CN101450039A - 一种含两性霉素b的长效制剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种包含微油滴于水性介质中的水包油乳液，其中所述微油滴中包含大量两性霉素B药理活性物质，所述微油滴通过“胆甾醇通过小分子物以醚键接枝的聚乙二醇醚”(PEG－(CH₂)n－胆甾醇)将两性霉素B稳定在油滴中，可以制成稳定的乳液和冻干乳剂，制成的乳剂与上市产品相比具有明显的缓释效果。

Description

一种含两性霉素B的长效制剂

技术领域

本发明涉及一种含胆甾醇通过小分子物以醚键接枝的聚乙二醇醚(简称PGC)的两性霉素B的稳定的长效制剂。

背景技术

两性霉素B(Amphotericin B)又叫两性霉素乙；异性霉素，二性霉素，是由链霉菌产生一种多烯类光谱抗真菌抗生素，与真菌细胞膜上的固醇类特别是麦角固醇有高亲和力，在细胞膜上形成小分子通道，造成细胞内钾例子，核苷酸，氨基酸等小分子外漏，破坏细胞的正常代谢而起到抑菌作用。

两性霉素B可与敏感真菌细胞膜上的甾醇结合，损伤膜的通透性，导致细胞内重要物质如钾离子、核苷酸和氨基酸等外漏，从而破坏了细胞的正常代谢而抑制其生长。通常临床治疗所达到的药物浓度对真菌为抑菌作用，如药物浓度达到人体可耐受范围的高限时则对真菌起杀菌作用。适用于下列真菌感染的治疗：隐球菌病、北美芽生菌病、播散性念珠菌病、球孢子菌病、组织胞浆菌病，由毛霉菌、酒曲菌属、犁头霉菌属、内胞霉属和蛙粪霉属等所致的毛霉菌病，由申克孢子丝菌引起的孢子丝菌病，由烟曲菌所致的曲菌病等。由于两性霉素B的明显毒性，故本品主要用于诊断已确立的深部真菌感染(如获培养或组织学检查阳性则更佳)，且病情危重呈进行性发展者。对临床真菌感染征象不明显，仅皮肤或血清试验阳性的患者不宜选用.

市售的可溶性两性霉素B含45％两性霉素B，35％脱氧胆酸钠和20％磷酸氢钠，已经上市的产品中为可溶性两性霉素B与去氧胆酸加适量磷酸盐缓冲剂制成的无菌冻干粉针。检索到与本发明相关的专利申请号为：02155190.1发明名称：两性霉素B脂质体及制备方法，介绍了一种两性霉素B脂质体的制备方法，市售注射剂LD50约为2.5mg/kg，该专利中LD50约为5.0mg/kg，我们研究对比发现，用本发明制备的两性霉素B长效制剂，LD50约为15.0mg/kg，分别是上市普通制剂的6倍，两性霉素B脂质体的3倍，具有更好的安全性，非常具有开发价值。

两性霉素B已经成为临床深度真菌感染危重病人不可缺少的治疗药物，增效减毒是制剂研究的要点。

发明内容

本发明一种包含微油滴于水性介质中的水包油乳液，其中所述微油滴中包含大量药理活性物质，所述微油滴通过胆甾醇通过小分子物以醚键接枝的聚乙二醇醚(PEG-(CH2)n-胆甾醇，其中n为整数，大小为2-10，以下简称PGC)将药理活性物质稳定在油滴中，碳链长度为2-10，小分二醇选自乙二醇、丙二醇、丁二醇、戊二醇、己二醇、庚二醇、辛二醇、任二醇、癸二醇中的一种，通过化学反应以醚键与胆甾醇和聚乙二醇相连，聚乙二醇选自分子量为200、300、400、600和1000中的一种，比如：PEG300-(CH₂)₂-胆甾醇、PEG300-(CH₂)₄-胆甾醇、PEG400-(CH₂)₄-胆甾醇、PEG600-(CH₂)₈-胆甾醇、PEG1000-(CH₂)₆-胆甾醇等，PEG-(CH₂)n-胆甾醇用量以重量计为0.01％-5％。；所述微滴的平均粒径不大于1微米，所述乳液可以通过过滤除菌；所述乳液中可以加入冻干支持剂制成冻干乳，冻干支持剂选自单糖、二糖、多糖或糖醇中的一种或两钟以上，具体包括麦芽糖、乳糖、蔗糖、葡萄糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇和右旋糖苷中的一种或几种的混合物，更优选二糖类，所述的用量以重量计为1％-40％。

本发明一种包含微油滴于水性介质中的水包油乳液，其中药理活性剂为两性霉素B，两性霉素B在乳液中的用量以重量计为0.01％-0.5％；乳液中包括至少一种可注射的油、表面活性剂和稳定剂，其中：

a)可注射的油，可以是任何种类的植物油、动物油、化学改性制造油的一种或其混合物，其中植物油选自豆油、亚麻子油、茶油、红花油、棉子油、玉米油、月见草油、花生油、蓖麻油，动物油选自鱼油、鲱油、鲑鱼油或金枪鱼油，化学改性制造的油选自中链甘油三酯、甘油单酯、甘油二酯、油酸乙酯、棕榈酸异丙酯、聚氧基氢化蓖麻油、长链或中链脂肪酸或脂肪酸醇中的一种或两种以上的混合物，可注射的油在乳液中的用量以重量计为1％-20％。

b)表面活性剂，选自磷脂及其聚乙二醇衍生物、吐温、司盘、泊洛沙姆(poloxamer)、solutolHS15中的一种或几种，其中磷脂包括磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝胺酸、鞘磷脂，磷脂聚乙二醇衍生物包括聚乙二醇2000—磷脂酰乙醇胺(PEG2000-DSPE)、聚乙二醇1000—磷脂酰胆碱，来源不同分为大豆磷脂和蛋黄卵磷脂，优选蛋黄磷脂，吐温优选吐温80，泊洛沙姆优选泊洛沙姆188；所述表面活性剂的用量以重量计为0.5％-10％。

c)稳定剂，选自甘油、油酸、亚油酸、胆酸钠、去氧胆酸钠、硬脂酸单甘油酯、油酸乙酯、亚油酸乙酯中的一种或几种，以重量计为0.1％-20％。

本发明一种包含微油滴于水性介质中的水包油乳液，进一步包含抗氧化剂α-生育酚及其衍生物(如：α—生育酚琥珀酸酯)、抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基茴香醚(BHA)、二丁基羟基甲苯(BHT)中的一种或几种；还可以含有EDTA、三胺五乙酸和亚硫酸盐中的一种，还可以含有PH值调节剂如：盐酸、磷酸、氢氧化钠、乳酸和柠檬酸中的一种。

本发明一种包含微油滴于水性介质中的水包油乳液，其中两性霉素B和PGC通过研磨溶解在油性组分中，两性霉素B和油性组分在水中形成稳定的分散相；其中分散相的平均粒径≤1um，其制备方法如下：

a)将两性霉素B和PGC加入油性组分，充分研磨制成油相，表面活性剂、稳定剂溶于适量水中，于50～90℃高速搅拌制成水相，油水两相混合于50～90℃高速搅拌制成初乳剂，调节PH值5.0～7.0。

b)取上述(a)中初乳剂，注射用水定容至处方量，转移至高压乳匀机中，反复乳化至乳滴平均粒径≤1微米。

C)取上述(b)的乳剂除菌过滤后分装，热压灭菌既得。

本发明冻干乳其制备方法如下：

a)将两性霉素B和PGC加入油性组分，充分研磨制成油相，表面活性剂、稳定剂、冻干支持剂溶于适量水中，于50～90℃高速搅拌制成水相，油水两相混合于50～90℃高速搅拌制成初乳剂，调节PH值5.0～7.0。

b)取上述(a)中初乳剂，注射用水定容至处方量，转移至高压乳匀机中，反复乳化至乳滴平均粒径≤1微米。

C)取上述(b)的乳剂除菌过滤后分装，冷冻干燥后充氮气压盖既得。

冻干条件如下：于零下40—50℃预冻3—6h，升温至零下30—零下10℃，真空减压除去大部分水分，再升温至0℃，继续真空减压除去水分，继续升温除去水分，得干燥的冻干乳剂。

本发明制备的乳剂可以用于静脉给药、肌肉给药或局部给药。

具体实施例

实施例一

两性霉素B0.01％～1.0％、PEG300-(CH₂)₄-胆甾醇0.01％～2.0％、生育酚0.1％～1.0％、磷脂1.0％～6.0％、泊洛沙姆1881.0％～6.0％、植物油1％～10％、油酸1.0％～6.0％，甘油2％—6％，注射用水添至100ml。

称取两性霉素B25mg、加入生育酚0.6g、PEG300-(CH₂)₄-胆甾醇0.2g、10g注射用大豆油、0.3g油酸，充分研磨制成油相；称取蛋黄卵磷脂1.0g、泊洛沙姆1882.0g、甘油3g，加入处方量的水于50℃～80℃高速搅拌使充分分散，制成水相。油水两相混合，于50℃～80℃高速搅拌制成初乳剂；取初乳剂，注射用水定容至处方量，调节PH值为5.0～7.0，转移至高压乳匀机中，反复乳化至乳滴平均粒径≤1微米，除菌过滤，充氮气灌装，灭菌既得。

注：整个生产过程需要充氮气保护。

实施例二

两性霉素B0.01％～1.0％、PEG400-(CH₂)₄-胆甾醇0.01％～2.0％、α-生育酚琥珀酸酯0.1％～1.0％、磷脂1.0％～6.0％、去胆酸钠0.1％～1.0％、植物油1％～10％、油酸1.0％～6.0％，麦芽糖10g、蔗糖10g，注射用水添至100ml。

称取两性霉素B200mg、PEGG600-(CH₂)₆-胆甾醇0.4g、α-生育酚琥珀酸酯0.6g、加入3g中链油、加入3g大豆油和0.3g油酸充分研磨制成油相；称取大豆卵磷脂2.0g、去胆酸钠0.2g、麦芽糖10g、蔗糖10g，加入处方量的水于50℃～80℃高速搅拌使充分分散，制成水相；油水两相混合，于50℃～80℃高速搅拌制成初乳剂，取初乳剂，注射用水定容至处方量，调节PH值为5.0～7.0，转移至高压乳匀机中，反复乳化至乳滴平均粒径≤1微米，除菌过滤，充氮气灌装，低温冷冻干燥既得。

注：整个生产过程需要充氮气保护。

实施例三

两性霉素B0.01％～1.0％、PEG300-(CH₂)₄-胆甾醇0.01％～2.0％、PEG2000-DSPE0.01％～1.0％、生育酚0.1％～1.0％、磷脂1.0％～6.0％、泊洛沙姆1881.0％～6.0％、植物油1％～10％、中油酸1.0％～6.0％，甘油2％—6％，注射用水添至100ml。

称取两性霉素B100mg、加入生育酚0.6g、PEG300-(CH₂)₄-胆甾醇0.2g、注射用大豆油3g、中链油3g、0.3g油酸，充分研磨制成油相；称取蛋黄卵磷脂1.2g、泊洛沙姆1882.4g、PEG2000-DSPE0.1g、甘油3.6g，加入处方量的水于50℃～80℃高速搅拌使充分分散，制成水相；油水两相混合，于50℃～80℃高速搅拌制成初乳剂；取初乳剂，注射用水定容至处方量，调节PH值为5.0～7.0，转移至高压乳匀机中，反复乳化至乳滴平均粒径≤1微米，除菌过滤，充氮气灌装，灭菌既得。

注：整个生产过程需要充氮气保护。

实施例四(血管刺激性试验)

试验药物：本发明两性霉素B乳剂，北京金方华医药科技有限公司提供，两性霉素B注射液组，自制，试验时用0.9％氯化钠注射液配制成5％溶液。

试验动物：健康家兔，体重2.1～2.3kg。

试验方法：取健康家兔10只，雌雄各半，按体重及性别分为0.9％氯化钠注射液对照组和两性霉素B剂组以及两性霉素B注射液对照药组，每组2只，两性霉素B乳剂组和两性霉素B注射液组于家兔左耳耳缘按临床给药浓度静脉滴注10ml/kg，滴注速度1ml/分，每日1次，连续7日。对照组同法静脉滴注0.9％氯化钠注射液。除每次给药时及给药后观察给药局部表现外，于末次静脉滴注后剪下药侧耳廓，常规固定后，在距静脉滴注入针近心端1cm处，每隔1cm切取0.5cm宽标本，共取3块标本。切片染色，进行镜下病理观察，结果见下表：

表1：血管刺激性试验

 

项目	兔耳廓血管扩张	红肿	有无炎细胞浸润
				0.9％氯化钠注射液对照组	-	-	-
两性霉素B注射液	++	++	+
				两性霉素B乳剂(实施例1)	-	-	-
两性霉素B冻干乳剂(实施例2)	-	-	-
				两性霉素B乳剂(实施例3)	-	-	-

备注：“++”严重、“+”少许、“-”无

前后粒径无显著变化。

实施例五(小鼠急性毒性试验)

取清洁级小鼠40只，分成四组，尾静脉注射，观察动物发应情况，连续观察七天，记录动物毒性发应情况和死亡动物分布，计算出LD50值，统计结果如下：

表3：小鼠尾静脉注射LD50值

 

	实施例1	实施例2	实施例3	市售产品
					LD50值	15.20mg/kg	15.20mg/kg	17.00mg/kg	2.45mg/kg

结果表明：本发明两性霉素B冻干乳剂毒性较上市产品分别提高了5—7倍，具有市场开发价值。

实施例六(家兔药动力学比较)

试验药物：本发明两性霉素B乳剂(按实施例三制备)，两性霉素B注射液组，市售制剂，试验时用0.9％氯化钠注射液配制成5％溶液。

试验动物：健康家兔，体重2.1～2.3kg。

试验方法：将6只家兔禁食过夜后，随机分为两组，分别交叉从耳缘静脉注射两性霉素B或市售制剂，给药剂量为1mg/kg。于给药后即刻0.25、0.5、1、2、3、5、8、12、16、24h、36h从耳缘静脉采取血样2～3ml，置肝素抗凝管中，3000r/min离心10min后分离血浆，按“血浆样品的处理与测定”处理分析。

试验结果：由血药浓度的数据可知：在0～36h范围内，两性霉素B乳剂的血药浓度均高于相应时间市售制剂的血药浓度。两性霉素B乳剂给药后体内血药浓度峰值Cmax为8.517mg/l，在给药后3h降至4.262mg/l，然后缓慢地下降，在给药后24h内，两性霉素B乳剂的平均血药浓度在8.517～1.221mg/l范围内，在给药后24-36h内，两性霉素B乳剂的平均血药浓度在1.221～0.251mg/l范围内，而市售制剂给药后，24h内的浓度在2.558～0.009mg/l范围内，只有在0～12h内，血药浓度为2.408～0.290mg/l才能高于有效抑菌浓度(0.250mg/l)，可见两性霉素B乳剂体在体内的抗菌作用要比市售制剂持久，其抗菌疗效也会更优于市售注射剂。

Claims (9)

1、一种包含微油滴于水性介质中的水包油乳液，其中所述微油滴中包含大量药理活性物质，所述微油滴通过胆甾醇通过小分子物以醚键接枝的聚乙二醇醚(PEG-(CH₂)n-胆甾醇，其中n为整数，大小为2-10)将药理活性物质稳定在油滴中，碳链长度为2-10，小分二醇选自乙二醇、丙二醇、丁二醇、戊二醇、己二醇、庚二醇、辛二醇、任二醇、癸二醇中的一种，通过化学反应以醚键与胆甾醇和聚乙二醇相连，聚乙二醇选自分子量为200、300、400、600和1000中的一种，PEG-(CH₂)n-胆甾醇用量以重量计为0.01％-5％。

2、根据权利要求1中的乳液，所述乳液中可以加入冻干支持剂制成冻干乳，冻干支持剂选自单糖、二糖、多糖或糖醇中的一种或两钟以上，具体包括麦芽糖、乳糖、蔗糖、葡萄糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇和右旋糖苷中的一种或几种的混合物，更优选二糖类，所述的用量以重量计为1％-40％。

3、根据权利要求1-3中的乳液，其中药理活性剂为两性霉素B，两性霉素B在乳液中的用量以重量计为0.01％-0.5％。

4、根据权利要求1-4中的乳液，其中包括至少一种可注射的油、表面活性剂和稳定剂，其中：

a)可注射的油，可以是任何种类的植物油、动物油、化学改性制造油的一种或其混合物，其中植物油选自豆油、亚麻子油、茶油、红花油、棉子油、玉米油、月见草油、花生油、蓖麻油，动物油选自鱼油、鲱油、鲑鱼油或金枪鱼油，化学改性制造的油选自中链甘油三酯、甘油单酯、甘油二酯、油酸乙酯、棕榈酸异丙酯、聚氧基氢化蓖麻油、长链或中链脂肪酸或脂肪酸醇中的一种或两种以上的混合物，可注射的油在乳液中的用量以重量计为1％-20％。

b)表面活性剂，选自磷脂及其聚乙二醇衍生物、吐温、司盘、泊洛沙姆(poloxamer)、solutolHS15中的一种或几种，其中磷脂包括磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝胺酸、鞘磷脂，磷脂聚乙二醇衍生物包括聚乙二醇2000—磷脂酰乙醇胺(PEG2000-DSPE)、聚乙二醇1000—磷脂酰胆碱，来源不同分为大豆磷脂和蛋黄卵磷脂，优选蛋黄磷脂，吐温优选吐温80，泊洛沙姆优选泊洛沙姆188；所述表面活性剂的用量以重量计为0.5％-10％。

c)稳定剂，选自甘油、油酸、亚油酸、胆酸钠、去氧胆酸钠、硬脂酸单甘油酯、油酸乙酯、亚油酸乙酯中的一种或几种，以重量计为0.1％-20％。

5、据权利要求1—2中的乳液，其特征在于进一步包含抗氧化剂α-生育酚及其衍生物(如：α—生育酚琥珀酸酯)、抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基茴香醚(BHA)、二丁基羟基甲苯(BHT)中的一种或几种。

6、根据权利要求1—2中的乳液其特征在于还可以含有EDTA、三胺五乙酸和亚硫酸盐中的一种，还可以含有PH值调节剂如：盐酸、磷酸、氢氧化钠、乳酸和柠檬酸中的一种。

7、根据权利要求1中的乳液，其中两性霉素B通过研磨溶解在油性载体中，两性霉素B和油性载体在水中形成稳定的分散相；其中分散相的平均粒径≤1um。

8、根据权利要求1-8中的乳液，其制备方法如下：

a)将两性霉素B和PEG-(CH2)n-胆甾醇加入油性组分，充分研磨制成油相，表面活性剂、稳定剂溶于适量水中，于50～90℃高速搅拌制成水相，油水两相混合于50～90℃高速搅拌制成初乳剂，调节PH值5.0～7.0。

b)取上述(a)中初乳剂，注射用水定容至处方量，转移至高压乳匀机中，反复乳化至乳滴平均粒径≤1微米。

C)取上述(b)的乳剂除菌过滤后分装，热压灭菌既得。

9、根据权利要求1-8中的冻干乳，其制备方法如下：

a)将两性霉素B和PEG-(CH₂)n-胆甾醇加入油性组分，充分研磨制成油相，表面活性剂、稳定剂、冻干支持剂溶于适量水中，于50～90℃高速搅拌制成水相，油水两相混合于50～90℃高速搅拌制成初乳剂，调节PH值5.0～7.0。

b)取上述(a)中初乳剂，注射用水定容至处方量，转移至高压乳匀机中，反复乳化至乳滴平均粒径≤1微米。

C)取上述(b)的乳剂除菌过滤后分装，冷冻干燥后充氮气压盖既得。