CN112641955B - 人间充质干细胞小囊泡作为靶向递药平台的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种人间充质干细胞小囊泡作为靶向递药平台的应用,通过在人间充质干细胞膜外表达SAV,SAV被传递到人间充质干细胞的小囊泡膜外,将b iot i n标记的抗体与人间充质干细胞小囊泡通过SAC‑biot i n的生物结合,获取可携带特定抗体的人间充质干细胞小囊泡,该小囊泡可以聚集定位到其所携带抗体的高表达的区域,赋予了小囊泡靶向性,只要在小囊泡内装载药物,即可实现精准、靶向递药的作用,通过采用不同的b iot i n标记的抗体,可实现对不同疾病的靶向治疗。本发明提出了一种新的靶向递药的方式,对于医学研究具有重大意义。
Description
技术领域
本发明涉及疾病的靶向治疗领域,特别是涉及一种人间充质干细胞小囊泡作为靶向递药平台的应用。
背景技术
靶向治疗是临床上治疗肿瘤等疾病的重要手段,实现精准、靶向递药是进行靶向治疗的关键,目前,并没有将人间充质干细胞小囊泡作为一个递药平台的应用。
发明内容
针对上述问题,本发明提供了一种人间充质干细胞小囊泡作为靶向递药平台的应用,将携带SAV的人间充质干细胞小囊泡作为一个递药平台,可以装载不同的药物,赋予它不同的靶向性,实现精准、靶向递药的作用,完成对不同疾病的靶向治疗。
本发明的技术方案如下:
一种人间充质干细胞小囊泡作为靶向递药平台的应用,在人间充质干细胞(hBMSCs)膜外表达SAV(链霉亲和素),SAV被传递到人间充质干细胞的小囊泡膜外,将biotin标记的不同的抗体与人间充质干细胞小囊泡通过SAV-biotin的生物结合,获取可携带特定抗体的人间充质干细胞小囊泡,于该小囊泡内装载药物,实现靶向递药。
在进一步的技术方案中,获取可携带特定抗体的人间充质干细胞小囊泡的方法如下:
S1、在SAV的基因N端连接信号肽、连接肽、跨膜肽,通过全合成构建融合蛋白,将融合蛋白克隆至PLV载体(用来克隆的满病毒载体),构建PLV-sig-SAV重组质粒,通过PLV-sig-SAV引导SAV在人间充质干细胞膜外侧表达;
S2、利用PLV-sig-SAV重组质粒转染人间充质干细胞;
S3、分离转染了PLV-sig-SAV的人间充质干细胞的小囊泡;
S4、制备EXO-PTX-anti-HER2和EXO-PTX-anti-EGFR抗体。
在进一步的技术方案中,步骤S2中,利用PLV-sig-SAV重组质粒转染人间充质干细胞的方法如下:
S21、将人间充质干细胞于培养皿中培养,待细胞生长至40%后,用制备好的PLV-sig-SAV重组质粒的慢病毒感染人间充质干细胞;
S22、感染24h后,采用嘌呤霉素筛选感染阳性细胞;
S23、稳定筛选一周后,扩大培养,制作细胞爬片,过夜培养后,吸走培养上清液;
S24、洗涤培养上清液,一抗anti-SAV4℃过夜孵育,再次洗涤后,二抗避光孵育1h,三次洗涤后,复染核5mg/ml的DAPI,封片。
在进一步的技术方案中,步骤S21中,培养条件为5%CO2,含10%胎牛血清的DMEM培养基。
在进一步的技术方案中,步骤S3中,分离转染了PLV-sig-SAV的人间充质干细胞的小囊泡的方法如下:
S31、将转染了PLV-sig-SAV的人间充质干细胞置于培养基中培养;
S32、待细胞增长至70%-80%时,用含10%无小囊泡胎牛血清的DMEM培养基在5%CO2条件下继续培养48h,收集培养上清液;
S33、离心去除细胞碎片,洗涤。
在进一步的技术方案中,步骤S4中,制备EXO-PTX-anti-HER2和EXO-PTX-anti-EGFR抗体的方法如下:
S41、将分离得到的小囊泡与PTX混合于PBS中,通过超声波将PTX装载于小囊泡内;
S42、重悬EXO-PTX,并分别与biotin-anti-HER2和biotin-anti-EGFR于37℃孵育30min;
S43、孵育结束后,超速离心纯化,获得EXO-PTX-anti-HER2和EXO-PTX-anti-EGFR抗体。
本发明的有益效果是:
本发明在人间充质干细胞膜外表达SAV,SAV被传递到人间充质干细胞的小囊泡膜外,将biotin标记的抗体与人间充质干细胞小囊泡通过SAV-biotin的生物结合,获取可携带特定抗体的人间充质干细胞小囊泡,该小囊泡可以聚集定位到其所携带抗体的高表达的区域,赋予了小囊泡靶向性,只要在小囊泡内装载药物,即可实现精准、靶向递药的作用,通过采用不同的biotin标记的抗体,可实现对不同疾病的靶向治疗。本发明提出了一种新的靶向递药的方式,对于医学研究具有重大意义。
附图说明
图1是本发明实施例所述sig-SAV的细胞内定位图;
图2是本发明实施例所述hBMSC-SAV-exo、hBMSC-exo分别与biotin-FITC孵育后于共聚焦显微镜下观察偶连效率图;
图3是本发明实施例所述采用Western blot检测hBMSC、hBMSC-SAV、hBMSC-SAV-exo、hBMSC-exo相关蛋白表达图;
图4是本发明实施例所述biotin-gold nanoparticle分别与hBMSC-SAV-exo、hBMSC-exo孵育后电镜下检测的小囊泡形态图;
图5是本发明实施例所述对hBMSC-SAV-exo和hBMSC-exo的粒径分析结果图;
图6是本发明实施例所述hBMSC-SAV-exo通过sav-biotin的结合偶连biotin-antiEGFR表现出对MDA-MB-468的高靶向效率图;
图7是本发明实施例所述hBMSC-SAV-exo通过sav-biotin的结合偶连biotin-antiHER2表现出对MDA-MB-453的高靶向效率图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的实施例作进一步说明。
实施例1:
一种人间充质干细胞小囊泡作为靶向递药平台的应用,在人间充质干细胞(hBMSCs)膜外表达SAV(链霉亲和素),SAV被传递到人间充质干细胞的小囊泡膜外,将biotin标记的不同的抗体与人间充质干细胞小囊泡通过SAV-biotin的生物结合,获取可携带特定抗体的人间充质干细胞小囊泡。
实施例2:
一种获取可携带特定抗体的人间充质干细胞小囊泡的方法,包括以下步骤:
S1、在SAV的基因N端连接信号肽、连接肽、跨膜肽,通过全合成构建融合蛋白,将融合蛋白克隆至PLV载体(用来克隆的满病毒载体),构建PLV-sig-SAV重组质粒,通过PLV-sig-SAV引导SAV在人间充质干细胞膜外侧表达;
S2、利用PLV-sig-SAV重组质粒转染人间充质干细胞;
S3、分离转染了PLV-sig-SAV的人间充质干细胞的小囊泡;
S4、制备EXO-PTX-anti-HER2和EXO-PTX-anti-EGFR抗体。
在本实施例中,步骤S1中,信号肽、连接肽和跨膜肽的序列如下:
信号肽DNA序列
ATGAATTTACAACCAATTTTCTGGATTGGACTGATCAGTTCAGTTTGCTGTGTGTTTGCT
跨膜肽DNA序列
TTATGGGTCATCCTGCTGAGTGCTTTTGCCGGATTGTTGCTGTTAATGCTGCTCATTTTAGCACTGTGG
连接肽DNA序列
GGAGGTGGAG GTTCGGGAGG TGGAGGTTCG GGAGGTGGAG GTTCG
在本实施例中,步骤S2中,利用PLV-sig-SAV重组质粒转染人间充质干细胞的方法如下:
将人间充质干细胞直接接种到6孔盘培养皿中,培养条件为5%CO2,含10%胎牛血清的DMEM培养基,待细胞生长至40%后,用制备好的PLV-sig-SAV重组质粒的慢病毒感染hBMSCs,感染24h后,嘌呤霉素筛选感染阳性细胞,稳定筛选一周后,扩大培养,制作细胞爬片,每孔5万个细胞,接种到含玻璃爬片的24孔盘里面,接种3个孔,过夜培养,第二天吸走培养上清液,PBS(磷酸盐溶液)洗三次,每次3min,4%多聚甲醛固定20min,PBS洗三次,每次3min,10%BSA封闭1h,一抗anti-SAV(abcam ab10020,0.2mg/ml)4℃过夜孵育,PBS洗三次,每次3min,二抗避光孵育1h,PBS洗三次,每次3min,复染核5mg/ml的DAPI,避光5min,PBS洗三次,每次3min,封片,共聚焦显微镜观察细胞内的定位情况,sig-SAV的细胞内定位,以及hBMSC-SAV-exo、hBMSC-exo分别与biotin-FITC孵育后于共聚焦显微镜下观察偶连效率,如图1和图2所示。
在本实施例中,步骤S3中,分离转染了PLV-sig-SAV的人间充质干细胞的小囊泡的方法如下:
将转染了PLV-sig-SAV的人间充质干细胞在正常培养基中培养,待细胞增长至70%-80%时,用含10%无小囊泡胎牛血清的DMEM培养基进行培养,并在5%CO2条件下继续培养48h后,收集培养上清液,随后,上清液经过一系列低速离心步骤(300×g离心10min,2000×g,10min)去除细胞碎片,然后,上清液在10000×g下离心30min,然后在100000×g下超速离心70min(OptimaL-100XP,Beckman Coulter,USA),最后用PBS洗涤一次,洗涤后的小囊泡保存在-80℃或用于后续实验。
在本实施例中,步骤S4中,制备EXO-PTX-anti-HER2和EXO-PTX-anti-EGFR抗体的方法如下:
小囊泡(100ug蛋白定量)与50ug PTX混合于1ml的PBS中,通过超声波将PTX装载于小囊泡内,使用505型超声分离器进行超声处理,该分离器前端为0.25英寸。程序设置如下:振幅为20%,30秒开/关,每个循环冰浴2min,一个循环3min,重复6次。超声后,多余的PTX通过超速离心去除,4℃,100000g,70min。重悬EXO-PTX,并分别与10ug的biotin-anti-HER2和biotin-anti-EGFR于37℃孵育30min。孵育结束后,超速离心纯化,获得EXO-PTX-anti-HER2(把干细胞囊泡中包裹了紫杉醇,外面链接了一个biotin标记的HER2抗体)、EXO-PTX-anti-EGFR(干细胞囊泡中包裹紫杉醇,外面链接了一个biotin标记的EGFR抗体)。
如图6和图7所示,细胞摄取小囊泡的过程中,hBMSC-SAV-exo通过sav-biotin的结合分别偶连biotin-anti EGFR和biotin-anti HER2分别表现出对MDA-MB-468、MDA-MB-453的高靶向效率。
在本实施例中,通过步骤S3分离得到小囊泡之后,还包括对小囊泡的分析检测步骤,具体如下:
一、透射电镜:
快速取出分离纯化得到的小囊泡,并将其固定在5%戊二醛(避光)中,在4℃的0.1M磷酸盐缓冲液中,将固定好的小囊泡样本置于电子显微镜(日立H-7650)专用的铜网上,然后用20μL2%磷钨酸进行10min的负染色,在100KV下用电子显微镜进行分析,如图4所示,为biotin-gold nanoparticle(10nm)分别与hBMSC-SAV-exo、hBMSC-exo孵育后电镜下检测的小囊泡形态。
二、小囊泡粒径分析:
Nanosight纳米颗粒粒径分析:将20μg小囊泡溶于1mL PBS中,涡旋1min,保持小囊泡均匀分布,随后用NanoSight纳米颗粒跟踪分析仪(NTA,英国马尔文仪器有限公司)直接观察测量EVs的粒径分布,图5为对hBMSC-SAV-exo(左侧)和hBMSC-exo(右侧)的分析,其粒径分布范围为30-100nm。
三、Western bolt:
如图3所示,采用Western blot检测hBMSC、hBMSC-SAV、hBMSC-SAV-exo、hBMSC-exo相关蛋白表达(重组蛋白sig-SAV;小囊泡表面标志蛋白CD63、ALIX、HSC70阳性APOA1阴性;NaKATPase作为细胞膜内参蛋白),包括小囊泡表面阳性标记蛋白ALIX、CD81、CD63,以及阴性标记载脂蛋白APOA1;检测hBMSC细胞表面和小囊泡膜表面SAV的表达,将分离的小囊泡悬液用BCA试剂盒(AR0146,博士德生物工程有限公司,中国武汉)测定其蛋白含量,制备SDS-PAGE凝胶并进行蛋白变性及电泳,结束后转膜并检测细胞标记蛋白,以β-actin抗体为内参。以目的蛋白条带的灰度值/内参蛋白条带的灰度值表示目的蛋白相对含量。
主要抗体如下:
APOA1(1:1000,ab22595,Abcam)
CD63(1:1000,SAB4301607t,sigma,UK)
CD81(1:1000,sigma,Abcam)
TGS101(1:1000,ab125011,Abcam,)
E-cadherin(1:5000,SAB3500454)
HSC70(1:1000,Q1222640,Thermo)
β-actin(1:500,CST)
Streptavidin(1:500,ab10020,abcam)
用Image J分析软件对Western blot图像中各组条带进行灰度定量,每次实验重复3次。
四、小囊泡膜表面SAV的鉴定:
用膜标记染料PKH26(Invitrogen,USA)标记分离纯化后的小囊泡,然后在无血清培养基中进行洗涤和重悬。将PKH26标记好的小囊泡与biotin-fitc于37℃孵育30min,孵育结束后4℃,100,000g离心70min,PBS洗涤,获得PKH26和biotin-FITC标记的小囊泡,共聚焦显微镜下观察。
五、肿瘤细胞摄取小囊泡:
用膜标记染料燃料PKH26(Invitrogen,USA)标记小囊泡,然后在无血清培养基中进行洗涤和重悬,然后将MDA-MB-453、MDA-MB-468细胞接种于单层玻璃爬片上(Cellvis,Mountain View,CA,US),与PKH26标记的小囊泡共培养。12h后,用PBS三次洗涤,4%多聚甲醛固定10min,PBS洗3次DAIP染核10minPBS洗3次,共聚焦显微镜观察。
在本实施例中,通过步骤S4制备EXO-PTX-anti-HER2和EXO-PTX-anti-EGFR抗体后,还需对EXO-PTX的装载效率进行检测,具体步骤如下:
采用高效液相色谱法测定小囊泡中PTX的含量:将EXO-PTX(200ul)置于75℃的水浴锅上蒸发溶剂,加入等体积的乙腈,涡旋,超声处理,13000rpm(Thermo Legend Micro21)离心10min,离心后取上清液,2um滤膜过滤后转入高效液相色谱柱内,采用C-18柱流动相(水:乙腈45:55V/V)流速1ml/min温度30℃,在227nm处测定吸光度,检测PTX的洗脱。
以上所述实施例仅表达了本发明的具体实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。
Claims (5)
1.一种人间充质干细胞小囊泡在制备靶向递药平台中的应用,其特征在于,在人间充质干细胞膜外表达链霉亲和素SAV,SAV被传递到人间充质干细胞的小囊泡膜外,将biotin标记的不同的抗体与人间充质干细胞小囊泡通过SAV-biotin进行生物结合,获取可携带特定抗体的人间充质干细胞小囊泡,于该小囊泡内装载药物,实现靶向递药。
2.根据权利要求1所述的人间充质干细胞小囊泡在制备靶向递药平台中的应用,其特征在于,获取可携带特定抗体的人间充质干细胞小囊泡的方法如下:
S1、在SAV的基因N端连接信号肽、连接肽、跨膜肽的DNA序列,通过全合成构建融合蛋白,将融合蛋白克隆至PLV载体,构建PLV-sig-SAV重组质粒,通过PLV-sig-SAV引导SAV在人间充质干细胞膜外侧表达;
S2、利用PLV-sig-SAV重组质粒转染人间充质干细胞;
S3、分离转染了PLV-sig-SAV的人间充质干细胞的小囊泡;
S4、制备EXO-PTX-anti-HER2和EXO-PTX-anti-EGFR抗体;
具体的制备方法如下:
S41、将分离得到的小囊泡与PTX混合于PBS中,通过超声波将PTX装载于小囊泡内,制备EXO-PTX;
S42、重悬EXO-PTX,并分别与biotin-anti-HER2和biotin-anti-EGFR于37℃孵育30min;
S43、孵育结束后,超速离心纯化,获得EXO-PTX-anti-HER2和EXO-PTX-anti-EGFR抗体。
3.根据权利要求2所述的人间充质干细胞小囊泡在制备靶向递药平台中的应用,其特征在于,步骤S2中,利用PLV-sig-SAV重组质粒转染人间充质干细胞的方法如下:
S21、将人间充质干细胞于培养皿中培养,待细胞生长至40%后,用制备好的PLV-sig-SAV重组质粒的慢病毒感染人间充质干细胞;
S22、感染24h后,采用嘌呤霉素筛选感染阳性细胞;
S23、稳定筛选一周后,扩大培养,制作细胞爬片,过夜培养后,吸走培养上清液;
S24、洗涤培养上清液,一抗anti-SAV4℃过夜孵育,再次洗涤后,二抗避光孵育1h,三次洗涤后,采用5mg/ml的DAPI复染核,封片。
4.根据权利要求3所述的人间充质干细胞小囊泡在制备靶向递药平台中的应用,其特征在于,步骤S21中,培养条件为5%CO2,含10%胎牛血清的DMEM培养基。
5.根据权利要求2所述的人间充质干细胞小囊泡在制备靶向递药平台中的应用,其特征在于,步骤S3中,分离转染了PLV-sig-SAV的人间充质干细胞的小囊泡的方法如下:
S31、将转染了PLV-sig-SAV的人间充质干细胞置于培养基中培养;
S32、待细胞增长至70%-80%时,用含10%胎牛血清的无小囊泡DMEM培养基在5%CO2条件下继续培养48h,收集培养上清液;
S33、离心去除细胞碎片,洗涤。
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