CN113528580A - 一种靶向性细胞外囊泡及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物药物载体制备技术领域,具体公开了一种靶向性细胞外囊泡及其制备方法和应用,构建LV‑Lac‑PDGFA融合表达慢病毒载体感染神经干细胞构建稳转细胞系NSC‑LV‑Lac‑PDGFA,使表达的外源配体PDGFA定位于细胞外囊泡膜表面,从而提升细胞外囊泡对少突胶质细胞谱系细胞的靶向能力。本发明获得的膜表面表达PDGFA小肽的细胞外囊泡具有高靶向性,能够作为药物载体,对脱髓鞘疾病的治疗效果好。
Description
技术领域
本发明涉及生物药物载体制备技术领域,具体涉及一种靶向性细胞外囊泡及其制备方法和应用。
背景技术
多发性硬化症(multiple sclerosis,MS)是一种以中枢神经系统(centralnervous system,CNS)神经炎症和脱髓鞘为特征的T细胞介导的疾病,影响着世界上大约250万人,发病率还在继续增加。实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)是最常用的MS动物模型,用于研究其潜在机制,为开发新的MS治疗方法提供理论依据。
神经干细胞(neural stem cell,NSC)是具有自我更新能力和多向分化潜能的高效多能细胞。近年来,大量证据表明细胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)具有mRNA,miRNA和蛋白质,被认为具有与其他细胞相互作用并影响其他细胞的能力。因此有研究表明,由NSC衍生的EVs具有显著调节全身免疫反应并强烈抑制疾病恶化的能力。
EVs是从细胞膜上脱落或者由细胞分泌的双层膜结构的囊泡状小体,直径从40nm到1000nm不等。据报道,EVs可用于递送小分子和核酸,且其在临床治疗领域显示出更广阔的前景。与人造药物载体(例如脂质体)相比,EVs可以直接与靶细胞质膜融合,并且不需要进行加工修饰。而且EVs可以从患者自己的细胞中获得,它们不具免疫原性。并且较小的EVs(如外泌体)能够穿过血脑屏障(blood brain barrier,BBB),扩散到脑脊液并到达远处组织。而EVs在多种疾病模型治疗中的应用,使其成为理想的药物载体。
从上个世纪末起,小分子药物研发获得了巨大的进步很大程度依赖于疾病新靶点和疾病指征的发现以及有机合成化学的爆发式发展与各类检测技术的进步。回顾创新药近20年的销售数据,我们发现全球销售额Top10创新药中8个为小分子药物,说明小分子药物拥有巨大的受众及明确的治疗效果。但由于很多小分子药物存在水溶性较差、溶解性低、毒性大、特异性差及半衰期短等缺点,所以其在体内吸收性差,生物利用度低且副作用大。而EVs可作为这类药物的天然载体从而克服这些缺点,并已有多个课题组开展了细胞外囊泡在脱髓鞘疾病方面的相关研究。但是使EVs能够精准的携带药物靶向递送到病灶位置的方法仍旧有限。
发明内容
为解决上述技术问题,本发明提供了一种靶向性细胞外囊泡及其制备方法和应用,制备得到的靶向性细胞外囊泡能够制成的包裹抗炎或神经保护药物且具有PDGFA靶向配体的细胞外囊泡载药体系,具有靶向性强、生物相容度好、载药效率高、在CNS病变区域分布量大,从而提升药物的抗炎及神经保护活性等优点。
本发明的第一个目的是提供了一种靶向性细胞外囊泡的制备方法,包括以下步骤:
S1,获得靶向配体PDGFA片段;
S2,在pCDH载体中分别依次插入信号序列、靶向配体序列和Lac胞内段序列,获得骨架载体pCDH-Lac;
所述信号序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示;
所述靶向配体序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示;
所述Lac胞内段序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示;
S3,将靶向配体PDGFA与骨架载体pCDH-Lac进行连接,获得pCDH-Lac-PDGFA靶向性载体;
S4,使用293T细胞对pCDH-Lac-PDGFA靶向性载体进行慢病毒的包装,获得LV-Lac-PDGFA慢病毒载体,然后感染神经干细胞后筛选获得NSC-Lac-PDGFA;
S5,分离得到靶向性细胞外囊泡EVPs。
进一步地,S1中,靶向配体PDGFA片段的获得:以成年鼠神经组织的cDNA文库作为模板,以核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的F引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的R引物为引物对进行PCR,获得5’-端和3’-端分别为XbaI和EcoRI限制性内切酶位点的PDGFA片段。
进一步地,S3中,所述靶向配体PDGFA与骨架载体pCDH-Lac进行连接时通过限制性内切酶XbaI和NotI消化。
进一步地,S4中,所述的感染神经干细胞后筛选的具体过程为:使用LV-Lac-PDGFA慢病毒载体感染神经干细胞72小时后进行首次新霉素的阳性细胞抗药性筛选,存活的细胞培养三天后再次进行新霉素的抗药性筛选,最终存活的细胞为经靶向配体PDGFA修饰阳性的神经干细胞,命名为NSC-Lac-PDGFA。
进一步地,所述首次新霉素的阳性细胞抗药性筛选中新霉素浓度为245-255μg/ml,所述再次新霉素的阳性细胞抗药性筛选中新霉素浓度为495-505μg/ml。
进一步地,所述首次新霉素的阳性细胞抗药性筛选中新霉素浓度为250μg/ml,所述再次新霉素的阳性细胞抗药性筛选中新霉素浓度为500μg/ml。
进一步地,S5中,分离过程为:先培养NSC-Lac-PDGFA细胞,培养液采用DMEM/F12和无血清补充物B27,4天后收集上清,首先200g离心2-3min收取上清,使用0.22μm滤器过滤上清液,分别将细胞上清液以300g,离心10min用于除去细胞,而后依次2000g离心20min,8000g离心30min用于除去细胞碎片,使用超速离心机在4℃下以110,000g离心65-75min,然后小心地去除去上清液,用PBS洗涤,再次超速离心即得细胞外囊泡EVPs。
进一步地,S5中,首先200g离心2min收取上清,除去细胞碎片后使用超速离心机在4℃下以110,000g离心70min。
进一步地,S5中,制备得到的细胞外囊泡EVPs来源为小鼠神经干细胞。
本发明的第二个目的是提供了一种上述的制备方法制备得到的细胞外囊泡。
本发明的第三个目的是提供了一种所述的细胞外囊泡在制备中枢神经系统脱髓鞘疾病药物中的应用。
进一步地,通过将细胞外囊泡装载治疗药物的方式进行中枢神经系统脱髓鞘疾病药物的制备。
与现有技术相比,本发明的有益效果在于:
1、本发明发现,将PDGFA靶向配体通过装载入含有特定信号序列的载体后,可使PDGFA高度表达于细胞外囊泡,使得细胞外囊泡具有趋向和结合少突胶质细胞谱系的能力;
2、本发明使用表达PDGFA靶向配体片段的细胞外囊泡作为靶向性药物载体,创新性地构建一种可高效穿越血脑屏障、同时特异性靶向脱髓鞘病灶及少突胶质细胞谱系细胞的携带促少突胶质细胞分化药物的新型细胞外囊泡药物递送系统。制成的装载促少突胶质细胞分化的靶向性细胞外囊泡载体,具有生物相容性好、载药率高、精准靶向、易于穿越血脑屏障等特点,增加了药物对脱髓鞘疾病的治疗活性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明中pCDH-Lac载体结构图;
图2为本发明中EVs与EVPs的EV标记物(CD63和Alix1)的Western Blot印迹分析及电子显微镜图;
其中,图a表示来自NSCs的EVs和EVPs对EV标记物(CD63和Alix1)的Western Blot印迹分析图;
图b表示EVs与EVPs的电子显微镜图;
图3为本发明中少突胶质前体细胞(OPCs)在正常培养基及LPS处理条件下摄取EVs与EVPs的免疫染色和统计分析图;
其中,图3a表示OPCs在正常培养基及LPS处理条件下摄取EVs与EVPs的免疫染色图;
图3b表示OPCs在正常培养基及LPS处理条件下摄取EVs与EVPs的统计分析图;
图4为活体成像仪对小鼠各个器官组织的分布成像及荧光检测图;
其中,图a为活体动物成像图;
图b为小鼠脊髓病灶部位的EVPs和EVs的荧光信号强度;
图5为本发明中用免疫荧光染色检测EVPs的靶向性;
其中,图a表示免疫荧光染色检测EVPs的靶向性的显示图;
图a中第一列从上到下各图分别依次对应第二列图中方框内的局部放大图,第四列从上到下各图分别依次对应第三列图中方框内的局部放大图;
图b表示EVPs和EVs进入在不同细胞中的数量统计分析;
图6为本发明中EVPs装载T3效率测试统计图;
图7为本发明中EVPs,T3及EVPs+T3治疗EAE小鼠的临床评分;
图8为本发明中EVPs,T3及EVPs+T3三者治疗的小鼠的组织学改变;
其中,图a为EVPs,T3及EVPs+T3三者的HE和LFB染色情况;
图b为EVPs,T3及EVPs+T3三者的HE和LFB染色统计分析;
图9为本发明中髓鞘碱性蛋白MBP抗体免疫荧光染色检测EVPs,T3及EVPs+T3对髓鞘白质区阻断髓鞘损伤的治疗效果及统计分析;
其中,图a为EVPs,T3及EVPs+T3对髓鞘白质区阻断髓鞘损伤的治疗效果直观图;
图b为EVPs,T3及EVPs+T3对髓鞘白质区阻断髓鞘损伤的治疗效果统计分析;
图10为本发明中透射电镜检测EVPs,T3及EVPs+T3对髓鞘再生的效果图;
其中,图a表示病变轴突G-ratio比率散点图;
图b表示使用Image-Pro Plus软件测定平均G-ratio的值(轴突直径除以整个有髓纤维直径);
图c表示EVPs,T3及EVPs+T3对髓鞘再生的不同促进作用;
图d为小鼠脊髓病变部位电子显微镜图。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式进行详细描述,但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。本发明各实施例中所述实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例1
一、一种膜表面表达PDGFA小肽的细胞外囊泡的制备方法,具体包括如下步骤:
S1,靶向配体PDGFA的获得:选用成年鼠神经组织的cDNA文库作为模板,设计PDGFA基因的正向引物(F引物)和反向引物(R引物),所述F引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示,所述R引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示,通过PCR获得5’-端和3’-端分别为XbaI和EcoRI限制性内切酶位点的PDGFA片段;
SEQ ID NO.4:ACTTCTAGAATGAGGACCTGGGCTTGCCT
SEQ ID NO.5:CTTGAATTCTCACCTCACATCTGTCTCCT
S2,以商业化的pCDH载体(购买自System Biosciences,Palo Alto,USA)进行改造,在MSCV启动子后分别依次插入信号序列(SS,引导蛋白质定向转移的线性序列,具有分选信号的功能,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)、靶向配体序列(其核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示)和Lac胞内段序列(其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示),获得骨架载体pCDH-Lac,所述骨架载体pCDH-Lac结构见图1。
SEQ ID NO.1:ATGGATCCAAAAGGATCACTATCATGGAGAATCCTACTATTTCTATCACTAGCATTTGAACTAAGTTATGGA
SEQ ID NO.2:GCTAGCTCTCGAGACCCGGGATTGAATTCAAGGATCC
SEQ ID NO.3:TGGGTCACCGGCGTAGTAACACAAGGCGCAAGTCGATTAGCAAGCCACGAATATCTAAAAGCATTAAAAGTAGCATATAGTCTCAACGGGCATGAGTTAGACTTTATACACGACGTCAACAAGAAGCAGAAAGAATTCGTAGGCAATTGGAATAAGAATGCAGTACACGTTAATCTATTCGAAACACCCGTAGAAGCCCAATATGTAAGGTTATATCCAACAAGTTGTCATACAGCATGTACCCTACGTTTCGAACTGCTAGGATGCGAACTAAATGGCTGTGCAAACCCACTAGGACTAAAAAACAATAGTATACCCGATAAACAAATTACAGCATCAAGTAGTTATAAAACATGGGGTTTACACCTATTTAGTTGGAATCCATCATACGCCCGACTAGATAAACAAGGAAATTTTAATGCATGGGTCGCAGGAAGTTATGGCAATGACCAATGGCTACAAGTAGATCTAGGATCGTCAAAAGAAGTAACCGGAATAATAACACAAGGAGCACGCAATTTCGGTTCCGTTCAATTCGTAGCGTCATATAAAGTCGCATATAGCAACGATAGCGCAAATTGGACCGAATATCAAGATCCAAGAACCGGAAGTAGCAAAATATTTCCCGGAAATTGGGATAATCATTCACATAAAAAAAATTTATTCGAAACACCAATACTAGCCCGCTACGTACGAATTCTACCCGTCGCATGGCATAATCGTATAGCACTACGACTAGAACTACTAGGATGCTAG
S3,通过限制性内切酶XbaI和NotI消化,将靶向配体PDGFA与骨架载体pCDH-Lac进行连接,获得pCDH-Lac-PDGFA靶向性载体。
S4,使用293T细胞对pCDH-Lac-PDGFA靶向性载体进行慢病毒的包装,获得LV-Lac-PDGFA慢病毒载体,使用LV-Lac-PDGFA慢病毒载体感染神经干细胞72小时后进行新霉素(250μg/ml)的阳性细胞抗药性筛选,存活的细胞培养三天后再次进行新霉素(500μg/ml)的抗药性筛选,最终存活的细胞为经靶向配体PDGFA修饰阳性的神经干细胞,命名为NSC-Lac-PDGFA,对照细胞为NSC-Lac。所述神经干细胞由6-8周龄的C57BL/6新生小鼠的脑室下区(Subventricular Zone,SVZ)中提取。
S5,以1×105cell/ml的浓度分别培养对照细胞NSC-Lac和NSC-Lac-PDGFA细胞,培养液采用DMEM/F12和无血清补充物B27,4天后收集上清,首先200g离心2min收取上清,使用0.22μm滤器(Millipore)过滤上清液,分别将细胞上清液以300g,离心10min用于除去细胞,而后依次2000g离心20min,8000g离心30min用于除去细胞碎片,使用超速离心机(OptimaXPN-100,Beckman Coulter)在4℃下以110,000g离心70min,然后小心地去除去上清液,用PBS洗涤,再次超速离心即得细胞外囊泡,分别命名为EVs和EVPs。
二、上述细胞外囊泡的鉴定,具体包括如下步骤:
分别取20μL EVs和EVPs添加到碳膜铜网上10min,然后在室温下用1%醋酸铀染色10min,后用一滴水清洗铜网。在空气干燥的环境于透射电子显微镜(HITACHI HT 7800)中观察。
分别向EVs、EVPs和NSC细胞上清液中加入RIPA裂解缓冲液(Solarbio)和蛋白酶抑制剂苯甲磺酰氟,使用BCA试剂盒(Zoman Biotechnology)测量浓度,并对NSC进行相同的操作以提取蛋白质。将提取的蛋白质加入蛋白质上样缓冲液中进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。然后将蛋白质条带转移至PVDF膜(Millipore)并与一抗抗CD63(System Bioscience)和抗Alix(Abcam)的山羊抗体一起孵育。兔辣根过氧化物酶偶联二抗(Jackson ImmunoResearch)。随后,在化学发光分析系统中观察。
实验结果如图2所示:电子显微镜图像清楚地显示EVs和EVPs呈现圆形形态(见图2a)。蛋白质印迹证实EVs和EVPs均表达EVs特异性标记CD63和Alix(见图2b)。
三、上述细胞外囊泡体外靶向效率检测,具体包括如下步骤:
EVs或EVPs用EV标记试剂盒(System Bioscience)标记,按说明书进行。将适量的EVs或EVPs与6μL反应缓冲液和1μL标记染料充分混合,在室温下孵育30min。然后使用PDSpinTrap G-25(GE)去除游离的未被标记染料的EVs或EVPs,而后与小鼠少突胶质前体细胞一起培养。同时还给予脂多糖LPS(100ng/ml)用来模拟体内炎症环境。
实验结果如图3所示:免疫荧光染色结果表明,在LPS培养条件下,EVPs被少突胶质前体细胞摄取的效率明显高于EVs。
四、上述细胞外囊泡体内靶向效率检测,方法包括如下步骤:
EVs或EVPs用EV红色荧光标记试剂盒(System Bioscience)或近红外荧光记试剂盒(Thermo Fisher)标记,按说明书进行。将适量的EVs或EVPs与6μL反应缓冲液和1μL标记染料充分混合,在室温下孵育30min。然后使用PD SpinTrap G-25(GE)去除游离的未被标记染料的EVs或EVPs,而后将标记的EVs和EVPs通过尾静脉注射给EAE小鼠。五天后,使用活体成像仪检测EVs或EVPs在各个器官组织的分布,同时通过免疫荧光染色的方法检测EVs或EVPs在不同类型细胞中的分布。
实验结果:小动物活体成像仪检测结果显示,经过配体PDGFA修饰后的EVPs在小鼠脊髓病灶部位的荧光信号明显强于未修饰的EVs(见图4)。免疫荧光染色检测,EVPs进入少突胶质细胞谱系的数量显著强于EVs,而进入神经元的EVPs数量则明显降低,表明靶向性配体改变了细胞外囊泡的趋向性(见图5)。
五、上述细胞外囊泡药物装载及装载效率检测,方法包括如下步骤:
(1)装载治疗药物:
将细胞外囊泡1×108particle与三碘甲状腺原氨酸(Triiodothyronine,T3)(Sigma)(0.2μg)混匀并溶于200μl的PBS;将离心管置于冰上并固定,超声:振幅20%超声时间6s,间隙时间30s循环6次;超声完毕后置于37℃培养箱,45min;使用PD Spin Trap(GEHealthcare,Pittsburgh)去除游离小分子。
(2)提取并检测装载入细胞外囊泡的治疗药物T3:
超声装载T3的细胞外囊泡,超声仪设置条件为:振幅20%,超声时间6s,间隙时间30s,循环6次;离心13000rpm 10min,取上清;使用T3 ELISA试剂盒(Abbkine)检测细胞外囊泡装载药物的含量。
实验结果:ELISA结果显示,EVPs装载T3的效率为51.9%(见图6)
六、EVPs+T3在EAE高峰期缓解EAE小鼠的发病症状
1、EVP+T3改善了T3治疗效果更好
八周龄的雌性C57BL/6小鼠购自空军军医大学(中国西安)。所有实验程序和方案均经陕西师范大学动物护理和使用委员会批准,并按照批准的机构指南和法规进行。在标准条件下(23±2℃)在陕西师范大学动物饲养室饲养小鼠。为了诱导EAE,用200μL含200μg髓鞘少突胶质细胞糖蛋白肽(MOG35-55)、50%体积完全弗氏佐剂和5mg/mL结核分枝杆菌H37Ra(Sigma-Aldrich)的乳剂在背部的两个部位皮下免疫小鼠。并且在免疫后第0天和第2天对所有小鼠腹膜内注射200ng百日咳毒素(由Sigma-Aldrich提供)。而后两名研究人员每天盲评EAE小鼠的临床评分,按0-5评分标准进行评估:0.5分,僵硬的尾巴;1分,跛尾;1.5分,跛尾和蹒跚;2分,一肢瘫痪;2.5分,一肢瘫痪,另一肢无力;3分,完全瘫痪两个后肢;4分,垂死;5分,死亡。T3在NaOH(1mol/L)中以10μg/ml制备原液。在疾病高峰期后每隔3天,静脉注射T3(10μg/kg)或EVPs+T3(10μg/kg),而未注射的小鼠则作为对照组。
免疫后第25天处死小鼠。为了评估CNS组织病理学,用预冷PBS灌注小鼠心脏;然后用4%多聚甲醛固定脊髓,切成5μm切片,并用苏木精和曙红(Hematoxylin and eosin,H&E)或Luxol fast blue(Luxol fast blue,LFB)染色,将固定的组织包埋在OCT化合物(Tissue-Tek)中,然后切片厚度为8μm,并用一抗和二抗对载玻片上的组织进行孵育染色。通过Nikon Eclipse E600荧光显微镜获得图像。分别用于评估浸润细胞或髓鞘损失。
实验结果:治疗后的EVPs组仅在第15天后的临床评分中显示出典型的EAE发展趋势,而使用T3治疗的小鼠与仅使用EVPs相比,临床评分逐渐降低。EVP s+T3处理的小鼠在第25天时显示出显著的恢复。与EVPs或T3相比,EVPs+T3的治疗能力明显高于其他两组(见图7)。与疾病评分一致,EVPs和T3治疗的小鼠表现出明显的炎症细胞浸润,在EVP s+T3治疗的小鼠白质中观察到很少的组织学改变(见图8)。同时,用EVPs+T3治疗的小鼠显示出明显的髓鞘蛋白恢复,比仅使用EVPs或T3效果明显(见图9)。这些结果表明,T3具有较好的治疗效果,而经EVPs装载后的T3在更低的注射剂量条件下还能够显著提升治疗效果,表明经过改造后的EVPs对于脊髓病灶区域具有明确的靶向性。
2、EVPs+T3促进髓鞘再生
按照上述方法进行诱导与治疗,随后处死小鼠取其脊髓进行使用电镜固定液进行固定,通过透射电子显微镜进行图像获取。髓鞘再生的检测标准是再生的髓鞘相对于正常髓鞘而言较薄。
实验结果:与免疫组化观察结果一致,与其他两组相比,EVPs+T3治疗组发现髓鞘较厚。虽然T3处理显示出一些髓鞘再生的迹象,但与EVP+T3治疗相比并不显著。还表现为平均g比值和有髓细胞百分比轴突。这些结果清楚地证明EVPs+T3显著加速髓鞘再生(见图10)。
尽管已描述了本发明的优选实施例,但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念,则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以,所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然,本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样,倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内,则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
序列表
<110> 陕西师范大学
<>
<120> 一种靶向性细胞外囊泡及其制备方法和应用
<>
<160> 5
<>
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<>
<210> 1
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工合成
<>
<400> 1
atggatccaa aaggatcact atcatggaga atcctactat ttctatcact agcatttgaa 60<>
ctaagttatg ga 72<>
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<210> 2
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工合成
<>
<400> 2
gctagctctc gagacccggg attgaattca aggatcc 37<>
<>
<210> 3
<211> 756
<212> DNA
<213> 人工合成
<>
<400> 3
tgggtcaccg gcgtagtaac acaaggcgca agtcgattag caagccacga atatctaaaa 60<>
gcattaaaag tagcatatag tctcaacggg catgagttag actttataca cgacgtcaac 120<>
aagaagcaga aagaattcgt aggcaattgg aataagaatg cagtacacgt taatctattc 180<>
gaaacacccg tagaagccca atatgtaagg ttatatccaa caagttgtca tacagcatgt 240<>
accctacgtt tcgaactgct aggatgcgaa ctaaatggct gtgcaaaccc actaggacta 300<>
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ttacacctat ttagttggaa tccatcatac gcccgactag ataaacaagg aaattttaat 420<>
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aaagaagtaa ccggaataat aacacaagga gcacgcaatt tcggttccgt tcaattcgta 540<>
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cgtatagcac tacgactaga actactagga tgctag 756<>
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<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工合成
<>
<400> 4
acttctagaa tgaggacctg ggcttgcct 29<>
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<210> 5
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工合成
<>
<400> 5
cttgaattct cacctcacat ctgtctcct 29<>
<>
<>
<>
Claims (10)
1.一种靶向性细胞外囊泡的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1,获得靶向配体PDGFA片段;
S2,在pCDH载体中分别依次插入信号序列、靶向配体序列和Lac胞内段序列,获得骨架载体pCDH-Lac;
所述信号序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示;
所述靶向配体序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示;
所述Lac胞内段序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示;
S3,将靶向配体PDGFA与骨架载体pCDH-Lac进行连接,获得pCDH-Lac-PDGFA靶向性载体;
S4,使用293T细胞对pCDH-Lac-PDGFA靶向性载体进行慢病毒的包装,获得LV-Lac-PDGFA慢病毒载体,然后感染神经干细胞后筛选获得NSC-Lac-PDGFA;
S5,分离得到靶向性细胞外囊泡EVPs。
2.如权利要求1所述一种靶向性细胞外囊泡的制备方法,其特征在于,S1中,靶向配体PDGFA片段的获得:以成年鼠神经组织的cDNA文库作为模板,以核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的F引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的R引物为引物对进行PCR,获得5’-端和3’-端分别为XbaI和EcoRI限制性内切酶位点的PDGFA片段。
3.如权利要求2所述一种靶向性细胞外囊泡的制备方法,其特征在于,S3中,所述靶向配体PDGFA与骨架载体pCDH-Lac进行连接时通过限制性内切酶XbaI和NotI消化。
4.如权利要求3所述一种靶向性细胞外囊泡的制备方法,其特征在于,S4中,所述的感染神经干细胞后筛选的具体过程为:使用LV-Lac-PDGFA慢病毒载体感染神经干细胞进行新霉素的阳性细胞抗药性筛选,存活的细胞培养三天后再次进行新霉素的抗药性筛选,最终存活的细胞为经靶向配体PDGFA修饰阳性的神经干细胞,命名为NSC-Lac-PDGFA。
5.如权利要求4所述一种靶向性细胞外囊泡的制备方法,其特征在于,S4中,所述首次新霉素的阳性细胞抗药性筛选中新霉素浓度为245-255μg/ml,所述再次新霉素的阳性细胞抗药性筛选中新霉素浓度为495-505μg/ml。
6.如权利要求5所述一种靶向性细胞外囊泡的制备方法,其特征在于,S5中,分离过程为:先培养NSC-Lac-PDGFA细胞,培养液采用DMEM/F12和无血清补充物B27,收集上清,200g离心2-3min收取上清,0.22μm过滤上清液,将细胞上清液离心除去细胞,而后梯度离心除去细胞碎片,在4℃下以110,000g离心65-75min,然后去除去上清液,洗涤后再次超速离心即得细胞外囊泡EVPs。
7.如权利要求6所述一种靶向性细胞外囊泡的制备方法,其特征在于,S5中,制备得到的细胞外囊泡EVPs来源为小鼠神经干细胞。
8.一种权利要求1-7任一项所述的制备方法制备得到的细胞外囊泡。
9.一种权利要求8所述的细胞外囊泡在制备中枢神经系统脱髓鞘疾病药物中的应用。
10.如权利要求9所述的细胞外囊泡在制备中枢神经系统脱髓鞘疾病药物中的应用,其特征在于,通过将细胞外囊泡装载治疗药物的方式进行中枢神经系统脱髓鞘疾病药物的制备。
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