CN102399279A - 用于促进细胞增殖的蝎毒多肽及其制备方法和药用用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于促进细胞增殖的蝎毒多肽及其制备方法和药用用途，用于促进细胞增殖的蝎毒多肽，其特征是：从东亚钳蝎Buthus martensii Karsch蝎毒中分离、纯化而成，所述用于促进细胞增殖的蝎毒多肽的N端66个氨基酸残基的序列如序列表SEQ ID№：1所示，其分子量为7217.4Da。本发明来源于东亚钳蝎蝎毒的一种新的多肽，并具有促进造血细胞增殖的作用。具有成分单一、精确分子量及N端66个氨基酸残基清楚，促细胞增殖的作用显著，且纯化过程的质量标准可控，故利于规模化的生产的特点。在促进细胞增殖和防护细胞应激性损伤(辐射等)药物的开发方面具有显著的优点及广泛的应用前景。能够促进γ射线或者X射线照射后的小鼠骨髓造血细胞集落形成以及M-NFS-60细胞的增殖。

Description

用于促进细胞增殖的蝎毒多肽及其制备方法和药用用途

技术领域

本发明涉及用于促进细胞增殖的蝎毒多肽及其制备方法和药用用途，是从东亚钳蝎(Buthus martensii Karsch)蝎毒中分离得到一种新的多肽——蝎毒增殖肽(Scorpion Venomproliferative Peptide from Buthus martensii Karsch，BmKpp)，该多肽具有促进造血细胞(正常/辐射后)增殖的作用。属于生物技术领域。

背景技术

全世界蝎目分6科，70属，约800余种，中国境内主要为东亚钳蝎，后者在历史上一直作为我国传统、名贵中药之一的“全蝎”而享誉海内外。蝎毒为蝎尾节毒囊中排泌出来的一种有毒分泌物，是全蝎治疗疾病的主要有效部位，其对肿瘤、疼痛、心血管疾病的疗效较全蝎强数倍。蝎毒以毒攻毒的药理作用是建立在全蝎及蝎尾千百年来大量临床应用的基础之上，具有鲜明的民族特色。

蝎毒是一个巨大的生物资源宝库，其中大部分是具有药理学活性的多肽类。目前，蝎毒中已分离出的蝎毒素大约有30种左右，主要是由35～70个氨基酸所组成的短肽，分子量约在4000～9000D之间，pH变化对蝎毒素的毒性影响不大，在加热至100℃并持续15～30min后，毒性依然较强。国外在蝎毒方面的研究始于十九世纪末，自上个世纪九十年代以来，蝎毒作为研究离子通道的工具及制作抗毒血清的原料而成为国际上研究的重点。从LQS蝎毒中分离出的氯毒素及charybdotoxin，对恶性神经胶质瘤细胞膜上的离子通道有特异的亲和作用，细胞的恶性度越高，氯毒素对它们的亲和作用越强。氯毒素与同位素结合后，其对胶质瘤的定向杀伤作用更为显著。此外，蝎毒素能够阻滞细胞膜的K⁺通道，同时导致Ca²⁺的内流减少，使肿瘤细胞的生长延缓。

我国在蝎毒方面的研究虽然起步晚，但在中医临床验证及理论体系(攻毒散结、通经活络、平肝熄风)的指导下，在抗肿瘤、抗痛、抗癫痫、抗凝、抗肝炎、抗风湿等领域均取得了丰硕的成果。

目前，国内外对蝎毒及其毒素(单一成分的纯品)抑制细胞生长的细胞生物学效应及作用机理有较多的研究，而对于其促进细胞增殖和防护细胞应激性损伤(辐射等)等方面尚无类似报道。

在以往的研究中，我们利用凝胶过滤层析技术，从东亚钳蝎(Buthus martensii Karsch，BMK)蝎毒中分离得到了蝎毒多肽(Scorpion Venom Polypeptide，SVP)，并利用离子交换层析技术从SVP中进一步分离得到了有效组分——SVP IV和SVP V。实验表明，SVP IV和SVP V对辐射后小鼠的骨髓有核细胞数、骨髓粒单系祖细胞集落形成单位(CFU-GM)数量、骨髓基质细胞集落数、脾结节数、骨髓细胞的增殖指数等均有升高的促进作用。其中，SVP IV促进造血细胞增殖的作用明显优于SVP V，而且前者应用30分钟后，还可促进小鼠骨髓细胞磷酸化STAT3蛋白表达水平明显升高(参考文献1-3)。上述的研究结果已被国外的研究者引用Salman(参考文献4)。Salman发现，全身辐射后的雄性豚鼠注射了从蝎毒(Buthus occitanus)中分离的缓激肽激活因子(bradykinin potentiating factor，BPF)后，血清总蛋白和白蛋白的水平均提高，认为从蝎毒中分离的BPF能够促进生长因子和/或生长激素的分泌，进而增加肝脏蛋白质的合成，减轻辐射损伤作用。说明蝎毒多肽在促进细胞增殖和防护细胞应激性损伤(辐射等)的药物开发方面具有重要的意义。

在实验中，申请人发现从SVP IV中进一步纯化出的单一毒素纯品——蝎毒增殖肽(Scorpion Venom proliferative Peptide from Buthus martensii Karsch，BmKpp)，在促进造血细胞(正常/辐射)增殖方面较SVP IV具有更显著的生物学活性。

发明内容

本发明的目的之一，是为了提供一种用于促进细胞增殖的蝎毒多肽，该用于促进细胞增殖的蝎毒多肽是从东亚钳蝎(Buthus martensii Karsch)蝎毒中分离一种新的蛋白质。

本发明的目的之二，是为了提供一种用于促进细胞增殖的蝎毒多肽的制备方法。

本发明的目的之三，是为了提供一种用于促进细胞增殖的蝎毒多肽的药用用途。

本发明的目的之一可以通过采取如下技术方案达到：

用于促进细胞增殖的蝎毒多肽，其特征是：从东亚钳蝎Buthus martensii Karsch蝎毒中分离、纯化而成，所述用于促进细胞增殖的蝎毒多肽的N端66个氨基酸残基的序列如序列表SEQ ID№：1所示，其分子量为7217.4Da。

本发明的目的之二可以通过采取如下技术方案达到：

用于促进细胞增殖的蝎毒多肽的制备方法，其特征在于它包括以下步骤：

1)采集东亚钳蝎蝎毒，从成年或非成年的东亚钳蝎体内提取新鲜毒液后，通过真空冷冻干燥成凝胶，备用；

2)从第1)步制的凝胶中分离出蝎毒多肽有效组分SVP IV，首先进行凝胶过滤：采用分子筛层析凝胶，即从蝎毒粗毒溶液进行层析分离出峰II，收集峰II冻干，备用；然后进行离子交换及纯化：采用填料CM Sepharose FF，通过离子凝胶柱对前述峰II进行离子交换、即作进一步纯化，用ph＝6.4的磷酸盐缓冲液作为洗脱液进行梯度洗脱后，收集蝎毒多肽有效组分SVP IV，再用切向超滤器VIVAFLOW 50对所收集的蝎毒多肽有效组分SVP IV脱盐、冻干，备用；

3)取得蝎毒增殖肽BmKpp，首先进行离子交换：采用CM Sepharose FF填料，通过离子凝胶柱对第2)步形成的蝎毒多肽有效组分SVPIV进行进一步纯化，用洗脱液为ph＝6.4的磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱，收集目标峰，用VIVAFLOW 50切向超滤器脱对所述目标峰进行脱盐、冻干，取得蝎毒增殖肽BmKpp；

4)测定蝎毒增殖肽BmKpp的分子量及其氨基酸序列，用质谱分析法测定蝎毒增殖肽BmKpp的精确分子量为7217.4Da，用埃德曼降解法Edman degradation测定蝎毒增殖肽BmKpp的N端66个氨基酸残基的序列如序列表SEQ ID№：1所示。

通过采用HPLC分析得知，第3)步中由离子交换所得的目标峰的BmKpp纯度达到95％以上。

经BLASTp比对的结果表明，BmKpp与已知蛋白的相似性均较低(＜35％)，说明BmKpp是一种新的多肽。

本发明的目的之二还可以通过采取如下技术方案达到：

实现本发明的目的之二的一种实施方案是：前述第2)步中所用分子筛层析的层析柱规格为50cm×5.5cm，所用离子凝胶柱规格为100cm×5.5cm，所述洗脱液由A液和B液组成，其中A液为0.05M磷酸盐缓冲液，该磷酸盐缓冲液的分子式Na₂HPO₄/NaH₂PO₄，B液为含0.3M的A液。

实现本发明的目的之二的一种实施方案是：前述第3)步中所用离子凝胶柱规格为50cm×5.5cm，所述洗脱液由A液和B液组成，其中A液为0.05M磷酸盐缓冲液，该磷酸盐缓冲液的分子式为Na₂HPO₄/NaH₂PO₄，B液为含0.3M的A液。

实现本发明的目的之二的一种实施方案是：前述第3)步所用HPLC分析过程中，采用流动相A液为0.1％TFA/H₂O，B液为70％乙腈+0.1％TFA；洗脱程序为0～60min，B液浓度由0～100，洗脱速度为0.5ml/min。

实现本发明的目的之二的一种实施方案是：前述第4)步所用质谱分析法，为Bruker公司的9.4T混合型串联傅立叶质谱Q-FT-MS法。

本发明的目的之三可以通过采取如下技术方案达到：

用于促进细胞增殖的蝎毒多肽的药用用途，其特征在于：

1)用于促进正常造血细胞增殖；

2)用于促进辐射后骨髓造血细胞增殖。

本发明具有如下突出的有益效果：

1、本发明所述用于促进细胞增殖的蝎毒多肽BmKpp，是来源于东亚钳蝎蝎毒的一种新的多肽，具有的精确分子量及N端66个氨基酸残基是申请人经过反复试验而取得，具有促进造血细胞(正常/辐射后)增殖的作用。

2、本发明所述用于促进细胞增殖的蝎毒多肽BmKpp成分单一、精确分子量及N端66个氨基酸残基清楚，其促细胞增殖的作用显著，且纯化过程的质量标准可控，故利于规模化的生产。

3、本发明所述用于促进细胞增殖的蝎毒多肽BmKpp在促进细胞增殖和防护细胞应激性损伤(辐射等)药物的开发方面具有显著的优点及广泛的应用前景。能够促进γ射线或者X射线照射后的小鼠骨髓造血细胞集落形成以及M-NFS-60细胞的增殖。

附图说明

图1是BmKpp的高效液相色谱图。

图2是用质谱分析法测定BmKpp的分子量示意图。

图3是BmKpp对M-NFS-60细胞的促增殖作用示意图。

图4是BmKpp对辐射小鼠骨髓细胞集落形成的作用示意图。

图4中：A.辐射对照，B.SVP IV 3μg/ml，C.BmKpp 1μg/ml，D.BmKpp 3μg/ml

具体实施方式

本发明公开一种用于促进细胞增殖的蝎毒多肽，其特征是：从东亚钳蝎Buthus martensiiKarsch蝎毒中分离、纯化而成，所述用于促进细胞增殖的蝎毒多肽的N端66个氨基酸残基的序列如序列表SEQ ID№：1所示，其分子量为7217.4Da。

本发明所述的用于促进细胞增殖的蝎毒多肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)采集东亚钳蝎蝎毒，从东亚钳蝎体内提取新鲜毒液后，通过真空冷冻干燥成凝胶，备用；

2)从第1)步制的凝胶中分离出蝎毒多肽有效组分SVP IV，首先进行凝胶过滤：采用分子筛层析凝胶，即从蝎毒粗毒溶液进行层析分离出峰II，收集峰II冻干，备用；然后进行离子交换及纯化：采用填料CM Sepharose FF，通过离子凝胶柱对前述峰II进行离子交换、即作进一步纯化，用ph＝6.4的磷酸盐缓冲液作为洗脱液进行梯度洗脱后，收集蝎毒多肽有效组分SVP IV，再用切向超滤器VIVAFLOW 50对所收集的蝎毒多肽有效组分SVP IV脱盐、冻干，备用；

3)取得蝎毒增殖肽BmKpp，首先进行离子交换：采用CM Sepharose FF填料，通过离子凝胶柱对第2)步形成的蝎毒多肽有效组分SVP IV进行进一步纯化，用洗脱液为ph＝6.4的磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱，收集目标峰，用VIVAFLOW 50切向超滤器脱对所述目标峰进行脱盐、冻干，取得蝎毒增殖肽BmKpp；然后用HPLC分析得知，由离子交换所得的目标峰的BmKpp纯度达95％以上。

4)测定蝎毒增殖肽BmKpp的分子量及其氨基酸序列，用质谱分析法测定蝎毒增殖肽BmKpp的精确分子量为7217.4Da，用埃德曼降解法Edman degradation测定蝎毒增殖肽BmKpp的N端66个氨基酸残基的序列如序列表SEQ ID№：1所示。

所述制备方法中：

1)采集东亚钳蝎蝎毒

成年东亚钳蝎取自金华市天道有毒生物科技开发有限公司下属的有毒生物种养殖基地，利用电刺激法提取新鲜毒液，真空冷冻干燥、备用；

2)SVPIV分离

(1)凝胶过滤：采用分子筛层析凝胶Sephadex G-50Medium对蝎毒粗毒溶液进行分离，层析柱规格为50cm×5.5cm，收集峰II冻干，备用；

(2)离子交换：采用CM Sepharose FF填料，通过离子凝胶柱对峰II进行进一步纯化，层析柱规格为100cm×5.5cm，洗脱液为ph＝6.4的磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱，其中A液为0.05M磷酸盐缓冲液(Na₂HPO₄/NaH₂PO₄)，B液为含0.3M的A液，收集SVPIV，用VIVAFLOW50切向超滤器脱盐，冻干，备用；

3)BmKpp纯化

(1)离子交换：采用CM Sepharose FF填料，通过离子凝胶柱对SVPIV进行进一步纯化。层析柱规格为50cm×5.5cm，洗脱液为ph＝6.4的磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱，其中A液为0.05M磷酸盐缓冲液(Na₂HPO₄/NaH₂PO₄)，B液为含0.3M的A液，收集目标峰，用VIVAFLOW 50切向超滤器脱盐，冻干，备用；

(2)HPLC分析：流动相A液为0.1％TFA/H₂O，B液为70％乙腈+0.1％TFA；洗脱程序为0～60min，B液浓度由0～100，洗脱速度为0.5ml/min；经分析，由离子交换所得的目标峰——BmKpp的纯度可达95％以上，如图1所示；

4)BmKpp分子量及其氨基酸序列测定

用质谱分析法(Bruker公司的9.4T混合型串联傅立叶质谱Q-FT-MS)测定BmKpp的精确分子量为7217.4Da，如图2所示；

用埃德曼降解法(Edman degradation)测定BmKpp N端66个氨基酸残基的序列为：

VRDGYIADDK NCAYFCGRNA YCDDECKKNG AESGYCQQAG VYYNACWCYYLLDDVVIIIP SGCDQW。

经BLASTp比对的结果表明，BmKpp与已知蛋白的相似性均较低(＜35％)，说明BmKpp是一种新的多肽。

下面通过具体实施例详细描述本发明的药用用途：

以下的应用实施例均以BmKpp促进细胞增殖为例对本发明进行具体的阐述，但是本发明的保护范围并不局限于此，本技术领域的普通技术人员通过以上内容也能实现本发明的目的。

应用实例一：BmKpp促进细胞增殖

r-h-MCSF依赖细胞株M-NFS-60购自美国ATCC公司(CRL-1838^TM)。M-NFS-60细胞为悬浮生长，常规培养于含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基(青霉素100∪/mL，链霉素100μg/mL，HEPES 5958mg/L)中，加入M-CSF 62ng/mL，于37℃、5％CO₂条件下培养，隔天换液1次，取对数生长期细胞用于实验。取生长状态良好的M-NFS-60细胞，用RPMI1640洗涤3次，用含10％胎牛血清的RPMI1640培养基重悬并调整细胞密度，按8×10⁴个/ml的密度，接种细胞悬液95μL于96孔板内，培养24小时后分别加入5μL生理盐水、不同浓度的BmKpp、IL-3，每组设3个平行孔；常规培养24h或48h后，每孔加入10μLCCK-8试剂，把培养板避光放入培养箱1h后，用全自动酶标仪于450nm处测各组吸光度值，计算出增值率。

不同浓度(0.5～1.5μg/mL)BmKpp明显促进细胞增殖，增殖率高于细胞因子IL-3对照组，而且具有剂量效应关系(图3)。说明BmKpp具有促进细胞增殖作用。

应用实例二：BmKpp促进细胞周期进程，细胞进入增殖期

取对数生长期M-NFS60细胞，用不含血清的RPMI 1640培养液洗涤3次，加入生理盐水(阴性对照)，IL-3(10ng/mL，阳性对照)以及BmKpp 3μg/mL，作用24小时，取各组细胞制作标本，用于流式细胞仪检测细胞周期。制作标本的步骤如下：制作浓度为1～5×10⁶/mL细胞悬液0.5mL，加入70％冻乙醇2mL，-4℃过夜；1000rpm/min离心弃上清液；PBS洗两次；加入50μL RNA酶，450μL PI染料，4℃避光放置30min；用流式细胞仪测定细胞周期。结果显示，BmKpp使处于G0/G1期的细胞明显降低，而明显升高S期细胞的比例至49.81％(表1)。BmKpp的作用于比SVP IV的作用显著，说明BmKpp能明显促进M-NFS60细胞的周期进程，使多数细胞进入增殖周期。

表1.BmKpp对M-NFS-60细胞周期的影响(％，24h)

应用实例三：BmKpp促进辐射后细胞增殖

r-h-MCSF依赖细胞株M-NFS-60常规培养于含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基(青霉素100∪/mL，链霉素100μg/mL，HEPES 5958mg/L)中，加入M-CSF 62ng/mL，于37℃、5％CO₂条件下培养，隔天换液1次，取对数生长期细胞用于实验。对数生长期细胞进行辐射，辐射条件为⁶⁰Coγ-射线一次均匀照射，照射剂量为25Gy，剂量率为5Gy/min。

取辐射后M-NFS60细胞，用RPMI 1640培养液洗涤3次，台盼蓝染色计数活细胞，用含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基(含r-h-M-CSF 62ng/mL)调整细胞浓度为5×10⁴cells/mL，每孔80μL加入96孔板中；培养24h后分别加入10μL生理盐水，IL-3(10ng/mL)，BmKpp1～3μg/mL，每组设3个平行孔；加入AlamarBlue^TM10μL，常规培养48h，于全自动酶标仪上测各组吸光度值，再根据AlamarBlue^TM方法既定公式换算出各实验组相对于对照组的细胞增殖率。

1～3μg/mL BmKpp能够明显促进辐射后M-NFS-60细胞的增殖，并且具有剂量效应关系；BmKpp的浓度在3μg/mL时，M-NFS-60细胞的增值率达到142％；BmKpp的促增殖作用强于同等浓度的SVP IV(表2)。说明BmKpp能够明显保护辐射后的M-NFS-60细胞，促进其辐射损伤的恢复，快速进行增殖。

表2.BmKpp对M-NFS-60细胞增殖的影响(％，48h)

应用实例四：BmKpp促进辐射后小鼠骨髓造血干/祖细胞的增殖

选用SPF级BALB/c小鼠，单一雄性，8～10周龄，体重(20±2)g。小鼠辐射条件：直线加速器一次性全身照射，剂量率为200mGy/min。

小鼠经6.0Gy X射线一次性全身照射后，取照射后第15天的股骨骨髓细胞培养集落。具体方法是：无菌条件下取小鼠双侧股骨，用1ml注射器吸取DMEM低糖培养基，冲洗分离骨髓细胞，制成单细胞悬液，800rpm×4min离心。用红细胞裂解液充分裂解清除红细胞，以上述培养基洗涤3次，再用DMEM培养基调整细胞浓度为4×10⁶/ml，采用12孔板培养。37℃、5％CO₂孵箱中培养14d后于显微镜下观察集落形成情况，以50个以上细胞组成的细胞团为1个集落进行计数。

实验分为辐射对照组(加入生理盐水)、SVP IV 3μg/ml组、BmKpp 1μg/mL和3μg/mL处理组。

结果表明，辐射后15天，小鼠骨髓造血细胞形成的集落数比较少(图4-A)，说明辐射导致的骨髓细胞损伤仍未恢复；而经过1μg/mL和3μg/mLBmKpp处理后，辐射后小鼠骨髓造血细胞形成的集落数明显增多(图4-C、图4-D)。SVP IV 3μg/ml的作用(图4-B)与BmKpp1μg/ml时的作用相似，说明BmKpp能够加速辐射后小鼠骨髓造血细胞增殖能力恢复，使造血细胞集落形成数增多，对辐射损伤的骨髓造血细胞具有保护作用。

本发明通过

1、BmKpp促进正常造血细胞增殖作用测定

不同剂量的BmKpp能明显促进M-NFS-60细胞的增殖和细胞周期的移行，具有剂量效应关系。

2、BmKpp促进辐射后骨髓造血细胞增殖作用测定

BmKpp能够促进γ射线或者X射线照射后的小鼠骨髓造血细胞集落形成以及M-NFS-60细胞的增殖。

证明BmKpp的药用用途。

序列表

<110>广州医学院

<120>用于促进细胞增殖的蝎毒多肽及其制备方法和药用用途

<160>1

<210>1

<211>

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于促进细胞增殖的蝎毒多肽的N端66个氨基酸残基的序列。

<400>1

VRDGYIADDK NCAYFCGRNA YCDDECKKNG AESGYCQQAGVYYNACWCYY LLDDVVIIIP SGCDQW

<110>广州医学院

<120>用于促进细胞增殖的蝎毒多肽及其制备方法和药用用途

<160>1

<210>1

<211>

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于促进细胞增殖的蝎毒多肽的N端66个氨基酸残基的序列。

<400>1

    VRDGYIADDK NCAYFCGRNA YCDDECKKNG AESGYCQQAG VYYNACWCYY LLDDVVIIIP SGCDQW

 

Claims (7)

1.用于促进细胞增殖的蝎毒多肽，其特征是：从东亚钳蝎Buthus martensii Karsch蝎毒中分离、纯化而成，所述用于促进细胞增殖的蝎毒多肽的N端66个氨基酸残基的序列如序列表SEQ ID№：1所示，其分子量为7217.4Da。

2.如权利要求1所述用于促进细胞增殖的蝎毒多肽的制备方法，其特征在于它包括以下步骤：

1)采集东亚钳蝎蝎毒，从东亚钳蝎体内提取新鲜毒液后，通过真空冷冻干燥成凝胶，备用；

2)从第1)步制的凝胶中分离出蝎毒多肽有效组分SVP IV，首先进行凝胶过滤：采用分子筛层析凝胶，即从蝎毒粗毒溶液进行层析分离出峰II，收集峰II冻干，备用；然后进行离子交换及纯化：采用填料CM Sepharose FF，通过离子凝胶柱对前述峰II进行离子交换、即作进一步纯化，用ph＝6.4的磷酸盐缓冲液作为洗脱液进行梯度洗脱后，收集蝎毒多肽有效组分SVP IV，再用切向超滤器VIVAFLOW 50对所收集的蝎毒多肽有效组分SVP IV脱盐、冻干，备用；

3)取得蝎毒增殖肽BmKpp，首先进行离子交换：采用CM Sepharose FF填料，通过离子凝胶柱对第2)步形成的蝎毒多肽有效组分SVP IV进行进一步纯化，用洗脱液为ph＝6.4的磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱，收集目标峰，用VIVAFLOW 50切向超滤器脱对所述目标峰进行脱盐、冻干，取得蝎毒增殖肽BmKpp；然后用HPLC分析得知，由离子交换所得的目标峰的BmKpp纯度达95％以上。

4)测定蝎毒增殖肽BmKpp的分子量及其氨基酸序列，用质谱分析法测定蝎毒增殖肽BmKpp的精确分子量为7217.4Da，用埃德曼降解法Edman degradation测定蝎毒增殖肽BmKpp的N端66个氨基酸残基的序列如序列表SEQ ID№：1所示。

3.如权利要求2所述的用于促进细胞增殖的蝎毒多肽的制备方法，其特征在于：前述第2)步中所用分子筛层析的层析柱规格为50cm×5.5cm，所用离子凝胶柱规格为100cm×5.5cm，所述洗脱液由A液和B液组成，其中A液为0.05M磷酸盐缓冲液，该磷酸盐缓冲液的分子式Na₂HPO₄/NaH₂PO₄，B液为含0.3M的A液。

4.如权利要求2所述的用于促进细胞增殖的蝎毒多肽的制备方法，其特征在于：前述第3)步中所用离子凝胶柱规格为50cm×5.5cm，所述洗脱液由A液和B液组成，其中A液为0.05M磷酸盐缓冲液，该磷酸盐缓冲液的分子式为Na₂HPO₄/NaH₂PO₄，B液为含0.3M的A液。

5.如权利要求2所述的用于促进细胞增殖的蝎毒多肽的制备方法，其特征在于：前述第3)步所用HPLC分析过程中，采用流动相A液为0.1％TFA/H₂O，B液为70％乙腈+0.1％TFA；洗脱程序为0～60min，B液浓度由0～100，洗脱速度为0.5ml/min。

6.如权利要求2所述的用于促进细胞增殖的蝎毒多肽的制备方法，其特征在于：前述第4)步所用质谱分析法，为Bruker公司的9.4T混合型串联傅立叶质谱Q-FT-MS法。

7.如权利要求1所述用于促进细胞增殖的蝎毒多肽的药用用途，其特征在于：

1)用于促进正常造血细胞增殖作用；

2)用于促进辐射后骨髓造血细胞增殖。

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