CN104606215B - 一种抑制肠道病毒71的药物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种抑制肠道病毒71的药物。本发明发现临床上用于治疗真菌感染的两性霉素B具有抑制肠道病毒71的特性，通过药物毒性试验、药物对病毒的抑制试验、病毒斑块形成试验，发现两性霉素B可明显抑制EV71病毒在RD细胞和293细胞中的感染，进一步发现两性霉素B是通过影响EV71病毒的吸附起到抵抗该病毒感染的作用。本发明为肠道病毒71的预防和治疗提供了新的药物，具有较好的市场价值和临床应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及抗病毒药物领域，具体地，涉及一种抑制肠道病毒71的药物。
背景技术
手足口病在世界多个地区,尤其是亚洲爆发并流行,且其感染率和死亡率逐年增高,危害十分严重。肠道病毒71(Enterovirus 71,EV71)是手足口病(Hand,foot,and mouthdisease,HFMD)的主要病原体,以感染婴幼儿为主,其感染常伴随神经系统并发症,严重可导致儿童死亡。目前,虽有一些针对EV71复制周期抗病毒药物、EV71的疫苗开发、RNA等方面的报道,但迄今为止,还没有找到行之有效的预防措施及治疗方法。
为了找到EV71感染的有效治疗方法,目前,国内外学者在药物研发方面已经取得了一些研究成果。一是利用现有的抗病毒药物治疗手足口病；二是依据EV71的分子生物学特点设计并合成现有抗病毒药物的衍生物；三是筛选新的抗EV71的药物。但是现今取得的抗EV71成果大多停留在实验室阶段,能否被应用于临床治疗,还有待深入的研究。目前抗EV71的药物主要包括以下几种：受体结合阻断剂、病毒衣壳阻断剂、酶抑制剂和核苷类似物等。研究发现EV71的受体不只一种，包括清道夫受体B2(Human scavenger receptor classB,member 2,SCARB2)、P选择素糖蛋白配体(Human P-selectin glycoprotein ligand-1,PSGL-1/CD162)等。抗SCARB2抗体和可溶的SCARB2结合剂能够阻止EV71的侵入。可溶性的PSGL-1单克隆抗体和纯化的唾液酸多糖也能阻断EV71的感染。但在EV71滴度较高的情况下,这些受体结合阻断剂都不能有效的抑制感染,这可能与EV71存在多种细胞受体有关。因此,只针对一种受体的抑制剂不能彻底抑制病毒的感染。
普拉康纳利(Pleconaril)是一种病毒衣壳阻断剂，能够通过与病毒的蛋白衣壳结合而干扰病毒的吸附和脱壳，是一类广谱的抗微小核糖核酸病毒药物。其咪唑啉酮衍生物，能够抑制EV71在横纹肌肉瘤(Rhabdomyosarcoma,RD)细胞中引起的病变效应且细胞毒性较低。
蛋白酶是微小核糖核酸病毒属病毒复制所必需的特异蛋白酶之一。芦平曲韦(Rupintrivir)是根据鼻病毒3C结构设计的抗病毒物质。Kuo等根据芦平曲韦设计了一系列衍生物，作为EV71蛋白酶3C抑制剂进行了验证。最终发现，其衍生物10b是一种有前景的抑制剂，并且没有明显的细胞毒性，但其在体内是否仍然具有抗病毒活性有待于进一步验证。
随着EV71分子生物学研究的深入,已经针对EV71复制过程中不同靶点设计了诸多抗病毒药物,但对其在体内的抗病毒效应及不良反应等大多还需进一步的体内试验和临床验证。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抑制肠道病毒71的药物。
两性霉素B(Amphotericin B)，是从链霉菌中分离而来的一种多烯类抗真菌抗生素，其结构中含有一羧基和一氨基，故兼有酸碱两性，对多种真菌如新型隐球酵母、皮炎芽酵母、巴西芽酵母、荚膜组织胞浆菌、申克氏侧孢霉、白假丝酵母和若干诺卡氏菌等有显著的抑菌作用。被称为治疗深部真菌感染的“金标准”，耐药率低、抗菌谱广。该药物已广泛应用于抗真菌感染的临床治疗中。
本发明经过大量试验研究发现临床上用于治疗真菌感染的两性霉素B具有抑制肠道病毒71的作用。
因此本发明提供一种抑制肠道病毒71的药物，含有多烯类抗真菌抗生素。
进一步，所述多烯类抗真菌抗生素为两性霉素B或其衍生物。
本发明提供的抑制肠道病毒71的药物还含有药学上可接受的辅料。
上述药物与医学上可接受的载体或赋形剂制成的药物制剂也属于本发明的保护范围。
所述制剂为片剂、胶囊剂、粉针剂、喷雾剂或颗粒剂。
本发明还提供了两性霉素B或其衍生物在制备抑制或治疗肠道病毒71药物中的应用。
本发明通过药物毒性试验、药物对病毒的抑制试验、病毒斑块形成试验，发现0.5μM的两性霉素B可明显抑制EV71在293中的感染，在293细胞中两性霉素B抵抗EV71的半数抑制浓度为0.32μM；2μM的两性霉素B可抑制EV71在RD细胞中的感染，在RD细胞中两性霉素B抵抗EV71的半数抑制浓度为1.74μM。本发明进一步发现两性霉素B是通过影响EV71病毒的吸附起到抵抗该病毒感染的作用。本发明为肠道病毒71的预防和治疗提供了新的药物，具有较好的市场价值和临床应用前景。
附图说明
图1为EV71感染两性霉素B处理的RD细胞后病毒蛋白的表达情况，持家基因Actin的表达作为对照。
图2为EV71感染两性霉素B处理的293细胞后病毒蛋白的表达情况，持家基因Actin的表达作为对照。
图3为EV71感染两性霉素B处理的RD细胞的不同时间后病毒蛋白的表达情况，用针对EV71的抗体及病毒结构蛋白VP1的抗体指示病毒蛋白的表达情况，持家基因Actin的表达作为对照。
图4为EV71感染两性霉素B处理的293细胞的不同时间后病毒蛋白的表达情况，用针对EV71的抗体及病毒蛋白VP1的抗体指示病毒蛋白的表达情况，持家基因Actin的表达作为对照。
图5为两性霉素B处理影响EV71的吸附。用针对EV71VP1的特异性引物指示病毒的吸附及进入量，持家基因GAPDH的表达作为对照。图5A为PCR结果，图5B为实时定量PCR的结果。
图6为RD细胞中不同浓度两性霉素B抑制EV71感染的情况。
图7为293细胞中不同浓度两性霉素B抑制EV71感染的情况。
图8为RD细胞中不同浓度两性霉素B的细胞毒性。
图9为293细胞中不同浓度两性霉素B的细胞毒性。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
本发明实施例中使用的两性霉素B，购自Sigma公司，溶于DMSO中。EV71病毒株为安徽阜阳株，由中国医学科学院病原生物学研究所分离得到，将病毒在人恶性胚胎横纹肌肉瘤细胞(RD)中扩增，取上清，分装后-70℃保存。RD细胞及感染用293细胞用含10％胎牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素的DMEM培养液，在37℃，5％CO2培养箱中培养，每2-3天传代一次。
实施例1药物对EV71的抑制实验
1、方法RD细胞(8×105)或293细胞(6×105)接种在六孔板无抗生素DMEM完全培养基中，培养过夜，细胞生长平铺90％以上时，RD细胞加入0、1、2、3、4、5μM的两性霉素B处理细胞，2h后分别加入MOI：0.08的EV71进行感染。293细胞加入0、0.2、0.5、1、2、3μM的两性霉素B处理细胞，2h后分别加入MOI：0.5的EV71进行感染。在培养箱中孵育1h后换成正常培养基培养相应时间，收集上清，进行病毒斑块形成试验。同时收集细胞，裂解后进行WesternBlotting实验，检测细胞中病毒蛋白的表达情况。
1.1病毒斑块形成实验
RD细胞(3×105)接种于12孔板中，待细胞平铺90％以上时，将收集的病毒上清10倍梯度稀释，感染细胞1h后，弃去病毒，覆盖37℃预温含1％低熔点琼脂糖的DMEM维持培养基继续培养2-3天后，用4％多聚甲醛固定4h后，5％结晶紫染色15分钟后用流水轻轻冲去，计数斑块形成个数。每次实验每个样品重复三次。采用概率单位回归法计算的半数抑制病毒浓度(Inhibitory concentration 50％，IC50)。
1.2Western-Blotting体系的建立
1.2.1病毒蛋白的提取
将空白对照组(细胞维持液)、阴性对照组(细胞维持液+DMSO+EV71)和两性霉素B处理组(两性霉素B+细胞维持液+EV71)细胞于病毒感染后收集细胞，3000rpm离心3min，PBS洗一次，加入100μL细胞裂解液RIPA，-20℃保存备用。
1.2.2Western Blotting检测病毒蛋白的表达
(l)首先制备12％的分离胶(4mL 30％丙烯酰胺溶液，2.5mL TriS/HCI pH8.8，100μL 10％SDS，100μL 10％过硫酸氨，5μL TEMED)，灌胶，液面顶端加入水，室温下聚合60min。
(2)倒干净上层水，再制备5％的积层胶(0.5mL 30％丙烯酰胺溶液，0.5mL TriS/HCI pH6.8，40μL 10％SDS，50μL 10％过硫酸氨，5μL TEMED)，在积层胶上插入梳齿，室温下聚合50min。待胶完全凝聚后，小心拔下梳齿。
(3)EV71病毒感染RD或293细胞(空白对照组、DMSO药物模拟组和药物处理组)收获的裂解液各20μL，加入5X上样缓冲液5μL，100℃煮10min。
(4)制备的电泳胶装进电泳槽，在内槽加满新鲜配制的电泳缓冲液(没过制胶板)，将上步处理好的样品取20μL缓缓加入积层胶梳齿孔中，再在电泳槽外槽内加入适量电泳缓冲液，进行电泳:首先是40V，电泳40分钟，观察样品被很好的压缩成一条线，蛋白预染Marker开始分离，说明样品进入分离胶，可调整电流为100V，继续电泳2.5h，观察蛋白预染Marker很好的分开，结束电泳。
(5)切掉多余胶块，按照从负极到正极分别为滤纸、胶、硝酸纤维素膜(NC膜)、滤纸的顺序叠放在转膜夹板中，放入转膜装置，加满新配的转膜液，冰上或4℃，插上电极进行转膜，100V 60min，将胶上的蛋白转移到NC膜上。
(6)转好的膜用5％脱脂奶粉封闭，水平摇床上25rpm，室温孵育l h。
(7)将膜浸在含适当稀释抗体(EV71抗体1:1000稀释、VP1抗体1:2000稀释)的5％脱脂奶粉中，水平摇床上25rpm，4℃过夜。
(8)50rpm水平摇床上，用TBST洗膜4次，5min/次。
(9)弃掉洗液，加入1:10000稀释的IRDye荧光二抗，水平摇床上25rpm，室温孵育lh。
(10)弃掉二抗，25rpm水平摇床上用TBST洗膜4次，5min/次。
(11)取出膜，利用LI-COR Odyssey仪器扫膜。
1.2.3病毒RNA提取
收集的细胞样品按QIAGEN RNeasy mini kit说明书提取RNA，然后将RNA溶于DEPC处理水，用Nanodrop测定RNA含量。提取的RNA样品-70℃保存。
1.2.4病毒RT-PCR体系的建立
用Invitrogen反转录试剂盒将mRNA逆转录合成cDNA后并进行PCR扩增。具体操作步骤如下：
引物设计根据NCBI数据库中提供的EV71病毒株的核苷酸全序列，依据引物设计的基本原则，运用软件Primer Premier 5.0设计编码病毒蛋白VP1/EV71基因序列的特异性引物。如下。
正义引物:5`-TAGATAGGGTGGCAGATGTAATTGAAAG-3`
反义引物:5`-TAGCATTTGATGAT GCTCCAATTTCAG-3
PCR操作步骤(1)逆转录成cDNA的操作步骤如下：
(2)按照下面表格剂量的添加到0.2mL无核酸的薄壁PCR管中。
(3)轻轻的混匀，通过短暂离心确保全部反应成分在扩增管的管底。
(4)将反应体系置入已经按照上述方法设置的PCR仪器中反应。收集PCR反应产物，-20℃保存。
RT-PCR产物电泳
利用2％琼脂糖凝胶电泳检测病毒RT-PCR产物：
(1)在已加有30mL 1×TAE电泳缓冲液的三角锥瓶中加入准确称量的琼脂糖粉0.6g。
(2)锥瓶放入微波炉中用中火加热至琼脂糖完全溶解后，室温下冷却至60-70℃左右，加入溴化乙锭(EB)2μL，轻轻摇晃使其充分混匀。
(3)将胶模放入胶槽中固定好，并在距底板0.5-1.0mm的位置放置梳子，以便加入琼脂糖后可以形成完好的加样孔。
(4)将温热的琼脂糖溶液倒入胶模中，凝胶的厚度在3-5mm之间。
(5)在凝胶完全凝固后(于室温放置10-25min或置于4℃冰箱5min)，小心移去梳子，将凝胶放入电泳槽中。
(6)加入恰好没过胶面约1mm深的足量电泳缓冲液。
(7)取10μL DNA样品与2μL的6×Loading Buffer混合后，用微量移液器缓慢将混合物加入加样孔内。
(8)盖上电泳槽并通电，使DNA向阳极移动。几分钟后，溴酚蓝从加样孔中迁移到凝胶中。继续电泳直至溴酚蓝在凝胶中迁移出适当的距离。
(9)切断电流，从电泳槽上拔下电线，打开槽盖。取出凝胶。
(10)紫外灯下观察样品的移动情况并拍照。
2、结果
2.1两性霉素B抗EV71病毒作用
RD细胞(8×105)或293细胞(6×105)接种在六孔板无抗生素DMEM完全培养基中，培养过夜。RD加入0，1，2，3，4，5μM的两性霉素B处理2h后，加入MOI：0.08的EV71感染6h后收集细胞，裂解进行Western Blotting实验，检测细胞中病毒蛋白的表达情况，结果见图1。293加入0，0.2，0.5，1，2，3μM的两性霉素B处理2h后，加入MOI：0.5的EV71感染6h后收集细胞，裂解进行Western Blotting实验，检测细胞中病毒蛋白的表达情况，结果见图2。如图1，图2显示，加入0.5μM的两性霉素B即可明显抑制EV71在293中的感染，加入2μM的两性霉素B即可抑制EV71在RD细胞中的感染。
RD加入2μM的两性霉素B处理2h后，加入MOI：0.06的EV71感染不同时间收集细胞，293加入1μM的两性霉素B处理2h后，加入MOI：0.5的EV71感染不同时间后收集细胞，裂解进行Western Blotting实验，检测细胞中病毒蛋白的表达情况。如图3，图4显示，在病毒感染的早期即可检测到两性霉素B对病毒的抑制效果。提示两性霉素B可能在病毒感染的早期阶段发挥抑制作用。
2.2两性霉素B对EV71病毒入侵过程的影响
RD加入2μM的两性霉素B处理2h后，加入MOI：0.06的EV71感染，加入病毒后于4℃吸附1h，用胰酶消化收集细胞为背景值，加入PBS用细胞刮子刮下细胞为吸附的病毒吸附量，另外，加入正常培养基37℃培养1h后用胰酶消化收集细胞为进入的病毒进入量。收集的细胞样品提取RNA，随机引物反转后加入EV71特异引物进行PCR及实时定量PCR。如图5A和图5B所示，两性霉素B处理影响了EV71的吸附，这可能是两性霉素B抵抗病毒感染的主要原因。
2.3两性霉素B抵抗EV71的半数抑制浓度
RD细胞(8×105)或293细胞(6×105)接种在六孔板无抗生素DMEM完全培养基中，培养过夜，加入不同浓度的两性霉素B处理2h后，分别加入EV71进行感染。在培养箱中孵育2h后换成正常培养基培养24h，收集上清，进行病毒斑块形成试验。如下图所示，在RD细胞中两性霉素B抵抗EV71的半数抑制浓度为1.74μM(图6)，在293细胞中两性霉素B抵抗EV71的半数抑制浓度为0.32μM(图7)。
2.4两性霉素B的细胞毒性实验
取已经生长成单层RD细胞的96孔培养板，分别加入0、2、3、4、5、6、8、16μM的两性霉素B，293细胞分别加入0、2、3、4、5、6、8、10、16μM的两性霉素B，在37℃，5％CO2培养箱中培养，每一药物浓度均重复3孔，同时设DMSO处理的细胞对照组，继续培养24h后参照Promega公司CellTiter-Glo发光法细胞活力检测试剂盒说明书检测细胞活性，在GloMAX化学发光检测仪上检测荧光值A，细胞存活率(％)＝(A药物组/A对照组)×100％，用统计软件SPSSl1.5的Probit回归法计算药物半数中毒浓度(TC50)。两性霉素B低于3μM处理时细胞活率并没有显著下降，对于RD细胞，其TC50为7.65μM(图8)，对于293细胞，其TC50为14.6μM(图9)。
通过药物毒性试验、药物对病毒的抑制试验、病毒斑块形成试验，本发明发现两性霉素B可明显抑制EV71病毒在RD细胞和293细胞中的感染，进一步发现两性霉素B是通过影响EV71病毒的吸附起到抵抗该病毒感染的作用。本发明为肠道病毒71的预防和治疗提供了新的药物，具有较好的市场价值和临床应用前景。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (1)
1.仅以两性霉素B为有效成分的原料在制备抑制或治疗肠道病毒71药物中的应用。
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