CN108026513A - 树突状细胞的抗原加载的方法和疫苗 - Google Patents
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Abstract
本文提供了一种在用于抗原呈递的树突状细胞内加载抗原的方法，该方法包括：使用编码抗原或其一个或多个免疫原性表位的核酸分子修饰多潜能干细胞；诱导多潜能干细胞分化成表达和呈递抗原或其一个或多个免疫原性表位的树突状细胞。本文还提供了树突状细胞、疫苗以及使用树突状细胞和疫苗的方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2015年3月31日提交的新加坡临时申请第10201502560Q号的优先权和权益，其内容通过引用纳入本文。
发明领域
本发明涉及生成抗原加载的树突状细胞以及将此类细胞在疫苗中的用途。
背景技术
基于树突状细胞(DC)的疫苗日渐成为治疗癌症的新的治疗工具[1,2]。该治疗策略利用了免疫系统的抗癌症能力和特异性，同时避免了传统癌症治疗常伴随着的破坏性的和威胁生命的副作用。
基于DC的免疫疗法具有更好的安全性，并且对于接受治疗的癌症患者可以提供更好的生活质量。然而，由于制造这种活细胞产品的复杂性，生产足够多数量的高质量DC疫苗以诱导临床显著的抗癌免疫性仍然是具有挑战的[3,4]。
如今，大多数的基于DC的癌症疫苗是通过患者自身所拥有的细胞生成的[6]。通过入侵白细胞去除术(invasive leukapheresis process)从患者处获得大量的外周血单核细胞(PBMC)。然后从PBMC中分离单核细胞并分化成DC。这些单核细胞衍生的DC(moDC)用肿瘤抗原加载，成熟，然后注射回患者。这一生产过程十分复杂，并且受限于许多技术和物料难题。同样，最终产物往往是昂贵的，如同丹德里昂公司的普罗文奇(Dendreon’sProvenge)的生产，这是FDA批准的第一个用于前列腺癌症的基于DC的疫苗[7]。
目前，若干抗原加载方法已经被用于生产DC疫苗。蛋白质或肿瘤裂解物加载为不受对象的MHC单体型限制的多个抗原表位的呈递提供了可能性。然而，该方法需要大量昂贵的临床级肿瘤抗原蛋白质或肿瘤细胞裂解物；此外，加载的肿瘤抗原往往由MHC II型而非MHC I型呈递[21]。
肽脉冲(Peptide-pulsing)是一种用肿瘤抗原加载DC以呈递至CD8+ T细胞的简单方法，其中MHC限制性肿瘤抗原肽不经过抗原加工途径直接连接至MHC I型分子。然而，由于MHC/肽复合物的高转换率，这些外源性抗原依赖性方法所具有的抗原呈递持续时间较短[22]。
基于核酸的抗原加载方式可以延长肿瘤抗原在DC中的呈递持续时间。以这种方式，肿瘤抗原编码DNA或RNA被递送至DC中，并且这些肿瘤抗原编码核酸的表达可以提供倾向于经内源性途径呈递的胞质肿瘤抗原的内源性供应[23]。使用这些方式的抗原呈递效率很大程度上取决于在DC内高水平的转基因表达。对于基于DNA的抗原加载，常常使用病毒载体[24]。对于基于RNA的抗原加载，肿瘤抗原编码RNA可以经电穿孔递送至DC细胞质内，其中RNA进行翻译以生产肿瘤抗原。不同于基于DNA的方法，基于RNA的方法不需要转录步骤，因而更加高效。然而，抗原呈递持续时间被RNA的弱稳定性和短寿命所限制[25]。
从DC疫苗生产的角度来看，上述所有传统的抗原加载方法都需要额外的努力以生产各种形式的临床级抗原荷载，例如肽、蛋白质、肿瘤细胞裂解物、DNA或RNA。
将这些抗原荷载递送至DC的额外操作是必须的。这样的操作包括细胞孵育、转染、电穿孔和病毒转导，它们常常降低产率以及DC疫苗中细胞的活力。此外，需要为每一批新的DC产品重复这样的操作，从而导致了批次间的可变性。
此外，DC的抗原加载并不是独立的步骤。抗原加载必须与离体DC生成和成熟步骤配合完成，从而使得对于各批疫苗的整个DC疫苗生产过程更加复杂化。
除了与生产相关联的技术和物料困难，由于患者间变化的不可控性，这种衍生自患者的DC疫苗产品的质量可以是高度可变的。将这些可变的DC产品用于临床试验使得对于那些对进一步改进疫苗效率十分重要的关键参数的优化变得困难。此外，这些衍生自患者的DC产品的供应常常受限，使得对于较高剂量和延长接种计划益处的临床评价变得不可能。
为了避免上述与使用有限的且可变的患者细胞进行DC疫苗生产相关联的问题，有必要研究其它用于生产抗原加载DC的方法。
发明内容
一方面，本文提供了一种在用于抗原呈递的树突状细胞内加载抗原的方法，该方法包括：使用编码抗原或其一种或多种免疫原性表位的核酸分子修饰多潜能干细胞；诱导多潜能干细胞分化成表达和呈递抗原或其一个或多个免疫原性表位的树突状细胞。
多潜能干细胞可以是诱导的多潜能干细胞，并可以用核酸分子稳定地修饰。
在该方法中，修饰可以包括使用病毒或非病毒方式将核酸分子递送至多潜能干细胞中的转导。在一些实施方式中，转导的方法可以提供长期转基因表达。
例如，修饰可以包括用包括例如慢病毒载体的逆转录病毒载体转导多潜能干细胞。
多潜能干细胞可以是哺乳动物细胞，包括例如人细胞。
抗原可以是全长抗原，并且可以是肿瘤抗原、病毒抗原、细菌抗原或自身免疫疾病抗原。一个或多个免疫原性表位可以是来自肿瘤抗原、病毒抗原、细菌抗原或自身免疫疾病抗原的表位。
核酸分子可以进一步编码融合至抗原或其一个或多个免疫原性表位的靶向序列。在一些实施方式中，靶向序列可以是蛋白酶体靶向序列，例如泛素序列。在一些实施方式中，靶向序列可以是核内体靶向序列。
在另一方面，本文提供了衍生自多潜能干细胞的树突状细胞，多潜能干细胞被编码抗原或其一个或多个免疫原性表位的核酸分子稳定地修饰，其中树突状细胞表达并呈递抗原或其一个或多个免疫原性表位。
树突状细胞可以根据本发明的方法生产。
树突状细胞可以表达CD11c、CD86和HLA标志物中的一种或多种。
在一个方面，本文提供了含有本发明的树突状细胞的疫苗。
疫苗可以进一步包含佐剂和/或药学上可接受的赋形剂或稀释剂。
在另一方面，本文提供了在对象中诱导免疫应答的方法，该方法包括：将本发明的树突状细胞或疫苗给予需要对抗原具有免疫性的对象。
免疫应答可以是T细胞介导的免疫应答，包括CD8+或CD4+ T细胞介导的应答。
在该方法中，树突状细胞可以与对象是自体的，或者可以是与对象同种异体的。在一些实施方式中，树突状细胞与对象可以至少部分MHC匹配。
对象可以是需要进行癌症治疗的对象，并且抗原可以是肿瘤抗原。例如，对象可以是需要进行黑素瘤、结直肠癌、胶质瘤、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胰腺癌、或胃肠癌治疗。
在另一方面，本文提供了本发明的树突状细胞或疫苗在对象中诱导免疫应答，或在制备用于在对象中诱导免疫应答的疫苗的用途。
本领域技术人员根据本发明下面的具体实施方式的描述以及附图将会明白本发明的其它方面和特征。
附图简要说明
本申请的附图如下所述，其仅通过示例方式说明本发明的实施方式。
图1：由人多潜能干细胞(hPSC)生产DC疫苗的抗原加载策略的原理总结图。(点线之上)传统患者血液细胞依赖性平台中，抗原加载受限于DC，其中不同形式的抗原荷载通过传统的抗原加载方法递送至DC。(点线之下)hPSC-DC平台中，抗原加载可以在hPSC中通过抗原性修饰hPSC实现。经由这样的抗原性修饰的hPSC，不需要传统抗原加载步骤就可以生成抗原加载的DC。使用该抗原加载策略将不在要求临床级的荷载生成以及额外的DC操作。因此，由hPSC生产DC疫苗被显著简化。
图2：肿瘤抗原基因修饰的hPSC生产肿瘤抗原表达型DC。(A)：携带肿瘤抗原基因MART-1的慢病毒载体LV.MP的结构。(B)：通过流式细胞术检测的在H1.MP细胞中的GPF表达，其中H1.MP细胞是由LV.MP转导和G418选择生产的H1细胞系。(C):通过RT-PCR测量的在H1.MP细胞中的MART-1表达。(D)：通过免疫染色测量的在H1.MP细胞中的MART-1表达。(E)：通过流式细胞术检测的在H1.MP衍生的DC(H1.MP-DC)中的GFP表达。(F)：通过RT-PCR测量的在H1.MP-DC中的MART-1表达。
图3：衍生自肿瘤抗原基因修饰的hPSC的DC呈递肿瘤抗原。(A)：GFP高H1.MP细胞在分选后的增殖。(B)：通过流式细胞术检测的在分选的GFP高H1.MP细胞中的GFP表达。(C):通过RT-PCR测量的在GFP高H1.MP细胞中的MART-1表达。(D)：通过免疫染色测量的在GFP高H1.MP细胞中的MART-1表达。(E)：通过五聚体染色和流式细胞术(初免/再刺激：无DC/无DC(上左图))检测到的由GFP高H1.MP衍生的DC对MART-1特异性CD8+ T细胞的扩增；MART1肽脉冲处理的H1-DC/H1-DC(上右图)；MART1肽脉冲处理的H1-DC/GFP高H1.MP-DC(下左图)；GFP高H1.MP-DC/GFP高H1.MP-DC(下右图)。
图4：用肿瘤抗原表位编码小基因对hPSC的修饰。(A)：携带MART-1表位编码小基因的慢病毒载体LV.ME的结构。(B)：通过流式细胞术检测的在H1.ME细胞中的GPF表达，其中H1.ME细胞是由LV.ME转导和G418选择生产的H1细胞系。(C):通过RT-PCR测量的在H1.ME细胞中的MART-1表达。(D)：通过免疫染色测量的在H1.ME细胞中的SSEA-4表达。
图5：肿瘤抗原表位编码小基因在衍生自经小基因修饰的hPSC的DC中表达。(A)：衍生自经小基因修饰的hPSC的DC(H1.ME-DC)的形态。(B)：H1.ME-DC的产率。统计学显著的区别通过双侧斯氏t检验确定(平均值±SD，n＝10)。(C):H1.ME-DC的表型。(D)：通过流式细胞术检测的在H1.ME-DC中的GFP表达。(E)：通过RT-PCR测量的在H1.ME-DC中的MART-1表位编码小基因表达。(F)：TNF处理后，在H1.ME-DC上的CD83表达。(G):TNF处理后，H1.ME-DC对CD4+ T细胞的异体刺激(Allostimulatory)功能。标出分裂的CD4+ T细胞的百分比。
图6：衍生自经小基因修饰的hPSC的DC高效地初免(prime)肿瘤抗原特异性T细胞应答。(A)：以0、1、5、10和20μg/ml浓度的MART-1肽脉冲处理的H1-DC对MART-1特异性CD8+ T细胞应答的诱导。(B至C):低响应性PBL中的H1.ME-DC对MART-1特异性CD8+ T细胞响应的诱导。抗原特异性T细胞经五聚体染色，并且在DC:PBL共培养9天后通过流式细胞术进行检测。(B)：代表性实验的等高线图。图中数字表示五聚体+CD8+细胞在总T细胞中的百分比。(C):实验的定量分析。统计学显著的区别通过双侧斯氏t检验确定(平均值±SD，n＝6)。(D至E)：高响应性PBL中的H1.ME-DC对MART-1特异性CD8+ T细胞响应的诱导。(F)：H1.ME-DC和MART-1肽脉冲处理的moDC的T细胞初免能力的比较。统计学显著的区别通过双侧斯氏t检验确定(平均值±SD，n＝5)。(G):延长培养后的H1.ME-DC和MART-1肽脉冲处理的H1-DC的T细胞初免能力的比较。H1-DC经MART-1肽脉冲处理，洗涤并在应用于初免之前进一步进行7天的培养。未经脉冲处理的H1-DC和H1.ME-DC作为对照。(H)：使用不同DC:PBL比(0,1:10、1:7.5、1:5和1:2.5DC:PBL)的H1.ME-DC对MART-1特异性CD8+ T细胞应答的诱导。
图7：通过衍生自经小基因修饰的hPSC的DC扩增的CTL具有免疫活性。(A)：大批培养(bulk culture)中H1.ME-DC对MART-1特异性CD8+ T细胞的扩增。对HLA-A2+PBL进行初免并且用H1.ME-DC进行两次再刺激。在该过程中的MART-1特异性T细胞扩增通过流式细胞术在指定的时间点进行监测。五聚体+CD8+细胞在总T细胞中的百分比以代表性的等高线图显示。(B)：H1.ME-DC扩增的MART-1特异性T细胞的表型。(C):H1.ME-DC扩增的MART-1特异性T细胞的GrB分泌通过ELISPOT进行测量。统计学显著的区别通过双侧斯氏t检验确定(平均值±SD，n＝3)。(D)：H1.ME-DC扩增的MART-1特异性T细胞的特异性细胞毒性。统计学显著的区别通过双侧斯氏t检验确定(平均值±SD，n＝3，*p<0.002)。
具体实施方式
树突状细胞(DC)是由Ralph M.Steinman教授于1973年首次发现，其在2011年被授予诺贝尔生理学或医学奖。DC疫苗在癌症免疫疗法的临床试验中已经进行了广泛的测试；丹德里昂公司的普罗文奇TM(ProvengeTM)是首个由FDA批准的用于前列腺癌的基于DC的疫苗。
相较于DC抗原加载的传统方法，本文所述方法提供了更为简单的抗原加载解决方案，其允许由已经用包括肿瘤抗原基因的抗原基因修饰的包括人PSC(hPSC)的多潜能干细胞(PSC)生产DC疫苗。这些经抗原性修饰的PSC可以分化成功能性抗原呈递DC。
具体地，使用包括以全长抗原基因或人工抗原表位编码小基因形式的抗原基因对PSC进行稳定地修饰。
这些经基因抗原性修饰的PSC可以分化成抗原呈递DC，其可被用于对抗原特异性T细胞应答进行初免，并且在再刺激过程中进一步扩增这些特异性T细胞。扩增的抗原特异性T细胞可以是具有中心记忆和效应物记忆表型的有效的抗原特异性效应物。
因此，具有免疫活性的抗原加载的DC可以使用本发明的方法直接由经抗原性修饰的PSC生成。使用这样的策略，可以将在分化的DC中完成的传统的抗原加载过程去除，因此显著地简化了DC疫苗的生产。
这一方法适用于各种不同的抗原类型，包括肿瘤、细菌、病毒和自身免疫疾病抗原，其使用全长序列和小基因两种形式的抗原基因，其中小基因编码选自全长序列的表位的重复。这些抗原基因的多肽产物可以被衍生的DC处理和呈递，其随后可能高效地诱导抗原特异性CD8+或CD4+ T细胞应答。
因此，具有免疫活性的抗原呈递DC可以由经抗原性修饰的PSC直接生成，从而相较于之前涉及DC的抗原加载的技术，消除了对于抗原荷载生产以及递送加载的额外的DC操作的需求。
这一新型抗原加载策略可以同样增强DC疫苗功效。对于抗原呈递途径，抗原是由引入前体PSC的转基因内源性合成的，并且因此表达的抗原或表位可以被自然地引导至内源性途径进行由MHC I类进行的呈递，这是对于用于癌症疫苗的DC所进行的肿瘤抗原呈递的优选途径。
除了MHC I型表位，MHC II型限制性表位可以通过用于疫苗的DC进行呈递。众所周知CD4+辅助T细胞也通过活化DC和产生最优细胞因子导致抗肿瘤免疫性[27]。活化CD4+辅助T细胞的DC疫苗同时可以进一步提高肿瘤抗原特异性CTL响应。通过使用包括HLA II型限制性表位的转基因，这一抗原加载策略还可以应用于将抗原呈递至CD4+ T细胞。
对于抗原呈递时间，抗原的组成型表达可以用于由转基因表达提供抗原的连续供应，这样可以通过衍生的DC延长抗原呈递，因此提高DC免疫原性。
从DC疫苗研发的角度出发，一批经抗原性修饰的PSC可以扩增并因此提供无限量标准化的抗原加载的DC。因此，这一过程因其标准化的DC的稳定供应可以用于优化DC疫苗的其它方面。
所以，本文提供了生产抗原加载的树突状细胞的方法。
该方法涉及用核酸分子对多潜能干细胞(PSC)的修饰，该核酸分子编码用于引起免疫应答的抗原，或编码这种抗原的一个或多个免疫原性表位。
如本文所述“细胞”，包括用于多潜能干细胞或树突状细胞时，在内容允许的情况下，旨在表示单细胞以及若干细胞或细胞群，除非另外说明。类似地，在内容允许的情况下，术语“多个细胞”或细胞的“群”也旨在表示单细胞，除非另外说明。。
细胞可以是体外细胞，可以生长在分批培养物或组织培养板，可以处于悬浮也可以附着在培养支撑物表面。可以将细胞配制成疫苗，并且可以给予对象从而可以在体内环境内出现。
用于该方法的多潜能干细胞可以是任何多潜能干细胞。多潜能干细胞是具有在该干细胞来源的生物体内分化成任何类型的细胞的潜能的任何未分化的干细胞。例如，多潜能干细胞可以分化成来自三胚层，内胚层，外胚层或中胚层之一的细胞，或由内胚层、外胚层或中胚层产生的任何细胞类型，包括部分分化或完全分化的细胞类型中任一细胞。多潜能细胞可以通过其多潜能标志物的表达进行鉴定，例如OCT4、TRA-1-60、SSEA-4、SOX2、KLF4、c-MYC、REX1、NONOG、LIN28和DNMT3B的一种或多种的表达。
多潜能干细胞可以是胚胎干细胞(ESC)，包括例如来自建立的细胞系的胚胎干细胞，包括市售可得的细胞系。胚胎干细胞可以衍生自体细胞核移植，即ntESC，或者可以衍生自通过单性生殖获得的未受经的卵，即pESC。
多潜能干细胞可以是诱导的多潜能干细胞(iPSC)。如本文所述，iPSC是从非多潜能原始细胞经诱导成多潜能状态的多潜能干细胞，例如，通过暴露于合适的条件和转录因子或其它在多潜能细胞中调控基因表达概况的蛋白质因子，部分或完全分化的细胞可以被诱导成具有多潜能。iPSC因此是经非多潜能原始细胞衍生的多潜能细胞，并且不是胚胎干细胞。用于从分化的细胞生成iPSC的方法是已知的，包括例如使用最初由Shinya Yamanaka教授在2006年鉴定的山中因子(Yamanaka factors)的方法，包括如Takahashi和Yamanaka(2006)细胞(Cell)126:663-676中所述。
PSC可以来自任何动物，包括哺乳动物，包括非人哺乳动物或人。在一些实施方式中，使用的PSC是人PSC(hPSC)。
PSC可以来自建立的细胞系，例如市售可得的ESC系或iPSC系。
如果DC被用于治疗，例如在疫苗中，PSC可以来自与产生的抗原加载的DC所要给予的物种相同的物种，并因此可以与进行治疗的对象是同种异体的。PSC可以是与进行治疗的对象部分MHC匹配的或完全MHC匹配的。PSC可以衍生自产生的抗原加载的DC所要给予的对象的细胞，并因此可以与进行治疗的对象是自体的。或者，PSC可以衍生自与对象基因相关的人，或可能与对象并不基因相关的健康的供体。
用于该方法中的PSC是用核酸分子修饰的，该核酸分子编码抗原或将由产生的DC呈递的抗原的一个或多个免疫原性表位。
抗原可以是能被核酸编码的任何抗原，并且希望其被DC表达和呈递，其中抗原呈递DC可以用做疫苗。抗原可以是具有蛋白性成分的全长抗原，如蛋白质或肽。全长抗原可以是在DC中表达后进一步经翻译后修饰的抗原，例如，糖蛋白或脂蛋白。
抗原可以是肿瘤抗原，例如，由肿瘤细胞表达的蛋白质或肽，其中肿瘤细胞通常并不在与肿瘤细胞相同的细胞谱系的健康的、非癌性细胞中表达。在一些实施方式中，肿瘤抗原可以是WT1、MUC1、EGFRvIII、HER-2、MAGE-A3、NY-ESO-1、PSMA、GD2、或MART1。
抗原可以是病毒抗原，例如组成病毒部分的蛋白质或肽，或者在受病毒表达机制控制的病毒感染的细胞中表达的蛋白质或肽。在一些实施方式中，病毒抗原可以是EBVLMP2、HPV E6 E7、腺病毒5 Hexon、或HCMV pp65。
抗原可以是细菌抗原，包括例如细菌表达的蛋白质或肽。在一些实施方式中，细菌抗原可以是牛型结核菌(Mycobacterium bovis)抗原。
抗原可以是与疾病相关的抗原，包括自身免疫相关抗原，例如涉及自身免疫疾病或病症或在其中过表达的抗原。在一些实施方式中，自身免疫相关抗原可以是ppIAPP、IGRP、GAD65、或髓磷脂碱性蛋白质抗原。
此外或或者，核酸分子可以编码一个或多个免疫原性表位。如本文所述，免疫原性表位(同样也称为表位)是被T细胞受体呈递和识别的抗原部分，例如，抗原的表位如本文所述。免疫原性表位可以是以5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸长度的氨基酸的线性序列的形式。
至于抗原，一个或多个免疫原性表位中的各免疫原性表位都具有由核酸编码的蛋白性部分，并且可以在DC中表达后进一步经翻译后修饰。
在各种实施方式中，核酸分子可以编码一、二、三、四、五、六、七、八、九或十个免疫原性表位。
超过一个免疫原性表位中的各免疫原性表位可以是相同的，或者可以是不同的表位。因此，如果超过一个免疫原性表位是由核酸分子编码的，那么所有的免疫原性表位可以具有相同的氨基酸序列，一些可以具有相同的氨基酸序列并且一些可以具有不同的氨基酸序列，或各自可以具有不同的氨基酸序列。为了提高T细胞对于表位的应答，在一些实施方式中，超过一个免疫原性表位是由核酸分子编码的并且超过一个免疫原性表位中的各免疫原性表位具有相同的氨基酸序列。
如果超过一个免疫原性表位是由核酸分子编码的，各免疫原性表位可以在不同的开放阅读框内编码，或者可以在相同的开放阅读框内编码。当在相同的开放阅读框中编码时，各免疫原性表位可以被氨基酸的间隔序列分隔。例如，各免疫原性表位可以被核酸分子编码的蛋白质序列中的1至20个氨基酸分隔。
核酸分子可以是包含抗原或一个或多个免疫原性表位的编码序列的任何核酸分子，并且其可以被转移至PSC，用于表达编码抗原或一个或多个免疫原性表位的序列。一些实施方式中，核酸分子是DNA。
核酸分子可以是能够稳定地维持在PSC和DC中的任何类型的核酸分子。例如，核酸分子可以是染色体外载体，其经复制和分裂以至于能稳定地维持在甚至扩增的细胞群中。或在另一示例中，可以将核酸分子插入宿主PSC内的染色体，并且因此染色体整合至PSC中。
因此，PSC可以用核酸分子进行稳定地修饰。
因此，在一些实施方式中，核酸分子是逆转录病毒载体，包括能够稳定地整合至其被引入的PSC的基因组的逆转录病毒载体。逆转录病毒载体包括，例如，MMLV载体，或慢病毒载体。在一些实施方式中，核酸分子是慢病毒载体。
应理解的是，可以将合适的启动子可操作地连接至抗原或一个或多个免疫原性表位的编码区域以实现在DC中表达，并且在一些实施方式中，可以这样选择以同样实现在PSC中表达。编码序列可操作地连接至启动子，前提是所述启动子激活该编码序列的转录。
启动子可以因此对于树突状细胞或衍生自外周血淋巴细胞或造血祖细胞的细胞是细胞类型特异性的。启动子可以是表达在PSC和DC中的遍在启动子。启动子可以是组成型启动子，例如在DC中具有活性的组成型启动子，或者其可以是包括任何必须的编码元件的诱导型启动子，如对诱导型启动子表达进行诱导所需的操纵子。
核酸分子可以还包括可以可操作地连接至编码序列的其它序列，或可以整合至编码序列开放阅读框的其它序列。
例如，为了将表达的蛋白质产物引导至MHC I抗原降解途径，并因此包含在DC内MHC I分子的抗原呈递，可以包括蛋白酶体靶向序列。蛋白酶体靶向序列是已知的，并且包括例如泛素序列。蛋白酶体靶向序列可以被纳入在开放阅读框中，因此当从该核酸分子表达时，其与抗原或一个或多个免疫原性表位的蛋白质部分融合。
在另一实施例中，为了将表达的蛋白质引导至核内体途径，可以包括核内体靶向序列和分选信号，用于在DC中通过MHC II分子进行抗原呈递。这样的核内体靶向序列或分选信号是已知的。核内体靶向序列或分选信号可以被纳入在开放阅读框中，因此当从该核酸分子表达时，其与抗原或一个或多个免疫原性表位的蛋白质部分融合。
以此方法，用核酸分子修饰PSC。PSC的修饰指使用分子克隆和重组技术将核酸分子引入细胞。这样的技术是本领域已知的，包括涉及使用核酸分子的细胞转染、转导或转化使得核酸分子被细胞摄取的技术。
可以使用核酸分子和导致PSC稳定修饰的方法对PSC进行修饰，从而使得未分化状态培养时，PSC维持核酸分子，在分化成DC的过程中，DC在分化后的培养中维持核酸分子，因此允许DC长期表达抗原或一个或多个免疫原性表位。例如，包含核酸的分化的DC在进行7天或更长、2周或更长、3周或更长、或4周或更长的培养后可以表达抗原或一个或多个免疫原性表位。
在一些实施方式中，稳定的修饰涉及将核酸分子整合进经修饰的PSC的基因组。例如，如果将逆转录病毒载体用作核酸分子，包括例如慢病毒载体，该逆转录病毒载体可以稳定的整合至经修饰的PSC的细胞DNA，并且由该经修饰的PSC进行细胞增殖或分化所产生的细胞也将包括插入细胞DNA内的核酸分子。
可能期望获得经修饰的PSC的富集细胞群。因此，在用核酸分子修饰PSC之后，使用细胞分选技术可以对细胞进行分选，以选择已经用核酸分子修饰的细胞。细胞分选技术是本领域已知的。在这种情况下，核酸分子可以包含表达标志物的表达构建体，该标志物可以使用细胞分选方法进行检测以鉴定经修饰的PSC并通过分选方法选择这样的经修饰的PSC。例如，标志物可以是在PSC，甚至是在未分化的状态下表达的荧光蛋白。例如，该标志物可以处于EF1α启动子的控制之下，其可以在PSC中表达。
已经用核酸分子修饰的PSC其后经诱导分化成树突状细胞。本文所使用的诱导分化指提供合适的生长条件，包括含有适当生长因子和营养物质的培养基，PSC分化成DC所必须的温度和时间。
诱导PSC成为树突状细胞的分化方法是本领域所熟知的并且之前已经进行了描述[9、10、12、31]。例如，PSC可以与饲养细胞共培养以获得髓系祖细胞，随后对其进行扩增并进一步分化成树突状细胞。
分化的DC可以从核酸分子表达并呈递抗原或一个或多个免疫原性表位。因此，一旦分化，为了表达抗原，在允许从核酸表达抗原的条件下对DC进行培养，包括存在调节编码抗原或一个或多个免疫原性表位的编码序列表达所需的任何转录因子或调节因子。抗原的表达可以处于DC中具有组成型活性的启动子的控制之下，其可以在将DC给予对象用于治疗之后促进抗原表达。然而，在一些实施方式中，抗原或一个或多个免疫原性表位的编码序列可以处于诱导型启动子的控制之下。在这样的情况下，诱导来自启动子的表达所需的任何因子或条件也是同样包括在培养条件中。
一旦抗原或一个或多个免疫原性表位在DC中表达，抗原或免疫原性表位因此由DC呈递。
通过抗原呈递细胞，包括DC，进行的MHC I抗原呈递涉及通过蛋白酶将抗原内部蛋白酶水解消化成肽片段，以及将该片段转运至内质网，其中肽被加载至包含MHC I分子的肽加载复合物。MHC I分子将识别并结合片段，并且其后将MHC I/肽复合物转运至细胞膜的外表面，这使得MHC I/肽复合物被识别并且活化适当的CD8+ T细胞群。
除了MHC I抗原和表位，可以使用MHC II型抗原和表位。一旦在细胞中表达，可以通过核内体分选信号将胞质抗原分选至核内体，其后进行抗原的降解，并且通过MHC II分子识别和结合。其后将MHC II/肽复合物转运至细胞膜的外表面，这使得MHC II/肽复合物被识别并且活化适当的CD4+ T细胞群。
如果需要，DC可以进一步通过在存在细胞因子的情况下培养来成熟，例如，肿瘤坏死因子(TNF)或其它成熟混合物，例如脂多糖(LPS)与干扰素(IFN-)一起，或其它成熟试剂，如例如Toll样受体的激动剂(TLR激动剂)。再将DC给予对象之前对其进行成熟可以提高DC在给予对象之后对适当的T细胞应答进行初免和再刺激的能力。
因此，该方法产生了经基因修饰的DC，其导致期待的抗原或表位的表达和呈递。对于给予DC的疫苗，DC的抗原加载是最重要的步骤之一，并且有效定义了由DC疫苗所引起的抗肿瘤免疫应答的特异性。本文所述方法使用多潜能干细胞的基因修饰，其随后分化成树突状细胞。在分化后使用对多潜能干细胞的基因修饰可以获得稳定表达所需抗原的DC群，其中可以将表达维持较长的一段培养时间，例如，7天，或更长。
这一生产DC的方法因此消除了对于肽脉冲、蛋白质加载、肿瘤裂解物加载、RNA/DNA转染或病毒转导这些前述常用技术的需要[11]。避免之前已知抗原加载方法同样避免了额外的细胞操作。使用多潜能干细胞以衍生DC种群可以提供具有足够数量细胞的具有一致性的细胞来源，从而允许进行大规模的DC疫苗生产，因此避免了小批次疫苗生产中所见的批次与批次间的不一致性。
因此，该方法使用经基因修饰的PSC生产了呈递所期待的抗原或表位的DC。
相应地，本文还提供了树突状细胞，其衍生自已经用编码抗原或其一个或多个免疫原性表位的核酸分子稳定修饰的多潜能干细胞。
因此，该DC能够表达并呈递核抗原或一个或多个免疫原性表位。
因此，当在导致抗原或一个或多个免疫原性表位表达的条件下进行培养之时，DC可以通过抗原或一个或多个免疫原性表位在细胞表面的呈递进行鉴定。可以例如通过测试DC刺激抗原特异性T细胞应答的能力确定在DC上的抗原呈递。
同样，DC表达DC特异性细胞标志物，其可以包括例如CD11c、CD40、CD83、CD86和HLA-DR中的一种或多种。
由于抗原或一个或多个免疫原性表位的呈递，DC能够诱导T细胞应答。也就是，DC能够在T细胞群中初免抗原或表位特异性应答，或者能够对已经用特异性抗原或表位初免的T细胞群进行再刺激。因此，有可能通过将抗原呈递DC与T细胞群孵育对T细胞群进行测试，并且检测T细胞群在应答中是否成为初免的、再刺激的或扩增的。同样，已经暴露于抗原或表位的T细胞群可以使用标记的表位进行对响应的测试。
如上所述，初免或再刺激的T细胞群可以是CD8+或CD4+ T细胞群，这取决于MHC I或MHC II分子是否分别呈递抗原。
DC可以根据所述方法生产。
DC可以包含在细胞的群中，并且因此这样还提供了含有DC的细胞的群或若干细胞。
在细胞的群中，大多数或所有的细胞可以是呈递抗原或一个或多个免疫原性表位的DC。例如，呈递抗原或一个或多个免疫原性表位的经基因修饰的DC占细胞的群的比例可以是至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％。在一些实施方式中，呈递抗原或一个或多个免疫原性表位的经基因修饰的DC的比例可以是从约50％至约75％，或约55％至约60％。
该群含有来源于PSC的DC。因此，该群可以还包含未分化的PSC，部分分化的PSC，并且甚至一些转分化的细胞，虽然在一些实施方式中绝大部分的细胞，甚至所有的细胞会是DC。
为了提高群中呈递抗原或一个或多个免疫原性表位的DC的细胞在细胞种群中的比例，可以针对呈递抗原或一个或多个免疫原性表位的DC对群进行富集，例如通过使用细胞分选技术。
将PSC，包括hPSC用于本文所述的方法以衍生经编码所需要的抗原或其一个或多个免疫原性表位的核酸分子修饰的DC可以产生一致性的和可再生的细胞来源，用于疫苗生产。因此，所述方法产生了经抗原性修饰的DC，其可以进行集中的和大规模的DC疫苗生产，以及当iPSC是衍生自将要接受该疫苗治疗的对象时进行的DC疫苗的量身定制。本文所述通过基因修饰分化成抗原呈递DC的的前体hPSC制备经抗原性修饰的DC的方法避免了任何传统抗原加载步骤，因此简化了生产过程。
因此，经基因修饰的DC，如那些衍生自所述方法的DC可以用于对抗原特异性T细胞应答进行初免和放大，或对DC呈递的抗原或表位的抗原免疫T细胞应答进行再刺激和放大。这些扩增的抗原特异性T细胞可以作为具有中心记忆或效应物记忆表型的免疫活性抗原特异性效应物，并且因此可以当DC作为疫苗给予之时，将针对抗原或表位的免疫应答赋予个体。相应地，DC，包括当其包含在群或若干细胞中之时，可以配制成疫苗以给予对象。
因此，本文还提供了含有如本文所述的树突状细胞的疫苗。
为了提供包含有效量的DC的剂量，对包括在疫苗中的DC的浓度进行选择。本文所使用的术语“有效量”指按照一定剂量和必要时间能够实现所需结果的量，例如，在对象体内对抗原进行初免或加强免疫应答所需要的量。
例如，可以将疫苗配制成提供从约1x 105至约1x 109的DC、或约1x 106至约1x 108的DC、或约1x 106至约5x 107的DC的剂量。
在一些实施方式中，疫苗的最初的初免剂量可以包含比后续加强的再刺激剂量更高计数的DC。
在疫苗中，DC在溶液中活体配制。
溶液可以因此包含药学上可接受浓度的盐、缓冲剂、防腐剂和各种相容性运载体，这样可以协助维持在该制剂中的活细胞。包含细胞的溶液可以因此被设计成与细胞等张，并且还可以进行pH缓冲处理。因此，当在疫苗中配制之时，运载体溶液可以被设计成为了防止、最小化或减少疫苗给予对象之前的细胞裂解。
如果疫苗将要冷冻储存，疫苗可以包括冷冻保护剂，例如DMSO。
如果需要，疫苗可以进一步包括佐剂，从而协助免疫应答的诱导或再刺激，包括延长或加强免疫应答。合适的佐剂是本领域已知的，包括加强T细胞应答的佐剂。例如，佐剂可以包括明矾佐剂、弗氏佐剂、胞壁肽、环磷酰胺、ISCOMS、MAPS、胸腺素α1、左旋咪唑、异戊肌苷或TLR配体。
溶液中包括的各种成分的比例和种类由选定的给药途径、与活细胞的相容性、和标准药学实践确定。通常，疫苗会与不会杀伤或显著损伤DC的生物学特性的组分一起配制。
本领域技术人员已知如何制备合适的疫苗制剂。用于选择和制备合适疫苗以及活细胞制备物的传统方法和成分在例如《雷明顿药物科学》(Remington's PharmaceuticalSciences)和美国药典：国家处方集中有所描述。
可以因此将DC和疫苗用于产生免疫应答，包括初免初始应答或再刺激或加强已经初免的T细胞中的应答。
因此，本文提供了诱导免疫应答的方法。免疫应答受到DC，包括当其配制成疫苗之时与T细胞接触的影响。
T细胞可以是体外T细胞，包括CD4+ T细胞或CD8+ T细胞，并且因此可以将DC和/或疫苗用于体外方法以活化、初免或再刺激体外T细胞群。
DC，包括当其配制成疫苗之时还可以用于在对象体内引发免疫应答，包括如本文所述的T细胞介导的免疫应答。
因此，可以将DC或疫苗给予希望产生针对抗原或一个或多个免疫原性表位的免疫应答的对象。在一些实施方式中，将包含DC的疫苗给予对象。
免疫应答可以是T细胞介导的免疫应答，意味着DC表面上呈递的抗原或一个或多个免疫原性表位能够被T细胞识别并且能够诱导T细胞内的应答，这样使得T细胞扩增，从而提供抗原特异性T细胞群。T细胞介导的免疫应答可以是初级应答，其中T细胞之前并未暴露于抗原或表位，或者其可以是对之前已经暴露于抗原或表位的T细胞或是对扩增自之前已经暴露于抗原或表位的T细胞的扩增群内的细胞的再刺激。T细胞可以是CD8+ T细胞，或者可以是CD4+ T细胞。
对象可以是任何需要在其体内诱导针对抗原或一个或多个免疫原性表位的免疫应答，或需要针对抗原或一个或多个免疫原性表位的免疫性的动物，包括哺乳动物，包括非人哺乳动物或人。在一些实施方式中，该对象是人。
对象可能需要针对病原体，包括病毒或细菌病原体的免疫性。对象可能需要针对疾病的治疗，其中该疾病可以通过免疫疗法治疗，包括例如癌症。癌症可以是，例如，黑素瘤、结直肠癌、胶质瘤、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胰腺癌、或胃肠癌。
对象可能先前已经暴露于抗原或其一个或多个免疫原性表位。例如，对象可能之前已经接种了针对病原体的疫苗，或者可能已经与衍生抗原或一个或多个免疫原性表位的病原体接触。对象可能患有与抗原的表达相关联的疾病。
在其他实施方式中，在给予疫苗之前，对象可能先前并未暴露于抗原。
DC或疫苗可以通过注射，包括例如，静脉内、皮下、皮内、或节内给予。如果DC表达肿瘤抗原，为了避开位于该肿瘤附近的淋巴结，可能需要选择远离该肿瘤的注射位置，这可能会受到肿瘤衍生的免疫抑制因子的影响，并且因此有可能会使得给予的DC被耗尽。
将有效量的疫苗给予对象从而诱导或引发如本文所指所需的免疫应答，包括初始应答的初免或之前刺激的应答的再刺激。
待给予的疫苗的浓度和数量以及剂量的数量和时间是变化的，这取决于各种因素，包括抗原或一个或多个免疫原性表位的种类，将要引发的免疫应答的类型，疫苗的给予是否用于防止病原体感染还是治疗疾病或紊乱，治疗的持续时间，以及给药的模式，对象的年龄和健康，同步治疗的性质(如果有)，给药的特殊途径和其它类似因素。这些因素是本领域技术人员已知的，并可用最少的常规实验解决。
疫苗可以以一个或多个剂量给予。例如，DC或疫苗可以以初始初免剂量给予，随后给予一个或多个加强剂量，或者以合适的间隔以一个或多个加强剂量给予。
后续加强剂量的时间和大小可以变化，这取决于抗原对T细胞应答的初免和/或再刺激的能力。例如，基于引发的T细胞应答的强度，肿瘤抗原可能需要更频繁的加强方案。
疫苗可以与其它疗法联合给予。例如，疫苗可以与衍生自衰减的或灭活的病原体或裂解物或病原体的组分的传统疫苗联合给予。疫苗可以与对于疾病的治疗联合给予，如任何可以受益于免疫疗法治疗的疾病，包括例如癌症。
如果与其它疗法联合给予，疫苗可以与其它疗法同时给予，包括与用于其它疗法的药剂一起配制或分开配制。
疫苗和其它疗法可能在重叠的时间给予，这意味着在用疫苗进行治疗的时间段中的至少一部分与用其它疗法进行治疗的时间段中的至少一部分是同时发生的。疫苗可以与其它疗法依次给予，包括在其它疗法的时间段之前的时间段，或在其它疗法的时间段之后的时间段。
如上所述，疫苗内包含的DC与对象可以是同种异体的。因此，DC可以衍生自与对象相同的物种，并且可以是与对象部分MHC匹配的或完全MHC匹配的。DC可以衍生自PSC，其中PSC是衍生自与对象基因相关的人，或可能与对象并不基因相关的健康的供体。
不同于在再生药物的情况下长期移植需要HLA匹配的移植，在基于DC的疗法中，因为DC的长期存活不是必须的，组织相容性的要求并不严格。然而，在这样同种异体的情况下，应当对DC进行选择，从而在被对象的异常反应性的细胞毒性淋巴细胞清除之前诱导和免疫应答。
包括在疫苗中的DC可以是对象自体的，并且因此可以衍生自来自对象的PSC。
还考虑了所述DC和疫苗的用途，与本文所述的方法保持一致，包括DC或疫苗用于在对象中诱导免疫应答，或制备用于在对象内诱导免疫应答的药剂的用途。同样，所述DC或疫苗可以用于本文所述的用途，包括用于在对象内诱导免疫应答。
本文所述的方法、树突状细胞、疫苗和用途通过下文非限制性实施例进一步说明。
实施例
材料和方法
细胞培养和DC生成
hPSC系——H1(WiCell研究中心(WiCell Research Institute)，麦迪逊，威斯康辛州)通过无血清和无饲养细胞培养系统使用mTeSR1培养基(干细胞技术公司(StemCellTechnologies)温哥华，不列颠哥伦比亚省，加拿大)和基质胶(BD生物科学公司(BDBiosciences)圣地亚哥，加利福尼亚)包覆的六孔板按照生产商的技术手册进行维持。OP9细胞(美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)[ATTC]，马纳萨斯，维吉尼亚州)用补充有20％胎牛血清(FBS)(海克隆公司(HyClone)，洛根，犹他州)的α-MEM(生命技术公司(Life Technologies)，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)培养。T2细胞(ATCC)用补充有20％FBS的IMDM(生命技术公司)培养。
为了由H1细胞衍生出人DC，我们使用了如之前所述的三步法[9、10、12]。简言之，将OP9细胞接种到0.1％明胶(西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)，圣路易斯，密苏里州)包覆的T75烧瓶。铺满后，通过替换一半的培养基进料培养物，然后进行4至6天的过度生长。随后，将1-1.5x106H1细胞接种到补充有10％FBS和100μM单硫代甘油(西格玛-奥德里奇公司)的α-MEM中的过度生长的OP9细胞上并进行分化。饲养共培养物，在第4天和第六天替换一半的培养基，并且在第9天使用1mg/ml胶原酶IV(生命技术公司)和0.05％胰蛋白酶-0.5mM EDTA(生命技术公司)收获共培养物。使用补充有10％FBS、100μM单硫代甘油和100ng/ml GM-CSF(派罗科技公司(Peprotech)，洛基山脉，新泽西州)的α-MEM，在聚2-甲基丙烯酸羟乙基酯(西格玛-奥德里奇公司)包覆的T75烧瓶中，对收获的细胞进行进一步10天的培养。为了产生人DC，使用25％Percoll溶液(西格玛-奥德里奇公司)通过密度梯度离心对这些细胞进行纯化，并在补充有1％脂质混合物1(西格玛-奥德里奇公司)、100ng/ml GM-CSF和100ng/ml IL-4(派罗科技公司)的StemSpan无血清扩增培养基(干细胞技术公司(StemCell Technologie))中进行8至12天的培养。
为了获得人外周血淋巴细胞(PBL)，将来自健康供体的冷冻的HLA-A2+PBMC(干细胞科技公司)融化并在完全RPMI 1640培养基中培养，其包含补充有10％热灭活人血清AB(双子座生物制品公司(Gemini Bio-Products)，西萨克拉门托，加利福尼亚州)、2mML谷氨酰胺(生命技术公司)、0.1mM非必需氨基酸(生命技术公司)和0.1mM 2-巯基乙醇(生命技术公司)的RPMI1640(生命科技公司)。孵育2小时之后，收获悬浮的细胞为PBL。为了衍生出moDC，塑料粘附细胞在DC分化培养基中进行6天的分化。
慢病毒载体制备和hPSC修饰
使用两种不同的转移质粒生成两种类型的慢病毒载体。为了构建携带肿瘤抗原基因MART-1的转移质粒，通过PCR从质粒MART-1(ATCC)中克隆出MART-1的编码序列，从而包括其启动密码子上游的Kozak序列以及位于其末端的EcoRI和BamHI限制性位点。这两个位点用于将MART-1基因插入
pCDH-EF1-MCS-IRES-coGFP-Neo(系统生物科学公司(System Biosciences)，山景市，加利福尼亚州)。为了构建携带编码HLA-A2限制性MART-1表位的4个重复的基因(MART-126-35A27L，ELAGIGILTV[SEQ ID NO:1])的另一个转移质粒，合成了小基因(1st Base公司，新加坡)。该小基因编码的氨基酸序列如下：
在上面的序列中，泛素序列(斜体和下划线)处于4个MART-1表位的序列(黑体和下划线)之前，用于蛋白酶体靶向，并且密码子使用针对在人细胞中表达进行了优化。克隆小基因，并且使用NheI和BamHI位点将其插入pCDH-EF1-MCS-IRES-coGFP-Neo。通过共转染293FT细胞(生命科技公司)，使用上述构建和包装质粒(系统生物科学公司)生成慢病毒载体，并命名为LV.MP和LV.ME。在连续稀释和后续的抗生素选择后，使用293FT，通过使用病毒转导，确定病毒效价。
为了对H1细胞进行基因修饰，将H1细胞团以低细胞密度接种到基质胶包覆的6孔板。两天后，通过与LV.MP或LV.ME以10的MOI进行6小时的孵育来转导H1细胞。在转导进行3天后，开始使用50μg/ml G418(生命科技公司)的抗生素选择。为了下游试验，将所得G418-抗性H1系用于衍生DC，所得G418-抗性H1系被称之为H1.MP或H1.ME，而DC被称之为H1.MP-DC或H1.ME-DC。
RT-PCR和免疫染色。
为了检测MART-1基因或小基因表达，使用TRIzol试剂(生命科学公司)抽提经修饰的H1细胞或其DC后代的总RNA。其后，使用用于RT-PCR的SuperScript III第一链合成系统合成第一链cDNA(生命技术公司)。利用PCR SuperMix(生命技术公司)使用1μl的cDNA反应混合物对整个MART-1或小基因进行扩增。PCR产物通过在1％琼脂糖凝胶中的电泳分离。
为了检测MART-1蛋白质表达，用4％多聚甲醛(西格玛-奥德里奇公司)固定经修饰的H1细胞并与针对MART-1的一抗(圣克鲁兹生物技术公司(Santa Cruz Biotechnology)，达拉斯，德克萨斯州)孵育1小时。在洗涤后，使用二抗山羊抗-小鼠IgG-TR(圣克鲁兹生物技术公司)，用于荧光显微镜下可视化。
肿瘤抗原特异性T细胞的初免、扩增和检测
为了初免肿瘤抗原特异性T细胞应答，1x105的经修饰的H1衍生的DC使用20ng/mlTNF(Peprotech公司)成熟1天，并且与1x106的HLA-A2+PBL在完全RPMI培养基中共培养。未经修饰的H1衍生的DC(H1-DC)和经过10μg/ml的MART-1肽(ELAGIGILTV)(ProImmune公司(ProImmune)，牛津，英国)4小时脉冲处理的H1-DC分别用做阴性对照和阳性对照。在共培养9天后，使用APC小鼠抗-人CD3(BD生物科学公司)、FITC-标记的抗-CD8(ProImmune公司)和R-PE-标记的A*0201/ELAGIGILTV五聚体(ProImmune公司)对样品进行染色。MART-1-特异性CD8+ T细胞使用FACSAria流式细胞仪(BD生物科学公司)进行检测。
为了扩增MART-1-特异性CD8+ T细胞，以2x106的H1.ME-DC和20x106的PBL开始进行大批培养。在孵育9天后，每周两次以1：10的DC:PBL比用H1.ME-DC再刺激细胞。使用H1-DC刺激的大批培养物用作对照。对大批培养物中的MART-1-特异性CD8+ T细胞进行染色并通过FACSAria流式细胞仪监测。
流式细胞术和异体刺激(allostimulation)试验
为了研究H1.ME-DC的表型，使用针对CD11c、CD40、CD83、CD86、HLA-DR和HLA-A2的抗体(BD生物科学公司)对这些细胞进行染色，并且使用FACSCalibur流式细胞仪(BD生命科学公司)进行分析。为了在多次刺激后检查MART-1-特异性CD8+ T细胞的表型，在使用FACSAria流式细胞仪进行分析之前，使用R-PE-标记的A*0201/ELAGIGILTV五聚体和针对CD8、CD45RA和CD62L的抗体(BD生物科学公司)对细胞进行染色。
为了测量DC的异体刺激(allostimulatory)功能，溶解冷冻的人外周血全T细胞(pan-T cell)，并且用二乙酸羧基荧光素琥珀酰亚胺基酯(CFSE；生命技术公司)如之前所述进行标记[9]。为了开始异体刺激实验，2X 105的CFSE-标记的全T细胞与DC在各种DC：T细胞比下共培养。孵育5天之后，使用APC小鼠抗-人CD4抗体(BD生物科技公司)对样品进行染色，并且在使用FACSAria流式细胞仪门选CD4+群后，通过CFSE稀释对CD4+ T细胞增殖进行评价。
ELISPOT和细胞毒性试验
使用人颗粒酶B ELISpot试剂盒(R&D系统公司(R&D Systems)，明尼阿波利斯，尼苏达州)对GrB分泌进行测量。简言之，105扩增的T细胞和105的MART-1肽脉冲处理的T2细胞在人GrB微板上进行4小时的共培养。其后如生产商的技术手册所述对GrB斑点进行染色，并且使用免疫斑点分析仪(ImmunoSpot Analyzer)(CTL公司，榭柯高地，俄亥俄州)进行计数。
为了测量扩增的MART-1-特异性T细胞的细胞毒性，进行了基于流式细胞术的VITAL-FR试验[13]。简言之，使用CFSE进行染色并用MART-1肽脉冲处理的T2细胞被用做特异性靶细胞，同时CSFE染色的经HLA-A2-限制性WT1肽(WT1126–134，RMFPNAPYL[SEQ ID NO:3]；ProImmune公司)脉冲处理的T2细胞被用做非特异性靶细胞。使用远红DDAO-SE(FR；生命科技公司)染色并经gp120肽(HIV-1env gp12090–98，KLTPLCVTL[SEQ ID NO:4]，ProImmune公司)脉冲处理的T2细胞被用做内部对照靶细胞。经过H1.ME-DC或H1-DC多次刺激后，PBL与4X 104的靶细胞和4X 104的内部对照靶细胞以指定的效应物：靶标(E:T)比进行共培养。不含效应细胞的内部对照靶细胞和靶细胞的共培养物被用于比较。经过夜孵育，通过FACSAria流式细胞仪对所有的样品进行评估，并且在各E：T比下的特异性裂解的％以如下所述进行计算：特异性裂解的％＝[1-(靶细胞数量/内部对照靶细胞数量)对应E:T比/(靶细胞数量/内部对照靶细胞数量)没有效应物]X 100％。
为了测量扩增的MART-1-特异性T细胞的细胞毒性，进行了基于流式细胞术的VITAL-FR试验[13]。简言之，使用二乙酸羧基荧光素琥珀酰亚胺基酯(CFSE；生命技术公司)进行染色并用MART-1肽脉冲处理的T2细胞被用做特异性靶细胞，同时远红DDAO-SE(FR；生命科技公司)染色并用120肽(HIV-1envgp12090-98，KLTPLCVTL；ProImmune公司)脉冲处理的T2细胞被用对照靶细胞。扩增的MART-1特异性T细胞与4x104的特异性靶细胞和4x104的对照靶细胞以指定的效应物：靶标(E：T)比进行共培养。不含效应细胞的特异性靶细胞和对照靶细胞的共培养物被用作对照。经过夜孵育，通过FACSAria流式细胞仪对所有的样品进行评估，并且在各E：T比下的特异性裂解的％以如下所述进行计算：特异性裂解的％＝[1-(特异性靶细胞数量/对照靶细胞数量)对应E:T比/(特异性靶细胞数量/对照靶细胞数量)没有效应物]X100％。
统计
统计学显著的区别通过双侧斯氏t检验确定。认为p值<0.05时有统计学显著性。
结论
肿瘤抗原基因修饰的hPSC生产肿瘤抗原表达型DC
为了研究hPSC是否可以被肿瘤抗原基因修饰并随后用于衍生肿瘤抗原表达型DC，我们生成了携带MART-1基因的慢病毒载体，并将其命名为LV.MP(图2a)。LV.MP同样包含作为报告子的GFP基因和用于药物选择的新霉素耐药性基因(图2a)。该慢病毒载体用于转导hPSC系——H1。在用G418选择后，生成G418抗性H1系。这些系中的一个，H1.MP表现出大量的GFP表达(图2b)。此外，在H1.MP中同样观测到MART-1表达，其在RNA水平(图2c)和蛋白质水平(图2d)上证明。H1.MP系和亲本H1系其后用于生成DC，并分别被命名为H1.MP-DC和H1-DC。尽管GFP和MART-1仍然在H1.MP-DC中表达，其表达水平较低(图2e、图2f)。这些结果表明从经肿瘤抗原基因修饰的hPSC衍生肿瘤抗原表达型DC是可行的。然而，在这些DC中肿瘤抗原表达水平的进一步增加可能会增加DC表面上的抗原呈递。
衍生自肿瘤细胞抗原基因修饰的hPSC的DC呈递肿瘤抗原
为了在hPSC-DC中获得较高水平的肿瘤抗原表达，通过荧光活化细胞分选，对GFP高H1.MP细胞进行富集。通过在分选后进行的细胞增殖，证明了这些GFP高H1.MP细胞在细胞分选过程中存活(图3a)。获得的H1细胞系不仅表现出高百分比的GFP+细胞(图3b)，而且通过RT-PCR(图3c)和免疫染色(图3d)证明了MART-1表达的增强。使用这些GFP高H1.MP细胞，我们衍生了DC并且检查了其肿瘤抗原呈递。如图3e所示，这些GFP高H1.MP衍生的DC在再刺激过程中高效地扩增了初免的MART-1-特异性CD8+ T细胞。然而，我们同样观测到当使用这些DC进行初免时，并没有出现特异性T细胞应答。这表明肿瘤抗原是由这些hPSC-DC表达、加工并呈递的。对于一些抗原，为了对T细胞应答进行初免，可能需要提高抗原呈递水平。
用肿瘤抗原表位编码小基因对hPSC的修饰
除了肿瘤抗原表达水平，DC对于肿瘤抗原处理效率对于DC表面上的抗原呈递是同等重要的。目前的研究已知DC的免疫蛋白酶体未充分处理一些肿瘤抗原，包括MART-1[14]。为了促进MART-1抗原处理并且因此增强在hPSC-DC上的MART-1抗原呈递，我们生成了另一个慢病毒载体——LV.ME，从而对H1细胞进行抗原性修饰(图4a)。并非携带全部的MART-1基因，该LV.ME携带了包含用于蛋白酶体靶向的泛素序列的小基因以及4个MART-1表位的序列，从而促进抗原处理以及增加抗原性表位拷贝数。通过获得的细胞系——H1.ME中显著的GFP表达证明了慢病毒载体能够高效地修饰H1细胞(图4b)。RT-PCR结果表明小基因同样在这些H1.ME细胞中表达(图4c)。此外，通过在H1.ME细胞中典型的hPSC形态和SSEA-4表达表明这样使用小基因的基因修饰并不影响“干细胞”状态(图4d)。
肿瘤抗原表位编码小基因在衍生自经小基因修饰的hPSC的DC中表达
为了研究经小基因修饰的hPSC是否仍然可以生成DC，以及这样生成的DC是否仍然表达肿瘤抗原表位编码的小基因，我们使用之前所述[9、10、12]三步法从H1.ME细胞衍生了DC。获得的H1.ME-DC与自从未经修饰的H1细胞衍生的DC在形态(图5a)和表型(图5c)上是相似的。经修饰的H1.ME-DC表达像CD11c、CD86、CD40和HLA-DR这些典型的DC表面标志物，但是很少CD83(图5c)，这表明其是未成熟的DC表型。经修饰的H1.ME-DC也表达HLA-A2(图5c)，这是在本研究中对于MART-1表位呈递重要的MHC I型分子。来自H1.ME细胞的DC的产率与来自H1细胞的同样类似(图5b)。就转基因表达而言，经流式细胞仪测量超过半数的这些H1.ME-DC仍然是GFP+(图5d)；更为重要的是，在这些H1.ME-DC中检测到明显的小基因表达(图5e)。这些结果表明经小基因修饰的hPSC能够分化成小基因表达型DC。为了进一步成熟，H1.ME-DC用20ng/ml TNF培养1天。这一TNF处理上调了在H1.ME-DC上CD83表达(图5f)并且增强了它们在CD4+ T细胞上的异体刺激功能(图5g)，这表明了这些DC的免疫原性性质。
衍生自经小基因修饰的hPSC的DC高效地初免肿瘤抗原特异性T细胞应答
为了检测这些肿瘤抗原表位编码小基因的表达产物是否可以在由经小基因修饰的hPSC衍生的DC中高效地进行处理和呈递，我们评估了H1.ME-DC初免MART-1-特异性CD8+T细胞应答的能力，并且将其效力与用10μg/ml MART-1肽脉冲处理的H1-DC进行了比较，其中这是加载h1-DC的最佳肽浓度(图6a)。H1.ME-DC与来自健康供体的HLA-A2+外周血淋巴细胞(PBL)共培养。9天后，MART-1特异性T细胞通过五聚体染色进行鉴定。如低响应性的PBL所示，H1.ME-DC高效地初免了MART-1-特异性T细胞应答，并且这一效力显著好于使用常用抗原加载方法制备的MART-1肽脉冲处理的H1.DC(图6a和图6b)。使用高响应性PBL获得了相似的结果(图6d和图6e)，这更加证实了小基因产物在H1.ME-DC中被高效地处理，并且获得的肿瘤抗原表位被充分地呈递到H1.ME-DC上用于T细胞初免。此外，这样产生的H1.ME-DC比用MART-1肽处理的常用的moDC更为高效(图6f)。
在这两种类型的DC中MART-1表位呈递的持续性是相当的。经4小时肽脉冲处理，洗涤MART-1肽脉冲处理的H1-DC，并在应用于初免之前进一步进行7天的培养。未经脉冲处理的H1-DC和H1.ME-DC作为对照。在该延长培养之后，MART-1肽脉冲处理的H1-DC不再诱导特异性T细胞应答；相反，H1.ME-DC维持T细胞初免能力(图6g)。该结果表明H1.ME-DC相较于MART-1肽脉冲处理的H1-DC具有更加持续的MART-1抗原呈递，其中前者可以从小基因表达持续供应MART-1表位。为了探究在T细胞初免中使用高剂量DC可能带来的效益，我们开始以各种DC：PBL比进行使用H1.ME-DC和HLA-A2+PBL的共培养(图6h)。该结果表明H1.ME-DC能够以宽范围的DC：PBL比诱导特异性T细胞应答，尽管在比例超过1：5之后并无明显的效益增加。
通过衍生自经小基因修饰的hPSC的DC扩增的CTL具有免疫活性
为了测试H1.ME-DC在大批培养中是否能够扩增特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，首先初免HLA-A2+PBL，然后使用H1.ME-DC进行两次再刺激。在该过程中的MART-1-特异性T细胞扩增通过五聚体染色监测。如图7a所示，在每次用H1.ME-DC再刺激后，MART-1-特异性T细胞群继续增长，但是用H1-DC并没有出现该情况。有趣的是，这些扩增的MART-1-特异性CTL主要具有中心记忆和效应物记忆表型(图7b)，这与具有更好的抗肿瘤免疫性的较少分化的T细胞群相关。为了测试这些扩增的CTL的功能，通过ELISPO对颗粒酶B(GrB)的分泌进行检测。如图7c所示，由H1.ME-DC扩增的CTL响应MART-1肽脉冲处理的T2细胞的刺激。此外，这些CTL在多次刺激之后并未出现功能耗尽。如细胞毒性试验所示它们能够特异性地杀伤靶细胞(图7d)。这些结果表明H1.ME-DE对于特异性CTL扩增是感受态抗原呈递细胞。
本说明书引用的所有发表物和专利申请通过引用纳入本文，就好像各发表物或专利申请特定和单独地通过引用纳入本文那样。任何出版物的引用针对提交日之前的公开而不应解释为承认本发明不具有通过在先发明先于这些出版物的权利。
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虽然出于阐明目的已经通过说明和举例的方式对本发明有所描述，但本领域普通技术人员根据本发明的教导不难了解，可以对本发明作出某些改变和修改而不背离本发明的范围。
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序列表
<110> 新加坡科技研究局（Agency for Science, Technology and Research）
J·曾(Zing, Jieming)
S·王(Wang, Shu)
<120> 树突状细胞的抗原加载的方法和疫苗
<130> 93231-930
<150> SG 10201502560Q
<151> 2015-03-31
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含MART-1 26-35 (A27L)表位的肽片段
<400> 1
Glu Leu Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val
1 5 10
<210> 2
<211> 142
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含泛素序列和4个MART-1突变表位的构建的肽
<400> 2
Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu
1 5 10 15
Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp
20 25 30
Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys
35 40 45
Gln Leu Glu Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu Ser
50 55 60
Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Val Val Asn Ser Glu Phe
65 70 75 80
Lys His Glu Glu Leu Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val Ala Glu Phe
85 90 95
Lys Ser Glu Glu Leu Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val Ala Glu Glu
100 105 110
Glu Leu Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val Ala Glu Glu Glu Leu Ala
115 120 125
Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val Ala Glu Glu Val Asn Arg Ala
130 135 140
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含WT1 126-134片段的肽片段
<400> 3
Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu
1 5
<210> 4
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含HIV-1 env gp120 90-98片段的肽片段
<400> 4
Lys Leu Thr Pro Leu Cys Val Thr Leu
1 5
Claims (32)
1.一种在用于抗原呈递的树突状细胞内加载抗原的方法，所述方法包括：
使用编码抗原或其一个或多个免疫原性表位的核酸分子修饰多潜能干细胞；
诱导所述多潜能干细胞分化成表达和呈递所述抗原或其一个或多个免疫原性表位的树突状细胞。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述多潜能干细胞是诱导的多潜能干细胞。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述多潜能干细胞是用核酸分子稳定修饰的。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中修饰包括使用病毒或非病毒方法将核酸分子递送至多潜能干细胞中的转导。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述病毒或非病毒方法能够提供长期转基因表达。
6.如权利要求1至5中任一项所述方法，其中所述修饰包括用逆转录病毒载体对多潜能干细胞进行转导。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述逆转录载体是慢病毒载体。
8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述多潜能干细胞是哺乳动物细胞。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述多潜能干细胞是人细胞。
10.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述抗原是全长抗原。
11.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述抗原是肿瘤抗原、病毒抗原、细菌抗原或自身免疫疾病抗原。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述抗原是肿瘤抗原。
13.如权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述核酸分子还编码融合至抗原或其一个或多个免疫原性表位的靶向序列。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述靶向序列是蛋白酶体靶向序列。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述蛋白酶体靶向序列是泛素序列。
16.如权利要求13所述的方法，其中所述靶向序列是核内体靶向序列。
17.一种衍生自多潜能干细胞的树突状细胞，所述多潜能干细胞用编码抗原或其一个或多个免疫原性表位的核酸分子稳定地修饰，其中所述树突状细胞表达并呈递所述抗原或其一个或多个免疫原性表位。
18.如权利要求17所述的树突状细胞，其通过权利要求1至16中任一项所述的方法产生。
19.如权利要求17或18中所述的树突状细胞，其中所述细胞表达CD11c、CD86和HLA中的一种或多种。
20.一种疫苗，其包含权利要求17至19中任一项所述的树突状细胞。
21.如权利要求20所述的疫苗，其还包含佐剂。
22.如权利要求20或21所述的疫苗，其还包含药学上可接受的赋形剂或稀释剂。
23.一种在对象中诱导免疫应答的方法，所述方法包括：
将权利要求17至19中任一项所述的树突状细胞或权利要求20至22中任一项所述的疫苗给予需要具有对抗原的免疫性的对象。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述免疫应答是T细胞介导的免疫应答。
25.如权利要求23或24所述的方法，其中所述树突状细胞是对象自体的。
26.如权利要求23或24所述的方法，其中所述树突状细胞与对象是同种异体的关系。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述树突状细胞与对象至少部分MHC匹配。
28.如权利要求23至27中任一项所述的方法，其中所述对象需要用于癌症的治疗并且所述抗原是肿瘤抗原。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述癌症是黑素瘤、结直肠癌、胶质瘤、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胰腺癌、或胃肠癌。
30.权利要求17至19中任一项所述的树突状细胞或权利要求20至22中任一项所述的疫苗在对象中诱导免疫应答的用途。
31.权利要求17至19中任一项所述的树突状细胞在制备用于在对象中诱导免疫应答的疫苗中的用途。
32.权利要求17至19中任一项所述的树突状细胞或权利要求20至22中任一项所述的疫苗，其用于在对象内诱导免疫应答。
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| Markowicz et al. | Nonviral transfection of human umbilical cord blood dendritic cells is feasible, but the yield of dendritic cells with transgene expression limits the application of this method in cancer immunotherapy |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
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Application publication date: 20180511 |