CN112641955B - 人间充质干细胞小囊泡作为靶向递药平台的应用 - Google Patents

人间充质干细胞小囊泡作为靶向递药平台的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种人间充质干细胞小囊泡作为靶向递药平台的应用，通过在人间充质干细胞膜外表达SAV，SAV被传递到人间充质干细胞的小囊泡膜外，将b iot i n标记的抗体与人间充质干细胞小囊泡通过SAC‑biot i n的生物结合，获取可携带特定抗体的人间充质干细胞小囊泡，该小囊泡可以聚集定位到其所携带抗体的高表达的区域，赋予了小囊泡靶向性，只要在小囊泡内装载药物，即可实现精准、靶向递药的作用，通过采用不同的b iot i n标记的抗体，可实现对不同疾病的靶向治疗。本发明提出了一种新的靶向递药的方式，对于医学研究具有重大意义。

Description

人间充质干细胞小囊泡作为靶向递药平台的应用
技术领域
本发明涉及疾病的靶向治疗领域，特别是涉及一种人间充质干细胞小囊泡作为靶向递药平台的应用。
背景技术
靶向治疗是临床上治疗肿瘤等疾病的重要手段，实现精准、靶向递药是进行靶向治疗的关键，目前，并没有将人间充质干细胞小囊泡作为一个递药平台的应用。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一种人间充质干细胞小囊泡作为靶向递药平台的应用，将携带SAV的人间充质干细胞小囊泡作为一个递药平台，可以装载不同的药物，赋予它不同的靶向性，实现精准、靶向递药的作用，完成对不同疾病的靶向治疗。
本发明的技术方案如下：
一种人间充质干细胞小囊泡作为靶向递药平台的应用，在人间充质干细胞(hBMSCs)膜外表达SAV(链霉亲和素)，SAV被传递到人间充质干细胞的小囊泡膜外，将biotin标记的不同的抗体与人间充质干细胞小囊泡通过SAV-biotin的生物结合，获取可携带特定抗体的人间充质干细胞小囊泡，于该小囊泡内装载药物，实现靶向递药。
在进一步的技术方案中，获取可携带特定抗体的人间充质干细胞小囊泡的方法如下：
S1、在SAV的基因N端连接信号肽、连接肽、跨膜肽，通过全合成构建融合蛋白，将融合蛋白克隆至PLV载体(用来克隆的满病毒载体)，构建PLV-sig-SAV重组质粒，通过PLV-sig-SAV引导SAV在人间充质干细胞膜外侧表达；
S2、利用PLV-sig-SAV重组质粒转染人间充质干细胞；
S3、分离转染了PLV-sig-SAV的人间充质干细胞的小囊泡；
S4、制备EXO-PTX-anti-HER2和EXO-PTX-anti-EGFR抗体。
在进一步的技术方案中，步骤S2中，利用PLV-sig-SAV重组质粒转染人间充质干细胞的方法如下：
S21、将人间充质干细胞于培养皿中培养，待细胞生长至40％后，用制备好的PLV-sig-SAV重组质粒的慢病毒感染人间充质干细胞；
S22、感染24h后，采用嘌呤霉素筛选感染阳性细胞；
S23、稳定筛选一周后，扩大培养，制作细胞爬片，过夜培养后，吸走培养上清液；
S24、洗涤培养上清液，一抗anti-SAV4℃过夜孵育，再次洗涤后，二抗避光孵育1h，三次洗涤后，复染核5mg/ml的DAPI，封片。
在进一步的技术方案中，步骤S21中，培养条件为5％CO2，含10％胎牛血清的DMEM培养基。
在进一步的技术方案中，步骤S3中，分离转染了PLV-sig-SAV的人间充质干细胞的小囊泡的方法如下：
S31、将转染了PLV-sig-SAV的人间充质干细胞置于培养基中培养；
S32、待细胞增长至70％-80％时，用含10％无小囊泡胎牛血清的DMEM培养基在5％CO2条件下继续培养48h，收集培养上清液；
S33、离心去除细胞碎片，洗涤。
在进一步的技术方案中，步骤S4中，制备EXO-PTX-anti-HER2和EXO-PTX-anti-EGFR抗体的方法如下：
S41、将分离得到的小囊泡与PTX混合于PBS中，通过超声波将PTX装载于小囊泡内；
S42、重悬EXO-PTX，并分别与biotin-anti-HER2和biotin-anti-EGFR于37℃孵育30min；
S43、孵育结束后，超速离心纯化，获得EXO-PTX-anti-HER2和EXO-PTX-anti-EGFR抗体。
本发明的有益效果是：
本发明在人间充质干细胞膜外表达SAV，SAV被传递到人间充质干细胞的小囊泡膜外，将biotin标记的抗体与人间充质干细胞小囊泡通过SAV-biotin的生物结合，获取可携带特定抗体的人间充质干细胞小囊泡，该小囊泡可以聚集定位到其所携带抗体的高表达的区域，赋予了小囊泡靶向性，只要在小囊泡内装载药物，即可实现精准、靶向递药的作用，通过采用不同的biotin标记的抗体，可实现对不同疾病的靶向治疗。本发明提出了一种新的靶向递药的方式，对于医学研究具有重大意义。
附图说明
图1是本发明实施例所述sig-SAV的细胞内定位图；
图2是本发明实施例所述hBMSC-SAV-exo、hBMSC-exo分别与biotin-FITC孵育后于共聚焦显微镜下观察偶连效率图；
图3是本发明实施例所述采用Western blot检测hBMSC、hBMSC-SAV、hBMSC-SAV-exo、hBMSC-exo相关蛋白表达图；
图4是本发明实施例所述biotin-gold nanoparticle分别与hBMSC-SAV-exo、hBMSC-exo孵育后电镜下检测的小囊泡形态图；
图5是本发明实施例所述对hBMSC-SAV-exo和hBMSC-exo的粒径分析结果图；
图6是本发明实施例所述hBMSC-SAV-exo通过sav-biotin的结合偶连biotin-antiEGFR表现出对MDA-MB-468的高靶向效率图；
图7是本发明实施例所述hBMSC-SAV-exo通过sav-biotin的结合偶连biotin-antiHER2表现出对MDA-MB-453的高靶向效率图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的实施例作进一步说明。
实施例1：
一种人间充质干细胞小囊泡作为靶向递药平台的应用，在人间充质干细胞(hBMSCs)膜外表达SAV(链霉亲和素)，SAV被传递到人间充质干细胞的小囊泡膜外，将biotin标记的不同的抗体与人间充质干细胞小囊泡通过SAV-biotin的生物结合，获取可携带特定抗体的人间充质干细胞小囊泡。
实施例2：
一种获取可携带特定抗体的人间充质干细胞小囊泡的方法，包括以下步骤：
S1、在SAV的基因N端连接信号肽、连接肽、跨膜肽，通过全合成构建融合蛋白，将融合蛋白克隆至PLV载体(用来克隆的满病毒载体)，构建PLV-sig-SAV重组质粒，通过PLV-sig-SAV引导SAV在人间充质干细胞膜外侧表达；
S2、利用PLV-sig-SAV重组质粒转染人间充质干细胞；
S3、分离转染了PLV-sig-SAV的人间充质干细胞的小囊泡；
S4、制备EXO-PTX-anti-HER2和EXO-PTX-anti-EGFR抗体。
在本实施例中，步骤S1中，信号肽、连接肽和跨膜肽的序列如下：
信号肽DNA序列
ATGAATTTACAACCAATTTTCTGGATTGGACTGATCAGTTCAGTTTGCTGTGTGTTTGCT
跨膜肽DNA序列
TTATGGGTCATCCTGCTGAGTGCTTTTGCCGGATTGTTGCTGTTAATGCTGCTCATTTTAGCACTGTGG
连接肽DNA序列
GGAGGTGGAG GTTCGGGAGG TGGAGGTTCG GGAGGTGGAG GTTCG
在本实施例中，步骤S2中，利用PLV-sig-SAV重组质粒转染人间充质干细胞的方法如下：
将人间充质干细胞直接接种到6孔盘培养皿中，培养条件为5％CO2，含10％胎牛血清的DMEM培养基，待细胞生长至40％后，用制备好的PLV-sig-SAV重组质粒的慢病毒感染hBMSCs，感染24h后，嘌呤霉素筛选感染阳性细胞，稳定筛选一周后，扩大培养，制作细胞爬片，每孔5万个细胞，接种到含玻璃爬片的24孔盘里面，接种3个孔，过夜培养，第二天吸走培养上清液，PBS(磷酸盐溶液)洗三次，每次3min，4％多聚甲醛固定20min，PBS洗三次，每次3min，10％BSA封闭1h，一抗anti-SAV(abcam ab10020，0.2mg/ml)4℃过夜孵育，PBS洗三次，每次3min，二抗避光孵育1h，PBS洗三次，每次3min，复染核5mg/ml的DAPI，避光5min，PBS洗三次，每次3min，封片，共聚焦显微镜观察细胞内的定位情况，sig-SAV的细胞内定位，以及hBMSC-SAV-exo、hBMSC-exo分别与biotin-FITC孵育后于共聚焦显微镜下观察偶连效率，如图1和图2所示。
在本实施例中，步骤S3中，分离转染了PLV-sig-SAV的人间充质干细胞的小囊泡的方法如下：
将转染了PLV-sig-SAV的人间充质干细胞在正常培养基中培养，待细胞增长至70％-80％时，用含10％无小囊泡胎牛血清的DMEM培养基进行培养，并在5％CO2条件下继续培养48h后，收集培养上清液，随后，上清液经过一系列低速离心步骤(300×g离心10min，2000×g，10min)去除细胞碎片，然后，上清液在10000×g下离心30min，然后在100000×g下超速离心70min(OptimaL-100XP，Beckman Coulter，USA)，最后用PBS洗涤一次，洗涤后的小囊泡保存在-80℃或用于后续实验。
在本实施例中，步骤S4中，制备EXO-PTX-anti-HER2和EXO-PTX-anti-EGFR抗体的方法如下：
小囊泡(100ug蛋白定量)与50ug PTX混合于1ml的PBS中，通过超声波将PTX装载于小囊泡内，使用505型超声分离器进行超声处理，该分离器前端为0.25英寸。程序设置如下：振幅为20％，30秒开/关，每个循环冰浴2min，一个循环3min，重复6次。超声后，多余的PTX通过超速离心去除，4℃，100000g，70min。重悬EXO-PTX，并分别与10ug的biotin-anti-HER2和biotin-anti-EGFR于37℃孵育30min。孵育结束后，超速离心纯化，获得EXO-PTX-anti-HER2(把干细胞囊泡中包裹了紫杉醇，外面链接了一个biotin标记的HER2抗体)、EXO-PTX-anti-EGFR(干细胞囊泡中包裹紫杉醇，外面链接了一个biotin标记的EGFR抗体)。
如图6和图7所示，细胞摄取小囊泡的过程中，hBMSC-SAV-exo通过sav-biotin的结合分别偶连biotin-anti EGFR和biotin-anti HER2分别表现出对MDA-MB-468、MDA-MB-453的高靶向效率。
在本实施例中，通过步骤S3分离得到小囊泡之后，还包括对小囊泡的分析检测步骤，具体如下：
一、透射电镜：
快速取出分离纯化得到的小囊泡，并将其固定在5％戊二醛(避光)中，在4℃的0.1M磷酸盐缓冲液中，将固定好的小囊泡样本置于电子显微镜(日立H-7650)专用的铜网上，然后用20μL2％磷钨酸进行10min的负染色，在100KV下用电子显微镜进行分析，如图4所示，为biotin-gold nanoparticle(10nm)分别与hBMSC-SAV-exo、hBMSC-exo孵育后电镜下检测的小囊泡形态。
二、小囊泡粒径分析：
Nanosight纳米颗粒粒径分析：将20μg小囊泡溶于1mL PBS中，涡旋1min，保持小囊泡均匀分布，随后用NanoSight纳米颗粒跟踪分析仪(NTA，英国马尔文仪器有限公司)直接观察测量EVs的粒径分布，图5为对hBMSC-SAV-exo(左侧)和hBMSC-exo(右侧)的分析，其粒径分布范围为30-100nm。
三、Western bolt：
如图3所示，采用Western blot检测hBMSC、hBMSC-SAV、hBMSC-SAV-exo、hBMSC-exo相关蛋白表达(重组蛋白sig-SAV；小囊泡表面标志蛋白CD63、ALIX、HSC70阳性APOA1阴性；NaKATPase作为细胞膜内参蛋白)，包括小囊泡表面阳性标记蛋白ALIX、CD81、CD63，以及阴性标记载脂蛋白APOA1；检测hBMSC细胞表面和小囊泡膜表面SAV的表达，将分离的小囊泡悬液用BCA试剂盒(AR0146，博士德生物工程有限公司，中国武汉)测定其蛋白含量，制备SDS-PAGE凝胶并进行蛋白变性及电泳，结束后转膜并检测细胞标记蛋白，以β-actin抗体为内参。以目的蛋白条带的灰度值/内参蛋白条带的灰度值表示目的蛋白相对含量。
主要抗体如下：
APOA1(1:1000,ab22595,Abcam)
CD63(1：1000,SAB4301607t,sigma,UK)
CD81(1：1000,sigma,Abcam)
TGS101(1：1000,ab125011,Abcam,)
E-cadherin(1：5000,SAB3500454)
HSC70(1：1000,Q1222640,Thermo)
β-actin(1：500,CST)
Streptavidin(1：500，ab10020，abcam)
用Image J分析软件对Western blot图像中各组条带进行灰度定量，每次实验重复3次。
四、小囊泡膜表面SAV的鉴定：
用膜标记染料PKH26(Invitrogen,USA)标记分离纯化后的小囊泡，然后在无血清培养基中进行洗涤和重悬。将PKH26标记好的小囊泡与biotin-fitc于37℃孵育30min，孵育结束后4℃，100,000g离心70min，PBS洗涤，获得PKH26和biotin-FITC标记的小囊泡，共聚焦显微镜下观察。
五、肿瘤细胞摄取小囊泡：
用膜标记染料燃料PKH26(Invitrogen,USA)标记小囊泡，然后在无血清培养基中进行洗涤和重悬，然后将MDA-MB-453、MDA-MB-468细胞接种于单层玻璃爬片上(Cellvis,Mountain View,CA,US)，与PKH26标记的小囊泡共培养。12h后，用PBS三次洗涤，4％多聚甲醛固定10min，PBS洗3次DAIP染核10minPBS洗3次，共聚焦显微镜观察。
在本实施例中，通过步骤S4制备EXO-PTX-anti-HER2和EXO-PTX-anti-EGFR抗体后，还需对EXO-PTX的装载效率进行检测，具体步骤如下：
采用高效液相色谱法测定小囊泡中PTX的含量：将EXO-PTX(200ul)置于75℃的水浴锅上蒸发溶剂，加入等体积的乙腈，涡旋，超声处理，13000rpm(Thermo Legend Micro21)离心10min，离心后取上清液，2um滤膜过滤后转入高效液相色谱柱内，采用C-18柱流动相(水：乙腈45:55V/V)流速1ml/min温度30℃，在227nm处测定吸光度，检测PTX的洗脱。
以上所述实施例仅表达了本发明的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种人间充质干细胞小囊泡在制备靶向递药平台中的应用，其特征在于，在人间充质干细胞膜外表达链霉亲和素SAV，SAV被传递到人间充质干细胞的小囊泡膜外，将biotin标记的不同的抗体与人间充质干细胞小囊泡通过SAV-biotin进行生物结合，获取可携带特定抗体的人间充质干细胞小囊泡，于该小囊泡内装载药物，实现靶向递药。
2.根据权利要求1所述的人间充质干细胞小囊泡在制备靶向递药平台中的应用，其特征在于，获取可携带特定抗体的人间充质干细胞小囊泡的方法如下：
S1、在SAV的基因N端连接信号肽、连接肽、跨膜肽的DNA序列，通过全合成构建融合蛋白，将融合蛋白克隆至PLV载体，构建PLV-sig-SAV重组质粒，通过PLV-sig-SAV引导SAV在人间充质干细胞膜外侧表达；
S2、利用PLV-sig-SAV重组质粒转染人间充质干细胞；
S3、分离转染了PLV-sig-SAV的人间充质干细胞的小囊泡；
S4、制备EXO-PTX-anti-HER2和EXO-PTX-anti-EGFR抗体；
具体的制备方法如下：
S41、将分离得到的小囊泡与PTX混合于PBS中，通过超声波将PTX装载于小囊泡内，制备EXO-PTX；
S42、重悬EXO-PTX，并分别与biotin-anti-HER2和biotin-anti-EGFR于37℃孵育30min；
S43、孵育结束后，超速离心纯化，获得EXO-PTX-anti-HER2和EXO-PTX-anti-EGFR抗体。
3.根据权利要求2所述的人间充质干细胞小囊泡在制备靶向递药平台中的应用，其特征在于，步骤S2中，利用PLV-sig-SAV重组质粒转染人间充质干细胞的方法如下：
S21、将人间充质干细胞于培养皿中培养，待细胞生长至40％后，用制备好的PLV-sig-SAV重组质粒的慢病毒感染人间充质干细胞；
S22、感染24h后，采用嘌呤霉素筛选感染阳性细胞；
S23、稳定筛选一周后，扩大培养，制作细胞爬片，过夜培养后，吸走培养上清液；
S24、洗涤培养上清液，一抗anti-SAV4℃过夜孵育，再次洗涤后，二抗避光孵育1h，三次洗涤后，采用5mg/ml的DAPI复染核，封片。
4.根据权利要求3所述的人间充质干细胞小囊泡在制备靶向递药平台中的应用，其特征在于，步骤S21中，培养条件为5％CO2，含10％胎牛血清的DMEM培养基。
5.根据权利要求2所述的人间充质干细胞小囊泡在制备靶向递药平台中的应用，其特征在于，步骤S3中，分离转染了PLV-sig-SAV的人间充质干细胞的小囊泡的方法如下：
S31、将转染了PLV-sig-SAV的人间充质干细胞置于培养基中培养；
S32、待细胞增长至70％-80％时，用含10％胎牛血清的无小囊泡DMEM培养基在5％CO2条件下继续培养48h，收集培养上清液；
S33、离心去除细胞碎片，洗涤。
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