CN104725498A - 天然蝎毒多肽制备方法及其在骨髓造血功能保护的应用 - Google Patents

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孔天翰
郭奇峰
王燕
王彩霞
刘四红
邱轶芳
蒋丽苑
李婷
邢百倩
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Dongguan Zhong Ke Biology Pharmacy Co Ltd
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Abstract

本发明公开了一种天然蝎毒多肽，该天然蝎毒多肽是从东亚钳蝎(Buthus martensii Karsch)蝎毒中分离的一种新的蛋白质，其在骨髓造血功能保护方面的药用新用途。一种天然蝎毒多肽的制备方法，包括以下步骤：(1)东亚钳蝎蝎毒采集；(2)SVPⅣ分离；(3)BmKpp纯化；(4)BmKpp分子量及其氨基酸序列测定；(5)BmKpp对骨髓造血功能保护作用测定。BmKpp是来源于东亚钳蝎蝎毒的一种新的多肽，并具有显著的骨髓造血功能保护作用。BmKpp成分单一、精确分子量及氨基酸全序列清楚，其促细胞增殖的作用显著，且纯化过程的质量标准可控，故利于规模化的生产。BmKpp在保护骨髓造血功能和防护细胞应激性损伤(放疗、化疗等)药物的开发方面具有显著的优点及前景。

Description

天然蝎毒多肽制备方法及其在骨髓造血功能保护的应用
技术领域
本发明涉及一种天然蝎毒多肽、及其制备方法和应用。具体涉及一种从东亚钳蝎(Buthusmartensii Karsch)的蝎毒中分离得到一种新的天然多肽，及其在制备骨髓造血功能保护作用药物中的应用。
技术背景
全世界蝎目分6科，70属，约800余种，中国境内主要为东亚钳蝎，后者在历史上一直作为我国传统、名贵中药之一的“全蝎”而享誉海内外。蝎毒为蝎尾节毒囊中排泌出来的一种有毒分泌物，是全蝎治疗疾病的主要有效部位，其对肿瘤、疼痛、心血管疾病的疗效较全蝎强数倍。蝎毒以毒攻毒的药理作用是建立在全蝎及蝎尾千百年来大量临床应用的基础之上，具有鲜明的民族特色。
蝎毒是一个巨大的生物资源宝库，其中大部分是具有药理学活性的多肽类。目前，蝎毒中已分离出的蝎毒素大约有30种左右，主要是由35～70个氨基酸所组成的短肽，分子量约在4000～9000D之间，pH变化对蝎毒素的毒性影响不大，在加热至100℃并持续15～30min后，毒性依然较强。国外在蝎毒方面的研究始于十九世纪末，自上个世纪九十年代以来，蝎毒作为研究离子通道的工具及制作抗毒血清的原料而成为国际上研究的重点。从LQS蝎毒中分离出的氯毒素及charybdotoxin，对恶性神经胶质瘤细胞膜上的离子通道有特异的亲和作用，细胞的恶性度越高，氯毒素对它们的亲和作用越强。氯毒素与同位素结合后，其对胶质瘤的定向杀伤作用更为显著。此外，蝎毒素能够阻滞细胞膜的K+通道，同时导致Ca2+的内流减少，使肿瘤细胞的生长延缓。
我国在蝎毒方面的研究虽然起步晚，但在中医临床验证及理论体系(攻毒散结、通经活络、平肝熄风)的指导下，在抗肿瘤、抗痛、抗癫痫、抗凝、抗肝炎、抗风湿等领域均取得了丰硕的成果。
目前，国内外对蝎毒及其毒素(单一成分的纯品)抑制细胞生长的细胞生物学效应及作用机理有较多的研究，而对于其保护骨髓造血功能和防护细胞应激性损伤(辐射等)等方面尚无类似报道。
在以往的研究中，我们利用凝胶过滤层析技术，从东亚钳蝎(Buthus martensii Karsch，BMK)蝎毒中分离得到了蝎毒多肽(Scorpion Venom Polypeptide，SVP)，并利用离子交换层析技术从SVP中进一步分离得到了有效组分——SVPⅣ和SVPⅤ。实验表明，SVPⅣ和SVPⅤ对辐射后小鼠的骨髓有核细胞数、骨髓粒单系祖细胞集落形成单位(CFU-GM)数量、骨髓基质细胞集落数、脾结节数、骨髓细胞的增殖指数等均有升高的促进作用。其中，SVPⅣ促进造血细胞增殖的作用明显优于SVPⅤ，而且前者应用30分钟后，还可促进小鼠骨髓细胞磷酸化STAT3蛋白表达水平明显升高。经过改进分离方法，将蝎毒分成了三个组分(SVP Ⅰ、SVP Ⅱ和SVPⅢ)。SVP Ⅱ对辐射后的骨髓造血细胞功能具有显著的保护作用，并能导致辐射后造血细胞白细胞介素-3受体(IL-3receptor，IL-3R)的高表达(参考文献1-4)。上述的研究结果已被国外的研究者引用Salman(参考文献4)。Salman发现，全身辐射后的雄性豚鼠注射了从蝎毒(Buthus occitanus)中分离的缓激肽激活因子(bradykinin potentiating factor，BPF)后，血清总蛋白和白蛋白的水平均提高，认为从蝎毒中分离的BPF能够促进生长因子和/或生长激素的分泌，进而增加肝脏蛋白质的合成，减轻辐射损伤作用。说明蝎毒多肽在促进细胞增殖和防护细胞应激性损伤(辐射等)的药物开发方面具有重要的意义。
在近期实验中，申请者观察到从SVP Ⅱ中进一步纯化出的单一天然蝎毒毒素多肽纯品——蝎毒增殖肽(Scorpion Venom proliferative Peptide from Buthus martensii Karsch，BmKpp)对骨髓造血功能的保护作用显著好于SVP Ⅱ。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明人经过锐意研究，最终从东亚钳蝎(Buthus martensii Karsch)蝎毒中分离一种新的蛋白质，并证实了其在骨髓造血功能保护方面的药用新用途。详细言之，本发明提供了：
(1)一种多肽，其特征在于：具有SEQ No.1所示的氨基酸序列。
(2)如(1)所述的多肽，其中所述多肽是从东亚钳蝎的蝎毒中所分离得到的天然多肽。
(3.一种保护骨髓造血功能的药物组合物，其特征在于含有SEQ No.1的多肽。
(4)上述(1)或(2)所述多肽在制备保护骨髓造血功能的药物中的应用。
(5)上述(1)或(2)所述多肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
S1通过电刺激法，从东亚钳蝎活体中提取并收集新鲜毒液；
S2采用分子筛层析凝胶对所述毒液进行分离，并收集分离得到的第II峰处溶液；
S3通过离子凝胶柱对所述第II峰处溶液进行纯化，收集蝎毒组分Ⅱ；
S4通过离子凝胶柱对所述蝎毒组分Ⅱ进行二次纯化，收集目标峰处溶液；
(6)如(5)所述的制备方法，其中，所述S2和S3中所使用的层析柱规格为100cm×5.5cm，洗脱液为ph＝6.4的磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱，A液为0.05M磷酸盐缓冲液(Na-2HPO4/NaH2PO4)，B液为含0.3M氯化钠的A。
附图说明
图1.BmKpp的高效液相色谱图
图2.质谱分析法(MALDI-TOF)测定BmKpp的分子量为7217.4Da
图3.BmKpp对TBI后小鼠生存率的影响
图4.BmKpp促进TBI后小鼠骨髓及外周血细胞恢复
图5.BmKpp促进辐射后小鼠骨髓细胞造血集落的形成
图6.BmKpp对辐射后骨髓细胞CAFC形成的影响
具体实施方式
本发明将结合附图通过以下实施例作进一步说明。
以下的实施例均以BmKpp保护骨髓造血功能为例对本发明进行具体的阐述，但是本发明的保护范围并不局限于此，本技术领域的普通技术人员通过以上内容也能实现本发明的目的。
本发明的目的在于提供一种天然蝎毒多肽，该天然蝎毒多肽是从东亚钳蝎(Buthusmartensii Karsch)蝎毒中分离的一种新的蛋白质。所述东亚钳蝎可以为野生或是任何一种市售的人工养殖的东亚钳蝎，如乌鲁木齐县东亚钳蝎良种繁育场、徐州新沂市浩大蝎子养殖场、金华市天道有毒生物科技开发有限公司等市售的东亚钳蝎。
本发明的目的还在于提供一种天然蝎毒多肽的应用，其在骨髓造血功能保护方面的药用新用途。
本发明的目的还在于提供一种天然蝎毒多肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)东亚钳蝎蝎毒采集
本实施方式中成年东亚钳蝎取自东莞中科生物制药有限公司下属的有毒生物种养殖基地，利用电刺激法提取新鲜毒液。采毒仪器：采用JL-D药理生理实验多用仪(上海益联科教设备有限公司生产)；仪器参数：连续脉冲25-30Hz，波宽0.5-0.7ms，电压6～8伏；操作方法：用一电极夹住蝎的一个触肢，再用一个金属夹夹在蝎子后腹部第5节处，用另一个电极轻触金属夹，待尾节毒针尖端有毒液排出后即停止电刺激。用5ml试管收集尾刺所排出的毒液，经真空冷冻干燥成干毒。通常5kg活蝎可提取1.5-2.0g冻干蝎毒。
(2)SVP Ⅱ分离
a.凝胶过滤：采用分子筛层析凝胶Sephadex G-50Medium对蝎毒粗毒溶液进行分离。层析柱规格为50cm×5.5cm，每次上样量为400mg原毒，体积为20ml，收集峰II冻干，备用，收率约60％。
b.离子交换：采用CM Sepharose FF填料，通过离子凝胶柱对峰II进行进一步纯化。层析柱规格为100cm×5.5cm，每次上样量为500mg II峰冻干粉，体积为20ml，洗脱液为ph＝6.4的磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱，其中A液为0.05M磷酸盐缓冲液(Na2HPO4/NaH2PO4)，B液为含0.3M的A液，收集SVP Ⅱ，用VIVAFLOW 50切向超滤器脱盐，冻干，备用，收率约9％。
(3)BmKpp纯化
a.离子交换：采用CM Sepharose FF填料，通过离子凝胶柱对SVP Ⅱ进行进一步纯化。层析柱规格为50cm×5.5cm，洗脱液为ph＝6.4的磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱，其中A液为0.05M磷酸盐缓冲液(Na2HPO4/NaH2PO4)，B液为含0.3M的A液，收集目标峰，用VIVAFLOW 50切向超滤器脱盐，冻干，备用；
b.HPLC分析：流动相A液为0.1％TFA/H2O，B液为70％乙腈+0.1％TFA；洗脱程序为0～60min，B液浓度由0～100，洗脱速度为0.5ml/min。经分析，由离子交换所得的目标峰——BmKpp的纯度可达95％以上(参见图1)；
(4)BmKpp分子量及其氨基酸序列测定
用质谱分析法(Bruker公司的9.4T混合型串联傅立叶质谱仪Q-FT-MS)测定BmKpp的精确分子量为7217.4Da；用蛋白质N端测序法(岛津公司的PPSQ-31A蛋白自动测序仪)测定BmKpp共有66个氨基酸残基，其始自N端的全序列为：VRDGYIADDK NCAYFCGRNAYCDDECKKNG AESGYCQQAG VYYNACWCYY LLDDVVIIIP SGCDQW(SEQ ID No.1)
经BLASTp比对的结果表明，BmKpp属于蝎毒的α毒素家族，与已知的其他成员均有一定的差异性，说明BmKpp是一种新的天然多肽；
(5)本发明的BmKpp对骨髓造血功能保护作用测定
不同剂量的BmKpp能明显延长辐射后小鼠的生存期，促进放疗后小鼠造血功能的恢复，并具有剂量效应关系。
以上研究表明，BmKpp是来源于东亚钳蝎蝎毒的一种新的多肽，并具有显著的骨髓造血功能保护作用。BmKpp成分单一、精确分子量及氨基酸全序列清楚，其促细胞增殖的作用显著，且纯化过程的质量标准可控，故利于规模化的生产。BmKpp在保护骨髓造血功能和防护细胞应激性损伤(放疗、化疗等)药物的开发方面具有显著的优点及广泛的应用前景。
实施例1：BmKpp延长辐射后小鼠的生存期
C57BL/6小鼠接受7.5Gy的全身辐射(TBI)(6M高能直线加速器，剂量率300cGy/min，SIMENS PRIMUS)。接受7.5GyX线辐射的C57BL/6小鼠随机分为辐射对照组(IR+组)和BmKpp治疗组(IR++BmKpp组：BmKpp 2.63μg/kg)。每组15只小鼠，TBI前2h和辐射后隔日腹腔注射BmKpp或生理盐水至TBI后14d。另取15只正常小鼠作为未辐射对照组(IR-组)，于相同的时间点腹腔注射生理盐水。TBI后每天秤重，观察小鼠毛发、大便、精神状态等，并记录动物的症状、体征及死亡数目和时间至辐射后30d。生存实验表明，IR+组C57BL/6小鼠均在8天内死亡，生存率为0，平均生存时间为6.67d；IR++BmKpp治疗组小鼠存活率较IR+组明显提高，该组在TBI后30天仍有40％小鼠(6/15)存活，小鼠的平均生存时间也从IR+组的6.67d延长至14.9d(如图3所示，图3为BmKpp对TBI后小鼠生存率的影响)。BmKpp能显著降低致死量TBI后小鼠的死亡率(p<0.05)，延长TBI后小鼠的生存时间(p<0.05)，具辐射保护作用。
蝎毒组分Ⅱ(SVPII)也能延长辐射后小鼠的生存期，IR+组的长期生存期为0，SVPII组的长期生存率为26.6％(与IR+组比较，p<0.05)，但是BmKpp能明显提高TBI后小鼠的长期生存率至40％，显著高于IR+组及IR++SVPII组(p<0.05，结果见表1)。
表1.BmKpp对辐射后小鼠生存的影响
注：对数秩检验(Log‐rank)分析显示：χ2＝11.23,p＝0.000；a表示与IR+组比较p<0.05，b表示与IR++SVPII组比较p<0.05。
实施例2：BmKpp促进放疗后小鼠造血功能的恢复
小鼠辐射后分为IR+组和IR++BmKpp组，动物给药方式同上。TBI前及TBI后5d、7d、14d及28d从小鼠眼内眦采血，EDTA抗凝，全血细胞1小时内采用F-820动物血细胞分析仪(Sysmex,Japan)行血常规检查，分析外周血白细胞总数(WBC)、中性粒细胞数(Number of neutrophils)、血小板数(PLT number)以及血红蛋白(HB)。IR+组和IR++BmKpp组C57BL/6小鼠脱臼处死，取胫骨及股骨，用IMDM冲出骨髓液，离心后去上清，用含3％FBS的IMDM重悬细胞，加入约6ml红细胞裂解液裂解红细胞，离心去上清，IMDM洗涤，重悬，制成小鼠骨髓单个核细胞(BMNCs)悬液，计数BMNCs。
结果显示：①IR+组BMNCs数量明显下降，而IR++BmKpp组BMNCs计数均明显高于IR+组(p<0.05，图4A)；②IR+组小鼠的WBC、中性粒细胞数、血小板数及血红蛋白量均明显下降(p<0.05)，而BmKpp治疗组小鼠WBC无论在细胞低谷期及恢复期均比IR+组高(p<0.05，图4B)；③BmKpp能显著促进TBI后中性粒细胞的恢复，实验中各时间点该组中性粒细胞数量显著高于IR+组(p<0.05，图4C)；④IR+组小鼠的血小板数在7d降到低点，TBI后14d BmKpp治疗组血小板数恢复至TBI前水平，然而IR+组在TBI后14d仅恢复至TBI前的59.9％(图4D)。IR++BmKpp组血小板恢复情况在辐射后初期、细胞低谷期以及造血恢复期均好于IR+组(p<0.05)。
图4中：小鼠在TBI(6Gy)前后分别腹腔注射BmKpp 2.63μg/kg或生理盐水至TBI后14天。TBI前及TBI后5d、7d、14d及28d采集小鼠骨髓单个核细胞(BMNCs)及外周血进行检测。BmKpp对BMNCs数(A)、白细胞数(B)、中性粒细胞数(C)、血小板数(D)的恢复均具有明显的促进作用，对血红蛋白量(E)的影响不明显。实验重复3次以上，数据以均数±标准差方式表示。*表示IR++BmKpp组与IR+组比较p<0.05，#表示IR++BmKpp组及IR+组与辐射前比较p<0.05。
实施例3：BmKpp促进辐射后小鼠骨髓细胞集落形成单位生长
C57BL/6小鼠脱臼处死，取胫骨及股骨，用IMDM冲出骨髓液，离心后去上清，用含3％FBS的IMDM重悬细胞，加入约6ml红细胞裂解液裂解红细胞，离心去上清，IMDM洗涤，重悬，制成BMNCs悬液。实验分为IR-组(细胞未经辐射)、IR+组和IR++BmKpp组。辐射的细胞接受总剂量为2Gy的X线辐射。IR++BmKpp组细胞用BmKpp 0.5μg/ml处理，IR+组和IR-组细胞加入等量生理盐水处理。处理后的细胞置于24孔培养板，放入37℃，体积分数为5％的CO2全湿培养箱中培养(95％air/5％CO2)，细胞培养7～14d后倒置显微镜下进行集落形成单位(Colony-Forming Unit，CFU)计数，以50个以上细胞组成的细胞团为1个CFU。
结果显示，BmKpp促进辐射后小鼠骨髓细胞CFU的形成(图5)。IR-组骨髓CFU数为42.5个/105BMNCs，在TBI后7d及14d，IR+组CFU数分别为12个/105BMNCs、10.7个/105BMNCs，IR+组CFU数目与IR-组相比显著下降(p<0.05)；在TBI后7d及14d，BmKpp处理组CFU数分别为28.3个/105BMNCs、以及31.3个/105BMNCs。与IR+组比较，BmKpp治疗显著改善TBI后小鼠骨髓CFU形成能力(p<0.05)。提示BmKpp能保护辐射后小鼠骨髓造血细胞，促进造血祖细胞的恢复及增殖。
图5.BmKpp促进辐射后小鼠骨髓细胞造血集落的形成：
小鼠BMNCs(1×106/mL)辐射(2Gy)后体外半固体集落培养，培养后7d及第14d观察BmKpp对骨髓造血细胞CFU形成的作用。在培养的7d及第14d计数CFU数，表达方式为CFU数/105BMNCs。实验重复3次，数据以均数±标准差表示。a表示IR++BmKpp组与IR+组比较，p<0.05；b表示IR++BmKpp组及IR+组与IR-组比较，p<0.05。
实施例4：BmKpp促进小鼠骨髓造血干/祖细胞的增殖
鹅卵石区域形成细胞实验(Cobblestone area forming cell，CAFC)是一种克隆形成试验，被广泛的用于检测造血干细胞的造血功能。骨髓基质层细胞株FBMD-1以每孔6×105个细胞的密度种植于平底96孔板内，2周以后，从小鼠股骨取得骨髓细胞，分为未辐射组(IR-)和辐射组(IR+)，辐射组细胞经2Gy辐射处理，两组细胞再分别重悬于CAFC培养基(IMDM加上20％的马血清，10-6M的氢化可的松，10-5M的2-巯基乙醇，100U/毫升的青霉素，100毫克/毫升的链霉素)。IR-和IR+细胞分为对照组和Bmkpp处理组，种植于基质细胞层之上，以每3倍的比例稀释，种植6组浓度梯度。以每组浓度种植20个复孔来分析梯度稀释的细胞CAFC的形成能力。每周半量换液。在接种后的第2周观察每孔CAFC的形成情况。CAFC形成率用泊松分布统计方法计算。多次独立实验的结果以CAFC的形成数目/股骨的中位数±SD(n＝3)来表示。结果显示，BmKpp处理14d时，IR+或者IR-小鼠骨髓细胞的CAFC比例均升高，与对照组相比，差异显著(p<0.05)(图6)。说明在辐射后的一段时间内，BmKpp能明显促进辐射后骨髓造血干细胞的功能的恢复。
图6.BmKpp对辐射后骨髓细胞CAFC形成的影响：BmKpp处理辐射与未辐射的小鼠骨髓细胞14d；*表示与空白对照组相比，p<0.05。
由此表明，本发明方法中的各个参数均是最佳选择，可实现本发明的最优效果。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (6)

1.一种多肽，其特征在于：具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的多肽，其中所述多肽是从东亚钳蝎的蝎毒中所分离得到的天然多肽。
3.一种保护骨髓造血功能的药物组合物，其特征在于含有SEQ ID No.1的多肽。
4.权利要求1或2所述多肽在制备保护骨髓造血功能的药物中的应用。
5.权利要求1或2所述多肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
S1通过电刺激法，从东亚钳蝎活体中提取并收集新鲜毒液；
S2采用分子筛层析凝胶对所述毒液进行分离，并收集分离得到的第II峰处溶液；
S3通过离子凝胶柱对所述第II峰处溶液进行纯化，收集蝎毒组分Ⅱ；
S4通过离子凝胶柱对所述蝎毒组分Ⅱ进行二次纯化，收集目标峰处溶液。
6.如权利要求5所述的制备方法，其中，所述S2和S3中所使用的层析柱规格为100cm×5.5cm，洗脱液为ph＝6.4的磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱，A液为0.05M磷酸盐缓冲液(Na2HPO4/NaH2PO4)，B液为含0.3M氯化钠的A液。
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