CN101450045A - 一种含两性霉素b的冷冻干燥制剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种含两性霉素B的稳定的冷冻干燥制剂，其中包含两性霉素B、油性载体、表面活性剂和冻干支持剂，对平均粒径小于1000nm的脂肪乳剂进行冷冻干燥，再溶解后的粒度小于2000nm，其液性的pH值在4－7的范围内。

Description

一种含两性霉素B的冷冻干燥制剂

技术领域

本发明涉及一种含两性霉素B的稳定的冷冻干燥制剂，其包含：两性霉素B、油性载体、表面活性剂和冻干支持剂，平均粒径小于1000nm的脂肪乳剂进行冷冻干燥，再溶解后的粒度小于2000nm，其液性的PH值在4—7的范围内。

背景技术

两性霉素B(Amphotericin B)又叫两性霉素乙；异性霉素，二性霉素，是由链霉菌产生一种多烯类光谱抗真菌抗生素，与真菌细胞膜上的固醇类特别是麦角固醇有高亲和力，在细胞膜上形成小分子通道，造成细胞内钾例子，核苷酸，氨基酸等小分子外漏，破坏细胞的正常代谢而起到抑菌作用。

两性霉素B可与敏感真菌细胞膜上的甾醇结合，损伤膜的通透性，导致细胞内重要物质如钾离子、核苷酸和氨基酸等外漏，从而破坏了细胞的正常代谢而抑制其生长。通常临床治疗所达到的药物浓度对真菌为抑菌作用，如药物浓度达到人体可耐受范围的高限时则对真菌起杀菌作用。适用于下列真菌感染的治疗：隐球菌病、北美芽生菌病、播散性念珠菌病、球孢子菌病、组织胞浆菌病，由毛霉菌、酒曲菌属、犁头霉菌属、内胞霉属和蛙粪霉属等所致的毛霉菌病，由申克孢子丝菌引起的孢子丝菌病，由烟曲菌所致的曲菌病等。由于两性霉素B的明显毒性，故本品主要用于诊断已确立的深部真菌感染(如获培养或组织学检查阳性则更佳)，且病情危重呈进行性发展者。对临床真菌感染征象不明显，仅皮肤或血清试验阳性的患者不宜选用.

市售的可溶性两性霉素B含45％两性霉素B，35％脱氧胆酸钠和20％磷酸氢钠，已经上市的产品中为可溶性两性霉素B与去氧胆酸加适量磷酸盐缓冲剂制成的无菌冻干粉针。检索到与本发明相关的专利申请号为：02155190.1发明名称：两性霉素B脂质体及制备方法，介绍了一种两性霉素B脂质体的制备方法，市售注射剂LD50约为为2.5mg/kg，该专利中LD50约为5.0mg/kg，我们研究对比发现，用本发明制备的两性霉素B冻干乳剂，LD50约为11.0mg/kg，具有更好的安全性，非常具有开发价值。

两性霉素B已经成为临床深度真菌感染危重病人不可缺少的治疗药物，增效减毒是制剂研究的要点。

发明内容

本发明含两性霉素B的稳定的冷冻干燥制剂，其包含两性霉素B、油性载体、表面活性剂和冻干支持剂，其中两性霉素B的用量以重量计为0.01％-1.0％。

本发明含两性霉素B的稳定的冷冻干燥制剂，其中油性载体可以是任何种类的植物油、动物油、化学改性制造油的一种或其混合物，植物油选自豆油、亚麻子油、茶油、红花油、棉子油、玉米油、月见草油、花生油、蓖麻油，动物油选自鱼油、鲱油、鲑鱼油或金枪鱼油，化学改性制造的油选自中链甘油三酯、甘油单酯、甘油二酯、油酸乙酯、棕榈酸异丙酯、聚氧基氢化蓖麻油、长链或中链脂肪酸或脂肪酸醇；该油性载体中还可以包括脂肪酸甘油酯、脂肪酸/醇、脂肪酸乙酯、甾醇及其衍生物、聚氧乙烯脂肪酸酯中的一种或几种，比如油酸、亚油酸、硬脂酸单甘油酯、油酸乙酯、亚油酸乙酯中的一种或几种；聚乙二醇及其衍生物系列，如聚乙二醇2000—磷脂酰乙醇胺(PEG2000-DSPE)、聚乙二醇1000—磷脂酰胆碱、solutolHS15以及聚乙二醇琥珀酸酯中的一种或几种；甾醇及其衍生物，其中包含胆甾醇、胆酸、去氧胆酸、胆甾醇油酸酯、胆甾醇硬脂酸酯、胆甾醇壬酸酯、胆甾醇棕榈酸酯和胆甾醇丁二醇聚乙二醇醚(其中聚乙二醇分子量为200、300、400和600)中的一种或几种；油性载体中还可以包含抗氧化剂如α-生育酚及其衍生物(比如α-生育酚琥珀酸酯)、抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基茴香醚(BHA)、二丁基羟基甲苯(BHT)中的一种或几种；所述油性载体的用量以重量计为0.1％-30％。

本发明含两性霉素B的稳定的冷冻干燥制剂，其中表面活性剂是指磷脂、吐温、泊洛沙姆(poloxamer)中的一种或几种，其中磷脂包括：磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝胺酸和鞘磷脂等，来源不同分为大豆磷脂和蛋黄卵磷脂，优选蛋黄磷脂，吐温优选吐温80，泊洛沙姆优选泊洛沙姆188；所述表面活性剂的用量以重量计为0.1％-10％。

本发明含两性霉素B的稳定的冷冻干燥制剂，其中冻干支持剂选自单糖、二糖、多糖或糖醇中的一种或两钟以上，所述冻干支持剂的用量以重量计为1％-40％，具体包括麦芽糖、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、右旋糖苷中的一种或几种的混合物，更优选糖类。

本发明含两性霉素B的稳定的冷冻干燥制剂，还可以含有EDTA、三胺五乙酸和亚硫酸盐等，还可以含有PH调节剂，如盐酸、磷酸、氢氧化钠、乳酸和柠檬酸中的一种。。

本发明含两性霉素B的稳定的冷冻干燥制剂，是对包含两性霉素B、油性组分、乳化剂、冻干支持剂的平均粒径小于1000nm的脂肪乳剂进行冷冻干燥，再溶解后的粒度小于2000nm，其液性的PH值在4—7的范围内，其中两性霉素B是通过与油性载体充分研磨而被惨入油中的，两性霉素B和油性载体在水中形成稳定的分散相；其中分散相的平均粒径≤1um。

本发明的两性霉素B冻干乳剂，其制备方法如下：

a)将两性霉素B加入油相载体，充分研磨制成油相，其余组分溶于适量水中，于50～90℃高速搅拌制成水相，油水两相混合于50～90℃高速搅拌制成初乳剂，调节PH值5.0～7.0。

b)取上述(a)中初乳剂，注射用水定容至处方量，转移至高压乳匀机中，反复乳化至乳滴平均粒径≤1微米。

C)取上述(b)的乳剂除菌过滤后分装，冷冻干燥后充氮气压盖既得。

冻干条件如下：于零下40—50℃预冻3—6h，升温至零下30—零下10℃，真空减压除去大部分水分，再升温至0℃，继续真空减压除去水分，继续升温除去水分，得干燥的冻干乳剂。

具体实施例

实施例一

两性霉素B0.01％～1.0％、甾醇0.01％～2.0％、去氧胆酸钠0.01％～10.0％、生育酚0.1％～1.0％、磷脂1.0％～6.0％、植物油1％～10％、油酸1.0％～6.0％，蔗糖20％—40％，注射用水添至100ml。

称取两性霉素B25mg、加入生育酚1.0g、胆甾醇0.5g、10g精制植物油(豆油、亚麻子油、茶油、红花油、棉子油、玉米油、月见草油、花生油、蓖麻油中的一种)、0.3g油酸，充分研磨制成油相；称取蛋黄卵磷脂2.0g、去氧胆酸钠2.0g、蔗糖20g，加入处方量的水于50℃～80℃高速搅拌使充分分散，制成水相。油水两相混合，于50℃～80℃高速搅拌制成初乳剂。取初乳剂，注射用水定容至处方量，调节PH值为5.0～7.0，转移至高压乳匀机中，反复乳化至乳滴平均粒径≤1微米，除菌过滤，灌装，低温冷冻干燥既得。

实施例二

两性霉素B0.01％～1.0％、抗坏血酸棕榈酸酯0.01％～1.0％、α-生育酚琥珀酸酯0.01％～1.0％、胆酸钠1～10％、胆甾醇壬酸酯0.05％～0.5％、磷脂1.0％～6.0％、中链油3％～20％、油酸0.1％～5.0％、麦芽糖10％—20％、蔗糖10％—20％，注射用水添至100ml。

称取两性霉素B50mg、加入抗坏血酸棕榈酸酯0.2g、α-生育酚琥珀酸酯0.5g、胆甾醇壬酸酯0.2g、加入5g中链油和0.3g油酸充分研磨制成油相；称取大豆卵磷脂2.0g、胆酸钠2g、麦芽糖10g、蔗糖10g，加入处方量的水于50℃～80℃高速搅拌使充分分散，制成水相。油水两相混合，于50℃～80℃高速搅拌制成初乳剂，取初乳剂，注射用水定容至处方量，调节PH值为5.0～7.0，转移至高压乳匀机中，反复乳化至乳滴平均粒径≤1微米，除菌过滤，灌装，低温冷冻干燥既得。

实施例三

两性霉素B0.01％～1.0％、胆甾醇丁二醇聚乙二醇醚(PEG400-丁二醇-胆甾醇)0.1％～5.0％、PEG2000-DSPE0.1％～5.0％、α-生育酚0.01％～1.0％、磷脂1.0％～6.0％、中链油1％～20％、油酸1.0％～6.0％、蔗糖10％—20％、乳糖5％—10％，注射用水添至100ml。

称取两性霉素B100mg加入生育酚0.5g和PEG400-丁二醇-胆甾醇0.5g、加入6g中链油、0.1-0.3g油酸，充研磨溶解制成油相；称取蛋黄卵磷脂2.0g、PEG2000-DSPE0.1g、蔗糖20g，加入处方量的水于50℃～80℃高速搅拌使充分分散，制成水相。油水两相混合，于50℃～80℃高速搅拌制成初乳剂。取初乳剂，注射用水定容至处方量，调节PH值为5.0～7.0，转移至高压乳匀机中，反复乳化至乳滴平均粒径≤1微米，除菌过滤，灌装，低温冷冻干燥既得。

实施例四(血管刺激性试验)

试验药物：本发明两性霉素B冻干乳剂，北京金方华医药科技有限公司提供，两性霉素B注射液组，自制，试验时用0.9％氯化钠注射液配制成5％溶液。

试验动物：健康家兔，体重2.1～2.3kg。

试验方法：取健康家兔6只，雌雄各半，按体重及性别分为0.9％氯化钠注射液对照组和两性霉素B剂组以及两性霉素B注射液对照药组，每组2只。两性霉素B冻干乳剂组和两性霉素B注射液组于家兔左耳耳缘按临床给药浓度静脉滴注10ml/kg，滴注速度1ml/分，每日1次，连续7日。对照组同法静脉滴注0.9％氯化钠注射液。除每次给药时及给药后观察给药局部表现外，于末次静脉滴注后剪下药侧耳廓，常规固定后，在距静脉滴注入针近心端1cm处，每隔1cm切取0.5cm宽标本，共取3块标本。切片染色，进行镜下病理观察，结果见下表：

表1：血管刺激性试验

 

项目	兔耳廓血管扩张	红肿	有无炎细胞浸润
				0.9％氯化钠注射液对照组	-	-	-
两性霉素B注射液	++	++	+
				两性霉素B冻干乳剂(实施例1)	-	-	-
两性霉素B冻干乳剂(实施例2)	-	-	-
				两性霉素B冻干乳剂(实施例3)	-	-	-

备注：“++”严重、“+”少许、“-”无

实施例五(冻干前后粒径的变化)

表2：乳剂冻干前后粒径(平均粒径)变化

 

	实施例1	实施例2	实施例3
				冻干前(nm)	200.2	181.3	193.3
冻干后(nm)	280.5	235.6	250.1

结果表明，乳剂冻干前后粒径无显著变化。

实施例六(小鼠急性毒性试验)

取清洁级小鼠40只，分成四组，尾静脉注射，观察动物发应情况，连续观察七天，记录动物毒性发应情况和死亡动物分布，计算出LD50值，统计结果如下：

表3：小鼠尾静脉注射LD50值

 

	实施例1	实施例2	实施例3	市售产品
					LD50值	9.78mg/kg	10.28mg/kg	12.32mg/kg	2.45mg/kg

结果表明：本发明两性霉素B冻干乳剂毒性较上市产品分别提高了4—6倍，具有市场开发价值。

Claims (9)

1、一种含两性霉素B的稳定的冷冻干燥制剂，其特征在于包含：两性霉素B、油性载体、表面活性剂和冻干支持剂，两性霉素B的用量以重量计为0.01％-1.0％。

2、根据权利要求1中的冷冻干燥制剂，其中油性载体可以是任何种类的植物油、动物油、化学改性制造油的一种或其混合物，其中植物油选自豆油、亚麻子油、茶油、红花油、棉子油、玉米油、月见草油、花生油、蓖麻油，动物油选自鱼油、鲱油、鲑鱼油或金枪鱼油，化学改性制造的油选自中链甘油三酯、甘油单酯、甘油二酯、油酸乙酯、棕榈酸异丙酯、聚氧基氢化蓖麻油、长链或中链脂肪酸或脂肪酸醇；该油性载体中还可以包括脂肪酸甘油酯、脂肪酸/醇、脂肪酸乙酯、甾醇及其衍生物、聚氧乙烯脂肪酸酯中的一种或几种，比如油酸、亚油酸、硬脂酸单甘油酯、油酸乙酯、亚油酸乙酯中的一种或几种；聚乙二醇及其衍生物系列，如聚乙二醇2000—磷脂酰乙醇胺(PEG2000-DSPE)、聚乙二醇1000—磷脂酰胆碱以及聚乙二醇琥珀酸酯中的一种或几种；甾醇及其衍生物，其中包含胆甾醇、胆酸钠、去氧胆酸钠、胆甾醇油酸酯、胆甾醇硬脂酸酯、胆甾醇壬酸酯和胆甾醇丁二醇聚乙二醇醚(PEG-丁二醇-胆甾醇)中的一种或几种，其中PEG分子量可以是200、300、400、600，所述油性载体的用量以重量计为0.1％-20％。

3、据权利要求1—2中的油性载体，其特征在于进一步包含抗氧化剂α-生育酚及其衍生物(如：α—生育酚琥珀酸酯)、抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基茴香醚(BHA)、二丁基羟基甲苯(BHT)中的一种或几种。

4、根据权利要求1中的表面活性剂，其特征在于包括指磷脂、吐温、司盘、泊洛沙姆(poloxamer)、solutolHS15中的一种或几种，其中磷脂包括磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝胺酸、鞘磷脂等，来源不同分为大豆磷脂和蛋黄卵磷脂，优选蛋黄磷脂，吐温优选吐温80，泊洛沙姆优选泊洛沙姆188；所述表面活性剂的用量以重量计为1％-60％。

5、根据权利要求1中的冻干支持剂，其特征在于选自单糖、二糖、多糖或糖醇中的一种或两钟以上，具体包括麦芽糖、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇和右旋糖苷中的一种或几种的混合物，更优选二糖类，所述冻干支持剂的用量以重量计为1％-40％。

6、据权利要求1—5的冻干支持剂，其特征在于还可以含有EDTA、三胺五乙酸和亚硫酸盐等，还可以含有PH值调节剂如：盐酸、磷酸、氢氧化钠、乳酸和柠檬酸中的一种。

7、根据权利要求1—6中的两性霉素B冷冻干燥制剂，其特征在于对包含两性霉素B、油性组分、乳化剂、冻干支持剂的平均粒径小于1000nm的脂肪乳剂进行冷冻干燥，再溶解后的粒度小于2000nm，其液性的PH值在4—7的范围内。

8、根据权利要求1中的冷冻干燥制剂，其中两性霉素B通过研磨溶解在油性载体中，两性霉素B和油性载体在水中形成稳定的分散相；其中分散相的平均粒径≤1um。

9、根据权利要求1-8中的冷冻干燥制剂本发明的两性霉素B冻干乳剂，其制备方法如下：

a)将两性霉素B加入油相载体，充分研磨制成油相，其余组分溶于适量水中，于50～90℃高速搅拌制成水相，油水两相混合于50～90℃高速搅拌制成初乳剂，调节PH值5.0～7.0。

b)取上述(a)中初乳剂，注射用水定容至处方量，转移至高压乳匀机中，反复乳化至乳滴平均粒径≤1微米。

C)取上述(b)的乳剂除菌过滤后分装，冷冻干燥后充氮气压盖既得。