EPO的浓度为4IU/ml。
上述实施例中，收集培养基的上清液，对上清液进行离心的具体步骤为：
收集培养基的上清液，进行离心处理，去除细胞碎片；然后将上清液滤膜过滤处理，去除凋亡小体，得到预处理后的上清液。
上述实施例中，对上清液进行离心的离心转速为1800g；所述离心的时间为12min。
上述实施例中，超滤用超滤膜；所述离心速度为2000g；所述离心时间为15min。
上述实施例中，还包括对浓缩液进行过滤除菌；过滤用滤膜的孔径为0.22μm。
用无血清培养基培养人脐带间质干细胞，添加干扰素、EPO和PDGF-BB能提升人脐带间质干细胞的存活率，以及降低破损率，分离纯化方法操作简便，外泌体的蛋白纯度高，重复性好，适合工业化生产。所述人脐带间质干细胞外泌体的纯度达到92％～94％。
实施例2：
如图1所示，一种脐带间质干细胞外泌体分离方法，包括以下步骤：
将人脐带间质干细胞在培养基中培养2天，在细胞培养基中添加干扰素、EPO和PDGF-BB；收集培养基的上清液，对上清液进行离心，收集上层液，得到人脐带间质干细胞外泌体粗液；
将人脐带间质干细胞外泌体粗液经超滤浓缩离心，得到浓缩液；
将浓缩液移至质量浓度为30％的蔗糖重水密度垫上，在4℃条件下，80000g密度梯度离心120min，收集底部缓冲垫；
将底部缓冲垫经PBS溶液洗涤后置于超滤离心管中洗涤，收集浓缩液，得到人脐带间质干细胞外泌体。
上述实施例中，在细胞培养基中添加干扰素、EPO和PDGF-BB具体包括以下步骤：培养基的培养温度为36℃；首先加入重组人干扰素、PDGF-BB，在37℃，5％的CO2条件下培养24小时；然后，再加入EPO，在37℃，5％的CO2条件下培养72小时。其中干扰素的浓度为15U/mlU/ml、PDGF-BB的浓度为3ng/mlng/ml，EPO的浓度为0.5IU/ml。
上述实施例中，收集培养基的上清液，对上清液进行离心的具体步骤为：
收集培养基的上清液，进行离心处理，去除细胞碎片；然后将上清液滤膜过滤处理，去除凋亡小体，得到预处理后的上清液。
上述实施例中，对上清液进行离心的离心转速为2000g；所述离心的时间为8min。
上述实施例中，超滤用超滤膜；所述离心速度为2000g；所述离心时间为15min。
上述实施例中，还包括对浓缩液进行过滤除菌；过滤用滤膜的孔径为0.22μm。
用无血清培养基培养人脐带间质干细胞，添加干扰素、EPO和PDGF-BB能提升人脐带间质干细胞的存活率，以及降低破损率，分离纯化方法操作简便，外泌体的蛋白纯度高，重复性好，适合工业化生产。所述人脐带间质干细胞外泌体的纯度达到92％～94％。
实施例3：
如图1所示，一种脐带间质干细胞外泌体分离方法，包括以下步骤：
将人脐带间质干细胞在培养基中培养2天，在细胞培养基中添加干扰素、EPO和PDGF-BB；收集培养基的上清液，对上清液进行离心，收集上层液，得到人脐带间质干细胞外泌体粗液；
将人脐带间质干细胞外泌体粗液经超滤浓缩离心，得到浓缩液；
将浓缩液移至质量浓度为30％的蔗糖重水密度垫上，在4℃条件下，120000g密度梯度离心120min，收集底部缓冲垫；
将底部缓冲垫经PBS溶液洗涤后置于超滤离心管中洗涤，收集浓缩液，得到人脐带间质干细胞外泌体。
上述实施例中，在细胞培养基中添加干扰素、EPO和PDGF-BB具体包括以下步骤：培养基的培养温度为36～38℃；首先加入重组人干扰素、PDGF-BB，在37℃，5％的CO2条件下培养24小时；然后，再加入EPO，在37℃，5％的CO2条件下培养72小时。其中干扰素的浓度为250U/ml、PDGF-BB的浓度为25ng/ml，EPO的浓度为2IU/ml。
上述实施例中，收集培养基的上清液，对上清液进行离心的具体步骤为：
收集培养基的上清液，进行离心处理，去除细胞碎片；然后将上清液滤膜过滤处理，去除凋亡小体，得到预处理后的上清液。
上述实施例中，对上清液进行离心的离心转速为1900g；所述离心的时间为10min。
上述实施例中，超滤用超滤膜；所述离心速度为1500g；所述离心时间为18min。
上述实施例中，还包括对浓缩液进行过滤除菌；过滤用滤膜的孔径为0.22μm。
用无血清培养基培养人脐带间质干细胞，添加干扰素、EPO和PDGF-BB能提升人脐带间质干细胞的存活率，以及降低破损率，分离纯化方法操作简便，外泌体的蛋白纯度高，重复性好，适合工业化生产。所述人脐带间质干细胞外泌体的纯度达到92％～94％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种脐带间质干细胞外泌体分离方法，其特征在于，包括以下步骤：
将人脐带间质干细胞在培养基中培养2～3天，在细胞培养基中添加干扰素、EPO和PDGF-BB；收集培养基的上清液，对上清液进行离心，收集上层液，得到人脐带间质干细胞外泌体粗液；
将人脐带间质干细胞外泌体粗液经超滤浓缩离心，得到浓缩液；
将浓缩液移至质量浓度为30％的蔗糖重水密度垫上，在4℃条件下，80000～160000g密度梯度离心120min，收集底部缓冲垫；
将底部缓冲垫经PBS溶液洗涤后置于超滤离心管中洗涤，收集浓缩液，得到人脐带间质干细胞外泌体。
2.根据权利要求1所述一种脐带间质干细胞外泌体分离方法，其特征在于，在细胞培养基中添加干扰素、EPO和PDGF-BB具体包括以下步骤：培养基的培养温度为36～38℃；首先加入重组人干扰素、PDGF-BB，在37℃，5％的CO2条件下培养24小时；然后，再加入EPO，在37℃，5％的CO2条件下培养72小时。
3.根据权利要求2所述一种脐带间质干细胞外泌体分离方法，其特征在于，其中干扰素的浓度为15U/ml～500U/ml、PDGF-BB的浓度为3ng/ml～50ng/ml，EPO的浓度为0.5IU/ml～4IU/ml。
4.根据权利要求1所述一种脐带间质干细胞外泌体分离方法，其特征在于，收集培养基的上清液，对上清液进行离心的具体步骤为：
收集培养基的上清液，进行离心处理，去除细胞碎片；然后将上清液滤膜过滤处理，去除凋亡小体，得到预处理后的上清液。
5.根据权利要求4所述一种脐带间质干细胞外泌体分离方法，其特征在于，对上清液进行离心的离心转速为1800～2000g；所述离心的时间为8～12min。
6.根据权利要求1所述一种脐带间质干细胞外泌体分离方法，其特征在于，超滤用超滤膜；所述离心速度为1000～2000g；所述离心时间为15～20min。
7.根据权利要求1所述一种脐带间质干细胞外泌体分离方法，其特征在于，还包括对浓缩液进行过滤除菌；过滤用滤膜的孔径为0.22μm。
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