CN105193715B - 一种蛮龙液的制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种蛮龙液的制备方法，由雄蚕蛾25g、刺五加25g、酒制菟丝子17.5g、淫羊藿20g、盐制熟地黄10g、盐制补骨脂10g作为原料药制成，采用微波萃取制备而成，使得含量有很大提高，服用量减少，本发明还提供了蛮龙液在制备抑制小鼠黑色素瘤B16细胞增殖药物和治疗或预防登革病毒感染药物中的应用。
Description
技术领域
本发明涉及中药制剂技术领域，具体涉及一种蛮龙液的制备方法及应用。
背景技术
蛮龙液记载于部颁标准，处方为雄蚕蛾25g、刺五加25g、酒制菟丝子17.5g、淫羊藿20g、盐制熟地黄10g、盐制补骨脂10g，以上六味，取雄蚕蛾加白酒适量，浸泡30天，浸液减压回收乙醇，制成流浸膏；其余刺五加等五味，加70％乙醇提取二次，第一次4小时，第二次2小时，合并提取液，滤过，滤液回收乙醇至适量，加乙醇使含醇量为70％，静置24小时，滤过，沉淀用适量60％乙醇洗涤，洗液与滤液合并，回收乙醇至无醇味，加蔗糖适量，使溶解，与雄蚕蛾浸膏混合，加白酒及适量水调整总量至1000ml，混匀，即得。现有技术中，尚未有蛮龙液在提取制备方面采用微波技术的报道，而采用乙醇回流等方法，工艺粗糙、落后，杂质多，导致患者用量过大，不方便服用，严重影响了本品在临床上应用。
发明内容
发明目的：为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种蛮龙液的制备方法。
本发明的另一个目的在于提供一种蛮龙液在制备抑制小鼠黑色素瘤B16细胞增殖药物和治疗或预防登革病毒感染药物中的应用。
技术方案：本发明的目的是通过如下的方案实现的：
一种蛮龙液的制备方法，由雄蚕蛾25g、刺五加25g、酒制菟丝子17.5g、淫羊藿20g、盐制熟地黄10g、盐制补骨脂10g作为原料药制成，所述的方法由下列步骤组成：取雄蚕蛾25g、刺五加25g、酒制菟丝子17.5g、淫羊藿20g、盐制熟地黄10g、盐制补骨脂10g，粉碎，加入2L的70％乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率400-600W，萃取2次，每次4-8分钟，合并萃取液，浓缩，加到D101大孔吸附树脂柱上，50％乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩，加蔗糖、白酒及适量水调整总量至800ml，混匀，即得。
所述蛮龙液的制备方法，所述微波萃取功率500W，每次萃取6分钟。
所述蛮龙液在制备抑制小鼠黑色素瘤B16细胞增殖药物中的应用，其特征在于蛮龙液由雄蚕蛾25g、刺五加25g、酒制菟丝子17.5g、淫羊藿20g、盐制熟地黄10g、盐制补骨脂10g作为原料药制成，制备方法由下列步骤组成：取雄蚕蛾25g、刺五加25g、 酒制菟丝子17.5g、淫羊藿20g、盐制熟地黄10g、盐制补骨脂10g，粉碎，加入2L的70％乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率400-600W，萃取2次，每次4-8分钟，合并萃取液，浓缩，加到D101大孔吸附树脂柱上，50％乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩，加蔗糖、白酒及适量水调整总量至800ml，混匀，即得。
所述蛮龙液在制备抑制小鼠黑色素瘤B16细胞增殖药物中的应用，所述微波萃取功率500W，每次萃取6分钟。
所述蛮龙液在制备治疗或预防登革病毒感染药物中的应用，蛮龙液由雄蚕蛾25g、刺五加25g、酒制菟丝子17.5g、淫羊藿20g、盐制熟地黄10g、盐制补骨脂10g作为原料药制成，制备方法由下列步骤组成：取雄蚕蛾25g、刺五加25g、酒制菟丝子17.5g、淫羊藿20g、盐制熟地黄10g、盐制补骨脂10g，粉碎，加入2L的70％乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率400-600W，萃取2次，每次4-8分钟，合并萃取液，浓缩，加到D101大孔吸附树脂柱上，50％乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩，加蔗糖、白酒及适量水调整总量至800ml，混匀，即得。
所述蛮龙液在制备治疗或预防登革病毒感染药物中的应用，所述微波萃取功率500W，每次萃取6分钟。
上述中药均符合药典标准或者记载在《中药大辞典》中。
现有技术中，原蛮龙液，口服，一次30～40毫升，一日2次，采用本发明制备成的蛮龙液单位体积的蛮龙液中药材量增加，因此每次仅需20ml，一日服用3次，在具有更多活性成分的条件下大大减少了服用量。
具体实施方式
以下通过实施例形式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
实施例1：取雄蚕蛾25g、刺五加25g、酒制菟丝子17.5g、淫羊藿20g、盐制熟地黄10g、盐制补骨脂10g，粉碎，加入2L的70％乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率400W，萃取2次，每次4分钟，合并萃取液，浓缩，加到D101大孔吸附树脂柱上，50％乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩，加蔗糖5g、白酒500ml及适量水调整总量至800ml，混匀，即得。
实施例2：取雄蚕蛾25g、刺五加25g、酒制菟丝子17.5g、淫羊藿20g、盐制熟地黄10g、盐制补骨脂10g，粉碎，加入2L的70％乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率500W，萃取2次，每次6分钟，合并萃取液，浓缩，加到D101大孔吸附树脂柱上，50％乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩，加蔗糖5g、白酒500ml及适量水调整总量至800ml，混匀，即得。
实施例3：取雄蚕蛾25g、刺五加25g、酒制菟丝子17.5g、淫羊藿20g、盐制熟地黄10g、盐制补骨脂10g，粉碎，加入2L的70％乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率600W，萃取2次，每次8分钟，合并萃取液，浓缩，加到D101大孔吸附树脂柱上，50％乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩，加蔗糖5g、白酒500ml及适量水调整总量至800ml，混匀，即得。
实施例4：蛮龙液抑制小鼠黑色素瘤B16细胞增殖的实验研究资料
1实验材料
1.1实验用细胞株
小鼠黑色素瘤B16细胞，南京医科大学实验室细胞库，DMEM+10％FBS常规培养。
1.2实验药物
研究药物：本发明蛮龙液：按实施例3方法制备。
药液储液：取5ml蛮龙液，0.2μm滤器过滤，500μl doff管分装，-20℃存储，同时0.2μm滤器过滤无水乙醇以备对照组之用。按卫生部方法制备市售蛮龙液的对照组样品。
1.3实验试剂
DMEM(GIBCO公司Cat.No.12100-061Lot.No.758137)；胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司Lot.No.100419)；NaHCO3(上海久亿化学试剂有限公司Cat.No.11810-033Lot.No.1088387)；Trypsin(AMRESCO公司批号：2010/04)；EDTA(AMRESCO公司批号：2009/10)；Penicillin G Sodium Salt(AMRESCO公司批号：2010242)；StreptomycinSulfate(AMRESCO公司批号：2010382)；无水乙醇(南京化学试剂有限公司批号：080310182)；MTT(Biosharp批号：0793)；PBS(实验室自配)；
1.4实验器材
莱卡倒置显微镜(德国Leica型号：DM1L)；可见-紫外光微孔板检测仪(美国MD公司型号：SPECTRAMAX 190)；CO2培养箱(FORMA型号：3111)；超净台(苏净 集团安泰公司制造型号：SW-CJ-ZFD)；纯水仪(美国Spring公司型号：S/N 020579)；精密移液器(法国吉尔森公司型号：P2)；电子天平(德国赛多利斯有限公司型号：BT323S)；全自动高压灭菌锅(日本SANYO公司型号：MLS-3020)；台式电热鼓风干燥箱(上海精密实验设备公司型号：DHG9123A)；冰箱(西门子公司型号：KG18V21TI)；液氮罐(CBS型号：2001)；低速离心机(上海安亭科学仪器厂型号：KA-1000)；0.2μm滤器(MILLIPORE型号：SLGP033RB)；10cm培养皿(NEST公司)、96孔培养板(NEST公司)；细胞计数板；离心管、移液管、Tips若干。
2实验方法
1)小鼠黑色素瘤B16细胞用DMEM+10％FBS于37℃、5％CO2进行常规培养(10cm培养皿)，当细胞生长至对数期时，收集细胞，弃去培养液，PBS轻洗3遍，加入3ml0.25％胰蛋白酶-0.04％EDTA，37℃消化2min后，向其中加入5ml完全培养基中和反应，吹打细胞后将其转入离心管中，1000rpm离心5min，调整细胞悬液浓度3×104个/ml。
2)将细胞种入96孔培养板中，每孔加入细胞悬液180μl，培养板放入细胞培养箱中(37℃，5％CO2)常规培养。
3)根据细胞生长情况，一般长至50％-70％，加入蛮龙液溶液或苍耳子的对照组样品，继续培养24h。
4)24h后加入20μl MTT溶液(5mg/ml，即0.5％MTT)，继续培养4h。
5)4h后扣板法倒去上清，用吸水纸轻轻拍干，每孔加入200μl二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的吸光值。
6)同时设置本底(不加细胞，只加培养液)，对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)，每组设定6个复孔。
7)结果以药物对细胞的抑制率表示：
细胞增值抑制率(％)＝(对照孔OD值-给药孔OD值)/对照孔OD值×100％。实验重复3次。
3统计处理
采用Microsoft Excel 2003软件中的相关分析和Student t检验，数据以mean±S.D.表示。
4实验结果
MTT法实验后统计结果显示，与对照组比较，当剂量达到5mg/ml时，对SF295细胞增殖抑制有差异(P<0.05)，剂量在10mg/ml时该差异具有显著性(P<0.01)，当剂量达到15-20mg/ml时有极显著性差异(P<0.001)。
表1蛮龙液对小鼠黑色素瘤B16细胞增殖抑制影响研究
注：与对照组比较，*P<0.01；**P<0.001，与苍耳子组比较，#P<0.01；##P<0.001
5实验结论
蛮龙液可以抑制小鼠黑色素瘤B16细胞增殖，减少小鼠黑色素瘤B16细胞的细胞生长数目，该作用呈剂量依赖性，而且与市售蛮龙液相比也有显著性差异。
实施例4：本发明蛮龙液治疗或预防登革病毒感染的研究
A.本发明对Vero细胞的毒性实验：
Vero细胞(非洲绿猴肾细胞)是DENV的易感细胞。实验中的Vero细胞购买于中国科学院上海生科院细胞资料中心；MTT试剂盒购于碧云天生物技术研究所；胎牛血清(FetalBovine Serum，FBS)购买于美国GIBCO公司；细胞培养板购买于德国Greinerbioone公司；DMEM培养基和MEM培养基购买于美国GIBCO公司。
实验步骤如下：
1：接种Vero细胞：用含10％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基配成单个细胞悬液，以每孔1000-10000个细胞接种到96孔细胞培养板，每孔接种体积100ul；
2：培养Vero细胞：在37℃，5％(v/v)CO2培养条件下，培养2天；
3：加入本发明：取按上述实施例3制备的蛮龙液5ml，0.2μm滤器过滤，备用。吸弃每个孔中的DMEM培养基，向各个孔中加入100ul用含10％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基稀释成相应浓度(0uM，0.4uM，1.2uM，3.7uM，11uM，33uM，100uM，300uM)的本发明，对照孔加不加含10％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基100ul；
4：呈色：培养48小时后，每孔加MTT溶液10ul，在37℃，5％(v/v)CO2培养 条件下继续孵育4小时，然后加入Formazan溶解液，在37℃，5％(v/v)CO2培养条件下继续孵育4小时，直至在普通光学显微镜下观察发现Formazan全部溶解；
(1)：测量：在570nm测定吸收值。
表1不同浓度的本发明对Vero细胞的毒性实验
B.本发明对DENV的抑制实验：
以Vero细胞为培养病毒DENV的细胞，MOI为0.1，实验步骤如下：在24孔细胞培养板中接入Vero细胞，24小时后细胞长至单层(细胞覆盖孔底的面积约为80％～90％)，吸出培养基，接入病毒样品200ul，37℃吸附2小时。吸附完成后，吸弃各孔中的病毒液，用DMEM培养基洗去未吸附的病毒。加入用含10％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基稀释的指定浓度(0uM，0.04uM，0.12uM，0.37uM，1.1uM，3.3uM，10.0uM)的本发明，于37℃、5％(v/v)CO2的培养箱中培养42小时，收集各个孔中的上清，做病毒噬斑实验。
病毒噬斑实验：在24孔板中接入Vero细胞，24小时后细胞长至单层(细胞覆盖孔底的面积约为80％～90％)，吸弃各孔中的培养基，接入用含3％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基10倍系列稀释的病毒样品200ul，37℃吸附2小时。吸附完成后将各个孔的上清板吸弃，用10％(v/v)FBS的DMEM培养基洗去未吸附的病毒。加入新鲜的45℃预热的半固定培养基[A成分：3％(v/v)FBS，2×MEM培养基，青霉素(美国AMRESCO)和链霉素(美国AMRESCO)终浓度分别为100U/ml，0.1mg/ml；B成分：1％(w/v)的琼脂糖(法国Biowest)。A成分：B成分＝1:1(v/v)]，于37℃、5％(v/v)CO2的培养 箱中培养48～72小时。待噬斑形成后用结晶紫(美国AMRESCO)染色(2％(w/v)结晶紫溶于10％(v/v)甲醛)，2小时后用流水冲去结晶紫和琼脂糖，在显微镜下对每孔产生的细胞噬斑，根据噬斑数和稀释倍数计算病毒的滴度(PFU/ml，PFU：plaque formation unit噬斑形成单位)。PFU＝病毒稀释度×P/V，(P：空蚀斑数目；V：接种量)。在2次不同的时间进行实验。
表2不同浓度的本发明对DENV滴度降低及抑制作用
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：本发明通过对DENV的抑制实验证实了本发明对DENV具有很好的抑制作用，从本质上证明了该药物在治疗DENV感染疾病中具有广泛的应用背景。该发明能够为临床治疗由DENV引起的疾病提供很好的候选药物，具有十分良好的应用前景。
Claims (4)
1.蛮龙液在制备抑制小鼠黑色素瘤B16细胞增殖药物中的应用，其特征在于蛮龙液由雄蚕蛾25g、刺五加25g、酒制菟丝子17.5g、淫羊藿20g、盐制熟地黄10g、盐制补骨脂10g作为原料药制成，制备方法由下列步骤组成：取雄蚕蛾25g、刺五加25g、酒制菟丝子17.5g、淫羊藿20g、盐制熟地黄10g、盐制补骨脂10g，粉碎，加入2L的70％乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率400-600W，萃取2次，每次4-8分钟，合并萃取液，浓缩，加到D101大孔吸附树脂柱上，50％乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩，加蔗糖、白酒及适量水调整总量至800ml，混匀，即得。
2.根据权利要求1所述蛮龙液在制备抑制小鼠黑色素瘤B16细胞增殖药物中的应用，其特征在于所述微波萃取功率500W，每次萃取6分钟。
3.蛮龙液在制备治疗或预防登革病毒感染药物中的应用，其特征在于蛮龙液由雄蚕蛾25g、刺五加25g、酒制菟丝子17.5g、淫羊藿20g、盐制熟地黄10g、盐制补骨脂10g作为原料药制成，制备方法由下列步骤组成：取雄蚕蛾25g、刺五加25g、酒制菟丝子17.5g、淫羊藿20g、盐制熟地黄10g、盐制补骨脂10g，粉碎，加入2L的70％乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率400-600W，萃取2次，每次4-8分钟，合并萃取液，浓缩，加到D101大孔吸附树脂柱上，50％乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩，加蔗糖、白酒及适量水调整总量至800ml，混匀，即得。
4.根据权利要求3所述蛮龙液在制备治疗或预防登革病毒感染药物中的应用，其特征在于所述微波萃取功率500W，每次萃取6分钟。
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