JP2024522074A - １型の通常型樹状細胞または抗原提示細胞への細胞のリプログラミング - Google Patents

１型の通常型樹状細胞または抗原提示細胞への細胞のリプログラミング Download PDF

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Abstract

本発明は、プロモーター領域の制御下で転写因子を含む組成物に関し、該組成物は、１型の通常型樹状細胞または抗原提示細胞へと細胞をリプログラミングするのに使用することができる。本発明はさらに、細胞を１型の通常型樹状細胞または抗原提示細胞へとリプログラミングするための方法に関する。【選択図】図１Ａ

Description

本発明は、１型の通常型樹状細胞または抗原提示細胞へと細胞をリプログラミングするための組成物及び方法に関する。
細胞のリプログラミングは、ある細胞状態のエピジェネティックなネットワークと転写ネットワークとを、別の細胞型のものに再配線することに依存している。転写因子（ＴＦ）過剰発現実験は、成体の体細胞または分化細胞の可塑性を浮き彫りにしており、任意の所望の細胞型を生成するための新しい技術を提供している。ＴＦの強制発現によって、体細胞または分化細胞を、胚性幹細胞に顕著に類似する誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）にリプログラミングすることができる（Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，２００７、Ｔａｋａｈａｓｈｉ＆Ｙａｍａｎａｋａ，２００６）。代替的に、体細胞を、別の特殊な細胞型に直接変換することもできる（Ｐｅｒｅｉｒａ，Ｌｅｍｉｓｃｈｋａ， ＆ Ｍｏｏｒｅ，２０１２）。直接的な系統転換は、標的細胞識別性を特定するＴＦを使用して、マウス及びヒトの線維芽細胞をニューロン、心筋細胞、及び肝細胞などのいくつかの細胞型にリプログラミングすることに成功することが証明されている（Ｘｕ，Ｄｕ， ＆ Ｄｅｎｇ，２０１５）。造血系でも直接的な細胞変換が実証され、その際、ＴＦの強制発現がＢ細胞及び線維芽細胞におけるマクロファージの運命を誘発し（Ｘｉｅ，Ｙｅ，Ｆｅｎｇ，＆ Ｇｒａｆ，２００４）、マウス線維芽細胞のクローン形成性造血前駆細胞への直接的なリプログラミングが、Ｇａｔａ２、Ｇｆｉ１ｂ、ｃＦｏｓ、及びＥｔｖ６により達成された（Ｐｅｒｅｉｒａ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。これらの４つのＴＦは、内皮様中間体を通して進行し、インビトロで発生する発生的造血を再現する動的な多段階造血過程を誘導する（Ｐｅｒｅｉｒａ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。
リプログラミングされた細胞は、再生医療のための非常に有望な治療ツールであり、ｉＰＳＣの分化によって得られた細胞については、臨床研究においてすでに試験が行われている（Ｐｉｒｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１９）。近年、抗原提示樹状細胞（ＤＣ）は、ＴＦの小さな組み合わせによって無関係な細胞型からリプログラミングできることが実証されており（Ｒｏｓａ ｅｔ ａｌ．，２０１８）、それによって免疫応答を調節して新しい免疫療法を開発するために細胞リプログラミングを適用する機会が開かれる。
古典的には、ＤＣコンパートメントは、機能的に異なる２つのＤＣサブセット、すなわち、プロフェッショナルな抗原提示細胞（ＡＰＣ）である通常型ＤＣ（ｃＤＣ）と、形質細胞様ＤＣ（ｐＤＣ）とに分類され得る。ｃＤＣは抗原特異的免疫応答を駆動し、ｐＤＣはウイルス感染中にＩ型インターフェロンのプロフェッショナルな生産体である。しかしながら、ＤＣ発生中の異なるサブセットの発散を制御するタイミング及び正確な機構は、依然としてまだこれから確立されていくものである。
ＤＣは、病原体に関して生物を走査するリンパ－骨髄系造血から生じる骨－骨髄由来の細胞のクラスであり、自然免疫系と適応免疫の活性化との間の本質的な界面を形成する。ＤＣは、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）と複合体形成したペプチド抗原を表面上に、必要なすべての可溶性及び膜結合共刺激分子と一緒に提示することによって、Ｔ細胞応答を活性化させることができるプロフェッショナルなＡＰＣとして作用する。ＤＣは、ナイーブＴリンパ球をプライミングすることによって一次免疫応答を誘導し、予めプライミングしたＴリンパ球のエフェクター機能を増強し、自然免疫と適応免疫との間の情報伝達を調整する。ＤＣは、ほとんどの組織で見られ、抗原環境を連続的にサンプリングし、病原体の侵入をモニターするためにいくつかの種類の受容体を使用する。定常状態において、そして病原体の検出に応じて高められた割合で、非リンパ性組織中のセンチネルＤＣは、リンパ器官に移動し、そこで収集及び処理した抗原をＴ細胞に提示する。Ｔ細胞が獲得する表現型は抗原提示の状況に依存する。抗原が病原体または損傷自己に由来する場合、ＤＣは危険シグナルを受け、活性化され、その後、防御免疫をもたらすために必要なエフェクターとなるＴ細胞を刺激する。
免疫応答の制御の重要な側面は、それぞれ特定の病原体に応答し、かつＴ細胞の特定のサブセットと相互作用するように特化された、異なる種類のＤＣの存在である。この文脈では、ｃＤＣは、骨髄／通常型ＤＣタイプ１（ｃＤＣ１またはｃＤＣ１ｓ）と骨髄／通常型ＤＣタイプ２（ｃＤＣ２）とでさらに分けることができる。これは、免疫系が広範囲の異なる病原体及び危険シグナルに適切に反応する柔軟性を拡張する。
ＣＤ１４１、ＣＬＥＣ９Ａ、ＸＣＲ１、及びＣＤ２２６の表面発現を特徴とするヒトｃＤＣ１（Ｗｃｕｌｅｋ ｅｔ ａｌ．，２０１９、Ｈｅｉｄｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．，２０１６、Ｄｕｔｅｒｔｒｅ ｅｔ ａｌ．，２０１９）は、ＩＬ－１２及びインターフェロン（ＩＦＮ）を含む免疫調節サイトカイン、ならびにＣＸＣＬ１０などのケモカインを分泌することによってと、抗原をＣＤ８＋Ｔ細胞に交差提示することによってとで、機能的に定義される（Ｌａｕｔｅｒｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．，２０１０、Ｐｏｕｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。抗腫瘍免疫の文脈では、ｃＤＣ１を欠くＢａｔｆ３－／－動物は、免疫原性腫瘍を拒絶することができない（Ｈｉｌｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００８）。この効果は、腫瘍常在性ｃＤＣ１に依存することが示されており、確立された腫瘍の免疫拒絶（Ｂｏｔｔｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１８）及び療法への応答を媒介する（Ｓａｌｍｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６、Ｓｐｒａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１７）ための、腫瘍部位におけるこのＤＣサブセットの重要性を浮き彫りにしている。したがって、ヒト腫瘍におけるｃＤＣ１存在量は、患者の生存及びチェックポイント阻害剤への応答性と関連付けられた（Ｂａｒｒｙ ｅｔ ａｌ．，２０１８、Ｂｒｏｚ ｅｔ ａｌ．，２０１４、Ｈｕｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，２０２０、Ｍａｙｏｕｘ ｅｔ ａｌ．２０２０、Ｓｐｒａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１７）。ヒト初代ｃＤＣ１は、インビボでは非常にまれであるため、それらの研究及びトランスレーショナルな用途は、インビトロで機能的ｃＤＣ１を生成する方法を必要とする。ヒトＣＤ３４＋骨髄（ＢＭ）前駆細胞は、ＳＣＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、及びＩＬ－４を伴うＦＬＴ３Ｌの存在下で、インビトロでＣＤ１４１＋ ｃＤＣ１を誘導するために使用されている（Ｐｏｕｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。より最近では、ＦＬＴ３Ｌを、ｃＤＣ１分化を促進するために、ノッチ発現間質細胞株との共培養と組み合わせた（Ｋｉｒｋｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１８、Ｂａｌａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。また、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）培養物からのｃＤＣ１様、ｃＤＣ２様、及びｐＤＣ様の細胞の生成も実証された（Ｓｏｎｔａｇ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。しかしながら、これらのプロトコールは複雑であり、フィーダ層を必要とし、低い収量と、競合する機能を有する異なるＤＣサブセットの混合物とを生じさせる。
したがって、分化したヒトｃＤＣ１の均一な集団をインビトロで生成するための新たな戦略が必要である。
本明細書において、細胞を樹状細胞または抗原提示細胞にリプログラミングするための組成物及び方法が提供される。本発明者らは、特定のプロモーター下で、転写因子ＢＡＴＦ３、ＩＲＦ８、ＰＵ．１の発現によって細胞のリプログラミングを有意に改善できることを見出した。本発明者らは、ＰＵ．１、ＩＲＦ８、及びＢＡＴＦ３と共発現させた場合に、リプログラミング効率を増加させる追加の転写因子（すなわち、ＩＲＦ７及びＢＡＴＦ）も見出した。
したがって、本明細書において、発現時に転写因子：
ａ）ＢＡＴＦ３、または、配列番号１０（ＢＡＴＦ３）と少なくとも７０％同一、配列番号１０（ＢＡＴＦ３）と、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％同一である、その生物学的に活性なバリアント、
ｂ）ＩＲＦ８、または、配列番号１１（ＩＲＦ８）と少なくとも７０％同一、配列番号１１（ＩＲＦ８）と、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％同一である、その生物学的に活性なバリアント、及び
ｃ）ＰＵ．１、または、配列番号１２（ＰＵ．１）と少なくとも７０％同一、配列番号１２（ＰＵ．１）と、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％同一である、その生物学的に活性なバリアント、
をコードする１つ以上のコンストラクトまたはベクターを含む組成物であって、１つ以上のコンストラクトまたはベクターは、転写因子の転写を制御することが可能なプロモーター領域を含み、プロモーター領域は、脾臓病巣形成ウイルス（ＳＦＦＶ）プロモーターを含む、組成物が提供される。
本明細書ではさらに、本明細書に記載の組成物による１つ以上のコンストラクトまたはベクターを含む細胞が提供される。
また本明細書において、細胞を樹状細胞または抗原提示細胞にリプログラミングまたは誘導する方法であって、
ａ）細胞を、本明細書に記載の組成物によるコンストラクトまたはベクターを含む組成物で形質導入するステップと、
ｂ）転写因子を発現させ、
それによって、リプログラミングまたは誘導された細胞が得られるステップと、
を含む方法が提供される。
さらに本明細書では、本明細書に開示された方法に従って得られるリプログラミングまたは誘導された細胞が提供される。
また本明細書では、がんを治療する方法であって、それを必要とする個体に、本発明による組成物、細胞、医薬組成物、及び／またはリプログラミングまたは誘導された細胞を投与することを含む方法も提供される。
さらに本明細書では、本発明による組成物、細胞、医薬組成物、及び／またはリプログラミングまたは誘導された細胞の、がんを治療するための医薬の製造のための使用が提供される。
ＰＵ．１、ＩＲＦ８、及びＢＡＴＦ３は、ヒト線維芽細胞において全般的なｃＤＣ１遺伝子発現プログラムを誘導する。ヒト胎児線維芽細胞（ＨＥＦ）に、ＰＵ．１、ＩＲＦ８、及びＢＡＴＦ３（ＰＩＢ、ＴｅｔＯ－ＰＩＢ）をコードするＤＯＸ誘導性レンチウイルス粒子とＭ２ｒｔＴＡ（ＵｂＣ－Ｍ２ｒｔＴＡ）を共形質導入した。精製されたＰＩＢ形質導入ＨＥＦ（ｈｉＤＣ）を、３日目（ｄ３、ＣＤ４５＋、６日目（ｄ６、ＣＤ４５＋）、及び９日目（ＣＤ４５＋ＨＬＡ－ＤＲ－、ｄ９ ＤＲ－、ＣＤ４５＋ＨＬＡ－ＤＲ＋、ｄ９ ＤＲ＋）の単一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑによりプロファイルした。ＨＥＦ及び末梢血ｃＤＣ１、ｃＤＣ２、及びｐＤＣを対照として含めた。 ＰＵ．１、ＩＲＦ８、及びＢＡＴＦ３は、ヒト線維芽細胞において全般的なｃＤＣ１遺伝子発現プログラムを誘導する。Ｄｏｘの添加後３日目及び９日目のｈｉＤＣのフローサイトメトリー分析。 ＰＵ．１、ＩＲＦ８、及びＢＡＴＦ３は、ヒト線維芽細胞において全般的なｃＤＣ１遺伝子発現プログラムを誘導する。ＤＲ－（上）及びＤＲ＋（下）の細胞出現の動態（ｎ＝２～８、平均±ＳＤ）。 ＰＵ．１、ＩＲＦ８、及びＢＡＴＦ３は、ヒト線維芽細胞において全般的なｃＤＣ１遺伝子発現プログラムを誘導する。９日目の走査型電子顕微鏡法。スケールバー、１０μｍ。 ＰＵ．１、ＩＲＦ８、及びＢＡＴＦ３は、ヒト線維芽細胞において全般的なｃＤＣ１遺伝子発現プログラムを誘導する。４５，８７０個の単一細胞を示すｔ－ＳＮＥプロット。 ＰＵ．１、ＩＲＦ８、及びＢＡＴＦ３は、ヒト線維芽細胞において全般的なｃＤＣ１遺伝子発現プログラムを誘導する。ｓｃＰｒｅｄ（Ａｌｑｕｉｃｉｒａ－Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．２０１９）を使用する公開されたＤＣサブセットデータ（Ｖｉｌｌａｎｉ ｅｔ ａｌ．２０１７）との統合。ヒートマップは、ｃＤＣ１～ＤＣ６サブセットに帰属する単一細胞のパーセンテージを示す。 ＰＵ．１、ＩＲＦ８、及びＢＡＴＦ３は、ヒト線維芽細胞において全般的なｃＤＣ１遺伝子発現プログラムを誘導する。ｃＤＣ１に帰属する単一細胞のｔ－ＳＮＥプロット。 ＰＵ．１、ＩＲＦ８、及びＢＡＴＦ３は、ヒト線維芽細胞において全般的なｃＤＣ１遺伝子発現プログラムを誘導する。ｃＤＣ１特異的遺伝子の遺伝子発現分布を示すバイオリンプロット。遺伝子カウントのログ値を示す。 ＰＵ．１、ＩＲＦ８、及びＢＡＴＦ３は、ヒト線維芽細胞において全般的なｃＤＣ１遺伝子発現プログラムを誘導する。５つのクラスタにおけるプロファイルされた集団を横断して差次的に発現する遺伝子を示すヒートマップ。 ＰＵ．１、ＩＲＦ８、及びＢＡＴＦ３は、ヒト線維芽細胞において全般的なｃＤＣ１遺伝子発現プログラムを誘導する。クラスタ３から選択された遺伝子のバイオリンプロット。 ＰＵ．１、ＩＲＦ８、及びＢＡＴＦ３は、ヒト線維芽細胞において全般的なｃＤＣ１遺伝子発現プログラムを誘導する。それぞれの遺伝子クラスタで富んでいる上位５つのＲｅａｃｔｏｍｅ経路。 ＰＵ．１、ＩＲＦ８、及びＢＡＴＦ３は、ヒト線維芽細胞において全般的なｃＤＣ１遺伝子発現プログラムを誘導する。抗原交差提示に関連する遺伝子の発現を示すヒートマップ。 ＰＵ．１、ＩＲＦ８、及びＢＡＴＦ３は、ヒト線維芽細胞において全般的なｃＤＣ１遺伝子発現プログラムを誘導する。抗原交差提示に関連する遺伝子の発現を示すバイオリンプロット。 単一細胞の疑似時間順序付けは、成功したｃＤＣ１リプログラミングと失敗したｃＤＣ１リプログラミングとに関連付けられた経路を浮き彫りにする。ＨＥＦ、３日目、６日目、及び９日目のｓｃＰｒｅｄ（Ａｌｑｕｉｃｉｒａ－Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．２０１９）でのｃＤＣ１に帰属しないかまたは帰属しているｈｉＤＣ（ＤＲ－及びＤＲ＋）、及びフィルタリングされたｃＤＣ１の単一細胞の軌跡のＭｏｎｏｃｌｅ３再構成。 単一細胞の疑似時間順序付けは、成功したｃＤＣ１リプログラミングと失敗したｃＤＣ１リプログラミングとに関連付けられた経路を浮き彫りにする。相対的な軌跡位置（疑似時間、左）によって色付けされたｃＤＣ１のリプログラミング軌跡。細胞型ごとの疑似時間分布を示す箱ひげプロット（右）。 単一細胞の疑似時間順序付けは、成功したｃＤＣ１リプログラミングと失敗したｃＤＣ１リプログラミングとに関連付けられた経路を浮き彫りにする。ｓｃＶｅｌｏ（Ｂｅｒｇｅｎ ｅｔ ａｌ．２０２０）により生成された単一細胞速度を示すｔＳＮＥプロット。矢印は軌跡に沿った方向及び厚さの速度を示している。 単一細胞の疑似時間順序付けは、成功したｃＤＣ１リプログラミングと失敗したｃＤＣ１リプログラミングとに関連付けられた経路を浮き彫りにする。ｓｃＶｅｌｏ潜在時間に沿った動的発現を示す６つの遺伝子クラスタ（Ａ～Ｆ）を強調したヒートマップ。 単一細胞の疑似時間順序付けは、成功したｃＤＣ１リプログラミングと失敗したｃＤＣ１リプログラミングとに関連付けられた経路を浮き彫りにする。それぞれのクラスタで富んでいる上位５つのＲｅａｃｔｏｍｅ経路。 単一細胞の疑似時間順序付けは、成功したｃＤＣ１リプログラミングと失敗したｃＤＣ１リプログラミングとに関連付けられた経路を浮き彫りにする。軌跡に沿って差次的に発現する細胞型による遺伝子モジュールの平均発現値を示すヒートマップ。 単一細胞の疑似時間順序付けは、成功したｃＤＣ１リプログラミングと失敗したｃＤＣ１リプログラミングとに関連付けられた経路を浮き彫りにする。ＤＣリプログラミングの失敗及び成功に関連する遺伝子の発現分布を示すバイオリンプロット。遺伝子カウントのログ値を示す。 単一細胞の疑似時間順序付けは、成功したｃＤＣ１リプログラミングと失敗したｃＤＣ１リプログラミングとに関連付けられた経路を浮き彫りにする。Ｃｈｅａ３を用いた不成功（左）及び成功（右）のｃＤＣ１リプログラミング転写因子。ＳＰＩ１、ＩＲＦ８、及びＢＡＴＦは、太字で強調表示されている。 単一細胞の疑似時間順序付けは、成功したｃＤＣ１リプログラミングと失敗したｃＤＣ１リプログラミングとに関連付けられた経路を浮き彫りにする。ｈｉＤＣにおけるＣＤ２２６発現のフローサイトメトリー分析。 単一細胞の疑似時間順序付けは、成功したｃＤＣ１リプログラミングと失敗したｃＤＣ１リプログラミングとに関連付けられた経路を浮き彫りにする。ＤＣサブセットデータ（Ｖｉｌｌａｎｉ ｅｔ ａｌ．２０１７）による分類。 単一細胞の疑似時間順序付けは、成功したｃＤＣ１リプログラミングと失敗したｃＤＣ１リプログラミングとに関連付けられた経路を浮き彫りにする。ＣＤ４５＋ＨＬＡ－ＤＲ＋ＣＤ２２６＋及びＣＤ４５＋ＨＬＡ－ＤＲ＋ＣＤ２２６－のｈｉＤＣによる死細胞貪食（ｎ＝６～７、平均±ＳＤ）。 単一細胞の疑似時間順序付けは、成功したｃＤＣ１リプログラミングと失敗したｃＤＣ１リプログラミングとに関連付けられた経路を浮き彫りにする。ＰＩＢと指示された転写因子との共形質導入によって生じた９日目のリプログラミング効率（ｎ＝４、平均±ＳＤ）。Ｍ２ｒｔＴＡ及びＰＩＢで形質導入された細胞を対照として含めた。＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊＊ｐ＜０．００００５ 炎症性サイトカインシグナル伝達により、ヒトｃＤＣ１の高い効率でのリプログラミングが可能となる。（Ａ）個々のサイトカイン及び（Ｂ）２～３種のサイトカインの組み合わせの存在下で得られた、９日目のｈｉＤＣ（ＣＤ４５＋ＨＬＡ－ＤＲ＋）の定量化。形質導入されていないＨＥＦを対照として含めた（ｎ＝２～１０、平均±ＳＤ）。 転写因子の強制発現は、ヒトｃＤＣ１の高い効率でのリプログラミングを可能にする。Ｃｌｅｃ９ａ－ｔｄＴｏｍａｔｏ（ｔｄＴ）レポーターマウス胚性線維芽細胞を、Ｄｏｘ誘導性（ＴｅｔＯ）または構成的プロモーター（ＵｂＣ、ＳＦＦＶ、ＰＧＫ、ＥＦ１Ｓ、ＥＦ１、及びＥＦ１ｉ）で駆動されるＰＩＢ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰで形質導入することによって得られるリプログラミング細胞（ｔｄＴ＋ＭＨＣ－ＩＩ＋）の定量化。ＧＦＰ（ｔｅｔＯ－ＧＦＰ）の発現を対照として使用した（ｎ＝２～６、平均±ＳＤ）。 転写因子の強制発現は、ヒトｃＤＣ１の高い効率でのリプログラミングを可能にする。ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－β、及びＴＮＦ－αの存在下または非存在下での、ＴｅｔＯ－ＰＩＢまたはＳＦＦＶ－ＰＩＢで生成された９日目のｈｉＤＣの定量化（ｎ＝４～１９、平均±ＳＤ）。 転写因子の強制発現は、ヒトｃＤＣ１の高い効率でのリプログラミングを可能にする。入力線維芽細胞１個当たりのｈｉＤＣ収率（ｎ＝１０～１２、平均±ＳＤ）。 転写因子の強制発現は、ヒトｃＤＣ１の高い効率でのリプログラミングを可能にする。４つの条件で生成した９日目のｈｉＤＣを精製し、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑによってプロファイルした。ヒートマップは、ｃＤＣ１～ＤＣ６サブセットに帰属する単一細胞のパーセンテージを示す。 抗炎症性サイトカインシグナル伝達はｃＤＣ１のリプログラミングを阻害しない。抗炎症サイトカインの存在下でＨＥＦをＳＦＦＶ－ＰＩＢで形質導入することによって生成された９日目のＣＤ４５＋ＨＬＡ－ＤＲ＋細胞（左）及びＣＤ４５＋ＨＬＡ－ＤＲ＋細胞でゲートされたＣＤ４０＋細胞（右）のフローサイトメトリー定量化（ｎ＝３、平均±ＳＤ）。 最適化されたリプログラミングプロトコールにより、機能的なヒトｃＤＣ１様細胞の生成が可能となる。ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－β、及びＴＮＦ－αの非存在下または存在下（ｈｉＤＣ＋ｃｙｔ）でＳＦＦＶ－ＰＩＢにより生成されたｈｉＤＣ（ＣＤ４５＋ＨＬＡ－ＤＲ＋）と末梢血ＣＤ１４１＋ＣＬＥＣ９Ａ＋ｃＤＣ１中のＣＤ４０及びＣＤ８０の９日目の蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）。細胞を、個々のＴＬＲアゴニストＬＰＳ、ポリＩ：Ｃ（ポリイノシン：ポリシチジル酸）、Ｒ８４８または組み合わせ（すべて）で一晩かけて刺激した（ｎ＝２～１４、平均±ＳＤ）。 最適化されたリプログラミングプロトコールにより、機能的なヒトｃＤＣ１様細胞の生成が可能となる。２時間のインキュベーション後の９日目のｈｉＤＣによる死細胞貪食の定量化。ＨＥＦ及びＣＤ１４１＋ＣＬＥＣ９Ａ＋ｃＤＣ１を対照として含めた（ｎ＝３～１２、平均±ＳＤ）。 最適化されたリプログラミングプロトコールにより、機能的なヒトｃＤＣ１様細胞の生成が可能となる。ＴＬＲアゴニストで一晩インキュベートした後の９日目の精製ｈｉＤＣのサイトカイン分泌。ＨＥＦ、単球由来ＤＣ（ｍｏＤＣ）、及びＣＤ１４１＋ＣＬＥＣ９Ａ＋ＸＣＲ１＋ｃＤＣ１を対照として含めた（ｎ＝２～１１、平均±ＳＤ）。 最適化されたリプログラミングプロトコールにより、機能的なヒトｃＤＣ１様細胞の生成が可能となる。細胞をＬＰＳ、ポリＩ：Ｃ、及びＲ８４８とともに一晩インキュベートし、ＣＭＶタンパク質で３時間パルス処理し、洗浄し、ＣＭＶ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞とともに共培養した。抗原交差提示は、２４時間後にＩＦＮ－γを測定することによって定量化した（ｎ＝２～４、平均±ＳＤ）＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．０００５、＊＊＊＊ｐ＜０．００００５。 成人線維芽細胞の効率的ｃＤＣ１リプログラミング。ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－β、及びＴＮＦ－αの非存在下（ＳＦＦＶ－ＰＩＢ）または存在下（ＳＦＦＶ－ＰＩＢ＋ｃｙｔ）での、３人の独立したドナーからのヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）から産生されたｈｉＤＣ（ＣＤ４５＋ＨＬＡ－ＤＲ＋）の９日目のフローサイトメトリー分析。 成人線維芽細胞の効率的ｃＤＣ１リプログラミング。ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－β、及びＴＮＦ－αの非存在下（ＳＦＦＶ－ＰＩＢ）または存在下（ＳＦＦＶ－ＰＩＢ＋ｃｙｔ）での、３人の独立したドナーからのヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）から産生されたｈｉＤＣ（ＣＤ４５＋ＨＬＡ－ＤＲ＋）の９日目の定量化。ＨＤＦを、対照として含めた（ｎ＝３～１３、平均±ＳＤ）。 成人線維芽細胞の効率的ｃＤＣ１リプログラミング。ＣＤ４０及びＣＤ８０の発現。 成人線維芽細胞の効率的ｃＤＣ１リプログラミング。９日目のＨＤＦ由来のｈｉＤＣを精製し、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑによってプロファイルした。ヒートマップは、ｃＤＣ１～６サブセットに帰属する単一細胞のパーセンテージを示す。 成人線維芽細胞の効率的ｃＤＣ１リプログラミング。ヒートマップは、リプログラミング中に上方制御され、ｃＤＣ１で発現する遺伝子の発現を示す。ｃＤＣ１及び抗原提示の遺伝子は、太字で強調する。 成人線維芽細胞の効率的ｃＤＣ１リプログラミング。ヒートマップは、リプログラミング中に上方制御され、ｃＤＣ１で発現する遺伝子の発現を示す。ｃＤＣ１及び抗原提示の遺伝子は、バイオリンプロットとして示されている。遺伝子カウントのログ値を示す。 間葉系間質細胞の効率的なｃＤＣ１リプログラミング。ｘｅｎｏフリー条件下でヒト間葉系間質細胞（ＭＳＣ）からｈｉＤＣを得る戦略。ＭＳＣは、３人の健康なドナーから単離し、ＦＡＣＳ精製（Ｌｉｎ－ＣＤ４５－ＣＤ２７１＋）し、ｐＨＰＬ培地で拡大し、Ｘ－ＶＩＶＯ １５中で形質導入及び培養した。ｄＸ＝Ｘ日目。 間葉系間質細胞の効率的なｃＤＣ１リプログラミング。サイトカインありまたはなしで産生された、ＭＳＣ由来のｈｉＤＣの９日目の定量化（ｎ＝３～１４、平均±ＳＤ）。 間葉系間質細胞の効率的なｃＤＣ１リプログラミング。サイトカインありまたはなしで産生された、ＭＳＣ由来のｈｉＤＣの９日目の定量化（ｎ＝３～１４、平均±ＳＤ）。 間葉系間質細胞の効率的なｃＤＣ１リプログラミング。ＣＤ４０及びＣＤ８０のフローサイトメトリー分析。ｎｓ－有意ではない、＊＊＊＊ ｐ＜０．００００５。 誘導されたＤＣはインビボで抗腫瘍免疫を誘発する。ＤＣリプログラミング中の交差提示能力の獲得の動態。代表的なフローサイトメトリープロットは、リプログラミングのｄ４、ｄ７、及びｄ９で５０，０００のｔｄＴ＋細胞と共培養したＴＣＲ＋ＣＤ８＋ＣＤ４４＋Ｔ細胞のＣＴＶ標識を示している。ＭＥＦを対照として含めた。 誘導されたＤＣはインビボで抗腫瘍免疫を誘発する。異なる時点で３つの異なる比率で分類したｔｄＴ＋細胞と共培養後の増殖Ｔ細胞の定量化（ｎ＝４、平均±ＳＤ）。 誘導されたＤＣはインビボで抗腫瘍免疫を誘発する。ＬＰＳまたはポリＩ：Ｃで刺激した後の選別されたｔｄｔＴ＋細胞のサイトカイン分泌（ｎ＝２、平均±ＳＤ）。ＭＥＦ及びＣＤ１０３＋骨髄由来ＤＣ（ＢＭ－ＤＣ）を対照として含めた。 誘導されたＤＣはインビボで抗腫瘍免疫を誘発する。精製したｔｄＴ＋ｉＤＣを０．５ＭのＢ１６ＯＶＡ細胞と混合し、その後、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに腫瘍を皮下移植した。腫瘍体積を１４日間で評価した（ｎ＝５～６、平均±ＳＥＭ）。 誘導されたＤＣはインビボで抗腫瘍免疫を誘発する。精製したｔｄＴ＋ｉＤＣを、確立から８日後にＢ１６ＯＶＡ腫瘍に腫瘍内注射した。２０日目まで腫瘍体積を評価した（ｎ＝４～９、平均±ＳＥＭ、２つの独立した実験）。ＰＢＳ、ＭＥＦ、及びＣＤ１０３＋ＢＭ－ＤＣを注射された動物を、対照として含めた。 誘導されたＤＣはインビボで抗腫瘍免疫を誘発する。ＣＴＶ標識したＯＴ－Ｉ ＣＤ８＋Ｔ細胞を、ｉＤＣと同じ日に静脈内注射し、腫瘍と腫瘍排出リンパ節を４日後に分析した。ＯＶＡ拘束ＣＤ８＋Ｔ細胞のインビトロ再刺激の腫瘍浸潤（左）とＩＦＮ－γ及びグランザイムＢ（ＧｚｍＢ）の発現（右）を定量化した（ｎ＝２～４、平均±ＳＤ）。 ＰＵ．１は、独立したクロマチン標的化能力を有し、ＩＲＦ８及びＢＡＴＦ３を同じ結合部位に動員する。ＰＵ．１、ＩＲＦ８、及びＢＡＴＦ３（ＰＩＢ）のクロマチン結合部位をリプログラミングの初期段階でプロファイルする戦略。ＨＤＦをＰＩＢ（左）または個々の因子（右）で形質導入し、４８時間後にＣｈＩＰ－ｓｅｑによって分析した。 ＰＵ．１は、独立したクロマチン標的化能力を有し、ＩＲＦ８及びＢＡＴＦ３を同じ結合部位に動員する。組み合わせて（左）または個々に（右）発現した場合のＰＵ．１、ＩＲＦ８、及びＢＡＴＦ３のゲノムワイド分布を示すヒートマップ。シグナルは、個々のピークを中心に８ｋｂのウィンドウ内に表示される。それぞれの条件におけるピークの数が示されている。ピークの平均信号強度を示す（下図）。 ＰＵ．１は、独立したクロマチン標的化能力を有し、ＩＲＦ８及びＢＡＴＦ３を同じ結合部位に動員する。組み合わせて発現する場合または個別に発現する場合の、ＰＵ．１、ＩＲＦ８、及びＢＡＴＦ３の標的部位についてのデノボモチーフ予測分析。ＰＵ．１のモチーフは太字で強調されている。 ＰＵ．１、ＩＲＦ８、及びＢＡＴＦ３は、オープンクロマチンにおいて結合して線維芽細胞遺伝子を阻害し、ｃＤＣ１転写プログラムを課す。ベン図は、ＰＵ．１、ＩＲＦ８、及びＢＡＴＦ３（ＰＩＢ）の間のゲノム全体でのピーク重なり合いを示す。 ＰＵ．１、ＩＲＦ８、及びＢＡＴＦ３は、オープンクロマチンにおいて結合して線維芽細胞遺伝子を阻害し、ｃＤＣ１転写プログラムを課す。組み合わせて発現させた場合の、ＰＵ．１、ＩＲＦ８、及びＢＡＴＦ３の共結合部位に対するデノボモチーフ予測分析。ＰＵ．１－ＩＲＦ及びＢＡＴＦのモチーフは、太字で強調されている。 ＰＵ．１、ＩＲＦ８、及びＢＡＴＦ３は、オープンクロマチンにおいて結合して線維芽細胞遺伝子を阻害し、ｃＤＣ１転写プログラムを課す。ＰＵ．１－ＩＲＦとＢＡＴＦのモチーフ比較。Ｊａｃｃａｒｄの類似度係数＝０．０２。 ＰＵ．１、ＩＲＦ８、及びＢＡＴＦ３は、オープンクロマチンにおいて結合して線維芽細胞遺伝子を阻害し、ｃＤＣ１転写プログラムを課す。ＰＩＢによるトランスフェクションの２４時間後のＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてＰＵ．１（上）、ＩＲＦ８（中）、及びＢＡＴＦ３（下）の免疫沈殿（ＩＰ）を示すイムノブロット（左）。共免疫沈殿（Ｃｏ－ＩＰ）を、百万、２百万、及び５百万（Ｍ）の細胞を用いて行った（右）。入力（１０％）及びＩｇＧアイソタイプを対照として使用した。 ＰＵ．１、ＩＲＦ８、及びＢＡＴＦ３は、オープンクロマチンにおいて結合して線維芽細胞遺伝子を阻害し、ｃＤＣ１転写プログラムを課す。ＰＵ．１、ＩＲＦ８、及びＢＡＴＦ３のいずれかまたは３つの因子（交差）によって結合される、９日目のＨＤＦとｈｉＤＣとの間で差次的に発現される遺伝子を示すヒートマップ。 ＰＵ．１、ＩＲＦ８、及びＢＡＴＦ３は、オープンクロマチンにおいて結合して線維芽細胞遺伝子を阻害し、ｃＤＣ１転写プログラムを課す。共結合部位に関するＨＤＦ内のクロマチンマークの正規化された読み取りカバレッジのヒートマップ。シグナルは、８ｋｂのウィンドウ内に表示され、転写因子結合部位にセンタリングされる。平均信号強度が示されている（上側のパネル）。 ＰＵ．１、ＩＲＦ８、及びＢＡＴＦ３は、オープンクロマチンにおいて結合して線維芽細胞遺伝子を阻害し、ｃＤＣ１転写プログラムを課す。ｃＤＣ１リプログラミングを動作させるために設定するメカニズムのモデル。 ＰＵ．１、ＩＲＦ８、及びＢＡＴＦ３は、マウスがん細胞をｃＤＣ１様細胞にリプログラミングする。ＳＦＦＶ－ＰＩＢ－ＧＦＰレンチウイルス粒子で形質導入後９日目のマウスルイス肺癌（３ＬＬ）細胞及び黒色腫（Ｂ１６）細胞（腫瘍抗原提示細胞、Ｔｕｍｏｕｒ－ＡＰＣ）のフローサイトメトリー分析。ＳＦＦＶ－ＧＦＰを形質導入した親細胞株を対照として含めた。 ＰＵ．１、ＩＲＦ８、及びＢＡＴＦ３は、マウスがん細胞をｃＤＣ１様細胞にリプログラミングする。ルイス肺癌（ＬＬＣ）及び黒色腫Ｂ１６由来のリプログラミングされた２細胞（ＧＦＰ＋ＣＤ４５＋ＭＨＣ－ＩＩ＋）を、９日目（ｄ９）にＦＡＣＳにより精製した。ＧＦＰベクターを形質導入したがん細胞３を対照として含めた（ｄ０）。ヒートマップは、リプログラミングＬＬＣ及び誘導された５つの樹状細胞（ｉＤＣ）におけるＩＦＮ－γ（左）及びＳＴＩＮＧ（右）経路に関連する発現４遺伝子を示す。１型（ｃＤＣ１）脾臓樹状細胞を参照６（ＧＳＥ１０３６１８）として含めた。 ＰＵ．１、ＩＲＦ８、及びＢＡＴＦ３は、マウスがん細胞をｃＤＣ１様細胞にリプログラミングする。示される場合、ポリ（Ｉ：Ｃ）（Ｐ（Ｉ：Ｃ））での一晩の刺激後リプログラミング３日目にてＰＩＢまたはｅＧＦＰレンチウイルスを形質導入したＦＡＣＳ精製Ｂ１６－ＯＶＡ細胞と共培養後のＣＤ８＋Ｔ細胞増殖（ＣＴＶ希釈）及び活性化（ＣＤ４４＋）として測定された内因性抗原提示のフローサイトメトリー分析（左）及び定量化（右）（ｎ＝３～４）。 ＰＵ．１、ＩＲＦ８、及びＢＡＴＦ３は、マウスがん細胞をｃＤＣ１様細胞にリプログラミングする。７２時間の共培養後にＰＩＢ形質導入またはＩＦＮ処理されたＢ１６－ＯＶＡ標的細胞（ｍＯｒａｎｇｅ＋）のＴ細胞による殺傷のフローサイトメトリー分析（左）及び定量化（右）（ｎ＝６～９）。 ＰＵ．１、ＩＲＦ８、及びＢＡＴＦ３は、マウスがん細胞をｃＤＣ１様細胞にリプログラミングする。示される場合、Ｐ（Ｉ：Ｃ）及び／またはインターフェロンガンマ（ＩＦＮ－ｇ）の存在下でＯＶＡタンパク質と一晩インキュベートした、ＳＦＦＶ－ＰＩＢ－ＧＦＰレンチウイルス粒子で形質導入されたＢ１６細胞と共培養後にＣＤ４４＋増殖性ＯＴ－Ｉ ＣＤ８＋９Ｔ細胞のパーセンテージとして測定された抗原交差提示能力のフローサイトメトリー定量化（ｎ＝４～８）。 ＰＵ．１、ＩＲＦ８、及びＢＡＴＦ３は、マウスがん細胞をｃＤＣ１様細胞にリプログラミングする。リプログラミング５日目のＢ１６由来の腫瘍－ＡＰＣを、ＯＶＡタンパク質及びＰ（Ｉ：Ｃ）でパルス処理し、７日目、１０日目及び１３日目に予め確立されたＢ１６－ＯＶＡ腫瘍に腫瘍内注射した。 ＰＵ．１、ＩＲＦ８、及びＢＡＴＦ３は、マウスがん細胞をｃＤＣ１様細胞にリプログラミングする。腫瘍ＡＰＣ（ＰＩＢ）、ＰＢＳ、または対照レンチウイルス（ＭＣＳ）によって形質導入されたＢ１６細胞を注射されたマウスにおける腫瘍増殖（ｎ＝６）。 ＰＵ．１、ＩＲＦ８、及びＢＡＴＦ３は、マウスがん細胞をｃＤＣ１様細胞にリプログラミングする。腫瘍ＡＰＣ（ＰＩＢ）、ＰＢＳ、または対照レンチウイルス（ＭＣＳ）によって形質導入されたＢ１６細胞を注射されたマウスにおける生存（ｎ＝６）。平均±ＳＤが表されている。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。 ＰＵ．１、ＩＲＦ８、及びＢＡＴＦ３は、ヒトがん細胞をｃＤＣ１様細胞にリプログラミングする。ＳＦＦＶ－ＰＩＢ－ＧＦＰまたは対照のＳＦＦＶ－ＧＦＰレンチウイルスで形質導入された場合に、形質導入されたＥＧＦＰ＋細胞（レッド）にゲートされたＣＤ４５及びＨＬＡ－ＤＲを共発現する細胞のパーセンテージとしてフローサイトメトリーによって分析された、膠芽細胞腫（Ｔ９８Ｇ）、直腸癌（ＥＣＣ４）及び中皮腫（ＡＣＣ－Ｍｅｓｏ－１、ＡＣＣＭ１）細胞株のリプログラミング効率。 ＰＵ．１、ＩＲＦ８、及びＢＡＴＦ３は、ヒトがん細胞をｃＤＣ１様細胞にリプログラミングする。２８個の固形腫瘍細胞株にわたるｃＤＣ１のリプログラミング効率。（ＣＤ４５＋ＨＬＡ－ＤＲ＋）を発現するリプログラミングされた集団及び中間集団（ＣＤ４５＋ＨＬＡ－ＤＲ－またはＣＤ４５－ＨＬＡ－ＤＲ＋）を示す（ｎ＝２～８）。平均±ＳＤが表されている。 ＰＵ．１、ＩＲＦ８、及びＢＡＴＦ３は、ヒトがん細胞をｃＤＣ１様細胞にリプログラミングする。ＳＦＦＶ－ＰＩＢ－ＧＦＰレンチウイルス粒子での形質導入から９日後に、ヒト膠芽細胞腫（Ｔ９８Ｇ）細胞におけるｃＤＣ１表面マーカー（ＣＬＥＣ９Ａ、ＣＤ１４１、ＣＤ１１ｃ）のフローサイトメトリー定量化。ＳＦＦＶ－ＧＦＰを形質導入した親細胞株を対照として含めた。 ＰＵ．１、ＩＲＦ８、及びＢＡＴＦ３は、ヒトがん細胞をｃＤＣ１様細胞にリプログラミングする。ポリＩ：Ｃ及びＬＰＳで一晩刺激したＳＦＦＶ－ＰＩＢ－ＧＦＰレンチウイルス粒子で形質導入した９日後のＣＤ４５＋ＨＬＡ－ＤＲ＋がん細胞における共刺激分子ＣＤ４０、ＣＤ８０、及びＣＤ８６の表面発現の動態。ＳＦＦＶ－ＧＦＰを形質導入した親細胞株及び刺激されていないＳＦＦＶ－ＰＩＢ－ＧＦＰで形質導入した親細胞株を対照として含めた。 ＰＵ．１、ＩＲＦ８、及びＢＡＴＦ３は、ヒトがん細胞をｃＤＣ１様細胞にリプログラミングする。９日目の例示的なプロットを示す。 ＰＵ．１、ＩＲＦ８、及びＢＡＴＦ３は、ヒトがん細胞をｃＤＣ１様細胞にリプログラミングする。ヒト原発性扁桃癌組織（ＪＣＡ１０）及び患者－異種移植片由来の膀胱癌細胞（Ｕ３Ｐ２Ｅ２）を、ｈＰＩＢ－ＩＲＥＳ－ＥＧＦＰまたはＥＧＦＰ対照ベクターで形質導入し（０日目）、９日目にフローサイトメトリーにより分析して、リプログラミングされたＣＤ４５＋ＨＬＡ－ＤＲ＋細胞（黒）及びＣＤ４５またはＨＬＡ－ＤＲのいずれかを発現する部分的にリプログラミングされた細胞のパーセンテージを決定した。 ＰＵ．１、ＩＲＦ８、及びＢＡＴＦ３は、ヒトがん細胞をｃＤＣ１様細胞にリプログラミングする。黒色腫（ｎ＝２）、肺癌（ｎ＝２）、頭頸部癌（扁桃、ｎ＝２、舌、ｎ＝３）、膵臓癌（ｎ＝２）、乳癌（ｎ＝２）、及び膀胱癌（ｎ＝２）ならびにがん関連線維芽細胞（ＣＡＦ、ｎ＝２）に由来する原発性ヒト腫瘍細胞で示されるリプログラミング効率。部分的にリプログラミングされた細胞が示される（ＣＤ４５＋ＨＬＡ－ＤＲ－、ＣＤ４５－ＨＬＡ－ＤＲ＋）。 ＰＵ．１、ＩＲＦ８、及びＢＡＴＦ３は、迅速な全般的な転写及びエピジェネティックなリプログラミングを誘導する。トランスクリプトミクス及びエピジェネティックなリプログラミングの動態を評価するための実験計画。ヒト膠芽細胞腫細胞株（Ｔ９８Ｇ）をＳＦＦＶ－ｈＰＩＢ－ＩＲＥＳ－ＥＧＦＰで形質導入した。リプログラミングされた（ＣＤ４５＋ＨＬＡ－ＤＲ＋、＋＋）細胞及び部分的にリプログラミングされた（ＣＤ４５－ＨＬＡ－ＤＲ＋、＋）細胞を、３日目（ｄ３）、５日目（ｄ５）、７日目（ｄ７）、及び９日目（ｄ９）にＦＡＣＳ分類ならびにｍＲＮＡ配列決定及びＡＴＡＣ配列決定でプロファイルした。空のＥＧＦＰベクターで形質導入された対照細胞を、０日目（ｄ０）として表す。ｃＤＣ１ドナー細胞を参照として使用した。 ＰＵ．１、ＩＲＦ８、及びＢＡＴＦ３は、迅速な全般的な転写及びエピジェネティックなリプログラミングを誘導する。差次的に発現される遺伝子に基づくがん細胞リプログラミングの経時変化の主成分分析（ＰＣＡ）（左パネル）。ヒト胚性線維芽細胞（ＨＥＦ）のリプログラミングも、この過程のダイナミクスに対する参照として含めた。矢印はリプログラミング軌跡を強調表示している。差次的アクセス可能なクロマチン領域に基づくＰＣＡ（右パネル）。ドナー末梢血ｃＤＣ１を参照として使用した。 ＰＵ．１、ＩＲＦ８、及びＢＡＴＦ３は、迅速な全般的な転写及びエピジェネティックなリプログラミングを誘導する。リプログラミング及び部分的にリプログラミングされたＴ９８Ｇ細胞における腫瘍－ＡＰＣトランスクリプトミクスシグネチャの確立（左）。腫瘍－ＡＰＣ遺伝子セットにおけるクロマチンのアクセシビリティを右側に示す。 ヒストン脱アセチル化酵素阻害は、腫瘍－ＡＰＣのリプログラミング効率を増強する。ルイス肺癌（ＬＬＣ）及びＢ１６癌細胞を、ＰＵ．１、ＩＲＦ８、及びＢＡＴＦ３（ＳＦＦＶ－ＰＩＢ－ｅＧＦＰ）で形質導入し、バルプロ酸（ＶＰＡ）の存在下または非存在下で培養し、９日目にフローサイトメトリーによってＣＤ４５及びＭＨＣ－ＩＩ発現について分析した。 ヒストン脱アセチル化酵素阻害は、腫瘍－ＡＰＣのリプログラミング効率を増強する。ｅＧＦＰ＋を形質導入した細胞でゲートした、ＶＰＡの存在下でのリプログラミング効率の定量化（ＣＤ４５＋ＭＨＣ－ＩＩ＋細胞％）（ｎ＝６～１６）。ｅＧＦＰベクターで形質導入されたがん細胞（緑色、ストライプ状）を、対照として含めた。 ヒストン脱アセチル化酵素阻害は、腫瘍－ＡＰＣのリプログラミング効率を増強する。ｅＧＦＰ＋で形質導入した細胞（ｎ＝６～１１）でゲートした、ＭＨＣ－Ｉ＋細胞のパーセンテージの定量化。 ヒストン脱アセチル化酵素阻害は、腫瘍－ＡＰＣのリプログラミング効率を増強する。リプログラミングされたＬＬＣ－ＯＶＡ及びＢ１６－ＯＶＡ細胞と共培養後のＣＤ４４＋増殖性ＯＴ－Ｉ ＣＤ８＋Ｔ細胞の定量化（ｎ＝４～１１）。 ヒストン脱アセチル化酵素阻害は、腫瘍－ＡＰＣのリプログラミング効率を増強する。活性化されたＯＴ－Ｉ Ｔ細胞とがん細胞の比を１：１として、リプログラミングされたＢ１６－ＯＶＡ標的細胞（ｍＯｒａｎｇｅ＋）、及び０時間後及び７２時間後に非標的Ｂ１６－ＯＶＡ細胞との共培養の、フローサイトメトリーによるＴ細胞の媒介による殺傷の定量化（ｎ＝５～７）。 ヒストン脱アセチル化酵素阻害は、腫瘍－ＡＰＣのリプログラミング効率を増強する。ＯＶＡペプチド（ＳＩＩＮＦＫＬ）で予めインキュベートしたリプログラミングされたＬＬＣまたはＢ１６細胞と共培養後のＣＤ４４＋増殖性ＯＴ－Ｉ ＣＤ８＋Ｔ細胞の定量化（ｎ＝４～１２）。平均±ＳＤが表されている。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。 ヒストン脱アセチル化酵素阻害は、腫瘍－ＡＰＣのリプログラミング効率を増強する。９日目に６つのヒト癌細胞株における、バルプロ酸（ＶＰＡ）の存在下及び非存在下でのｃＤＣ１のリプログラミング効率のフローサイトメトリー分析（上のパネル）及び定量化（下のパネル）。がん細胞株をＳＦＦＶ－ｈＰＩＢ－ＩＲＥＳ－ＥＧＦＰレンチウイルス粒子または対照としてのＥＧＦＰで形質導入し、リプログラミングの１日目から４日目までＶＰＡの存在下または非存在下で培養した。 ＳＰＩＢ及びＳＰＩＣは、ｃＤＣ１リプログラミングにおけるＰＵ．１の役割を補償する。（Ａ）ＰＵ．１ホモログ単独で、またはＩＲＦ８及びＢＡＴＦ３と組み合わせて形質導入した５日後のマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）におけるＣｌｅｃ９ａレポーター活性化のフローサイトメトリー定量化。（Ｂ）ＣＤ４５及びＭＨＣ－ＩＩ発現レベルのフローサイトメトリー定量化（ｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞でゲートされる）。グラフバーは平均±ＳＥＭを示す（Ｎ＝４）。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。 アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルスにより送達されるＰＵ．１、ＩＲＦ８、及びＢＡＴＦ３は、マウス及びヒト細胞においてｃＤＣ１リプログラミングを可能にする。ＰＵ．１、ＩＲＦ８、及びＢＡＴＦ３（ＰＩＢ）、ならびにＧＦＰ（ＰＩＢ－ＧＦＰ）をコードするレンチウイルス（Ｌｅｎｔｉ）、アデノウイルス（Ａｄ５及びＡｄ５／Ｆ３５）、及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ－ＤＪ及びＡＡＶ２－ｑＹＦ）での形質転換９日後のマウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）におけるＣｌｅｃ９ａレポーター活性化のフローサイトメトリー分析。 アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルスにより送達されるＰＵ．１、ＩＲＦ８、及びＢＡＴＦ３は、マウス及びヒト細胞においてｃＤＣ１リプログラミングを可能にする。ＰＵ．１、ＩＲＦ８、及びＢＡＴＦ３（ＰＩＢ）、ならびにＧＦＰ（ＰＩＢ－ＧＦＰ）をコードするレンチウイルス（Ｌｅｎｔｉ）、アデノウイルス（Ａｄ５及びＡｄ５／Ｆ３５）、及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ－ＤＪ及びＡＡＶ２－ｑＹＦ）での形質転換９日後のマウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）におけるＣＤ４５とＭＨＣ－ＩＩの発現の定量化。ＧＦＰのみをコードするウイルスを対照として含め、形質導入した細胞においてｔｄＴｏｍａｔｏ発現を誘導しなかった。グラフバーは、平均±ＳＥＭを示す（Ｎ＝４）。 アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルスにより送達されるＰＵ．１、ＩＲＦ８、及びＢＡＴＦ３は、マウス及びヒト細胞においてｃＤＣ１リプログラミングを可能にする。ＰＩＢ－ＧＦＰをコードするウイルスで形質導入してから９日後にＣＤ４５及びＭＨＣ－ＩＩの発現として測定されたＢ２９０５マウス黒色腫細胞株におけるｃＤＣ１リプログラミング効率のフローサイトメトリー定量化。ＧＦＰのみをコードするレンチウイルスを対照として含めた。グラフバーは、平均±ＳＥＭを示す（Ｎ＝４）。 アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルスにより送達されるＰＵ．１、ＩＲＦ８、及びＢＡＴＦ３は、マウス及びヒト細胞においてｃＤＣ１リプログラミングを可能にする。ＰＩＢ－ＧＦＰをコードするウイルスで形質導入してから９日後にＣＤ４５及びＨＬＡ－ＤＲの発現として測定された２つのヒトがん細胞株（ＩＧＲ－３９及びＴ９８Ｇ）ならびに１つの原発性黒色腫試料（２７７８）におけるｃＤＣ１リプログラミング効率のフローサイトメトリー定量化。ＧＦＰのみをコードするレンチウイルスを対照として含めた。グラフバーは、平均±ＳＥＭを示す（Ｎ＝４）。
定義
「生物学的に活性なバリアント」とは、本明細書では、親ＴＦの活性の少なくとも一部を保持する転写因子（ＴＦ）の生物学的に活性なバリアントを指す。例えば、塩基性ロイシンジッパーＡＴＦ様転写因子３（ＢＡＴＦ３）、インターフェロン調節因子８（ＩＲＦ８）、及びＰＵ．１の生物学的に活性なバリアントは、前述のそれぞれのＴＦとして作用し得、細胞においてＢＡＴＦ３、ＩＲＦ８、及びＰＵ．１がそれぞれ行うように、同一の遺伝子の発現をそれぞれ誘導または阻害するが、誘導の効率は異なっていてもよく、例えば、遺伝子の誘導または阻害の効率は、親ＴＦと比較して低下または増加する。
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに関する「同一性及び相同性」とは、本明細書では、配列をアラインメントし、必要に応じて最大の同一性／類似性／相同性のパーセントを達成するためにギャップを導入し、配列同一性の一部としてＮＣＩＵＢ規則（ｈｆｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈｅｍ．ｑｍｕｌ．ａｃ．ｕｋ／ｉｕｂｍｂ／ｍｉｓｃ／ｎａｓｅｑ．ｈｔｍｌ；ＮＣ－ＩＵＢ，Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ（１９８５））に従ったあらゆる保存的置換を考慮した後の、対応する天然の核酸またはアミノ酸の残基に対してそれぞれ同一または相同である、候補配列中の核酸またはアミノ酸のパーセンテージとして定義される。５’または３’の伸長も、挿入（核酸の場合）も、Ｎ’またはＣ’の伸長も、挿入（ポリペプチドの場合）も、同一性、類似性または相同性の低下を引き起こさない。アラインメントのための方法及びコンピュータプログラムは当該技術分野でよく知られている。総じて、２つの配列間の所与の相同性は、これらの配列間の同一性が少なくとも相同性と等しいことを意味する。例えば、２つの配列が互いに７０％の相同である場合、それらは互いに７０％未満同一であり得ないが、８０％の同一性を共有し得る。
本明細書では、「間葉系幹細胞」または「間葉系間質細胞」（いずれも「ＭＳＣ」という）は交換可能に使用され、骨芽細胞（骨細胞）、軟骨細胞（軟骨細胞）、及び脂肪細胞（脂肪細胞）を含むが、これらに限定されないさまざまな細胞型に分化し得る多能性間質細胞であると本明細書で呼ばれる。
「マウス（Ｍｕｒｉｎｅ）」とは、本明細書では、ラット及びマウスを含むネズミ科の任意の及びすべてのメンバーを指す。
「リプログラミング」とは、本明細書では、ある細胞型から別の細胞型に分化する細胞を変換するプロセスを指す。特に、本明細書でのリプログラミングとは、任意の種類の細胞を１型の通常型樹状細胞または抗原提示細胞に変換または分化転換させることを指す。
「治療する」または「治療」とは、本明細書では、対象における開示されている疾患、障害、及び症状に対する治療薬の任意の投与または適用を指し、疾患の進行の抑制、疾患またはその進行の遅延、疾患の発症の停止、疾患の部分的もしくは完全な緩和、または疾患の１つ以上の症状の部分的もしくは完全な緩和を含む。
本明細書で使用される場合、「アデノウイルス」という用語は、アデノウイルスとしてカテゴライズされ得る任意の及びすべてのウイルスを指すために使用されており、これは、別途必要に応じて除かれるが、すべての群、下位群、及び血清型を含む、ヒトまたは非ヒト動物に感染する任意のアデノウイルスを含む。したがって、本明細書で使用される場合、「アデノウイルス」とは、ウイルス自体またはその誘導体を指し、特に明記しない限り、すべての血清型及びサブタイプ、天然に存在する（野生型）、アデノウイルスベクター、例えば遺伝子送達ビヒクルとして使用される改変、例えばカプシド変異、リコンビナント形態、複製可能、条件付き複製可能、または複製欠損形態などの当該技術分野で既知の方法で改変された形態を含む。
本明細書で使用される場合、「アデノ随伴ウイルス」という用語は、天然に存在する野生型ウイルス自体またはその誘導体を指すために使用することができる。この用語は、ヒトまたは非ヒト動物に感染するいずれのアデノ随伴ウイルスも含むアデノ随伴ウイルスとしてカテゴライズされ得る任意の及びすべてのウイルスを指すのに使用され、すべてのサブタイプ、血清型、及び疑似型、ならびに天然に存在する形態と、別途必要な場合は除かれるが、アデノ随伴ウイルスベクター、例えば、遺伝子送達ビヒクルとして使用される改変などの、改変された、及び組換えされた形態との両方を含む。
本明細書で使用される場合、ウイルスベクターに関連する略語「Ａｄ」は、アデノウイルスを指し、典型的には、アデノウイルスの血清型を示す番号が続く。例えば、「Ａｄ５」は、アデノウイルスの血清型５を指す。
本明細書では、目的に適した任意のＡｄを使用することができ、例えば、非限定的に、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ Ａｄサブグループ、例えばＡｄ２、Ａｄ５またはＡｄ３５、鳥Ａｄ、ウシＡｄ、イヌＡｄ、ヤギＡｄ、ウマＡｄ、霊長類Ａｄ、非霊長類Ａｄ、及びヒツジＡｄのいずれかからの任意の血清型からのＡｄを使用することができる。「霊長類Ａｄ」は、霊長類に感染するＡｄを指し、「非霊長類Ａｄ」は、非霊長類哺乳動物に感染するＡｄを指し、「ウシＡｄ」は、ウシ哺乳動物に感染するＡｄを指す。
Ａｄのさまざまな血清型のゲノム配列、ならびに天然末端反復（ＴＲ）及びカプシドサブユニットの配列は、当該技術分野で既知である。
本明細書で使用される場合、ウイルスベクターに関連する略語「ＡＡＶ」は、アデノ随伴ウイルスを指し、典型的には、アデノ随伴ウイルスの血清型を示す番号が続く。例えば、「ＡＡＶ２」は、アデノ随伴ウイルス血清型２を指す。
本明細書では、この目的に適した任意のＡＡＶを使用することができ、例えば、非限定的に、ＡＡＶ血清型１（ＡＡＶ１）、ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）、ＡＡＶ血清型３Ａ（ＡＡＶ３Ａ）、ＡＡＶ血清型３Ｂ（ＡＡＶ３Ｂ）、ＡＡＶ血清型４（ＡＡＶ４）、ＡＡＶ血清型５（ＡＡＶ５）、ＡＡＶ血清型６（ＡＡＶ６）、ＡＡＶ血清型７（ＡＡＶ７）、ＡＡＶ血清型８（ＡＡＶ８）、ＡＡＶ血清型９（ＡＡＶ９）、ＡＡＶ血清型１０（ＡＡＶ１０）、鳥類ＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ヤギＡＡＶ、ウマＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶ、及びヒツジＡＡＶを使用することができる。例えば、「霊長類ＡＡＶ」は、霊長類に感染するＡＡＶを指し、「非霊長類ＡＡＶ」は、非霊長類哺乳動物に感染するＡＡＶを指し、「ウシＡＡＶ」は、ウシ哺乳動物に感染するＡＡＶを指す。
ＡＡＶのさまざまな血清型のゲノム配列、ならびに天然末端反復（ＴＲ）、Ｒｅｐタンパク質、及びカプシドサブユニットの配列は、当該技術分野で既知である。
本明細書で使用される場合、「ハイブリッド」ＡｄまたはＡＡＶベクターは、ＡｄまたはＡＡＶベクターが２つ以上の異なるＡｄまたはＡＡＶの血清型に由来するタンパク質を含むように操作されたＡｄまたはＡＡＶに基づいたベクターを指す。
本明細書で使用される場合、「ＡＡＶ２－ｑＹＦ」または「ＡＡＶ２－ＱｕａｄＹＦ」は、ＡＡＶ２の４重チロシン～フェニルアラニン変異体を指す。
本明細書で使用される場合、「ＡＡＶ－ＤＪ」とは、ＡＡＶ２、４、５、８、９、トリ、ウシ、及びヤギＡＡＶを含む８種類の野生型血清型ＡＡＶのＤＮＡファミリーシャフリングに由来するハイブリッドカプシドを指す。ＡＡＶ－ＤＪは、最も近い天然の近縁種（ＡＡＶ－２）から６０個のカプシドアミノ酸で区別される、合成血清型の２型／８型／９型キメラである。
組成物
本発明は、細胞を樹状細胞または抗原提示細胞へとリプログラミングまたは誘導するための組成物及び方法におけるそれらの使用に関する。本発明者らは、驚くべきことに、特定のプロモーター下でＴＦのＢＡＴＦ３、ＩＲＦ８、及びＰＵ．１を発現させることによって、リプログラミングを顕著に改善できることを見出した。
したがって、本明細書において、発現時に転写因子：
ａ）ＢＡＴＦ３、または配列番号１０（ＢＡＴＦ３）と少なくとも７０％同一であるその生物学的に活性なバリアント、
ｂ）ＩＲＦ８、または、配列番号１１（ＩＲＦ８）と少なくとも７０％同一であるその生物学的に活性なバリアント、及び
ｃ）ＰＵ．１、または、配列番号１２（ＰＵ．１）と少なくとも７０％同一であるその生物学的に活性なバリアント、
をコードする１つ以上のコンストラクトまたはベクターを含む組成物であって、１つ以上のコンストラクトまたはベクターは、転写因子の転写を制御することが可能なプロモーター領域を含み、プロモーター領域は、脾臓病巣形成ウイルス（ＳＦＦＶ）プロモーター、ＭＮＤ（骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、陰性制御領域欠失、ｄｌ５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換）プロモーター、ＣＡＧ（ＣＭＶ初期エンハンサー／ニワトリβアクチン）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ユビキチンＣ（ＵｂＣ）プロモーター、ＥＦ－１アルファ（ＥＦ－１α）プロモーター、ＥＦ－１アルファショート（ＥＦ１Ｓ）プロモーター、ＥＦ－１アルファとイントロン（ＥＦ１ｉ）プロモーター、ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、または実質的に同じ効果を示すプロモーターを含む、組成物が提供される。
ＴＦは、本明細書の「転写因子」の節で定義されるとおりであり得る。
プロモーター領域は、本明細書の「プロモーター」の節で定義されるとおりであり得る。
ＴＦは、１つ以上のベクターまたはコンストラクトから、ポリシストロン性コンストラクト、ジシストロン性（またはビシストロン性）コンストラクト、及び／またはモノシストロン性コンストラクトとして発現され得る。ｍＲＮＡ分子は、単一のタンパク質鎖のみを翻訳するための遺伝情報を含む場合にモノシストロン性であると言われる。一方、ポリシストロン性ｍＲＮＡは、複数のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有し、そのそれぞれがポリペプチドに翻訳される。ジシストロン性ｍＲＮＡは２種類のタンパク質のみをコードする。ポリシストロン性及びジシストロン性ｍＲＮＡは、単一のプロモーターまたはプロモーター領域から発現する。
一実施形態では、組成物は、発現時に：
ａ）ＩＲＦ７、または、配列番号２１（ＩＲＦ７）と少なくとも７０％同一であるその生物学的に活性なバリアント、
ｂ）ＢＡＴＦ、または、配列番号１９（ＢＡＴＦ）と少なくとも７０％同一であるその生物学的に活性なバリアント、
ｃ）ＳＰＩＢ、または、配列番号２３（ＳＰＩＢ）と少なくとも７０％同一であるその生物学的に活性なバリアント、
ｄ）ＳＰＩＣ、または、配列番号２５（ＳＰＩＣ）と少なくとも７０％同一であるその生物学的に活性なバリアント、
ｅ）ＣＥＢＰα、または、配列番号１３（ＣＥＢＰα）と少なくとも７０％同一であるその生物学的に活性なバリアント、
から選択される１つ以上の転写因子をコードする１つ以上のコンストラクトまたはベクターをさらに含み、１つ以上のコンストラクトまたはベクターは、転写因子の転写を制御することが可能なプロモーター領域を含み、プロモーター領域は、脾臓病巣形成ウイルス（ＳＦＦＶ）プロモーター、ＭＮＤ（骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、陰性制御領域欠失、ｄｌ５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換）プロモーター、ＣＡＧ（ＣＭＶ初期エンハンサー／ニワトリβアクチン）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ユビキチンＣ（ＵｂＣ）プロモーター、ＥＦ－１アルファ（ＥＦ－１α）プロモーター、ＥＦ－１アルファショート（ＥＦ１Ｓ）プロモーター、ＥＦ－１アルファとイントロン（ＥＦ１ｉ）プロモーター、ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、または実質的に同じ効果を示すプロモーターを含む。
一実施形態では、組成物は、
ａ）発現時に転写因子ＢＡＴＦ３、ＩＲＦ８、及びＰＵ．１をコードする１つのコンストラクトまたはベクター、
ｂ）発現時に転写因子ＢＡＴＦ３、ＩＲＦ８、及びＳＰＩＢをコードする１つのコンストラクトまたはベクター、
ｃ）発現時に転写因子ＢＡＴＦ３及びＩＲＦ８をコードする第１のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＰＵ．１をコードする第２のコンストラクトまたはベクター、
ｄ）発現時に転写因子ＢＡＴＦ３及びＩＲＦ８をコードする第１のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＳＰＩＢをコードする第２のコンストラクトまたはベクター、
ｅ）発現時に転写因子ＢＡＴＦ３をコードする第１のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＩＲＦ８及びＰＵ．１をコードする第２のコンストラクトまたはベクター、
ｆ）発現時に転写因子ＢＡＴＦ３をコードする第１のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＩＲＦ８及びＳＰＩＢをコードする第２のコンストラクトまたはベクター、
ｇ）発現時に転写因子ＩＲＦ８をコードする第１のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＢＡＴＦ３及びＰＵ．１をコードする第２のコンストラクトまたはベクター、
ｈ）発現時に転写因子ＩＲＦ８をコードする第１のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＢＡＴＦ３及びＳＰＩＢをコードする第２のコンストラクトまたはベクター、
ｉ）発現時に転写因子ＢＡＴＦ３をコードする第１のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＩＲＦ８をコードする第２のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＰＵ．１をコードする第３のコンストラクトまたはベクター、
及び／または、
ｊ）発現時に転写因子ＢＡＴＦ３をコードする第１のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＩＲＦ８をコードする第２のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＳＰＩＢをコードする第３のコンストラクトまたはベクター、
を含む。
一実施形態では、１つ以上のコンストラクトまたはベクターが、発現時に転写因子ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質アルファ（ｃΕΒΡα）、またはその生物学的に活性なバリアントをさらにコードする。ｃΕΒΡαは、本明細書で「転写因子」という節で定義されるとおりであり得る。
別の実施形態では、１つ以上のコンストラクトまたはベクターが、発現時に転写因子インターフェロン調節因子７（ＩＲＦ７）、またはその生物学的に活性なバリアントをさらにコードする。ＩＲＦ７は、本明細書の「転写因子」の節で定義されるとおりであり得る。
別の実施形態では、１つ以上のコンストラクトまたはベクターは、発現時に転写因子である塩基性ロイシンジッパーＡＴＦ様（ＢＡＴＦ）、またはその生物学的に活性なバリアントをさらにコードする。ＢＡＴＦは、本明細書の「転写因子」の節で定義されるとおりであり得る。
別の実施形態では、１つ以上のコンストラクトまたはベクターは、発現時に転写因子であるＳｐｉ－Ｃ（ＳＰＩＣ）、またはその生物学的に活性なバリアントをさらにコードする。ＳＰＩＣは、本明細書の「転写因子」の節で定義されるとおりであり得る。
一実施形態では、組成物は、
ａ）発現時に転写因子ＢＡＴＦ３、ＩＲＦ８、ＰＵ．１、及びＩＲＦ７をコードする１つのコンストラクトまたはベクター、
ｂ）発現時に転写因子ＢＡＴＦ３及びＩＲＦ８をコードする第１のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＰＵ．１及びＩＲＦ７をコードする第２のコンストラクトまたはベクター、
ｃ）発現時に転写因子ＢＡＴＦ３及びＰＵ．１をコードする第１のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＩＲＦ８及びＩＲＦ７をコードする第２のコンストラクトまたはベクター、
ｄ）発現時に転写因子ＰＵ．１及びＩＲＦ８をコードする第１のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＢＡＴＦ３及びＩＲＦ７をコードする第２のコンストラクトまたはベクター、
ｅ）発現時に転写因子ＢＡＴＦ３、ＩＲＦ８、及びＰＵ．１をコードする第１のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＩＲＦ７をコードする第２のコンストラクトまたはベクター、
ｆ）発現時に転写因子ＢＡＴＦ３をコードする第１のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＩＲＦ８、ＰＵ．１、及びＩＲＦ７をコードする第２のコンストラクトまたはベクター、
ｇ）発現時に転写因子ＩＲＦ８をコードする第１のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＢＡＴＦ３、ＰＵ．１、及びＩＲＦ７をコードする第２のコンストラクトまたはベクター、
ｈ）発現時に転写因子ＰＵ．１をコードする第１のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＢＡＴＦ３、ＩＲＦ８、及びＩＲＦ７をコードする第２のコンストラクトまたはベクター、
及び／または、
ｉ）発現時に転写因子ＢＡＴＦ３をコードする第１のコンストラクトまたはベクター、発現時に転写因子ＩＲＦ８をコードする第２のコンストラクトまたはベクター、発現時に転写因子ＰＵ．１をコードする第３のコンストラクトまたはベクター、及び発現時に転写因子ＩＲＦ７をコードする第４のコンストラクトまたはベクター、
を含む。
一実施形態では、組成物は、
ａ）発現時に転写因子ＢＡＴＦ３、ＩＲＦ８、ＰＵ．１、及びＢＡＴＦをコードする１つのコンストラクトまたはベクター、
ｂ）発現時に転写因子ＢＡＴＦ３及びＩＲＦ８をコードする第１のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＰＵ．１及びＢＡＴＦをコードする第２のコンストラクトまたはベクター、
ｃ）発現時に転写因子ＢＡＴＦ３及びＰＵ．１をコードする第１のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＩＲＦ８及びＢＡＴＦをコードする第２のコンストラクトまたはベクター、
ｄ）発現時に転写因子ＰＵ．１及びＩＲＦ８をコードする第１のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＢＡＴＦ３及びＢＡＴＦをコードする第２のコンストラクトまたはベクター、
ｅ）発現時に転写因子ＢＡＴＦ３、ＩＲＦ８、及びＰＵ．１をコードする第１のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＢＡＴＦをコードする第２のコンストラクトまたはベクター、
ｆ）発現時に転写因子ＢＡＴＦ３をコードする第１のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＩＲＦ８、ＰＵ．１、及びＢＡＴＦをコードする第２のコンストラクトまたはベクター、
ｇ）発現時に転写因子ＩＲＦ８をコードする第１のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＢＡＴＦ３、ＰＵ．１、及びＢＡＴＦをコードする第２のコンストラクトまたはベクター、
ｈ）発現時に転写因子ＰＵ．１をコードする第１のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＢＡＴＦ３、ＩＲＦ８、及びＢＡＴＦをコードする第２のコンストラクトまたはベクター、
及び／または、
ｉ）発現時に転写因子ＢＡＴＦ３をコードする第１のコンストラクトまたはベクター、発現時に転写因子ＩＲＦ８をコードする第２のコンストラクトまたはベクター、発現時に転写因子ＰＵ．１をコードする第３のコンストラクトまたはベクター、及び発現時に転写因子ＢＡＴＦをコードする第４のコンストラクトまたはベクター、
を含む。
一実施形態では、組成物は、
ａ）発現時に転写因子ＢＡＴＦ３、ＩＲＦ８、ＳＰＩＢ、及びＩＲＦ７をコードする１つのコンストラクトまたはベクター、
ｂ）発現時に転写因子ＢＡＴＦ３及びＩＲＦ８をコードする第１のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＳＰＩＢ及びＩＲＦ７をコードする第２のコンストラクトまたはベクター、
ｃ）発現時に転写因子ＢＡＴＦ３及びＳＰＩＢをコードする第１のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＩＲＦ８及びＩＲＦ７をコードする第２のコンストラクトまたはベクター、
ｄ）発現時に転写因子ＳＰＩＢ及びＩＲＦ８をコードする第１のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＢＡＴＦ３及びＩＲＦ７をコードする第２のコンストラクトまたはベクター、
ｅ）発現時に転写因子ＢＡＴＦ３、ＩＲＦ８、及びＳＰＩＢをコードする第１のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＩＲＦ７をコードする第２のコンストラクトまたはベクター、
ｆ）発現時に転写因子ＢＡＴＦ３をコードする第１のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＩＲＦ８、ＳＰＩＢ、及びＩＲＦ７をコードする第２のコンストラクトまたはベクター、
ｇ）発現時に転写因子ＩＲＦ８をコードする第１のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＢＡＴＦ３、ＳＰＩＢ、及びＩＲＦ７をコードする第２のコンストラクトまたはベクター、
ｈ）発現時に転写因子ＳＰＩＢをコードする第１のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＢＡＴＦ３、ＩＲＦ８、及びＩＲＦ７をコードする第２のコンストラクトまたはベクター、
及び／または、
ｉ）発現時に転写因子ＢＡＴＦ３をコードする第１のコンストラクトまたはベクター、発現時に転写因子ＩＲＦ８をコードする第２のコンストラクトまたはベクター、発現時に転写因子ＳＰＩＢをコードする第３のコンストラクトまたはベクター、及び発現時に転写因子ＩＲＦ７をコードする第４のコンストラクトまたはベクター、
を含む。
一実施形態では、組成物は、
ａ）発現時に転写因子ＢＡＴＦ３、ＩＲＦ８、ＳＰＩＢ、及びＢＡＴＦをコードする１つのコンストラクトまたはベクター、
ｂ）発現時に転写因子ＢＡＴＦ３及びＩＲＦ８をコードする第１のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＳＰＩＢ及びＢＡＴＦをコードする第２のコンストラクトまたはベクター、
ｃ）発現時に転写因子ＢＡＴＦ３及びＳＰＩＢをコードする第１のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＩＲＦ８及びＢＡＴＦをコードする第２のコンストラクトまたはベクター、
ｄ）発現時に転写因子ＳＰＩＢ及びＩＲＦ８をコードする第１のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＢＡＴＦ３及びＢＡＴＦをコードする第２のコンストラクトまたはベクター、
ｅ）発現時に転写因子ＢＡＴＦ３、ＩＲＦ８、及びＳＰＩＢをコードする第１のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＢＡＴＦをコードする第２のコンストラクトまたはベクター、
ｆ）発現時に転写因子ＢＡＴＦ３をコードする第１のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＩＲＦ８、ＳＰＩＢ、及びＢＡＴＦをコードする第２のコンストラクトまたはベクター、
ｇ）発現時に転写因子ＩＲＦ８をコードする第１のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＢＡＴＦ３、ＳＰＩＢ、及びＢＡＴＦをコードする第２のコンストラクトまたはベクター、
ｈ）発現時に転写因子ＳＰＩＢをコードする第１のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＢＡＴＦ３、ＩＲＦ８、及びＢＡＴＦをコードする第２のコンストラクトまたはベクター、
及び／または、
ｉ）発現時に転写因子ＢＡＴＦ３をコードする第１のコンストラクトまたはベクター、発現時に転写因子ＩＲＦ８をコードする第２のコンストラクトまたはベクター、発現時に転写因子ＳＰＩＢをコードする第３のコンストラクトまたはベクター、及び発現時に転写因子ＢＡＴＦをコードする第４のコンストラクトまたはベクター、
を含む。
本明細書に開示されている１つ以上のコンストラクト及びベクターは、プラスミドなどの任意の種類のコンストラクト及びベクターであり得る。
一実施形態では、１つ以上のコンストラクトまたはベクターは、１つ以上のウイルスベクターである。他の実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、パラミクソウイルスベクター、ラブドウイルスベクター、アルファウイルスベクター、フラビウイルスベクター、及びアデノ随伴ウイルスベクターからなる群から選択される。別の実施形態では、ウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。
アデノウイルス（Ａｄ）ベクター及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、当該技術分野で知られている任意のＡｄまたはＡＡＶの血清型に由来するベクターであってよく、例えばそれぞれの血清型について感染される標的細胞の特異性の適用によって、特定の細胞（例えば、神経細胞、筋肉細胞、及び肝細胞）、組織、及び器官における遺伝子発現を可能にし得る。ＡｄまたはＡＡＶは、野生型であってもよく、１つ以上の野生型遺伝子が全部または一部欠失していてもよい。ＡｄまたはＡＡＶは、例えば、疑似型判定などの当該技術分野で公知の任意の方法によってさらに操作されてよく、その結果、ハイブリッドウイルスカプシドなどのハイブリッド（またはキメラ）ウイルス粒子が得られる。
ＡＡＶまたはＡｄのウイルス粒子はまた、例えば１つ以上のチロシン残基などの１つ以上のアミノ酸残基で変異していてもよい。
一実施形態では、アデノウイルスベクターは、野生型Ａｄベクター、ハイブリッドＡｄベクター、及び変異体Ａｄベクターからなる群から選択される。
別の実施形態では、アデノ随伴ウイルスベクターは、野生型ＡＡＶベクター、ハイブリッドＡＡＶベクター、及び変異体ＡＡＶベクターからなる群から選択される。
さらなる実施形態では、野生型ＡｄベクターはＡｄ５であり、ハイブリッドＡｄベクターはＡｄ５／Ｆ３５である。
さらに別の実施形態では、ハイブリッドＡＡＶベクターは、ＡＡＶ－ＤＪであり、変異体ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２－ＱｕａｄＹＦである。
一実施形態では、ベクターまたはコンストラクトは、合成ｍＲＮＡ、ネイキッドアルファウイルスＲＮＡレプリコンまたはネイキッドフラビウイルスＲＮＡレプリコンである。
一実施形態では、レンチウイルスベクターは、異種のエンハンサー／プロモーター、例えばラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）またはＣＭＶプロモーターに融合したキメラ５’長末端反復（ＬＴＲ）を含む。
一実施形態では、レンチウイルスベクターは、３’ＬＴＲのＵ３領域内の欠失を含み、それによって、該ベクターは、複製不能性であり、組込み後に自己不活化する。
一実施形態では、１つ以上のコンストラクトまたはベクターは、１つ以上のプラスミドである。
一実施形態では、１つ以上のコンストラクトまたはベクターの骨格は、ＦＵＷ、ｐＲＲＬ－ｃＰＰＴ、ｐＲＬＬ、ｐＣＣＬ、ｐＣＬＬ、ｐＨＡＧＥ２、ｐＷＰＸＬ、ｐＬＫＯ、ｐＨＩＶ、ｐＬＬ、ｐＣＤＨ、及びｐＬｅｎｔｉからなる群から選択される。
ｐＲＲＬ、ｐＲＬＬ、ｐＣＣＬ、及びｐＣＬＬは、キメララウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）－ＨＩＶまたはＣＭＶ－ＨＩＶ ５’ＬＴＲと、シミアンウイルス４０のポリアデニル化及び（エンハンサーレス）複製配列の起点がＨＩＶ ３’ＬＴＲの下流に含まれ、ＨＩＶ組込み部位から残っているヒト配列の大部分を置き換えているベクター骨格と、を含む、レンチウイルス移入ベクターである。ｐＲＲＬでは、ＲＳＶのＵ３領域からのエンハンサー及びプロモーター（転写開始部位に対してヌクレオチド－２３３～－１、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｊ０２３４２）を、ＨＩＶ－１ ＬＴＲのＲ領域に結合する。ｐＲＬＬでは、ＲＳＶエンハンサー（ヌクレオチド－２３３～－５０）配列を、ＨＩＶ－１のプロモーター領域（転写開始部位に対して－７８の位置から）に結合する。ｐＣＣＬでは、ＣＭＶのエンハンサー及びプロモーター（転写開始部位に対してヌクレオチド－６７３～－１、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｋ０３１０４）を、ＨＩＶ－１のＲ領域に結合する。ｐＣＬＬでは、ＣＭＶエンハンサー（ヌクレオチド－６７３～－２２０）を、ＨＩＶ－１のプロモーター領域（位置－７８）に結合する。
本明細書に開示された１つ以上のコンストラクトまたはベクターは、ＴＦをコードするポリヌクレオチド及び該ＴＦの発現を促進するプロモーター領域（複数可）に加えて、任意の種類のエレメントを含み得る。例えば、１つ以上のコンストラクトまたはベクターは、調節的、選択可能、及び／または構造的エレメント及び／または配列を含むことができる。
一実施形態では、１つ以上のコンストラクトまたはベクターは、少なくとも３つのコード領域の少なくとも２つに作動可能に連結されている自己切断ペプチドを含み、したがって単一のオープンリーディングフレームを形成する。自己切断ペプチドは、任意の種類の自己切断ペプチドであってよい。一実施形態では、自己切断ペプチドは、２Ａペプチドである。一実施形態では、２Ａペプチドは、ウマ鼻炎Ａウイルス（Ｅ２Ａ）、口蹄疫ウイルス（Ｆ２Ａ）、ブタテシオウイルス－１（Ｐ２Ａ）及びトセアアシグナ（Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａ）ウイルス（Ｔ２Ａ）ペプチドからなる群から選択される。
一実施形態では、１つ以上のコンストラクトまたはベクターは、転写後調節エレメント（ＰＲＥ）配列を含む。好ましい実施形態では、ＰＲＥ配列は、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）である。
一実施形態では、１つ以上のコンストラクトまたはベクターは、５’及び３’末端反復を含む。好ましい実施形態では、５’及び３’末端反復の少なくとも一方は、レンチウイルスの長末端反復または３’長末端反復のＵ３を部分的に欠失した自己不活性化（ＳＩＮ）デザインである。
一実施形態では、１つ以上のコンストラクトまたはベクターは中央ポリプリン配列（ｃＰＰＴ）を含む。
一実施形態では、１つ以上のコンストラクトまたはベクターは、ヌクレオカプシドタンパク質パッケージング標的部位を含む。好ましい実施形態では、タンパク質パッケージング標的部位は、ＨＩＶ－１ ｐｓｉ配列を含む。
一実施形態では、１つ以上のコンストラクトまたはベクターは、ＲＥＶタンパク質応答エレメント（ＲＲＥ）を含む。
本明細書に開示される組成物は、本明細書に開示される方法に従って細胞のリプログラミングの効率を改善する成分などの追加の成分をさらに含み得る。追加の成分は、高分子、例えばタンパク質、例えばサイトカインであり得る。
サイトカインは、細胞シグナル伝達に重要な低分子タンパク質（ペプチド）である。サイトカインは、細胞の脂質二重層を通過して細胞質に入ることはできないが、細胞内シグナル伝達経路を調節する表面受容体を介して作用する。それらは免疫調節剤としてオートクリン、パラクリン、及び内分泌シグナル伝達に関与することが示されている。サイトカインとしては、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、リンホカイン、及び腫瘍壊死因子が挙げられる。
一実施形態では、組成物はさらに１種以上の炎症促進性サイトカインを含む。一実施形態では、組成物はさらに、１種以上の造血サイトカインを含む。一実施形態では、組成物は、ＩＦΝβ、ＩＦΝγ、ＴＮＦα、ＩＦΝα、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＣＤ４０Ｉ、Ｆｌｔ３Ｉ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮ－λ１、ＩＦＮ－ω、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－１５、プロスタグランジン２、ＳＣＦ、及びオンコスタチンＭ（ＯＭ）からなる群から選択される１種以上のサイトカインをさらに含む。好ましい実施形態では、１種以上のサイトカインは、ＩＦΝβ、ＩＦΝγ、及びＴＮＦαからなる群から選択される。
追加の成分は、例えば小分子を含んでもよい。小分子は、脂質類、単糖類、セカンドメッセンジャー、他の天然産物、及び代謝産物、ならびに薬物及びタンパク質などの高分子とは異なる他の生体異物を含む低分子量分子である。小分子は、高レベルの細胞透過性を有し、製造が安価であり、合成が容易であり、かつ標準化される。
一実施形態では、組成物はさらに１つ以上の小分子を含む。
小分子は、例えば、エピジェネティックなモジュレーターとして機能する小分子であってよい。小分子はまた、例えば、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（ＨＤＡＣｉ）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤、ヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴ）阻害剤、またはヒストンデメチラーゼ阻害剤などの、遺伝子発現のエピジェネティック制御を標的とする小分子であってもよい。
したがって、一実施形態では、組成物は、１つ以上のヒストン脱アセチル化酵素阻害剤をさらに含む。
一実施形態では、組成物は、バルプロ酸、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）、酪酸ナトリウムをさらに含む。
したがって、一実施形態では、組成物は、５’－アザシチジン（５’－ａｚａＣ）またはＲＧ１０８などの１つ以上のＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤をさらに含む。
一実施形態では、組成物は、１つ以上のヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴ）阻害剤、例えば、Ｇ９ａ介在性Ｈ３Ｋ９ｍｅ２メチル化の阻害の阻害剤であるＢＩＸ－０１２９４をさらに含む。
一実施形態では、組成物はさらに、１つ以上のヒストンデメチラーゼ阻害剤、例えばパルネート（ＬＳＤ１阻害剤）を含む。
そのような追加の成分には、例えば、リプログラミングの成功に関連する追加のＴＦまたは遺伝子をコードする核酸も含まれ得る。
したがって、一実施形態では、組成物は、１つ以上の追加のＴＦ及び／または１つ以上の追加のＴＦをコードする遺伝子をさらに含み、１つ以上のＴＦはリプログラミングの成功に関連している。一実施形態では、リプログラミングの成功に関連する１つ以上のＴＦが、表１に列挙されたリプログラミングの成功に関連するＴＦから選択される。
一実施形態では、組成物は、リプログラミングの成功に関連する１つ以上の追加のＴＦ及び／または追加のＴＦをコードする遺伝子をさらに含み、リプログラミングの成功に関連する１つ以上のＴＦは表１のリストから選択される。
一実施形態では、組成物は、１つ以上の追加の表面マーカーを発現する細胞を含み、１つ以上の追加の表面マーカーは、表１に列挙された表面マーカーから選択される。

Figure 2024522074000002
Figure 2024522074000003
Figure 2024522074000004
Figure 2024522074000005
Figure 2024522074000006
上記のように、組成物は、リプログラミングの成功に関連するタンパク質をコードする遺伝子をさらに含んでいてもよい。一実施形態では、該遺伝子は、ＴＦ以外のタンパク質をコードする。
遺伝子の発現は、例えば、トランスクリプトミクスまたは本明細書に記載される他の方法などの当該技術分野で知られている方法を使用して試験され得る。
一実施形態では、該組成物は医薬組成物である。
細胞
本明細書において、発現時に転写因子：
ａ）ＢＡＴＦ３、または配列番号１０（ＢＡＴＦ３）と少なくとも７０％同一であるその生物学的に活性なバリアント、
ｂ）ＩＲＦ８、または、配列番号１１（ＩＲＦ８）と少なくとも７０％同一であるその生物学的に活性なバリアント、及び
ｃ）ＰＵ．１、または、配列番号１２（ＰＵ．１）と少なくとも７０％同一であるその生物学的に活性なバリアント、
ｄ）ＩＲＦ７、または、配列番号２１（ＩＲＦ７）と少なくとも７０％同一であるその生物学的に活性なバリアント、
ｅ）ＢＡＴＦ、または、配列番号１９（ＢＡＴＦ）と少なくとも７０％同一であるその生物学的に活性なバリアント、
ｆ）ＳＰＩＢ、または、配列番号２３（ＳＰＩＢ）と少なくとも７０％同一であるその生物学的に活性なバリアント、
ｇ）ＳＰＩＣ、または、配列番号２５（ＳＰＩＣ）と少なくとも７０％同一であるその生物学的に活性なバリアント、及び／または
ｈ）ＣＥＢＰα、または、配列番号１３（ＣＥＢＰα）と少なくとも７０％同一であるその生物学的に活性なバリアント、またはそれらの任意の組み合わせ、
をコードする１つ以上のコンストラクトまたはベクターを含む細胞であって、１つ以上のコンストラクトまたはベクターは、転写因子の転写を制御することが可能なプロモーター領域を含み、プロモーター領域は、脾臓病巣形成ウイルス（ＳＦＦＶ）プロモーター、ＭＮＤ（骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、陰性制御領域欠失、ｄｌ５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換）プロモーター、ＣＡＧ（ＣＭＶ初期エンハンサー／ニワトリβアクチン）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ユビキチンＣ（ＵｂＣ）プロモーター、ＥＦ－１アルファ（ＥＦ－１α）プロモーター、ＥＦ－１アルファショート（ＥＦ１Ｓ）プロモーター、ＥＦ－１アルファとイントロン（ＥＦ１ｉ）プロモーター、ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、または実質的に同じ効果を示すプロモーターを含む、細胞が提供される。
一実施形態では、細胞は、
ａ）発現時に転写因子ＢＡＴＦ３、ＩＲＦ８、及びＰＵ．１をコードする１つのコンストラクトまたはベクター、
ｂ）発現時に転写因子ＢＡＴＦ３、ＩＲＦ８、及びＳＰＩＢをコードする１つのコンストラクトまたはベクター、
ｃ）発現時に転写因子ＢＡＴＦ３及びＩＲＦ８をコードする第１のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＰＵ．１をコードする第２のコンストラクトまたはベクター、
ｄ）発現時に転写因子ＢＡＴＦ３及びＩＲＦ８をコードする第１のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＳＰＩＢをコードする第２のコンストラクトまたはベクター、
ｅ）発現時に転写因子ＢＡＴＦ３をコードする第１のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＩＲＦ８及びＰＵ．１をコードする第２のコンストラクトまたはベクター、
ｆ）発現時に転写因子ＢＡＴＦ３をコードする第１のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＩＲＦ８及びＳＰＩＢをコードする第２のコンストラクトまたはベクター、
ｇ）発現時に転写因子ＩＲＦ８をコードする第１のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＢＡＴＦ３及びＰＵ．１をコードする第２のコンストラクトまたはベクター、
ｈ）発現時に転写因子ＩＲＦ８をコードする第１のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＢＡＴＦ３及びＳＰＩＢをコードする第２のコンストラクトまたはベクター、
ｉ）発現時に転写因子ＢＡＴＦ３をコードする第１のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＩＲＦ８をコードする第２のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＰＵ．１をコードする第３のコンストラクトまたはベクター、及び／または
ｊ）発現時に転写因子ＢＡＴＦ３をコードする第１のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＩＲＦ８をコードする第２のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＳＰＩＢをコードする第３のコンストラクトまたはベクター、
を含む。
ＴＦは、本明細書の「転写因子」の節で定義されるとおりであり得る。
プロモーター領域は、本明細書の「プロモーター」の節で定義されるとおりであり得る。
１つ以上のコンストラクトまたはベクターは、本明細書の「組成物」の節で定義されるとおりであり得る。
細胞は任意の細胞型であってもよい。一実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞である。一実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。別の実施形態では、細胞は、マウス細胞である。
一実施形態では、細胞は、幹細胞、分化細胞、及びがん細胞からなる群から選択される。
一実施形態では、幹細胞は、多能性幹細胞、内胚葉由来細胞、中胚葉由来細胞、外胚葉由来細胞及び複能性幹細胞、例えば、間葉系幹細胞及び造血幹細胞からなる群から選択される。
一実施形態では、分化細胞は、がん細胞であり、例えば、固形腫瘍細胞、造血腫瘍細胞、黒色腫細胞、膀胱癌細胞、乳癌細胞、肺癌細胞、胸膜癌細胞、結腸癌細胞、直腸癌細胞、結腸直腸癌細胞、前立腺癌細胞、肝臓癌細胞、膵臓癌細胞、胆管癌細胞、胃癌細胞、精巣癌細胞、脳癌細胞、卵巣癌細胞、リンパ系癌細胞、リンパ腫細胞、肉腫癌細胞、皮膚細胞、脳癌細胞、骨癌細胞、口腔癌細胞、頭頸部癌細胞、または軟組織がん細胞、例えば、膠芽腫細胞、直腸癌細胞、または中皮腫細胞である。
一実施形態では、分化細胞は、任意の体細胞である。
一実施形態では、体細胞は、線維芽細胞及び単球などの造血細胞からなる群から選択される。
本明細書に開示の細胞は、「方法」の節で本明細書に開示の方法に従ってリプログラミング効率を改善するように、さらに操作または改変することができる。そのような改変には、例えば、それぞれリプログラミングの成功に関連するＴＦをコードする遺伝子の過剰発現またはサイレンシングが含まれ得る。これはまた、リプログラミングの効率に関連する他の遺伝子の過剰発現またはサイレンシング、例えば、「転写因子」の節で本明細書に開示のＴＦの発現時に差動的に発現する遺伝子の過剰発現またはサイレンシングを含み得る。遺伝子を過剰発現またはサイレンシングする方法は当該技術分野で周知である。
一実施形態によれば、細胞は、リプログラミングの成功に関連するＴＦをコードする１つ以上の遺伝子、例えば表１に列挙されたリプログラミングの成功に関連するＴＦをコードする１つ以上の遺伝子を過剰発現するように操作されている。一実施形態では、細胞は、リプログラミングの成功に関連するＴＦをコードする１つ以上の遺伝子を過剰発現するように操作されており、リプログラミングの成功に関連するＴＦをコードする１つ以上の遺伝子は、表１のリストから選択される。
方法
本明細書において、細胞を樹状細胞または抗原提示細胞にリプログラミングまたは誘導する方法であって、方法が、以下の：
ａ）細胞を、発現時に転写因子：
ｉ）ＢＡＴＦ３、または配列番号１０（ＢＡＴＦ３）と少なくとも７０％同一であるその生物学的に活性なバリアント、
ｉｉ）ＩＲＦ８、または、配列番号１１（ＩＲＦ８）と少なくとも７０％同一であるその生物学的に活性なバリアント、及び
ｉｉｉ）ＰＵ．１、または、配列番号１２（ＰＵ．１）と少なくとも７０％同一であるその生物学的に活性なバリアント、
ｉｖ）ＩＲＦ７、または、配列番号２１（ＩＲＦ７）と少なくとも７０％同一であるその生物学的に活性なバリアント、
ｖ）ＢＡＴＦ、または、配列番号１９（ＢＡＴＦ）と少なくとも７０％同一であるその生物学的に活性なバリアント、
ｖｉ）ＳＰＩＢ、または、配列番号２３（ＳＰＩＢ）と少なくとも７０％同一であるその生物学的に活性なバリアント、
ｖｉｉ）ＳＰＩＣ、または、配列番号２５（ＳＰＩＣ）と少なくとも７０％同一であるその生物学的に活性なバリアント、及び／または
ｖｉｉｉ）ＣＥＢＰα、または、配列番号１３（ＣＥＢＰα）と少なくとも７０％同一であるその生物学的に活性なバリアント、
をコードする１つ以上のコンストラクトまたはベクターで形質導入するステップであって、１つ以上のコンストラクトまたはベクターは、転写因子の転写を制御することが可能なプロモーター領域を含み、プロモーター領域は、脾臓病巣形成ウイルス（ＳＦＦＶ）プロモーター、ＭＮＤ（骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、陰性制御領域欠失、ｄｌ５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換）プロモーター、ＣＡＧ（ＣＭＶ初期エンハンサー／ニワトリβアクチン）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ユビキチンＣ（ＵｂＣ）プロモーター、ＥＦ－１アルファ（ＥＦ－１α）プロモーター、ＥＦ－１アルファショート（ＥＦ１Ｓ）プロモーター、ＥＦ－１アルファとイントロン（ＥＦ１ｉ）プロモーター、ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、または実質的に同じ効果を示すプロモーターを含む、ステップと、
ｂ）転写因子を発現させ、
それによって、リプログラミングまたは誘導された細胞が得られるステップと、
を含む方法が提供される。
一実施形態では、リプログラミングまたは誘導すべき細胞は、樹状細胞でも抗原提示細胞でもない。
一実施形態では、リプログラミングまたは誘導は、動物またはヒトなどのインビボで行われる。
別の実施形態では、リプログラミングまたは誘導は、インビトロである。
別の実施形態では、リプログラミングまたは誘導は、エクスビボである。
一実施形態では、本方法は、形質導入された細胞を細胞培地中で培養するステップをさらに含む。細胞培地中で形質導入された細胞を培養するステップは、この方法のステップｂ）の前または後に、すなわち、転写因子を発現させる前または後に行うことができる。一実施形態では、形質導入された細胞を細胞培地中で培養するステップは、転写因子を発現させる前、すなわち、本明細書に提示される方法においてステップａ）の後、かつステップｂ）の前に行われる。一実施形態では、形質導入された細胞を、少なくとも２日間、例えば少なくとも５日間、例えば少なくとも８日間、例えば少なくとも１０日間、例えば少なくとも１２日間培養する。
例えばリプログラミングの効率にとって、細胞培養培地が１つ以上の追加の成分を含んでいると有利であり得る。
一実施形態では、方法は、導入された細胞を、１種以上のサイトカインを含む培地中で培養することをさらに含む。一実施形態では、１種以上のサイトカインは炎症促進性サイトカインである。一実施形態では、１種以上のサイトカインは造血性サイトカインである。一実施形態では、１種以上のサイトカインは、ＩＦΝβ、ＩＦΝγ、ＴＮＦα、ＩＦΝα、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＣＤ４０Ｉ、Ｆｌｔ３Ｉ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮ－λ１、ＩＦＮ－ω、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－１５、プロスタグランジン２、ＳＣＦ、及びオンコスタチンＭ（ＯＭ）からなる群から選択される。好ましい実施形態では、１種以上のサイトカインは、ＩＦΝβ、ＩＦΝγ、及びＴＮＦαからなる群から選択される。
この方法は、形質導入された細胞を、小分子を含む細胞培地中で培養することをさらに含み得る。小分子は、例えば、エピジェネティックなモジュレーターとして機能する小分子であってよい。小分子はまた、例えば、遺伝子発現のエピジェネティック制御を標的とする小分子、例えば、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（ＨＤＡＣｉ）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤、ヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴ）阻害剤またはヒストンデメチラーゼ阻害剤などのエピジェネティック修飾剤、またはこれらのカテゴリに属する任意の小分子、例えば、本明細書に開示されるこれらのカテゴリに属する小分子であってもよい。
いくつかの実施形態では、この方法は、形質導入された細胞を、１種以上のヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（複数可）を含む細胞培地中で培養することをさらに含む。
一実施形態では、１つ以上のヒストン脱アセチル化酵素阻害剤は、バルプロ酸である。
一実施形態では、細胞は、
ａ）発現時に転写因子ＢＡＴＦ３、ＩＲＦ８、及びＰＵ．１をコードする１つのコンストラクトまたはベクター、
ｂ）発現時に転写因子ＢＡＴＦ３、ＩＲＦ８、及びＳＰＩＢをコードする１つのコンストラクトまたはベクター、
ｃ）発現時に転写因子ＢＡＴＦ３及びＩＲＦ８をコードする第１のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＰＵ．１をコードする第２のコンストラクトまたはベクター、
ｄ）発現時に転写因子ＢＡＴＦ３及びＩＲＦ８をコードする第１のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＳＰＩＢをコードする第２のコンストラクトまたはベクター、
ｅ）発現時に転写因子ＢＡＴＦ３をコードする第１のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＩＲＦ８及びＰＵ．１をコードする第２のコンストラクトまたはベクター、
ｆ）発現時に転写因子ＢＡＴＦ３をコードする第１のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＩＲＦ８及びＳＰＩＢをコードする第２のコンストラクトまたはベクター、
ｇ）発現時に転写因子ＩＲＦ８をコードする第１のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＢＡＴＦ３及びＰＵ．１をコードする第２のコンストラクトまたはベクター、
ｈ）発現時に転写因子ＩＲＦ８をコードする第１のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＢＡＴＦ３及びＳＰＩＢをコードする第２のコンストラクトまたはベクター、
ｉ）発現時に転写因子ＢＡＴＦ３をコードする第１のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＩＲＦ８をコードする第２のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＰＵ．１をコードする第３のコンストラクトまたはベクター、及び／または
ｊ）発現時に転写因子ＢＡＴＦ３をコードする第１のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＩＲＦ８をコードする第２のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＳＰＩＢをコードする第３のコンストラクトまたはベクター、
で形質導入される。
ＴＦは、本明細書の「転写因子」の節で定義されるとおりであり得る。
プロモーター領域は、本明細書の「プロモーター」の節で定義されるとおりであり得る。
１つ以上のコンストラクトまたはベクターは、本明細書の「組成物」の節で定義されるとおりであり得る。
細胞は、本明細書の「細胞」の節で定義されるとおりであり得る。
この方法は、リプログラミング効率を改善する付加的なステップを含むことができる。
一実施形態では、本方法は、リプログラミングの成功に関連するＴＦをコードする１つ以上の遺伝子、例えば表１に列挙されたリプログラミングの成功に関連するＴＦをコードする１つ以上の遺伝子を形質導入された細胞で過剰発現させることをさらに含む。
一実施形態では、本方法は、リプログラミングの成功に関連するＴＦをコードする１つ以上の遺伝子を形質導入された細胞で過剰発現させることをさらに含み、リプログラミングの成功に関連するＴＦをコードする１つ以上の遺伝子は、表１のリストから選択される。
別の実施形態では、本方法は、形質導入された細胞で、リプログラミングの成功に関連するタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子を過剰発現させることをさらに含む。一実施形態では、該遺伝子は、ＴＦ以外のタンパク質をコードする。
遺伝子の過剰発現及びサイレンシングは、当該技術分野で知られている方法を用いて行うことができ、例えば、遺伝子をベクターから発現させるか、または遺伝子の一部もしくは遺伝子全体を細胞から欠失させることによってそれぞれ行うことができる。
一実施形態では、得られるリプログラミングされた細胞は、１型の通常型樹状細胞（ＤＣ１）である。ｃＤＣ１はＤＣの特別なサブセットであり、これは例えば、ヒト白血球抗原－ＤＲアイソタイプ（ＨＬＡ－ＤＲ）及び造血マーカー群分化４５（ＣＤ４５）を発現するものである。ｃＤＣ１はさらに、典型的なＲＮＡ発現プロファイルを有し、表面マーカーのクラスタ分化１４１（ＣＤ１４１）、Ｃ型レクチンドメインファミリー９メンバーＡ（ＣＬＥＣ９Ａ）、Ｘ－Ｃモチーフケモカインレセプター１（ＸＣＲ１）、及びクラスタ分化２２６（ＣＤ２２６）を発現する。
したがって、一実施形態では、得られるリプログラミングされた細胞は、表１のリストから選択された１つ以上の表面マーカーに富んでいる。
一実施形態では、得られるリプログラミングされた細胞は、ＣＤ４５陽性である。一実施形態では、得られるリプログラミングされた細胞は、ＨＬＡ－ＤＲ陽性である。一実施形態では、得られるリプログラミングされた細胞は、ＣＤ１４１陽性である。一実施形態では、得られるリプログラミングされた細胞は、ＣＬＥＣ９Ａ陽性である。一実施形態では、得られるリプログラミングまたは誘導された細胞は、ＣＤ２２６陽性である。一実施形態では、得られるリプログラミングまたは誘導された細胞は、ＸＣＲ１陽性である。一実施形態では、得られるリプログラミングまたは誘導された細胞は、ＣＤ４５、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ１４１、ＣＬＥＣ９Ａ、ＸＣＲ１及び／またはＣＤ２２６陽性である。
１つの細胞または複数の細胞がｃＤＣ１細胞であるか否かを判定するための方法は、当該技術分野で周知である。例えば該細胞をＣＤ４５、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ２２６、ＣＤ１４１、ＸＣＲ１及び／またはＣＬＥＣ９Ａに特異的なフルオロフォアコンジュゲート抗体でインキュベートし、続いてフローサイトメトリーを用いて細胞をスクリーニングすることによって、該細胞がＣＤ４５、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ２２６、ＣＤ１４１、ＸＣＲ１及び／またはＣＬＥＣ９Ａを発現するか判定することができる。例えば、細胞を１つ以上の表面マーカーに特異的なフルオロフォアコンジュゲート抗体でインキュベートし、続いてフローサイトメトリーを用いて細胞をスクリーニングすることによって、表１のリストから選択され、細胞のｃＤＣ１へのリプログラミングに成功したと同定された該表面マーカー（複数可）を該細胞が発現するか否かを判定することができる。
さらに、細胞のＲＮＡプロファイルは、単一細胞のＲＮＡ ｓｅｑを使用して決定され、該ＲＮＡプロファイルが天然のｃＤＣ１細胞のＲＮＡプロファイルと同一または類似している場合に、細胞をｃＤＣ１として分類するために使用され得る。さらに、該細胞は、その機能的特性、例えば、ＴＬＲ刺激に対する応答及びＣＤ４０、ＣＤ８０及び他の共刺激分子の表面発現を上方制御する能力、炎症促進性サイトカイン及びケモカインを分泌する能力、ならびに抗原特異的Ｔ細胞を活性化する能力に関して特徴付けることができる。
したがって、本明細書では、本明細書に提示される方法によって得られるリプログラミングまたは誘導された細胞が提供される。一実施形態では、細胞は、樹状細胞または抗原提示細胞である。
転写因子
転写因子（ＴＦ）は、特定のＤＮＡ配列に結合することによって、ＤＮＡからｍＲＮＡへの遺伝情報の転写速度を制御するタンパク質である。ＴＦの機能は、遺伝子の発現を制御すること、すなわち、オン及びオフすることである。ＴＦの群は、細胞分裂、細胞増殖、及び細胞死を生涯導くために、また胚発生の間の細胞遊走及び組織化のために、またホルモンなどの細胞外からのシグナルに応答して断続的に、協調して機能する。ヒトゲノムには１６００個までのＴＦが存在する。転写因子は、レギュロームと同様にプロテオームのメンバーである。
ＴＦは、特定の遺伝子に対するＲＮＡポリメラーゼの動員を（アクチベーターとして）促進するか、または（リプレッサーとして）ブロッキングすることによって、単独で働くか、または複合体中の他のタンパク質と協働する。ＴＦの定義される特徴は、それらが調節する遺伝子に隣接するＤＮＡの特定の配列に結合する少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）を含むことである。
本明細書では、細胞を樹状細胞または抗原提示細胞にリプログラミングするために使用することができるＴＦが提供される。そのようなＴＦは、ＢＡＴＦ３、ＩＲＦ８、ＰＵ．１、ＩＲＦ７、ＢＡＴＦ、ＳＰＩＢ、ＳＰＩＣ、及びＣＥＢＰＡを含む。
ＢＡＴＦ３は、ＴＦのＡＰ－１／ＡＴＦスーパーファミリーに属する核塩基性ロイシンジッパーである。これは、免疫系におけるＣＤ８＋胸腺の通常型樹状細胞の分化を制御する。これは、標的遺伝子の発現を調節するために特定のＤＮＡ配列を認識及び結合するＪＵＮファミリータンパク質とのヘテロダイマーの形成により作用する。
ＩＲＦ８は、インターフェロン調節因子（ＩＲＦ）ファミリーに属するＴＦである。これは、分化系列決定の制御、及び骨髄系細胞の成熟に役割を果たす。ＩＲＦ８ならびにＩＲＦファミリーの他のＴＦは、ＩＦＮ刺激応答エレメントに結合し、Ｉ型ＩＦＮによって刺激される遺伝子の発現を調節する。
ＰＵ．１は、赤芽球形質転換特異的（ＥＴＳ）ドメインファミリーに属するＴＦである。これは、リンパ球特異的なエンハンサーとして機能し得るプリンリッチＤＮＡ配列であるＰＵ－ｂｏｘに結合する転写活性化剤である。ＰＵ．１は、マクロファージ及び樹状細胞などの骨髄細胞、ならびにＢ細胞の分化または活性化に特異的に関与し得る。
ＩＲＦ７は、インターフェロン調節因子（ＩＲＦ）ファミリーに属するＴＦである。ＩＲＦ７は、Ｉ型インターフェロン遺伝子を含むウイルス誘導性細胞遺伝子の転写活性化に役割を果たすことが示されている。ＩＲＦ７は、リンパ組織で構成的に発現し、全身の他の多くの組織で誘導性である。
ＢＡＴＦは、ＴＦのＡＰ－１／ＡＴＦスーパーファミリーに属する核塩基性ロイシンジッパーである。ＢＡＴＦは、ロイシンジッパードメインを介して、ＩＲＦ８及びＩＲＦ４を含むパートナー転写因子と相互作用して、協調的な遺伝子活性化を媒介することができる。ＢＡＴＦ因子間の補償は、ｃＤＣ１発生の文脈において以前から実証されている。
ＳＰＩＢは、赤芽球形質転換特異的（ＥＴＳ）ドメインファミリーに属するＴＦである。ＰＵ．１と同様に、ＳＰＩＢは、リンパ球特異的なエンハンサーとして機能し得るプリンリッチＤＮＡ配列であるＰＵ－ｂｏｘに結合する配列特異的転写活性化剤である。形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）及びｃＤＣ前駆体の発生を促進する。
ＳＰＩＣは、赤芽球形質転換特異的（ＥＴＳ）ドメインファミリーに属するＴＦである。ＰＵ．１及びＳＰＩＢと同様に、ＳＰＩＣは、プリンリッチＤＮＡ配列であるＰＵ－ｂｏｘに結合する配列特異的転写活性化剤である。ＳＰＩＣは、赤血球のリサイクル及び鉄の恒常性に必要な赤髄マクロファージの発生を制御する。
ＣΕΒΡα（ＣＣＡＡＴエンハンサー結合タンパク質アルファ）は、塩基性ロイシンジッパー（ｂＺＩＰ）ドメインを含み、標的遺伝子のプロモーターでＣＣＡＡＴモチーフを認識するＴＦである。ＣΕΒΡαは、骨髄前駆細胞、脂肪細胞、肝細胞、ならびに肺及び胎盤の細胞の増殖停止及び分化を調整する。
本明細書ではまた、ＢＡＴＦ３、ＩＲＦ８、ＰＵ．１、ＩＲＦ７、ＢＡＴＦ、ＳＰＩＣ、及びＳＰＩＢの生物学的に活性なバリアントを開示する。生物学的に活性なバリアントは、親ＴＦの活性の少なくとも一部を保持する該ＴＦのバリアントである。例えば、ＳＰＩＢ、ＳＰＩＣ、ＢＡＴＦ、ＢＡＴＦ３、ＩＲＦ８、またはＰＵ．１の生物学的に活性なバリアントは、それぞれ、親ＢＡＴＦ３、ＩＲＦ８、またはＰＵ．１と同じ遺伝子の発現を誘導及び／または阻害することができる。ＳＰＩＢ、ＳＰＩＣ、ＢＡＴＦ、ＢＡＴＦ３、ＩＲＦ８、及びＰＵ．１の３つの生物学的に活性なバリアントは、本明細書に開示される方法に従って細胞を樹状細胞または抗原提示細胞にリプログラミングまたは誘導することができる。しかしながら、それぞれのＴＦの生物学的に活性なバリアントは、それぞれの親ＴＦと比較してより効率的であるかまたはより効率的でない可能性がある。例えば、遺伝子の発現を誘導及び／または阻害する効率、及び／または細胞を樹状細胞にリプログラミングまたは誘導する効率は、それぞれの親ＴＦと比較して増加または減少し得る。
一実施形態では、ＢＡＴＦ３の生物学的に活性なバリアントは、配列番号１０と少なくとも６０％同一、配列番号１０と、例えば少なくとも６１％、例えば少なくとも６２％、例えば少なくとも６３％、例えば少なくとも６４％、例えば少なくとも６５％、例えば少なくとも６６％、例えば少なくとも６７％、例えば少なくとも６８％、例えば少なくとも６９％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも７１％、例えば少なくとも７２％、例えば少なくとも７３％、例えば少なくとも７４％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも７６％、例えば少なくとも７７％、例えば少なくとも７８％、例えば少なくとも７９％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８１％、例えば少なくとも８２％、例えば少なくとも８３％、例えば少なくとも８４％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％同一である。
一実施形態では、ＩＲＦ８の生物学的に活性なバリアントは、配列番号１１と少なくとも６０％同一、配列番号１１と、例えば少なくとも６１％、例えば少なくとも６２％、例えば少なくとも６３％、例えば少なくとも６４％、例えば少なくとも６５％、例えば少なくとも６６％、例えば少なくとも６７％、例えば少なくとも６８％、例えば少なくとも６９％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも７１％、例えば少なくとも７２％、例えば少なくとも７３％、例えば少なくとも７４％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも７６％、例えば少なくとも７７％、例えば少なくとも７８％、例えば少なくとも７９％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８１％、例えば少なくとも８２％、例えば少なくとも８３％、例えば少なくとも８４％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％同一である。
一実施形態では、ＰＵ．１の生物学的に活性なバリアントは、配列番号１２と少なくとも６０％同一、配列番号１２と、例えば少なくとも６１％、例えば少なくとも６２％、例えば少なくとも６３％、例えば少なくとも６４％、例えば少なくとも６５％、例えば少なくとも６６％、例えば少なくとも６７％、例えば少なくとも６８％、例えば少なくとも６９％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも７１％、例えば少なくとも７２％、例えば少なくとも７３％、例えば少なくとも７４％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも７６％、例えば少なくとも７７％、例えば少なくとも７８％、例えば少なくとも７９％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８１％、例えば少なくとも８２％、例えば少なくとも８３％、例えば少なくとも８４％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％同一である。
一実施形態では、ＩＲＦ７の生物学的に活性なバリアントは、配列番号２１（ＩＲＦ７）と少なくとも６０％同一、配列番号２１と、例えば少なくとも６１％、例えば少なくとも６２％、例えば少なくとも６３％、例えば少なくとも６４％、例えば少なくとも６５％、例えば少なくとも６６％、例えば少なくとも６７％、例えば少なくとも６８％、例えば少なくとも６９％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも７１％、例えば少なくとも７２％、例えば少なくとも７３％、例えば少なくとも７４％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも７６％、例えば少なくとも７７％、例えば少なくとも７８％、例えば少なくとも７９％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８１％、例えば少なくとも８２％、例えば少なくとも８３％、例えば少なくとも８４％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％同一である。
一実施形態では、ＢＡＴＦの生物学的に活性なバリアントは、配列番号１９（ＢＡＴＦ）と少なくとも６０％同一、配列番号１９と、例えば少なくとも６１％、例えば少なくとも６２％、例えば少なくとも６３％、例えば少なくとも６４％、例えば少なくとも６５％、例えば少なくとも６６％、例えば少なくとも６７％、例えば少なくとも６８％、例えば少なくとも６９％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも７１％、例えば少なくとも７２％、例えば少なくとも７３％、例えば少なくとも７４％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも７６％、例えば少なくとも７７％、例えば少なくとも７８％、例えば少なくとも７９％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８１％、例えば少なくとも８２％、例えば少なくとも８３％、例えば少なくとも８４％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％同一である。
一実施形態では、ＳＰＩＢの生物学的に活性なバリアントは、配列番号２３（ＳＰＩＢ）と少なくとも６０％同一、配列番号２３と、例えば少なくとも６１％、例えば少なくとも６２％、例えば少なくとも６３％、例えば少なくとも６４％、例えば少なくとも６５％、例えば少なくとも６６％、例えば少なくとも６７％、例えば少なくとも６８％、例えば少なくとも６９％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも７１％、例えば少なくとも７２％、例えば少なくとも７３％、例えば少なくとも７４％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも７６％、例えば少なくとも７７％、例えば少なくとも７８％、例えば少なくとも７９％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８１％、例えば少なくとも８２％、例えば少なくとも８３％、例えば少なくとも８４％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％同一である。
一実施形態では、ＳＰＩＣの生物学的に活性なバリアントは、配列番号２５（ＳＰＩＣ）と少なくとも６０％同一、配列番号２５と、例えば少なくとも６１％、例えば少なくとも６２％、例えば少なくとも６３％、例えば少なくとも６４％、例えば少なくとも６５％、例えば少なくとも６６％、例えば少なくとも６７％、例えば少なくとも６８％、例えば少なくとも６９％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも７１％、例えば少なくとも７２％、例えば少なくとも７３％、例えば少なくとも７４％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも７６％、例えば少なくとも７７％、例えば少なくとも７８％、例えば少なくとも７９％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８１％、例えば少なくとも８２％、例えば少なくとも８３％、例えば少なくとも８４％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％同一である。
一実施形態では、ＣＥＢＰＡの生物学的に活性なバリアントは、配列番号１３（ＣＥＢＰα）と少なくとも６０％同一、配列番号１３と、例えば少なくとも６１％、例えば少なくとも６２％、例えば少なくとも６３％、例えば少なくとも６４％、例えば少なくとも６５％、例えば少なくとも６６％、例えば少なくとも６７％、例えば少なくとも６８％、例えば少なくとも６９％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも７１％、例えば少なくとも７２％、例えば少なくとも７３％、例えば少なくとも７４％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも７６％、例えば少なくとも７７％、例えば少なくとも７８％、例えば少なくとも７９％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８１％、例えば少なくとも８２％、例えば少なくとも８３％、例えば少なくとも８４％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％同一である。
一実施形態では、ＢＡＴＦ３は、配列番号１４に対して少なくとも６０％の配列同一性、配列番号１４に対して、例えば少なくとも６１％、例えば少なくとも６２％、例えば少なくとも６３％、例えば少なくとも６４％、例えば少なくとも６５％、例えば少なくとも６６％、例えば少なくとも６７％、例えば少なくとも６８％、例えば少なくとも６９％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも７１％、例えば少なくとも７２％、例えば少なくとも７３％、例えば少なくとも７４％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも７６％、例えば少なくとも７７％、例えば少なくとも７８％、例えば少なくとも７９％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８１％、例えば少なくとも８２％、例えば少なくとも８３％、例えば少なくとも８４％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列によってコードされる。
一実施形態では、ＩＲＦ８は、配列番号１５に対して少なくとも６０％の配列同一性、配列番号１５に対して、例えば少なくとも６１％、例えば少なくとも６２％、例えば少なくとも６３％、例えば少なくとも６４％、例えば少なくとも６５％、例えば少なくとも６６％、例えば少なくとも６７％、例えば少なくとも６８％、例えば少なくとも６９％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも７１％、例えば少なくとも７２％、例えば少なくとも７３％、例えば少なくとも７４％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも７６％、例えば少なくとも７７％、例えば少なくとも７８％、例えば少なくとも７９％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８１％、例えば少なくとも８２％、例えば少なくとも８３％、例えば少なくとも８４％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列によってコードされる。
一実施形態では、ＰＵ．１は、配列番号１６に対して少なくとも６０％の配列同一性、配列番号１６に対して、例えば少なくとも６１％、例えば少なくとも６２％、例えば少なくとも６３％、例えば少なくとも６４％、例えば少なくとも６５％、例えば少なくとも６６％、例えば少なくとも６７％、例えば少なくとも６８％、例えば少なくとも６９％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも７１％、例えば少なくとも７２％、例えば少なくとも７３％、例えば少なくとも７４％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも７６％、例えば少なくとも７７％、例えば少なくとも７８％、例えば少なくとも７９％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８１％、例えば少なくとも８２％、例えば少なくとも８３％、例えば少なくとも８４％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列によってコードされる。
一実施形態では、ＩＲＦ７は、配列番号２０に対して少なくとも６０％の配列同一性、配列番号２０に対して、例えば少なくとも６１％、例えば少なくとも６２％、例えば少なくとも６３％、例えば少なくとも６４％、例えば少なくとも６５％、例えば少なくとも６６％、例えば少なくとも６７％、例えば少なくとも６８％、例えば少なくとも６９％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも７１％、例えば少なくとも７２％、例えば少なくとも７３％、例えば少なくとも７４％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも７６％、例えば少なくとも７７％、例えば少なくとも７８％、例えば少なくとも７９％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８１％、例えば少なくとも８２％、例えば少なくとも８３％、例えば少なくとも８４％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列によってコードされる。
一実施形態では、ＢＡＴＦは、配列番号１８に対して少なくとも６０％の配列同一性、配列番号１８に対して、例えば少なくとも６１％、例えば少なくとも６２％、例えば少なくとも６３％、例えば少なくとも６４％、例えば少なくとも６５％、例えば少なくとも６６％、例えば少なくとも６７％、例えば少なくとも６８％、例えば少なくとも６９％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも７１％、例えば少なくとも７２％、例えば少なくとも７３％、例えば少なくとも７４％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも７６％、例えば少なくとも７７％、例えば少なくとも７８％、例えば少なくとも７９％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８１％、例えば少なくとも８２％、例えば少なくとも８３％、例えば少なくとも８４％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列によってコードされる。
一実施形態では、ＳＰＩＢは、配列番号２２に対して少なくとも６０％の配列同一性、配列番号２２に対して、例えば少なくとも６１％、例えば少なくとも６２％、例えば少なくとも６３％、例えば少なくとも６４％、例えば少なくとも６５％、例えば少なくとも６６％、例えば少なくとも６７％、例えば少なくとも６８％、例えば少なくとも６９％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも７１％、例えば少なくとも７２％、例えば少なくとも７３％、例えば少なくとも７４％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも７６％、例えば少なくとも７７％、例えば少なくとも７８％、例えば少なくとも７９％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８１％、例えば少なくとも８２％、例えば少なくとも８３％、例えば少なくとも８４％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列によってコードされる。
一実施形態では、ＳＰＩＣは、配列番号２４に対して少なくとも６０％の配列同一性、配列番号２４に対して、例えば少なくとも６１％、例えば少なくとも６２％、例えば少なくとも６３％、例えば少なくとも６４％、例えば少なくとも６５％、例えば少なくとも６６％、例えば少なくとも６７％、例えば少なくとも６８％、例えば少なくとも６９％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも７１％、例えば少なくとも７２％、例えば少なくとも７３％、例えば少なくとも７４％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも７６％、例えば少なくとも７７％、例えば少なくとも７８％、例えば少なくとも７９％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８１％、例えば少なくとも８２％、例えば少なくとも８３％、例えば少なくとも８４％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列によってコードされる。
一実施形態では、ＣＥＢＰαは、配列番号１７に対して少なくとも６０％の配列同一性、配列番号１７に対して、例えば少なくとも６１％、例えば少なくとも６２％、例えば少なくとも６３％、例えば少なくとも６４％、例えば少なくとも６５％、例えば少なくとも６６％、例えば少なくとも６７％、例えば少なくとも６８％、例えば少なくとも６９％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも７１％、例えば少なくとも７２％、例えば少なくとも７３％、例えば少なくとも７４％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも７６％、例えば少なくとも７７％、例えば少なくとも７８％、例えば少なくとも７９％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８１％、例えば少なくとも８２％、例えば少なくとも８３％、例えば少なくとも８４％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列によってコードされる。
プロモーター
プロモーターまたはプロモーター領域は、タンパク質が結合して、その下流のＤＮＡから単一のＲＮＡの転写を開始するＤＮＡの配列である。このＲＮＡは、タンパク質をコードするｍＲＮＡであってもよいし、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）などの機能自体を有していてもよい。プロモーターは、遺伝子の転写開始部位の近くに位置し、ＤＮＡ上の該遺伝子の上流にある。
真核生物プロモーター領域は、コアプロモーターの他に、例えば転写開始部位（ＴＳＳ）、ＲＮＡポリメラーゼの結合部位、ＴＦ結合部位、ならびに他の調節エレメント及び／または構造エレメントなどの他のエレメントをさらに含み得る。真核生物の遺伝子プロモーター領域は、典型的には遺伝子の上流に位置し、ＴＳＳから数キロベース離れた調節エレメントを有し得る。そのような調節エレメントは、例えばエンハンサーであってもよい。
本明細書に開示されるＴＦは、コアプロモーターを含むプロモーター領域によって制御される。本発明者らは、驚くべきことに、本明細書に開示された方法による細胞のリプログラミングが、本明細書に開示されたＴＦを特定のプロモーターまたはプロモーター領域の下で発現させることによって、顕著に改善され得ることを示した。そのようなプロモーター領域としては、ＳＦＦＶプロモーター、ＭＮＤプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＥＦ－１αプロモーター、ＥＦ１Ｓプロモーター、ＥＦ１ｉプロモーター、ＰＧＫプロモーター、ならびに本質的に同じ効果を示す他のプロモーターを含むものが挙げられる。
実質的に同じ効果を示すプロモーターまたはプロモーター領域は、それが制御する遺伝子（複数可）の発現レベルが、本明細書に開示されたプロモーターまたはプロモーター領域と同じ遺伝子（複数可）の発現レベルを示すプロモーターまたはプロモーター領域と本明細書に定義される。したがって、プロモーター領域が本明細書に開示されるプロモーター領域と実質的に同じ効果を示すか否かは、該プロモーター領域によって制御される遺伝子（複数可）の発現レベルを測定し、これを、本明細書に開示されるプロモーター領域によって制御される同じ遺伝子（複数可）の発現レベルと比較することによって測定することができ、試験されるプロモーター領域の発現レベル及び本明細書に開示されるプロモーター領域の発現レベルは、同じ条件下で試験される。発現レベルを測定する方法は当該技術分野ではよく知られており、日常的な実験を用いて行うことができる。例えば、特定のプロモーター領域によって制御される遺伝子の発現レベルは、該遺伝子の発現によって生成されるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の量を測定することによって測定することができる。ｍＲＮＡの量は、例えば、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）またはトランスクリプトミクスを用いて測定することができる。特定のプロモーター領域によって制御される遺伝子の発現レベルは、該遺伝子の発現によって生じるタンパク質の量、すなわち遺伝子産物の量をプロテオミクスまたはウェスタンブロットを用いて測定することによっても測定することができる。本明細書では、開示されたプロモーター領域と実質的に同じ効果を示すプロモーターは、本明細書に開示されているプロモーター領域の発現レベルより５０％高いまたは５０％低い発現レベル、本明細書に開示されているプロモーターの発現レベルより例えば４５％、例えば４０％、例えば３５％、例えば３０％、例えば２５％、例えば２０％、例えば１５％、例えば１０％、例えば５％高いまたは低い発現レベルを生成するプロモーター領域と定義される。
本明細書に開示されるＴＦは、開示されるプロモーター領域のいずれかによって制御することができる。一実施形態では、同じプロモーター領域が、少なくとも１つのＴＦ、例えば、少なくとも２つのＴＦ、例えば、３つのＴＦの発現を制御する。一実施形態では、第１のプロモーター領域が第１のＴＦの発現を制御し、第２のプロモーター領域が第２のＴＦの発現を制御し、第３のプロモーター領域が第３のＴＦの発現を制御する。一実施形態では、第１のプロモーター領域は、第１及び第２のＴＦの発現を制御し、第２のプロモーター領域は、第３のＴＦの発現を制御する。ＴＦは、本明細書の「転写因子」の節で開示されるとおりであり得る。
一実施形態では、ＳＦＦＶプロモーターは、配列番号１と少なくとも７０％同一、配列番号１と、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８１％、例えば少なくとも８２％、例えば少なくとも８３％、例えば少なくとも８４％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる。
一実施形態では、ＭＮＤプロモーターは、配列番号２と少なくとも７０％同一、配列番号２と、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８１％、例えば少なくとも８２％、例えば少なくとも８３％、例えば少なくとも８４％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％であるポリヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる。
一実施形態では、ＣＡＧプロモーターは、配列番号３と少なくとも７０％同一、配列番号３と、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８１％、例えば少なくとも８２％、例えば少なくとも８３％、例えば少なくとも８４％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％であるポリヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる。
一実施形態では、ＣＭＶプロモーターは、配列番号４と少なくとも７０％同一、配列番号４と、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８１％、例えば少なくとも８２％、例えば少なくとも８３％、例えば少なくとも８４％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％であるポリヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる。
一実施形態では、ＵｂＣプロモーターは、配列番号５と少なくとも７０％同一、配列番号５と、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８１％、例えば少なくとも８２％、例えば少なくとも８３％、例えば少なくとも８４％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％であるポリヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる。
一実施形態では、ＥＦ－１αプロモーターは、配列番号６と少なくとも７０％同一、配列番号６と、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８１％、例えば少なくとも８２％、例えば少なくとも８３％、例えば少なくとも８４％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％であるポリヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる。
一実施形態では、ＥＦ１Ｓプロモーターは、配列番号７と少なくとも７０％同一、配列番号７と、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８１％、例えば少なくとも８２％、例えば少なくとも８３％、例えば少なくとも８４％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％であるポリヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる。
一実施形態では、ＥＦ１ｉプロモーターは、配列番号８と少なくとも７０％同一、配列番号８と、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８１％、例えば少なくとも８２％、例えば少なくとも８３％、例えば少なくとも８４％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％であるポリヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる。
一実施形態では、ＰＧＫプロモーターは、配列番号９と少なくとも７０％同一、配列番号９と、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８１％、例えば少なくとも８２％、例えば少なくとも８３％、例えば少なくとも８４％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％であるポリヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる。
治療方法
本明細書に開示される組成物及び方法は、例えば、腫瘍及びがんまたは感染症などの疾患または障害の治療及び／または予防に使用することができる。
一実施形態では、本明細書に開示される組成物及び方法は、腫瘍及び／またはがんまたは感染症の治療に使用される。
一実施形態では、腫瘍及び／またはがんは、良性腫瘍、悪性腫瘍、早期がん、基底細胞癌、子宮頸異形成、肉腫、生殖細胞腫瘍、網膜芽細胞腫、膠芽細胞腫、リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、血液癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、食道癌、子宮癌、膣癌、乳癌、頭頸部癌、胃癌、口腔癌、上咽頭癌、気管癌、喉頭癌、気管支癌、細気管支癌、肺癌、胸膜癌、膀胱尿路上皮癌、管腔臓器癌、食道癌、胃癌、胆管癌、腸癌、結腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、膀胱癌、尿管癌、腎臓癌、肝臓癌、胆嚢癌、脾臓癌、脳癌、リンパ系癌、骨癌、膵臓癌、白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、皮膚癌、黒色腫または骨髄腫からなる群から選択される。好ましい実施形態では、がんは、黒色腫、頭頸部癌、膀胱尿路上皮癌、膵臓癌、ならびに膠芽細胞腫からなる群から選択される。
したがって、本明細書に記載された方法によって産生される細胞は、乳癌、前立腺癌、リンパ腫、皮膚癌、膵癌、結腸癌、黒色腫、悪性黒色腫、食道癌、卵巣癌、脳癌、原発性脳癌、頭頸部癌、神経膠腫、膠芽細胞腫、肝臓癌、膀胱癌、非小細胞肺癌、頭頸部癌、乳癌、卵巣癌、肺癌、小細胞肺癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣癌、膀胱癌、膵臓癌、胃癌、結腸癌、前立腺癌、泌尿生殖器癌、甲状腺癌、食道癌、骨髄腫、多発性骨髄腫、副腎癌、腎細胞癌、子宮内膜癌、副腎皮質癌、悪性膵臓インスリノーマ、悪性カルチノイド癌、絨毛癌、菌状息肉症、悪性高カルシウム血症、子宮頸部過形成、白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性顆粒球性白血病、急性顆粒球性白血病、有毛細胞白血病、神経芽腫、横紋筋肉腫、カポジ肉腫、真性赤血球増加症、本態性血小板増加症、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、軟部肉腫、骨原性肉腫、原発性マクログロブリン血症、及び網膜芽細胞腫などを含むが、これらに限定されないいくつかのがん及び腫瘍を治療または緩和するための細胞を調製するために使用することができる。
本明細書では、医療における使用のために本明細書で提供される組成物、細胞、医薬組成物、及び／またはリプログラミングまたは誘導された細胞が提供される。
本明細書ではまた、がんまたは感染症の治療における使用のために本明細書で提供される組成物、細胞、医薬組成物、及び／またはリプログラミングまたは誘導された細胞も提供される。
さらに本明細書では、がんまたは感染症を治療する方法であって、それを必要とする個体に、本明細書で提供されるような組成物、細胞、医薬組成物、及び／またはリプログラミングまたは誘導された細胞を投与することを含む方法も提供される。
本明細書ではまた、本明細書で提供されるような組成物、細胞、医薬組成物、及び／またはリプログラミングまたは誘導された細胞の、がんまたは感染症を治療するための医薬の製造のための使用が提供される。
実施例１．一般的な方法及び材料
細胞培養
１０％（ｖ／ｖ）熱不活性化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、２ｍＭのＬ－グルタミン及び抗生物質（１０Ｕ／ｍｌペニシリン１０μｇ／ｍｌストレプトマイシン）を補充した増殖培地ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（ＤＭＥＭコンプリート）中で、ヒト胎児腎臓ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ヒト胎児線維芽細胞（ＨＥＦ）（３～８継代）及びヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）（３～８継代）を維持した。マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）（３～５継代）を、前述のＣｌｅｃ９ａ－ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターマウスのＥ１３．５胚から単離し（Ｒｏｓａ ｅｔ ａｌ．２０２０）、０．１％のゼラチン被覆皿中でＤＭＥＭコンプリート中で培養した。単球由来樹状細胞（ｍｏＤＣ）を、１０％の熱不活性化ＦＢＳ、２ｍＭのＬ－グルタミン、及び抗生物質を補充したＲＰＭＩ １６４０（ＲＰＭＩコンプリート）中で培養した。末梢血から単離したｃＤＣ１を、５０μΜの２－メルカプトエタノール、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、及び抗生物質を補充したＲＰＭＩコンプリート中で維持した。間葉系間質細胞（ＭＳＣ、３～５継代）を、１０％のプールしたヒト血小板溶解物、２Ｕ／ｍｌのヘパリン（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、２ｍＭのＬ－グルタミン、及び抗生物質を補充した最小必須培地（ＭＥＭ）中で培養した。特に明記しない限り、すべての組織培養試薬はＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃより得た。
マウス
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ及びＯＴ－Ｉマウスをそれぞれ、Ｊａｎｖｉｅｒ及びＴａｃｏｎｉｃから入手した。Ｃｌｅｃ９ａＣｒｅ／ＣｒｅＲｏｓａｔｄＴｏｍａｔｏ／ｔｄＴｏｍａｔｏ（Ｃｌｅｃ９Ａ－ｔｄＴｏｍａｔｏ）動物は、Ｃａｅｔａｎｏ Ｒｅｉｓ ｅ Ｓｏｕｓａ，Ｆｒａｎｃｉｓ Ｃｒｉｃｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ（Ｒｏｓａ ｅｔ ａｌ．，２０１８）の親切な寄贈物であり、ルンド大学の動物舎へ国を超えて輸送する前にＪａｎｖｉｅｒによって再誘導された。すべての動物を、食物及び水への自由なアクセスを伴う固定された１２時間の明暗サイクルの下で制御された温度（２３±２℃）下で収容した。動物ケア及び実験手順を、スウェーデンのガイドライン及び規則に従って、地元の委員会の承認の後に実施した。
レンチウイルス産生
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、以前に記載されたように、トランスファープラスミド、パッケージング、及びＶＳＶ－Ｇをコードするエンベロープコンストラクトと、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）との混合物で共トランスフェクションした（Ｒｏｓａ ｅｔ ａｌ．，２０２０）。ウイルス上清を、３６時間、４８時間、及び７２時間後に収穫し、濾過し（０．４５μｍ、低タンパク質結合）、Ｌｅｎｔｉ－Ｘコンセントレータにより４０倍に濃縮し、－８０℃で保存した。
ウイルス導入及びリプログラミング
０．１％のゼラチンでコーティングした６ウェルプレート上で、ＨＥＦ、ＨＤＦ、及びＣｌｅｃ９ａ－ｔｄＴｏｍａｔｏ ＭＥＦを、１ウェル当たり４０，０００細胞の密度で、及びＭＳＣを、１ウェル当たり５０，０００細胞の密度で播種した。翌日、８μｇ／ｍｌのポリブレンを補充した培地中で、１：１のＴｅｔＯ－ＰＩＢとＭ２ｒｔＴＡとの比、ＳＦＦＶ－ＰＩＢ－ＧＦＰ、またはＳＦＦＶ－ＧＦＰのレンチウイルス粒子のいずれかとともに細胞を一晩インキュベートした。連続した日に２回、細胞を一晩形質導入し、その間に培地を交換した。２回目の形質導入後に、培地を正常な増殖培地（０日目）に交換した。ＴｅｔＯ－ＰＩＢを使用する場合、培地にＤｏｘ（１μｇ／ｍｌ）を補充した。培養期間にわたって、２～３日ごとに培地を交換した。言及される場合、培地にＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ、Ｅｎｚｏ）、ポリＩ：Ｃ（２５μｇ／ｍｌ、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）及びＲ８４８（３μｇ／ｍｌ、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を一晩かけて補充した。サイトカインを２日目に添加し、培養期間にわたって保持した。ゼノフリー条件でのリプログラミングのために、ＭＳＣを形質導入後にＸ－Ｖｉｖｏ １５（Ｌｏｎｚａ）中で培養し、培養期間にわたって２～３日ごとに培地を交換した。
分子クローニング
ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）誘導性過剰発現系の場合、ヒトＰＵ．１、ＩＲＦ８、及びＢＡＴＦ３（ＰＩＢ）のコード領域を、この順序で、２Ａ自己切断ペプチドによって分離されたｐＦＵＷ－ＴｅｔＯプラスミド中にクローニングした。最初の２つのコード配列は、ストップコドンを欠いていた。ＰＵ．１、ＩＲＦ８、ＢＡＴＦ３、ＩＤ２、ＴＸＮＩＰ、ＺＦＰ３６ＰＬＥＫ、ＳＵＢ１、ＪＵＮＢ、ＣＲＥＭ、ＫＬＦ４、ＭＸＤ１、ＬＩＴＡＦ、ＩＲＦ７、ＦＯＳ、ＮＭＩ、ＴＦＥＣ、ＳＰ１１０、ＩＲＦ５、ＳＴＡＴ２、ＢＡＴＦ、ＺＮＦ２６７、ＩＲＦ１、ＲＥＬＢ、及びＢＡＴＦ２のコード領域は、個別にｐＦＵＷ－ＴｅｔＯプラスミドにクローニングされた。構成的に活性なヒトユビキチンＣプロモーターの制御下にある逆テトラサイクリントランスアクチベーターＭ２ｒｔＴＡを含むレンチウイルスベクター（ｐＦＵＷ－ＵｂＣ－Ｍ２ｒｔＴＡ）を共形質導入に使用した（Ｒｏｓａ ｅｔ ａｌ．２０１８）。構成的過剰発現のために、ヒトＰＩＢポリシストロニックカセットを、構成的プロモーターであるｐＦＵＷ－ＵｂＣ、ｐＲＲＬ．ＰＰＴ－ＳＦＦＶ、ｐＲＲＬ．ＰＰＴ－ＰＧＫ、ｐＲＲＬ．ＰＰＴ－ＥＦ１Ｓ、ｐＨＡＧＥ２－ＥＦ１、及びｐＷＰＸＬ－ＥＦ１ｉ（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド番号１２２５７）を有するレンチウイルスベクターにサブクローニングした（Ｓｏｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．２００９、Ｄａｈｌ ｅｔ ａｌ．２０１５、Ｓｃｈａｍｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．２００６）。
ヒトＭＳＣ、ｍｏＤＣ、及びｃＤＣ１培養物の生成
腸骨稜からの吸引によって、同意を得た健康なドナーからルンド大学血液内科（スウェーデン）でヒト骨髄（ＢＭ）細胞を採取した。ヒト試料の使用は、ヘルシンキ宣言に従ってルンド大学の治験審査委員会により承認された。以前に記載されたように、磁気活性化細胞分別（ＭＡＣＳ）（ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３８、ＣＤ６６ｂ、グリコフォリンＡ）による系統枯渇のために、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ Ｈｕｍａｎ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）とともに予めインキュベートした後に、ＢＭ吸引試料に由来する単核球を密度勾配遠心分離（ＬＳＭ １０７７リンパ球、ＰＡＡ）により単離した（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．２０１４）。ＭＳＣ精製の後に、ＦＡＣＳソーティングを行った（追加情報は以下に続く）。ＭｏＤＣを生成するために、新鮮な白血球濃縮物をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で１：１の比率で１倍に希釈し、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いた密度勾配遠心分離により分離した。製造業者のプロトコールに従ってＣＤ１４マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を備えたＭＡＣＳを使用したポジティブ選択により、ＣＤ１４＋単球をＰＢＭＣから増加させた。ＣＤ１４＋＋単球を、５％ＦＢＳを補充したＸ－ＶＩＶＯ １５培地（Ｌｏｎｚａ）中で７日間培養した。細胞を１×１０６細胞／ｍｌの密度で播種し、８ｍｌの細胞懸濁液をＴ７５フラスコに加えた。培地に０日目にＩＬ－４（３５０ｎｇ／ｍｌ）及びＧＭ－ＣＳＦ（８５０ｎｇ／ｍｌ）を補充し、２～３日ごとに培地を交換した。６日目に、ＩＬ－６（１５ｎｇ／ｍｌ）、ＰＧＥ２（１０μｇ／ｍｌ）、ＴＮＦ－α（１０ｎｇ／ｍｌ）、及びＩＬ１β（５ｎｇ／ｍｌ）を培地に２４時間添加して、成熟したｍｏＤＣを生成した。成熟したＭｏＤＣを、ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｇｉｂｃｏ）を使用して解離し、機能的な特性評価に使用した。機能的アッセイのためにｃＤＣ１を単離するために、Ｐａｎ－ＤＣ濃縮キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用してＭＡＣＳによってＰＢＭＣからＤＣを濃縮し、続いてビオチン及び抗ビオチンマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）と結合させた抗ＣＬＥＣ９Ａ抗体でさらに精製した。
フローサイトメトリー分析
表面マーカー発現の分析のために、ヒト細胞及びマウス細胞を解離し、マウスまたはラット血清（１／１００、ＧｅｎｅＴｅｘ）の存在下で４℃にて５％ＦＢＳのＰＢＳに希釈した抗体とともに３０分間インキュベートし、それぞれヒト細胞及びマウス細胞について非特異的結合をブロックした。特に明記しない限り、細胞を洗浄し、５％ＦＢＳのＰＢＳに再懸濁し、ＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩまたはＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメータ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析した。ＤＡＰＩを、死細胞排除のために使用した。フローサイトメトリーデータを、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＦＬＯＷＪＯ，ＬＬＣ、バージョン１０．６．１）を使用して分析した。すべてのフローサイトメトリー分析を生単一細胞ゲートで行った。
蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）
製造業者のプロトコールに従ってＰａｎ－ＤＣ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用してＭＡＣＳを用いるネガティブ選択によってＰＢＭＣからＤＣを濃縮した。ＨＬＡ－ＤＲ＋ＣＤ１１Ｃ＋ＣＤ１４１＋ｃＤＣ１、ＨＬＡ－ＤＲ＋ＣＤ１１Ｃ＋ＣＤ１４１－ＣＤ１Ｃ＋ｃＤＣ２、及びＨＬＡ－ＤＲ＋ＣＤ１１Ｃ－ＣＤ１２３＋ｐＤＣを、ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で精製し、単一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑプロファイリングに使用した。ＣＤ４５＋、ＣＤ４５＋ＨＬＡ－ＤＲ－、ＣＤ４５＋ＨＬＡ－ＤＲ＋、及びＣＤ４５＋ＨＬＡ－ＤＲ＋ＣＤ２２６＋ ｈｉＤＣを精製するために、ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓを用いて細胞を解離し、５％ＦＢＳのＰＢＳに再懸濁し、マウス血清の存在下で、抗ＣＤ４５、抗ＨＬＡ－ＤＲ、及び抗ＣＤ２２６抗体とともに４℃で３０分インキュベートし、ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩＩで精製した。ヒト初代ＭＳＣの単離のために、系統を枯渇したＢＭ単核細胞をブロッキングバッファー［Ｃａ２／Ｍｇ２を含まないＰＢＳ、３．３ｍｇ／ｍｌのヒト正常免疫グロブリン（Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ）、１％のＦＢＳ］中でインキュベートし、続いて抗体染色した。ＣＤ４５－ＣＤ２７１＋ＭＳＣを、ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で精製し、リプログラミング実験に使用した。死細胞は、７－アミノ－アクチノマイシン染色（７－ＡＡＤ）または４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）により排除された。
単一細胞ＲＮＡ配列決定
ＨＥＦ、３、６及び９日目のｈｉＤＣ（ＣＤ４５＋ＨＬＡ－ＤＲ－及びＣＤ４５＋ＨＬＡ－ＤＲ＋）、末梢血（３人の個人ドナー由来）からのｃＤＣ１、ｃＤＣ２及びｐＤＣを、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑのためにＦＡＣＳ分類した。精製細胞を、製造業者のプロトコールに従って１０ｘ Ｃｈｒｏｍｉｕｍ（１０ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）に入れた。製造業者のプロトコールに従って、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑインデックス付きライブラリを、Ｃｈｒｏｍｉｕｍ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ ３’ｖ２及びｖ３試薬キット（１０ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）を使用して調製した。ＨＥＦ及びＨＤＦからのサイトカインの存在下及び非存在下でリプログラミングされた９日目のｈｉＤＣ、ならびにＣＤ４５＋ＨＬＡ－ＤＲ＋ＣＤ２２６＋ ｈｉＤＣも同様にプロファイルされた。ライブラリの定量化及び品質評価を、高感度ＤＮＡ分析キット（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用してＡｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒにより決定した。インデックス付きライブラリを等モル濃度でプールし、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑ ５００上で配列決定した。得られた読み取り率は、単一細胞当たり約１３０，０００の読み取りであった。ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑデータ分析に関する詳細は、補足資料で見ることができる。
ＲＮＡ配列決定データの分析
合計で５１，９０３個の単一細胞のトランスクリプトームを、細胞１つ当たり約１３０，０００個の読み取りでプロファイルした（Ｒ１読み取り：技術的、長さ：２６～２８ｂｐ、Ｒ２読み取り：生物学的、長さ：９０～９８ｂｐ）。単一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑのペア末端配列決定読み取りを、１０ｘ ＧｅｎｏｍｉｃｓソフトウェアＣｅｌｌ Ｒａｎｇｅｒ ｖ２．２．０（ｈｔｔｐｓ：／／ｓｕｐｐｏｒｔ．１０ｘｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｃｏｍ／ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ－ｇｅｎｅ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ／ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して処理した。第１に、ｃｅｌｌｒａｎｇｅｒ ｍｋｆａｓｔｑを用いて、バイナリベースのコールファイルをＦＡＳＴＱファイルに変換し、多重化された試料を同時にデコードした。次に、ｃｅｌｌｒａｎｇｅｒ数をＦＡＳＴＱファイルに適用し、ＳＴＡＲ ｖ２．５．３ａを用いてヒト（ｈｇ３８）ゲノムアセンブリへのアラインメントを行った。次に、それぞれの実行からの出力ファイルを組み合わせ、ｃｅｌｌｒａｎｇｅｒ ａｇｇｒを使用して１つの単一のマトリクスを生成した。ｃｅｌｌｒａｎｇｅｒ解析パイプラインにより生成されたスパース発現マトリクスをＳｃａｔｅｒライブラリ（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ．ｏｒｇ／ｐａｃｋａｇｅｓ／ｒｅｌｅａｓｅ／ｂｉｏｃ／ｈｔｍｌ／ｓｃａｔｅｒ）への入力として使用し、品質管理閾値を満たした細胞及び遺伝子を、次の基準に従って含めた：１）１試料当たりの検出された固有の分子識別子（ＵＭＩ）の総数が３下限中央絶対偏差（ＭＡＤ）を超える、２）それぞれの単一細胞で検出された遺伝子数が３下限ＭＡＤを超える、３）ミトコンドリア遺伝子内のカウント率＜７．５％。得られた発現マトリクスをＳｃａｔｅｒ分析パイプラインによりフィルタリングし、Ｓｅｕｒａｔライブラリｖ４（ｈｔｔｐｓ：／／ｓａｔｉｊａｌａｂ．ｏｒｇ／ｓｅｕｒａｔ）への入力として使用した。技術的変動を説明するために、バッチ積分を行った。まず、それぞれのバッチを、スケール係数が１０，０００の「ＬｏｇＮｏｒｍａｌｉｚｅ」を使用して個別に正規化し、９，０００個の可変の特徴を識別した。次に、３０の次元を用いてバッチ間で対応するアンカーを見つけることにより、バッチ積分を行った。その後、５０個の主成分を計算し、それらの重要性をＪａｃｋＳｔｒａｗによって試験した。最初の３０個の主成分を、後続のｔＳＮＥ視覚化のために選択した。細胞型間の発現差分析のために、バッチ効果を低減し、以下のパラメータを定義する：ｌｏｇｆｃ．ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ＝０．５、ｍｉｎ．ｐｃｔ＝０．５、ＢＨ－調整ｐ＜０．０５を定義するために、Ｓｅｕｒａｔ ｖ４ ＦｉｎｄＡｌｌＭａｒｋｅｒｓ関数を潜在変数（配列決定実行及びドナー）の指定を伴うＬＲ試験とともに使用した。さらに、ｖａｒｓ．ｔｏ．ｒｅｇｅｓｓパラメータの潜在変数の指定を用いてスケーリングを実行し、得られた遺伝子をＳｅｕｒａｔ ｖ４ ＤｏＨｅａｔｍａｐ関数を使用して視覚化した。追加の試料では、すべてのデータを、１０，０００のスケール係数で「ＬｏｇＮｏｒｍａｌｉｚｅ」を使用して一緒に正規化した。最初の３０個の主成分を、後続のｔＳＮＥ及びＵＭＡＰの視覚化のために選択した。帰属するｈｉＤＣを対照と比較する発現差分析では、Ｓｅｕｒａｔ ｖ４ ＦｉｎｄＭａｒｋｅｒｓ関数をＷｉｌｃｏｘ検定で使用し、以下のパラメータを定義した：ｌｏｇｆｃ．ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ＝０．２５、ｍｉｎ．ｐｃｔ＝０．２５、ＢＨ－調整ｐ＜０．０５。得られた交差点を、Ｖｅｎｎｅｒａｂｌｅ Ｒライブラリ（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｊｓ２２９／Ｖｅｎｎｅｒａｂｌｅ）を使用して視覚化した。
実施例２．ＰＵ．１、ＩＲＦ８、及びＢＡＴＦ３は、ヒト線維芽細胞において全般的なｃＤＣ１遺伝子発現プログラムを誘導する。
転写レベルでのヒト線維芽細胞のＤＣリプログラミングを特徴付けるために、非形質導入ＨＥＦ（ｄ０）、３日目（ＣＤ４５＋、ｄ３）、６日目（ＣＤ４５＋ｄ６）、及び９日目（ＣＤ４５＋ＨＬＡ－ＤＲ＋、ｄ９ ＤＲ＋、ＣＤ４５＋ＨＬＡ－ＤＲ－、ｄ９ ＤＲ－）のヒトｉＤＣ（ｈｉＤＣ）、ならびに末梢血ｃＤＣ１、ｃＤＣ２、及びｐＤＣのプロファイリングを、１０Ｘ Ｃｈｒｏｍｉｕｍシステムを使用して単一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑにより行った（図１Ａ）。
方法
ベクター
ＨＥＦにおいてＤＣ運命を誘導するために、２Ａ配列により分離されたＰＩＢ（ＰＵ．１、ＩＲＦ８、及びＢＡＴＦ３）をコードするポリシストロンコンストラクトを、ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）誘導性レンチウイルスベクター（ｔｅｔＯ－ＰＩＢ）中にクローニングし、細胞に導入した（Ｒｏｓａ ｅｔ ａｌ．，２０１８）（図１Ａ）。
単一細胞ＲＮＡ配列決定
形質導入及び未導入のＨＥＦ細胞をｓｃＲＮＡ－ｓｅｑのためにＦＡＣＳで選別された。精製細胞を、製造業者のプロトコールに従って１０ｘ Ｃｈｒｏｍｉｕｍ（１０ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）に入れた。ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑライブラリを、製造業者のプロトコールに従って、Ｃｈｒｏｍｉｕｍ単一細胞３’ｖ２試薬キット（１０ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）を使用して調製した。インデックス付き配列決定ライブラリを、Ｃｈｒｏｍｉｕｍ単一細胞３’ｖ２試薬キットからの試薬を用いて構築した。ライブラリの定量化及び品質評価を、高感度ＤＮＡ分析キットを使用してＡｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒにより決定した。インデックス付きライブラリを等モルでプールし、対末端２６×９８ｂｐのシーケンシングモードを用いてＩｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑ ５００上で配列決定した。得られた読み取り率は、単一細胞当たり約１００，０００の読み取りであった。
走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）
ＰＩＢ因子で形質導入したＨＥＦを８日目に選別し（ＣＤ４５＋ＨＬＡ－ＤＲ＋）、０．１％のゼラチン被覆カバースリップに播種し、９日目にＭ２ｒｔＴＡで形質導入したＨＥＦと一緒に分析した。試料を０．１ＭのＳｏｒｅｎｓｅｎのリン酸緩衝液中で洗浄し、０．１ＭのＳｏｒｅｎｓｅｎのリン酸緩衝液ｐＨ７．４、１．５％のホルムアルデヒド、及び２％のグルタルアルデヒドで室温にて３０分間固定した。固定後、試料を０．１ＭのＳｏｒｅｎｓｅｎの緩衝液中で洗浄した。次いで、試料を段階的な一連のエタノール（５０％、７０％、８０％、９０％、及び１００％で２回）中で脱水し、臨界点乾燥し、１２．５ｍｍのアルミニウムスタブに取り付けた。次いで、試料をＱｕｏｒｕｍ Ｑ１５０Ｔ ＥＳターボポンプドスパッタコーター中で１０ｎｍのＡｕ／Ｐｄ（８０／２０）でスパッタリングし、Ｊｅｏｌ ＪＳＭ－７８００Ｆ ＦＥＧ－ＳＥＭ中で試験した。
ＤＣサブセット分類
ｓｃＰｒｅｄライブラリ（Ａｌｑｕｉｃｉｒａ－Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．，２０１９）及び公的に利用可能なＤＣ単一細胞発現データ（Ｖｉｌｌａｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１７）を、サブセットへの帰属に使用した。（Ｒライブラリとして実装された）ｓｃＰｒｅｄ法を使用して分類指標をトレーニングするために、ツールビネットで定義されているように、ｇｅｔＦｅａｔｕｒｅＳｐａｃｅ、ｔｒａｉｎＭｏｄｅｌのデフォルトパラメータを使用した。ＰＢＭＣから単離されたＤＣの、公的に利用可能なＤＣサブセットへの割り当てを予測するために、ｓｃＰｒｅｄｉｃｔ関数は、デフォルトパラメータで使用された。ｈｉＤＣの分類では、ｓｃＰｒｅｄｉｃｔ関数を閾値＝０．９９でドナーごとに個別に使用し、次いでそれぞれのサブセットに帰属する細胞の数を組み合わせた。
結果
ヒト胎児線維芽細胞（ＨＥＦ）においてＤＣ運命を誘導するために、ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）誘導性レンチウイルスベクター（ＴｅｔＯ－ＰＩＢ）にクローニングした２Ａ配列により分離されたＰＵ．１、ＩＲＦ８、及びＢＡＴＦ３（ＰＩＢ）をコードするポリシストロンコンストラクト（Ｒｏｓａ ｅｔ ａｌ．２０１８）を使用した（図１Ａ）。ＨＥＦにＰＩＢを形質導入した後に、３日目にＤＣ様形態を有するＣＤ４５＋細胞集団及び６日目から９日目までにＤＣ様形態を有するＣＤ４５＋ＨＬＡ－ＤＲ＋細胞の少量の集団の出現が観察され（図１Ｂ～Ｄ）、これはヒト誘導性ＤＣ（ｈｉＤＣ）と名付けられた。転写変化を明らかにするために、１０Ｘ Ｃｈｒｏｍｉｕｍシステムを用いてｓｃＲＮＡ－ｓｅｑを行った。末梢血ｃＤＣ１、ｃＤＣ２、ｐＤＣ、非形質導入ＨＥＦ（ｄ０）、３日目（ＣＤ４５＋、ｄ３）、６日目（ＣＤ４５＋、ｄ６）、及び９日目のｈｉＤＣ（ＣＤ４５＋ＨＬＡ－ＤＲ－、ｄ９ ＤＲ－、ＣＤ４５＋ＨＬＡ－ＤＲ＋、ｄ９ ＤＲ＋）を含む、３人のドナーからの４５，８７０細胞がプロファイルされた。４つのクラスタすなわちＨＥＦ、ｃＤＣ１、ｃＤＣ２、及びｐＤＣを強調したデータセットのｔ－分散確率的近傍埋め込み（ｔ－ＳＮＥ）視覚化（図１Ｅ）。ｈｉＤＣ ｄ３及びｄ６が特にクラスタにマッピングしなかったのに対し、ｈｉＤＣ ｄ９はｃＤＣ１でマッピングされ、ＤＲ＋はＤＲ－よりもｃＤＣ１に近かった。これらのデータは、ヒトｃＤＣ１のリプログラミングには９日間の時間フレームが必要であり、ＣＤ４５＋ＨＬＡ－ＤＲ－細胞は、部分的にリプログラミングされた細胞状態を表すことを示唆している。次に、取得された単一細胞データを、ｓｃＰｒｅｄ（Ａｌｑｕｉｃｉｒａ－Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．２０１９）を使用して、公的に利用可能なＤＣデータセットと統合した（Ｖｉｌｌａｎｉ ｅｔ ａｌ．２０１７）。予想通り、精製ｃＤＣ１の５３．８％がｃＤＣ１サブセットに割り当てられ、ｃＤＣ２の６６．９％及び２９．８％がＤＣ２及びＤＣ３サブセットにそれぞれ割り当てられ、ｐＤＣの６６．５％がＤＣ６サブセットに割り当てられることが観察された（図Ｓ３）。ＨＥＦは独立しているが、ｄ３の１．３％、ｄ６の５．３％、ｄ９のＤＲ－ ｈｉＤＣの１４．４％、及びｄ９のＤＲ＋ ｈｉＤＣの３６．７％がｃＤＣ１サブセットに特異的に割り当てられており、ＰＵ．１、ＩＲＦ８、及びＢＡＴＦ３が、サブセット境界を横切らない程度の不均一性を有するｃＤＣ１シグネチャを漸進的に課すことを示唆している（図１Ｆ～Ｇ）。ｃＤＣ１帰属細胞は、ｃＤＣ１特異的遺伝子ＣＡＤＭ１及びＷＤＦＹ４をそれらの非帰属対応物と比較して高いレベルで発現している（Ｖｉｌｌａｎｉ ｅｔ ａｌ．２０１７）（図１Ｈ）。次に、データセットにわたってほとんどの可変遺伝子を抽出し、５つのクラスタにグループ化した（図１Ｉ）。クラスタ１は、ＨＥＦで高発現されかつリプログラミング中にサイレンシングされる遺伝子を含む。クラスタ２はリプログラミング中の初期の転写変化を浮き彫りにし、クラスタ３は、ｄ９ ｈｉＤＣ及びｃＤＣ１で高発現しているｃＤＣ１特異的遺伝子Ｃ１ｏｒｆ５４、ＡＮＰＥＰ、ＴＡＣＳＴＤ２、及びＳＬＡＭＦ８を含む（Ｈｅｉｄｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．２０１６、Ｓｅｅ ｅｔ ａｌ．２０１７、Ｖｉｌｌａｎｉ ｅｔ ａｌ．２０１７）（図１Ｊ、表２）。クラスタ４及びクラスタ５は、それぞれ、ｃＤＣ２及びｐＤＣで高発現している遺伝子を含む。興味深いことに、ｄ９ ｈｉＤＣは、ＰＳＭＢ９、ＴＡＰ１、及びＨＬＡ－Ｃを含む高レベルの抗原処理及び交差提示遺伝子を発現し（図１Ｋ～Ｍ）、リプログラミングされた細胞が交差提示能力を獲得したことを示唆している。

Figure 2024522074000007
結論
まとめると、これらのデータは、ＰＩＢ因子がヒト線維芽細胞にｃＤＣ１シグネチャを課すことを証明している。
実施例３．単一細胞分析により、ｃＤＣ１リプログラミングの成功及び失敗に関連する経路を浮き彫りにする
ヒトのＤＣリプログラミングの軌跡を解析し、成功したリプログラミングと相関する経路または因子を明らかにし、したがってヒト細胞におけるｃＤＣ１リプログラミングの最適化を可能にするために、単一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑを使用することができるという仮説が立てられた。
方法
疑似時間再構成
Ｍｏｎｏｃｌｅ３ライブラリ（Ｃａｏ ｅｔ ａｌ．２０１９）を使用して、リプログラミング疑似時間で細胞を順序付けた。Ｍｏｎｏｃｌｅ３は、以下のパラメータ：ｕｓｅ＿ｐａｒｔｉｔｉｏｎ＝ＦＡＬＳＥを指定してｔＳＮＥ上で実行した。これは、データセット内のすべての細胞が共通の転写祖先から派生していることを想定している。軌跡のルートが自動的に選択された。軌跡に沿って変動する遺伝子の同定におけるバッチ効果を軽減するために、ｂａｔｃｈｅｌｏｒ Ｒライブラリ（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ．ｏｒｇ／ｐａｃｋａｇｅｓ／ｒｅｌｅａｓｅ／ｂｉｏｃ／ｈｔｍｌ／ｂａｔｃｈｅｌｏｒ．ｈｔｍｌ）からのｒｅｇｒｅｓｓＢａｔｃｈｅｓ関数を使用してバッチ補正を実行した。次に、ｇｒａｐｈ＿ｔｅｓｔ関数を使用して軌跡にわたって変化する遺伝子を同定し、ｆｉｎｄ＿ｇｅｎｅ＿ｍｏｄｕｌｅｓ関数を使用して２１個の別個のモジュールにグループ化し、ｐｈｅａｔｍａｐ Ｒライブラリ（ｈｔｔｐｓ：／／ｃｒａｎ．ｒ－ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ／ｗｅｂ／ｐａｃｋａｇｅｓ／ｐｈｅａｔｍａｐ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）におけるＷａｒｄ．Ｄ２法を使用してクラスタリングした。遺伝子は、クラスタリング結果に従って、成功したリプログラミング群及び失敗したリプログラミング群として定義された。次に、これらの遺伝子リストを、それぞれの細胞集団のそれぞれの遺伝子の手段を計算し、以下の基準を使用して追加的にフィルタリングした：成功したリプログラミング－ｈｉＤＣ ｄ９ ＤＲ＋（帰属）＞ｈｉＤＣ ｄ９ ＤＲ＋（非帰属）及びｈｉＤＣ ｄ９ ＤＲ－（帰属）＞ｈｉＤＣ ｄ９ ＤＲ＋（非帰属）及びｈｉＤＣ ｄ９ ＤＲ＋（帰属）＞ＨＥＦ及びｈｉＤＣ ｄ９ ＤＲ－（帰属）＞ＨＥＦ。失敗したリプログラミングについてはすべての比較は逆である。リプログラミングダイナミクスｓｃＶｅｌｏ ｖ０．２．４（Ｂｅｒｇｅｎ ｅｔ ａｌ．２０２０）を再構成するために用いた。これらの分析のために、ｃｅｌｌｒａｎｇｅｒ分析パイプラインによって生成されたスパース発現マトリクスを、Ｖｅｌｏｃｙｔｏ ｖ０．１７．１７（ｈｔｔｐ：／／ｖｅｌｏｃｙｔｏ．ｏｒｇ）を使用して、スプライシングマトリクス及びスプライシングされていないマトリクスに変換した。ｓｃＶｅｌｏはデフォルト設定で実行した。さらに、潜在時間を回復させるためにもｓｃＶｅｌｏを使用し、潜在時間に沿って変化する遺伝子を上位１０００個選択し、ヒートマップ上に表示した。追加の試料（図３）では、Ｍｏｎｏｃｌｅ３ライブラリを使用して、同じアプローチを用いたｈｉＤＣリプログラミングへのＨＥＦ中の疑似経時変化上で細胞を順序付けした。
転写因子（ＴＦ）共制御ネットワーク分析
ＴＦネットワークを構築するために、ｃＤＣ１リプログラミングの成功または失敗に関連する遺伝子が、ＣｈＥＡ３（ｈｔｔｐｓ：／／ｍａａｙａｎｌａｂ．ｃｌｏｕｄ／ｃｈｅａ３／）を使用する分析のために提出され、ライブラリ全体にわたって平均ランクによって統合された。ＴＦネットワークを、ヒトＴＦをそれらの共発現類似性に基づいて表す点を有するネットワークプロットとして視覚化した。
結果
発明者らは、ｃＤＣ１リプログラミング軌跡を再構築するためにＭｏｎｏｃｌｅ３を使用した（Ｃａｏ ｅｔ ａｌ．２０１９）。ＨＥＦ及びｃＤＣ１を、それぞれ疑似時間の開始時及び終了時に配置した（図２Ａ～２Ｂ）。ｄ９ ｈｉＤＣをｃＤＣ１を用いて軌跡の終わりに配置したが、ｄ３及びｄ６のｈｉＤＣは中ほどに位置しており、これはｃＤＣ１のリプログラミング中に単一細胞のトランスクリプトームの段階的な遷移を浮き彫りにする。ここで重要であるのは、帰属するｄ９ ｈｉＤＣを、帰属しないｄ９ ｈｉＤＣと比較して疑似時間の後ろの方に配置したことであり、軌跡の再構成によって、成功したｃＤＣ１リプログラミング経路が捕捉できたことを示唆している。また、ＨＥＦに近い非帰属のｈｉＤＣマッピングを有する「デッドエンド」軌跡も観察され、これは、これらの細胞が成功したリプログラミング経路に入らないことを示唆している。リプログラミング中の個々の細胞の発現ダイナミクス及び方向性を推測するために、ｓｃＶｅｌｏ解析（Ｂｅｒｇｅｎ ｅｔ ａｌ．２０２０）をリプログラミング軌跡に適用した。ｈｉＤＣ速度は、主に、Ｍｏｎｏｃｌｅ３により投影されたｃＤＣ１リプログラミング軌跡と一致している（図２Ｃ）。それにもかかわらず、ＨＥＦを指し示すデッドエンド軌跡表示速度により近いｈｉＤＣマッピングが観察され、本来の細胞状態に関連する遺伝子の発現によって特徴付けられる失敗したリプログラミング経路が記載されていた以前の報告と一致していた（Ｂｉｄｄｙ ｅｔ ａｌ．２０１８、Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．２０１９、Ｔｒｅｕｔｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．２０１６）。潜在時間を用いた遺伝子発現ダイナミクスの再構築により、ｃＤＣ１のリプログラミング中の細胞周期遺伝子の下方制御が示され（図２Ｄ～Ｅ）、ｈｉＤＣがサイクルを外れることが示唆された。また、本発明者らは、サイトカインならびにＩＦＮ－Ｉ型及びＩＩ型（ＩＦＮ－γ）シグナル伝達経路における濃縮を、潜在時間の後半で観察した。細胞周期の下方制御及びＩＦＮ遺伝子シグネチャの上方制御は、マウス系における我々の以前の知見と一致し（Ｒｏｓａ ｅｔ ａｌ．２０１８）、ｃＤＣ１リプログラミングにおけるＩＦＮシグナル伝達のための種保存された役割を示唆している。リプログラミングに沿ってステージ特異的な遺伝子変化をマッピングするために、本発明者らは、２１個のモジュールにおいて疑似時間に沿って差次的に発現する遺伝子をクラスタリングした（図２Ｆ）。非帰属のｈｉＤＣは、モジュール１、２、４、及び７（リプログラミングの失敗）を含むＨＥＦに富んでいるいくつかの遺伝子モジュールの下方制御に失敗している。帰属するｈｉＤＣ及びｃＤＣ１は、モジュール３、９、１３、１５、及び１７（リプログラミングの成功）で発現する遺伝子に富んでいる。これらのモジュールからの表面分子及び転写調節因子をコードする遺伝子の抽出は、失敗したリプログラミング（ＣＤ２４８及びＰＲＲＸ１）に富む線維芽細胞遺伝子と、成功したリプログラミングされた細胞において上方制御される、ｃＤＣ１マーカーＣＤ２２６（Ｈｅｉｄｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．２０１６）及びＩＲＦ７（Ｈｏｎｄａ ｅｔ ａｌ．２００５）を含むＤＣ遺伝子とを強調した（図２Ｇ、表１）。失敗したリプログラミング遺伝子のための転写因子富化解析により、以前記載されているＴＷＩＳＴ１、ＴＷＩＳＴ２、ＰＲＲＸ１、ＰＲＲＸ２、及びＯＳＲ１を含む、直接的なリプログラミングの障害（Ｔｏｍａｒｕ ｅｔ ａｌ．２０１４）を同定した（図２Ｈ）。興味深いことに、成功したリプログラミング遺伝子に関する同じ分析により、成功したｃＤＣ１リプログラミング遺伝子シグネチャの確立におけるＰＵ．１、ＩＲＦ８、及びＢＡＴＦの重要性が強化された。
結論
これらのデータは、転写因子ＰＵ．１、ＩＲＦ８、及びＢＡＴＦ３の強制発現がリプログラミング効率を改善し、ｃＤＣ１リプログラミングにおけるサイトカイン及びＩＦＮシグナル伝達の役割を浮き彫りにし得ることを実証している。
実施例４．単一細胞分析により、リプログラミングの成功に関連する表面マーカーが浮き彫りになり、これによって、成功したリプログラミングされたｈｉＤＣの識別及び将来の単離が可能になる。
本発明者らは、成功したｃＤＣ１リプログラミングに富んだ表面マーカー（表１）により、成功したリプログラミングされたｈｉＤＣの識別及び将来の単離が可能となるという仮説を立てた。概念実証として、これらの表面マーカーのうちの１つであるＣＤ２２６を選択し、ＣＤ２２６＋リプログラミングされたｈｉＤＣを精製し、それらのｃＤＣ１の同一性を、ＣＤ２２６－リプログラミングされたｈｉＤＣと比較した。
方法
まず、本発明者らは、部分的にリプログラミングしたＣＤ４５＋ＨＬＡ－ＤＲ－、及びリプログラミングしたＣＤ４５＋ＨＬＡ－ＤＲ＋ ｈｉＤＣにおけるＣＤ２２６の表面発現を評価した。次いでＣＤ４５＋ＨＬＡ－ＤＲ＋ＣＤ２２６＋ ｈｉＤＣを精製し、それらのｃＤＣ１の同一性を、ｓｃＰｒｅｄシステムを使用してＣＤ４５＋ＨＬＡ－ＤＲ＋ＣＤ２２６－ ｈｉＤＣの同一性と比較した。実験の詳細については先の実施例を参照されたい。
結果
まず、ＣＤ４５＋ＨＬＡ－ＤＲ＋ ｈｉＤＣが、ＣＤ４５＋ＨＬＡ－ＤＲ－ ｈｉＤＣよりも高いレベルのＣＤ２２６を発現していることが観察された（図２Ｉ）。次いで、ｃＤＣ１様細胞を同定するためのＣＤ２２６の有用性を検証するために、ＣＤ４５＋ＨＬＡ－ＤＲ＋ＣＤ２２６＋ ｈｉＤＣを精製し、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑによってプロファイルした。興味深いことに、ＣＤ２２６＋細胞は、ｃＤＣ１帰属の増加を示した（１９．５％から４０．９％まで）（図２Ｊ）。さらに、ＣＤ２２６＋ ｈｉＤＣが、死細胞貪食でＣＤ２２６－ ｈｉＤＣと比較してより良好に機能することが観察され、ＣＤ２２６が機能的なｈｉＤＣをマークすることが示唆されている（図２Ｋ）。
結論
これらのデータは、ＣＤ２２６を含む、リプログラミングの成功に関連する表面マーカーにより、洗練されたｃＤＣ１同一性を有するより機能的なｈｉＤＣの単離が可能となることを示唆している。
実施例５．単一細胞分析により、ＰＵ．１、ＩＲＦ８、及びＢＡＴＦ３と協働して、ｃＤＣ１のリプログラミング効率を増加させることができる成功したｃＤＣ１リプログラミングに関連する転写因子が同定される
本発明者らは、成功したｃＤＣ１リプログラミングに富んだ転写因子（表１）が、ＰＵ．１、ＩＲＦ８、及びＢＡＴＦ３と協働して、ｃＤＣ１のリプログラミング効率を増強することができるという仮説を立てた。概念実証として、２２個の転写因子を選択した（ＩＤ２、ＴＸＮＩＰ、ＺＦＰ３６、ＰＬＥＫ、ＳＵＢ１、ＪＵＮＢ、ＣＲＥＭ、ＫＬＦ４、ＭＸＤ１、ＬＩＴＡＦ、ＩＲＦ７、ＦＯＳ、ＮＭＩ、ＴＦＥＣ、ＳＰ１１０、ＩＲＦ５、ＳＴＡＴ２、ＢＡＴＦ、ＺＮＦ２６７、ＩＲＦ１、ＲＥＬＢ、及びＢＡＴＦ２）。これらは、成功したｃＤＣ１リプログラミングと関連するか、または成功したｃＤＣ１リプログラミング遺伝子シグネチャを調節すると予測され（実施例３に記載の転写因子（ＴＦ）共制御ネットワーク分析を参照されたい）、ＰＵ．１、ＩＲＦ８、及びＢＡＴＦ３と共発現させた場合にｃＤＣ１リプログラミング効率を増加させるそれらの能力が評価された。
方法
ＩＤ２、ＴＸＮＩＰ、ＺＦＰ３６、ＰＬＥＫ、ＳＵＢ１、ＪＵＮＢ、ＣＲＥＭ、ＫＬＦ４、ＭＸＤ１、ＬＩＴＡＦ、ＩＲＦ７、ＦＯＳ、ＮＭＩ、ＴＦＥＣ、ＳＰ１１０、ＩＲＦ５、ＳＴＡＴ２、ＢＡＴＦ、ＺＮＦ２６７、ＩＲＦ１、ＲＥＬＢ、及びＢＡＴＦ２のコード領域は、個別にｐＦＵＷ－ＴｅｔＯプラスミドにクローニングされた。構成的に活性なヒトユビキチンＣプロモーターの制御下にある、個々の転写因子、すなわちＰＵ．１、ＩＲＦ８、及びＢＡＴＦ３（ｐＦＵＷ－ｔｅｔＯ－ＰＩＢ）、または逆テトラサイクリントランスアクチベーターＭ２ｒｔＴＡ（ｐＦＵＷ－ＵｂＣ－Ｍ２ｒｔＴＡ）をコードするレンチウイルス粒子を共形質導入に使用した（Ｒｏｓａ ｅｔ ａｌ．２０１８）。転写因子過剰発現の９日後に、ＨＥＦ中のフローサイトメトリーによりリプログラミング効率を評価した。
結果
付加的な制御因子がリプログラミングを増強するか否かを評価するために、本発明者らは、成功したｃＤＣ１リプログラミングに関連する個々の転写因子をＰＵ．１、ＩＲＦ８、及びＢＡＴＦ３に補充し、ＩＲＦ７及びＢＡＴＦがｃＤＣ１リプログラミング効率を増大させることを観察した（図２Ｌ）。ＩＲＦ７は、下流の炎症性シグナル伝達の転写調節因子である（Ｈｏｎｄａ ｅｔ ａｌ．２００５）。ＢＡＴＦはＢＡＴＦ３と非常に相同性が高く、ｃＤＣ１発生の間にＢＡＴＦ３を補償することが示されている（Ｔｕｓｓｉｗａｎｄ ｅｔ ａｌ．２０１２）。
結論
これらのデータは、ＩＲＦ７及びＢＡＴＦを含む、成功したリプログラミングに関連する転写因子が、ｃＤＣ１のリプログラミング効率を増加させ得ることを示唆している。
実施例６．外部サイトカインを使用したｃＤＣ１リプログラミング効率の増加
サイトカインシグナル伝達がリプログラミングされたｈｉＤＣで濃縮し、ヒトＤＣ特異性におけるその役割を動機として、本発明者らは、サイトカインがＤＣリプログラミングにおいてＰＵ．１、ＩＲＦ８、及びＢＡＴＦ３と相乗効果を発揮し得ることを仮定した。
方法
ＨＥＦにおいてＰＩＢ誘導から２日後に、炎症性メディエーターを含む１７個のヒト造血細胞サイトカイン（表３）を個別に培養培地に添加し、９日目にリプログラミング効率を測定した。単一のサイトカインと２個または３個のサイトカインの組み合わせの両方を使用して、リプログラミング効率の変化を分析した。

Figure 2024522074000008
結果
ＩＦＮ－γは、ＣＤ４５＋ＨＬＡ－ＤＲ＋細胞生成の２０倍の増加を促進する最も大きな影響を有していた（サイトカインを含まない０．４％±０．２％に対して７．９％±２．２％）（図３Ａ）。ＩＬ－１β（３倍）、ＩＬ－６（２．５倍）、オンコスタチンＭ（４倍）、ＴＮＦ－α（３倍）、及びＩＦＮ－β（４倍）を含む他の炎症性サイトカインもリプログラミング効率を増加させた。前駆細胞（Ｂａｌａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１８）または単球（Ｃｈａｐｕｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９７）からのＤＣのインビトロ分化のために使用したＦＬＴ３Ｌ、ＩＬ－４、及びＧＭ－ＣＳＦは、リプログラミング効率に影響を及ぼさなかった。ＩＦＮ－γをＩＦＮ－βまたはＴＮＦ－αと組み合わせることにより、それぞれリプログラミング効率がさらに２．５倍及び２倍増加した。３つのサイトカインであるＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－β、及びＴＮＦ－αを組み合わせると、２８．１％±３．４％のｈｉＤＣが得られ、サイトカインを含まない条件と比較して７０倍の増加である（図３Ｂ）。
結論
これらのデータは、炎症性サイトカインの供給に伴ってｃＤＣ１のリプログラミング効率が増加することを強く示唆している。
実施例７．より強力な構成的プロモーターを使用してｃＤＣ１のリプログラミング効率を増強する
ｃＤＣ１のリプログラミングの軌跡再構築が、ＰＵ．１、ＩＲＦ８、及びＢＡＴＦ３発現をｃＤＣ１運命の成功の確立と相関させたことを考慮して、本発明者らは、より強力な構成的プロモーターを使用するリプログラミング因子の強制発現がリプログラミング効率を増加させるかどうかを調べた。
方法
ＰＩＢポリシストロン酸カセット、続いてＩＲＥＳ－ＧＦＰを、レンチウイルス骨格における複数のプロモーターを利用する構成ベクターにクローニングし、Ｃｌｅｃ９ａ－ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターを保有するＭＥＦにおけるＤＣリプログラミング効率（Ｒｏｓａ ｅｔ ａｌ．，２０１８）を評価した。以下のベクター骨格及びプロモーターを使用した：ｐＦＵＷ－ＵｂＣ、ｐＲＲＬ．ＰＰＴ－ＳＦＦＶ、ｐＲＲＬ．ＰＰＴ－ＰＧＫ、ｐＲＲＬ．ＰＰＴ－ＥＦ１Ｓ、ｐＨＡＧＥ２－ＥＦ１、及びｐＷＰＸＬ－ＥＦ１ｉ。
結果
ＳＦＦＶプロモーターによって駆動されるＰＩＢ過剰発現は、マウス細胞において優れた効率（４６．６％±１６．７％ｔｄＴｏｍａｔｏ＋ＭＨＣ－ＩＩ＋細胞）を誘導した（図４Ａ）。ＨＥＦでは、２１．３±６．１％のｈｉＤＣの発生がＳＦＦＶ系で観察された（図４Ｂ）。さらに、大部分の線維芽細胞におけるＰＩＢの構成的過剰発現によりＣＤ４５の表面発現が誘導されており、Ｄｏｘ誘導系と比較してより大きい細胞の集団がＤＣリプログラミング過程を開始することを示唆している（図４Ｂ）。
結論
これらのデータは、ＳＦＦＶプロモーターを有するレンチウイルスベクターを、ヒト細胞におけるリプログラミングを改善するために使用できることを示している。
実施例８．サイトカインとより強力な構成的プロモーターとの組み合わせを使用してｃＤＣ１のリプログラミング効率を増強する
本発明者らは、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－β、及びＴＮＦ－αシグナル伝達と、ＰＵ．１、ＩＲＦ８、及びＢＡＴＦ３のＳＦＦＶ媒介構成的過剰発現がｃＤＣ１リプログラミング効率を増加させたことに鑑み、本発明者らは、炎症性サイトカインシグナル伝達がリプログラミング因子の構成的過剰発現と相乗的に作用し、より高いリプログラミング効率を達成するか否かを調べた。
方法
サイトカイン処理とＳＦＦＶ駆動型ＰＩＢ誘導との組み合わせ後のリプログラミング効率への影響を評価した。ｓｃＰｒｅｄシステムは、「天然の」ＤＣとの統合に使用した。実験の詳細については先の実施例を参照されたい。
結果
ＳＦＦＶ駆動誘導と、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－β、及びＴＮＦ－αでの処理とを組み合わせることにより、ｈｉＤＣは７６．９±１１．９％となり、これは、元のプロトコールに比べて、ｃＤＣ１リプログラミング効率が１９０倍向上した（図４Ｂ）。さらに、生成されたｈｉＤＣの絶対数の増加が、改良されたプロトコールにより観察された（図４Ｃ）。改善されたリプログラミングプロトコールにより生成されたｈｉＤＣのｃＤＣ１同一性を特徴付けるために、サイトカインを含む及び含まない誘導性（ｔｅｔＯ－ＰＩＢ）及び構成性（ＳＦＦＶ－ＰＩＢ）系を用いて得られたｈｉＤＣのプロファイルを行い、ｓｃＰｒｅｄを末梢血ＤＣとの統合に使用した（図４Ｅ）。興味深いことに、それぞれサイトカインを伴って、及び伴わずに、ＳＦＦＶで生成されたｈｉＤＣの６１．４％及び５３．２％が、ｃＤＣ１系統に帰属された。対照的に、誘導性系（ｔｅｔＯ－ＰＩＢ）で生成されたのはわずか３３．４％及び２２．０％であった。これらのデータは、サイトカインシグナル伝達とＰＵ．１、ＩＲＦ８、及びＢＡＴＦ３の強制発現とが、ｃＤＣ１様細胞運命の確立の成功に対して相乗的に作用することを示唆している。ＩＬ－１０はリプログラミング効率に影響を及ぼさず、ＴＧＦ－βは２倍減少させた（図５）。ＩＬ－１０及びＴＧＦ－βシグナル伝達は、ｈｉＤＣにおけるＣＤ４０発現に影響を及ぼさなかった。
結論
これらのデータは、１）改善されたプロトコールにより、ｃＤＣ１のリプログラミング効率とｃＤＣ１の同一性の両方が増加し、２）サイトカインとＰＵ．１、ＩＲＦ８、及びＢＡＴＦ３の強制発現が、成功したリプログラミングに対して相乗作用することを示唆している。
実施例９．ヒトｃＤＣ１様細胞の機能的リプログラミング
ｃＤＣ１は、サイトカインの分泌及びＴ細胞への抗原提示を含む複数の機序により適応免疫を調整する。本発明者らは、ＰＵ．１、ＩＲＦ８、及びＢＡＴＦ３過剰発現後に、ヒト線維芽細胞においてｃＤＣ１様遺伝子発現プロファイルを誘導することを動機として、ｈｉＤＣが天然に存在するｃＤＣ１として機能し得るか否かを調べた。
方法
これらのｈｉＤＣが天然に存在するＤＣと同じ機能を共有するかどうかを調べるために、これらのｈｉＤＣに対して、トール様受容体４（ＴＬＲ４）［リポポリサッカライド（ＬＰＳ）］、ＴＬＲ３［ポリイノシン－ポリシチジル酸（ポリＩ：Ｃ）］、もしくはＴＬＲ７／８［レシキモド（Ｒ８４８）］またはすべてのＴＬＲの組み合わせでチャレンジした。共刺激分子ＣＤ４０及びＣＤ８０の表面発現（Ｔ細胞の活性化に必要）をフローサイトメトリーで分析し、Ｔ細胞の活性化についてのマーカーとして使用した。
死細胞の貪食能にアクセスするために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を紫外線（ＵＶ）照射（５０Ｊ／ｍ２）に曝露して、細胞死を誘導し、ＣｅｌｌＶｕｅ Ｃｌａｒｅｔ Ｆａｒ Ｒｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｋｅｒ Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ）で標識した。ｈｉＤＣ（９日目）、ＨＥＦ、及びｃＤＣ１を遠赤標識死細胞とともに２時間インキュベートし、ＰＢＳ ５％ＦＢＳで洗浄し、ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ Ｘ－２０で分析した。生きたＣＤ４５＋ＨＬＡ－ＤＲ＋ ｈｉＤＣ、ＣＤ４５＋ＨＬＡ－ＤＲ＋ＣＤ２２６－ ｈｉＤＣ、ＣＤ４５＋ＨＬＡ－ＤＲ＋ＣＤ２２６＋ ｈｉＤＣ、ＣＤ１４１＋ＣＬＥＣ９Ａ＋末梢血ｃＤＣ１において、または遠赤色を使用する対照の集団において、死細胞の取り込みを定量化した。死細胞貪食の経時的蛍光顕微鏡検査イメージングのために、遠赤標識された死細胞を、Ｚｅｉｓｓ Ｃｅｌｌｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ ７での画像取得を開始する直前に、ＦＡＣＳで選別されたＨＥＦ由来のＣＤ４５＋ＨＬＡ－ＤＲ＋ ｈｉＤＣ培養に添加した。顕微鏡画像を１０分ごとに１６時間撮影した。
炎症性サイトカイン分泌にアクセスするために、サイトカインの存在下または非存在下で生成されるＦＡＣＳで選別されたＣＤ４５＋ＨＬＡ－ＤＲ＋９日目ｈｉＤＣ、サイトカインの存在下または非存在下で培養されたＨＥＦ、ｍｏＤＣ及びＦＡＣＳで選別されたＣＤ１４１＋ＣＬＥＣ９Ａ＋ＸＣＲ１＋ｃＤＣ１の培養上清２５μｌで、製造者の使用説明書に従ってサイトメトリックビーズアレイキット（ＬＥＧＥＮＤｐｌｅｘ Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉ－Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｐａｎｅｌ，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を用いてヒトサイトカインのレベルを定量化した。言及すると、ＬＰＳ、ポリＩ：ＣもしくはＲ８４８、または３つの組み合わされた刺激を、分析前に一晩かけて添加した。取得はＦＡＣＳＣａｎｔｏで行い、データはＬＥＧＥＮＤｐｌｅｘソフトウェア（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を使用して分析した。
交差提示能力にアクセスするために、ＨＥＦ、ｍｏＤＣ、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）濃縮Ｃｌｅｃ９ａ＋ｃＤＣ１、及びｈｉＤＣを、８日目にリプログラミングして、ＬＰＳ（３ｎｇ／ｍｌ）、ポリＩ：Ｃ（２５μｇ／ｍｌ）、及びＲ８４８（３ｎｇ／ｍｌ）で刺激した。一晩刺激の後、細胞を２％のＦＢＳを含有するＰＢＳ中で洗浄し、２μｌ／ｍｌのＣＭＶタンパク質（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）でパルス処理した。３時間後、細胞を洗浄し、ＣＭＶ血清陽性ドナーから単離したＭＡＣＳ濃縮ＣＤ８＋Ｔ細胞とともに共培養した。ＣＭＶ陽性を、ＣＭＶデキストラマー（Ｉｍｍｕｄｅｘ）を使用するフローサイトメトリーによって確認した。１×１０５個のＣＤ８＋Ｔ細胞及び５×１０４個のＤＣを、９６ウェルプレート内でＸ－ＶＩＶＯ １５の２００μｌ中で共培養した。２４時間後、上清中のＩＦＮ－γレベルをＥＬＩＳＡ（ＢＤ）を用いて定量化することにより、Ｔ細胞活性化を測定した。吸光度を、ＧｌｏＭａｘ Ｄｉｓｃｏｖｅｒ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で４９０ｎｍで読み取った。
結果
本発明者らは、ｈｉＤＣとｃＤＣ１の両方がＴＬＲ３または複合刺激の後に共刺激分子を上方制御したことを観察した（図６Ａ）。さらに、ｈｉＤＣは、ｃＤＣ１よりもＴＬＲ４誘起に高い程度で応答した。したがって、ＣＤ３４＋造血前駆細胞から分化したｃＤＣ１はＬＰＳに応答し、インビトロで生成されたｃＤＣ１様細胞（Ｂａｌａｎ ｅｔ ａｌ．２０１８）の一般的な特徴を指摘している。貪食能力を評価するために、標識した死細胞との短時間のインキュベーションを行った。本発明者らは、死細胞物質に組み込まれた、ｈｉＤＣ（４７．５±１２．０％）、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－β、及びＴＮＦ－αの存在下で生成されたｈｉＤＣ（１９．４±７．７％）、ならびにｃＤＣ１（１０．９±３．５％）を観察し（図６Ｂ～６Ｄ）、これは交差提示するＤＣの重要な特徴である。ＤＣ成熟と貪食は多くの場合、逆相関している（Ｂｒｏｚ ｅｔ ａｌ．２０１４）。したがって、サイトカインの存在下で生成されたｈｉＤＣは、より高いレベルの共刺激分子を発現し、死細胞を組み込む能力の低下を示した（図６Ａ～Ｃ）。ｈｉＤＣがＴ細胞活性化に必要な第３のシグナルも供給していることを確認するために、サイトカイン分泌を評価した（図６Ｆ）。まず始めに、ヒトｃＤＣ１特異的サイトカインＩＦＮ－λ１を分泌することによって、ｈｉＤＣ及びｃＤＣ１がＴＬＲ３チャレンジに応答することが観察された（Ｈｕｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．２０２０）。これは、ＴＬＲ３アゴニストに応答しなかったｍｏＤＣとは対照的である（Ｌａｕｔｅｒｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．２０１０）。さらに、ｈｉＤＣは、ＩＬ１２ｐ７０、ＣＸＣＬ１０、及びＴＮＦ－αを分泌することによってＴＬＲ４及び３にも反応した。さらに、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－β、及びＴＮＦ－αがサイトカイン分泌の大きさを増加させることが観察された。次いで、本発明者らは、ｈｉＤＣがＣＤ８＋Ｔ細胞に抗原を交差提示するかどうかを調べた。ＣＭＶタンパク質でパルス処理したＨＥＦ、ｍｏＤＣ、ｃＤＣ１、及びｈｉＤＣを、ＣＭＶ＋ドナーから単離したＣＤ８＋Ｔ細胞と共培養した。Ｔ細胞活性化の読み出しとして、ＩＦＮ－γ分泌を定量化した（図６Ｇ）。予想通り、ｃＤＣ１は、ｍｏＤＣまたはＨＥＦとは対照的に、ＣＤ８＋Ｔ細胞に対してＣＭＶ抗原を効率的に交差提示することが観察された。驚くべきことに、本発明者らは、サイトカインを伴ってまたは伴わずに生成されたｈｉＤＣがＣＤ８＋Ｔ細胞に抗原を交差提示する能力を確立したことを観察した。まとめると、これらのデータは、リプログラミングされたｈｉＤＣが機能的な交差提示ＤＣであることを裏付ける。
結論
まとめると、これらのデータは、ｃＤＣ１サブセットへのｈｉＤＣの帰属、ならびに炎症刺激に応答するそれらの獲得能力、死細胞の貪食、サイトカインの分泌、及び抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を可能にする抗原の交差提示を裏付けている。
実施例１０．ヒト成体体細胞の効率的なリプログラミング
ヒトのアクセス可能な細胞型からのｃＤＣ１の生成は、がん免疫療法のためのＤＣのさらなる供給源となり得る。したがって、本発明者らは、ＤＣリプログラミングプロトコールを改善することにより、ヒトの初代真皮線維芽細胞（ＨＤＦ）及び間葉系間質細胞（ＭＳＣ）をｃＤＣ１様細胞にリプログラミングしようと試みた。
方法
３人の健康なドナーからのＨＤＦを得て、ｃＤＣ１のリプログラミング効率について評価した。ＨＤＦ由来のｈｉＤＣについて単一細胞のトランスクリプトームを生成し、ＤＣサブセットの帰属にはｓｃＰｒｅｄ分析を使用した。３人の健康なドナーからの精製されたＭＳＣを、ＳＦＦＶ－ＰＩＢレンチウイルス粒子で形質導入し、化学的に定義された無血清Ｘ－ＶＩＶＯ １５培地中で培養した（図８Ａ）。細胞を、ｃＤＣ１リプログラミング効率について評価した。実験の詳細については先の実施例を参照されたい。
結果
ｈｉＤＣ生成の効率は、ＳＦＦＶ－ＰＩＢを使用するドナー全体で２０～３５％の範囲であった（図７Ａ～７Ｂ）。ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－β、及びＴＮＦ－αと組み合わせた場合に、リプログラミング効率は、約２倍に増加し（図７Ａ～Ｂ）、ＣＤ４０及びＣＤ８０の増加ももたらす（図７Ｃ）。ｓｃＰｒｅｄ分析により、サイトカインを伴う、及び伴わないＨＤＦ由来のｈｉＤＣのうち、それぞれ６０．６％及び５９．３％がｃＤＣ１サブセットに割り当てられた（図７Ｄ）。ｃＤＣ１の同定は、ｃＤＣ１特異的遺伝子Ｃ１ｏｒｆ５４及びＨＬＡ－ＤＰＡ１ならびに抗原処理及び提示遺伝子ＣＤ７４、ＨＬＡ－Ｃ、Ｂ２Ｍ、ＰＳＭＢ９、ＮＡＡＡ、及びＴＡＰ１（図７Ｅ～Ｆ）の発現によりさらに確認された。３人のドナーからのＭＳＣの６０～７５％は、ＣＤ４０及びＣＤ８０を共発現するｈｉＤＣ（ＣＤ４５＋ＨＬＡ－ＤＲ＋）に転換された（図８Ｂ～Ｄ）。ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－β、及びＴＮＦ－αは、ＭＳＣ培養物からのｈｉＤＣ１の生成をさらに改善しなかった。
結論
これらのデータは、ＰＵ．１、ＩＲＦ８、及びＢＡＴＦ３がヒト成人細胞とＭＳＣにおいてｃＤＣ１運命を誘導し、複数の細胞型とドナーにわたるリプログラミング方法の一貫性が浮き彫りになることを示唆している。ＭＳＣにサイトカインを添加する効果がないことは、炎症性サイトカインシグナル伝達により細胞型特異的にｃＤＣ１のリプログラミングが促進され得ることを示唆している。
実施例１１．インビボでの抗腫瘍免疫の誘導
本発明者らは、直接細胞リプログラミングによって生じたｉＤＣがインビボで機能するか否かを評価する関心があることを考慮して、マウス系を利用して、マウスｉＤＣ（Ｃｌｅｃ９ａ－ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターＭＥＦ由来、ｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞）が同系がんマウスモデルを用いて抗腫瘍免疫を誘導するか否かを調べた。
方法
抗原交差提示にアクセスするために、ＯＴ－Ｉマウスの脾臓由来のＣＤ８＋Ｔ細胞を、ナイーブマウスＣＤ８＋Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を用いて濃縮した。濃縮ＣＤ８＋Ｔ細胞を、室温で５μΜ Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ ＣＴＶ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で２０分間標識し、洗浄し、カウントした。ＦＡＣＳで選別された示された時点のｔｄＴｏｍａｔｏ＋（ＳＦＦＶ－ＰＩＢで生成）及びｃＤＣ１様ＢＭ－ＤＣを、ポリＩ：Ｃ（１μｇ／ｍｌ）の存在下で、ＯＶＡタンパク質（１０μｇ／ｍｌ）とともに３７℃で１０時間インキュベートした。広範囲の洗浄の後に、２０，０００個のＤＣを、１００，０００個のＣＴＶ標識ＯＴ－Ｉ ＣＤ８＋Ｔ細胞とともに、ポリＩ：Ｃ（１μｇ／ｍｌ）を有する９６ウェル丸底組織培養プレート中でインキュベートした。３日間の共培養の後、Ｔ細胞を回収し、染色し、ＢＤ ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａで分析した。Ｔ細胞の増殖（ＣＴＶ染色の希釈）を、生きた単一のＴＣＲ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞をゲーティングすることによって決定した。
マウスＩＦＮ－α及びＣｘｃｌ１０のレベルを、ＬＥＧＥＮＤｐｌｅｘマウス抗ウイルス応答パネル（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を使用して、９日目に精製されたｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞の培養物上清５０μｌにおいて評価した。ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）またはポリＩ：Ｃ（１μｇ／ｍｌ）を一晩添加した。取得はＦＡＣＳＣａｎｔｏで行い、データはＬＥＧＥＮＤｐｌｅｘ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）ソフトウェアを使用して分析した。
インビボでの実験の場合、Ｂ１６－ＯＶＡ（０．５×１０６）腫瘍細胞を、６～１０週齢のＣ５７Ｂｌ／６メスの左側腹部内に皮下注射した。９日目にＳＦＦＶ－ＰＩＢで生成したＦＡＣＳで選別されたｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞を、腫瘍移植前にＢ１６－ＯＶＡ細胞と混合した。代替的に、ｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞、ＳＦＦＶ－ＧＦＰ対照で形質導入したＭＥＦまたはＣＤ１０３＋ＢＭ－ＤＣを、腫瘍確立の後の８日目に、確立した腫瘍に腫瘍内注射した。前日に、細胞をＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）及びポリＩ：Ｃ（１μｇ／ｍｌ）で一晩かけて刺激した。注射の日に、細胞をＯＶＡ２５７－２６４ペプチド（５μｇ／ｍｌ）で３７℃で３０分間パルス処理した。ＰＢＳで２回洗浄した後、８０，０００個の細胞を６０μｌのＰＢＳに再懸濁し、Ｂ１６－ＯＶＡ腫瘍の移植後８日目に、それぞれの腫瘍担持マウスごとに腫瘍内注射した。腫瘍の大きさは、示された期間にわたって１～２日ごとにキャリパー［体積＝０．５×長さ×幅×高さ］で測定した。Ｔ細胞の浸潤及び活性化の評価のために、腫瘍担持動物へのｉＤＣの注射後、１．５×１０６のＣＴＶ標識ＯＴ－Ｉ ＣＤ８＋Ｔ細胞を静脈内注射した。４日後、動物を屠殺し、腫瘍及び腫瘍流入領域リンパ節を収集し、機械的及びコラゲナーゼＤ（１ｍｇ／ｍｌ）及びＤＮＡｓｅ Ｉ（１０ｍｇ／ｍｌ）により化学的に消化した。Ｐｅｒｃｏｌｌを用いて死細胞を排除した。細胞内サイトカイン分析のために、細胞を、ホルボール１２－ミリステート１３－アセテート（１００ｎｇ／ｍｌ）及びイオノマイシン（１μｇ／ｍｌ）の存在下で、コンプリートＲＰＭＩ培地中で、３７℃及び５％ＣＯ２で４時間再刺激した。ＧｏｌｇｉＰｌｕｇ溶液（１μｌ／ｍｌ）を最後の２．５時間、培地に加えた。細胞を固定可能な生細胞識別色素ＦＩＴＣで４℃で３０分間染色した。ＩＦＮ－γ及びグランザイムＢの細胞内染色を、細胞内固定＆透過処理バッファーセットを使用して行った。データは、Ｇａｌｌｉｏｓ及びＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａを使用して取得した。
結果
ｉＤＣは、リプログラミングの４日目及び６日目にすでに抗原交差提示を行うことができた（図９Ａ～９Ｂ）。さらに、精製されたｔｄＴｏｍａｔｏ＋ｉＤＣは、ｃＤＣ１媒介腫瘍拒絶に必須であると以前に記載されたＣｘｃｌ１０及びＩＦΝαを分泌した（図９Ｃ）（Ｄｉａｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。さらに、ｉＤＣとの共注射は、腫瘍形成の間に腫瘍の増殖を減少させることが観察された（図９Ｄ）。注目すべきことに、確立された腫瘍に８０，０００のｉＤＣの単一の腫瘍内注射だけで腫瘍の増殖を遅らせるのに十分であった（図９Ｅ）。リプログラミングされていないＭＥＦ及びＣＤ１０３＋ＢＭ－ＤＣの腫瘍内注射は、腫瘍の増殖を制御するのにそれほど効率的ではなかった。さらに、ｉＤＣの注射は、腫瘍内の抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の浸潤を増加させ、両方のモデルにおける腫瘍流入領域リンパ節のＴ細胞の細胞傷害性プロファイルの増加を促進した（図９Ｆ）。
結論
これらのデータは、ｉＤＣが抗腫瘍免疫応答を誘導するという仮説を裏付けている。まとめると、これらのデータは、ｉＤＣが抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化し、それらの腫瘍内への浸潤を促進することにより腫瘍の増殖を制御することを示唆している。
実施例１２．効率的なＤＣリプログラミングには、ＰＵ．１、ＩＲＦ８、及びＢＡＴＦ３の組み合わせ作用が必要である
本発明者らは、ＰＵ．１、ＩＲＦ８、及びＢＡＴＦ３を介したＤＣリプログラミングの基礎となる分子機構に光を当てるために、ＨＤＦを３つのリプログラミング因子を同時にまたは各々個別にコードするＤＯＸ誘導性レンチウイルス粒子で形質転換し、ＴＦ導入４８時間後、ＰＵ．１、ＩＦ８、及びＢＡＴＦ３についてＣｈＩＰ－ｓｅｑを行った（図１０Ａ）
方法
ＣｈＩＰ配列決定
ＴＦを、ｐＦＵＷ－Ｍ２ｒｔＴＡを有するポリシストロニックレンチウイルスベクター（ｐＦＵＷ－ｔｅｔＯ－ＰＩＢ）または個々のベクター（ｐＦＵＷ－ｔｅｔＯ－ＰＵ．１、ｐＦＵＷ－ｔｅｔＯ－ＩＲＦ８、またはｐＦＵＷ－ｔｅｔＯ－ＢＡＴＦ３）で送達した。ＣｈＩＰを、Ｄｏｘの添加の４８時間後に実施した。
培養細胞のクロマチンを、新たに調製したホルムアルデヒド溶液［１１％ホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ）、０．１ＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ及び５０ｍＭのＨＥＰＥＳ］の１／１０体積を、コンプリートＤＭＥＭ中のそれぞれの細胞懸濁液に加えることによって固定した。撹拌しながらチューブを室温で１５分間放置した。２ｍＭグリシン溶液（Ｓｉｇｍａ）１／２０体積を添加することにより、固定を停止した。５分間のインキュベーション後に、細胞を４℃で１０分間８００ｇで遠心分離した。細胞ペレットを１０ｍｌの冷却したＰＢＳ－Ｉｇｅｐａｌに再懸濁し、１００μｌのＰＭＳＦをそれぞれのチューブに加え、４℃で１０分間、８００ｇで遠心分離した。細胞ペレットをドライアイスでスナップ凍結し、－８０℃で保存した。Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）によりクロマチンを調製し、ＣｈＩＰを実行し、ライブラリを生成し、ライブラリを配列決定した。簡潔に述べると、溶解緩衝液の添加及びＤｏｕｎｃｅホモジナイザーでの破壊により、クロマチンを単離した。溶解液を超音波処理し、ＤＮＡを３００～５００ｂｐの平均長さにせん断した（Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ’ｓ ＥｐｉＳｈｅａｒプローブソニケーター）。ゲノムＤＮＡ（入力）を、クロマチンのアリコートをＲＮａｓｅ、プロテイナーゼＫ、及び熱で処理して脱架橋させ、続いて固相可逆固定化（ＳＰＲＩ）ビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して洗浄し、続いてＣｌａｒｉｏｓｔａｒ（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）により定量化することにより調製した。元のクロマチン体積への外挿は全クロマチン収量の決定を可能にした。３０μｇのクロマチンを、タンパク質Ａ／Ｇアガロースビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で前処理した。ヒトＰＵ．１、ＩＲＦ８、及びＢＡＴＦ３に対して４μｇの抗体（ウサギ抗ヒトＰＵ．１、ウサギ抗ヒトＩＲＦ８またはヒツジ抗ヒトＢＡＴＦ３）を用いて免疫沈降を実施した。複合体を洗浄し、ＳＤＳ緩衝液でビーズから溶出し、ＲＮａｓｅ及びプロテイナーゼＫ処理にかけた。６５℃で一晩、インキュベーションにより架橋を戻し、フェノール－クロロホルム抽出及びエタノール沈降によりＣｈＩＰ ＤＮＡを精製した。ＣｈＩＰ濃縮を確認するために、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して、特定のゲノム領域について定量的ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）反応を３回繰り返し行った。得られたシグナルを、入力ＤＮＡを使用してそれぞれのプライマー対に対してＱＰＣＲを行うことによりプライマー効率に関して正規化した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定ライブラリを、末端研磨、ｄＡ付加、及びアダプターライゲーションの標準の連続酵素ステップによりＣｈＩＰ及びＩｎｐｕｔ ＤＮＡから調製した。自動化されたシステム（Ａｐｏｌｌｏ ３４２、Ｗａｆｅｒｇｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／Ｔａｋａｒａ）でステップを行った。最終のＰＣＲ増幅ステップ後、得られたＤＮＡライブラリを、ＩｌｌｕｍｉｎａのＮｅｘｔＳｅｑ５００上で定量化し、配列決定した（７５ｎｔの読み取り、単一末端）。
ＣｈＩＰ配列決定解析及びデータの視覚化
ＣｈＩＰ－ｓｅｑ分析を、生のＦＡＳＴＱファイルについて実施した。ＦＡＳＴＱファイルを、Ｂｏｗｔｉｅ ２プログラムを使用して２塩基対のミスマッチを許容するヒトｈｇ３８ゲノムにマッピングした。マッピングされた出力ファイルを、ピークを決定するためにＭＡＣＳ ｖ２．１．０分析ソフトウェアを通じて処理した。ピーク注釈は、ＣｈＩＰｓｅｅｋｅｒ Ｒライブラリを使用して実行した。ゲノムトラックについては、ｄｅｅｐｔｏｏｌｓ（ｈｔｔｐｓ：／／ｄｅｅｐｔｏｏｌｓ．ｒｅａｄｔｈｅｄｏｃｓ．ｉｏ／ｅｎ／ｄｅｖｅｌｏｐ／）を使用してｂａｍファイルからｂｉｇｗｉｇファイルを作成し、ＵＣＳＣゲノムブラウザを使用して調査した。クロマチン状態倍率濃縮分析については、ＰＵ．１、ＩＲＦ８、及びＢＡＴＦ３ ＣｈＩＰ－ｓｅｑのピーク及びヒストンマークなどのゲノム特徴に関する濃縮スコアを、ＣｈｒｏｍＨＭＭ Ｏｖｅｒｌａｐ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ（ｈｔｔｐ：／／ｃｏｍｐｂｉｏ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ＣｈｒｏｍＨＭＭ／）を使用して計算した。１８個の異なるクロマチン状態を含むＣｈｒｏｍＨＭＭセグメンテーションを、Ｒｏａｄｍａｐウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｏａｄｍａｐｅｐｉｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ）からダウンロードし、分析に使用した。濃縮スコアを、それぞれの特徴及びクロマチン状態についての観察された重なりと予想される重なりとの間の比として、それらのサイズ及びヒトゲノムのサイズに基づいて計算した。デノボモチーフの発見のために、ＨＯＭＥＲからのｆｉｎｄＭｏｔｉｆｓＧｅｎｏｍｅ．ｐｌ手順を、ＰＵ．１、ＩＲＦ８、及びＢＡＴＦ３で個別に使用した。ＨＯＭＥＲを、デフォルトパラメータと、トップ２５００のピークの中心から＋／－１００ｂｐを含む入力配列とを使用して実行した。ＰＵ．１、ＩＲＦ８、及びＢＡＴＦ３による共結合領域が、ＣｈＩＰｐｅａｋＡｎｎｏ Ｒライブラリ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｍｅｄｃｅｎｔｒａｌ．ｃｏｍ／１４７１－２１０５／１１／２３７）の中の回路ｆｉｎｄＯｖｅｒｌａｐｓＯｆＰｅａｋｓ関数を用いて見出された。共結合領域を、ＨＯＭＥＲを使用するデノボｍｏｔｉｆ発見に使用した。交差点に基づいて２つのセットの類似性を評価するために、本発明者らは、ＭＡＣＲＯ－ＡＰＥ（ｈｔｔｐｓ：／／ｏｐｅｒａ．ａｕｔｏｓｏｍｅ．ｒｕ／ｍａｃｒｏａｐｅ／ｃｏｍｐａｒｅ）を使用してＪａｃｃａｒｄ統計を計算した。ヒートマップ及びプロファイルプロットを作成するために、それぞれの特徴（例えばＴＦのピークまたはヒストンマーク）がＰＵ．１、ＩＲＦ８、またはＢＡＴＦ３の頂点に位置合わせされ、隣接する上流領域及び下流領域が±４ｋｂ以内にタイル状に並べられた基準点モードのｄｅｅｐｔｏｏｌｓを使用した。
免疫共沈降（Ｃｏ－ＩＰ）
プロテアーゼ阻害剤［１×Ｈａｌｔプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、１ｍＭのＰＭＳＦ、５ｍＭのＮａＦ］を補充したＩＰ溶解緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）中の３つの細胞密度（１００万個、２００万個、５００万個の細胞）において、ＳＦＦＶ－ＰＩＢでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞から全細胞抽出物を調製した。ＣｈＩＰグレードのタンパク質Ａ／Ｇ磁気ビーズを、５μｇのそれぞれの抗体（ウサギ抗ヒトＰＵ．１、ウサギ抗ヒトＩＲＦ８、またはヒツジ抗ヒトＢＡＴＦ３）と一緒に２時間インキュベートした。細胞溶解物を、抗体処理されていないＣｈＩＰグレードのタンパク質Ａ／Ｇビーズで１時間にわたり前処理し、次いで１時間にわたり抗体処理ビーズとともにインキュベートした。上清を除去し、ビーズを０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０洗剤（ＴＢＳＴ）を含むＴｒｉｓ緩衝生理食塩水を用いて３回洗浄した。インプット対照は、非免疫沈降試料の１０％（２００万細胞密度）を使用して行った。対照として、溶解物（２００万細胞密度）を５μｇのウサギＩｇＧアイソタイプ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で免疫沈殿させた。試料をＬａｅｍｍｌｉ試料緩衝液中で沸騰により溶出させ、ウェスタンブロッティングのために処理した。免疫ブロッティングのために、膜を３％のミルクを含むＴＢＳＴ緩衝液でブロッキングし、一次抗体で一晩インキュベートし、０．１％のＴｗｅｅｎ ２０洗剤（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳで５回洗浄し、３％のミルクを含むＴＢＳＴ緩衝液で４５分間ブロッキングし、ＨＲＰ共役二次抗体で１時間インキュベートし、ＰＢＳＴで４回洗浄し、次いでＣｈｅｍｉｄｏｃ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）中でＥＣＬ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により検出した。
結果
ｃＤＣ１リプログラミングにおけるＰＵ．１ドミナントクロマチン標的化能力
本発明者らは、ＰＵ．１、ＩＲＦ８、及びＢＡＴＦ３を介したＤＣリプログラミングの基礎となる分子機構に光を当てるために、３つのリプログラミング因子を組み合わせで、または個別にＨＤＦで発現し、リプログラミングの初期段階（４８時間、図１０Ａ）でクロマチン免疫沈降配列決定（ＣｈＩＰ－ｓｅｑ）を行った。まず、因子を共発現させた場合、ＰＵ．１は最も高いクロマチン結合（７５，５９３ピーク）を示し、それに続いてＩＲＦ８（１８，９６２ピーク）及びＢＡＴＦ３（１１，５０５ピーク）が示された（図１０Ｂ）。興味深いことに、ＰＵ．１結合ピークの４０％超が、個々の発現と組み合わされた発現との間で類似していることが観察され、ＰＵ．１は、ＩＲＦ８及びＢＡＴＦ３が利用可能な場合に増強される独立した標的化能力を有することが示唆された。非常に対照的に、これらの転写因子が個々に発現した場合、ＩＲＦ８及びＢＡＴＦ３のピークは少なく（組み合わされた発現と比較してピークの３％未満）、ＩＲＦ８及びＢＡＴＦ３は、クロマチンに結合してｃＤＣ１運命を誘導するためにＰＵ．１と協調結合する必要があることを示唆している。ＰＵ．１ピークのデノボモチーフ予測分析は、個々にまたは組み合わせて発現した場合に、ＰＵ．１モチーフに対して強い濃縮を示した（図１０Ｃ）。ＩＲＦ８及びＢＡＴＦ３は、それぞれ個々に発現すると、それぞれＩＲＦ及びＡＰ－１モチーフの濃縮を示したが、ＰＵ．１モチーフは、組み合わせて発現する場合、これらの転写因子に対して非常に濃縮された。これらのデータは、ヒト骨髄細胞及びリンパ系細胞においてパートナー転写因子を再分布させることができる非古典的な先駆的な転写因子としてのＰＵ．１を記載した最近の知見に沿ったものであり（Ｍｉｎｄｅｒｊａｈｎ ｅｔ ａｌ．２０２０）、ｃＤＣ１リプログラミングの初期段階での転写因子協調運動性を浮き彫りにしている。
オープンクロマチンにおけるプロモーター及びエンハンサーでのＰＵ．１、ＩＲＦ８、及びＢＡＴＦ３の協調的結合
次に、本発明者らは、ＰＵ．１、ＩＲＦ８、及びＢＡＴＦ３クロマチン標的間の重複を調べた。３つのリプログラミング因子が一緒に発現されると５，３８３個のゲノム位置がそれらの因子間で共有され、それぞれＩＲＦ８及びＢＡＴＦ３の全ピークの２８％及び４７％を表す（図１１Ａ）。ＰＩＢ重複ピークについてのデノボモチーフ予測は、ＰＵ．１－ＩＲＦ及びＢＡＴＦモチーフについての濃縮を示し（図１１Ｂ）、これらもいくつかの重複及び類似性を示した（Ｊａｃｃａｒｄ類似度指数＝０．０２）（図１１Ｃ）。これらのデータは、ＰＵ．１、ＩＲＦ８、及びＢＡＴＦ３が物理的に相互作用することを示唆している。この仮説を検証するために、免疫共沈降（ｃｏ－ＩＰ）を行い、３つの因子間の相互作用を確認した（図１１Ｄ）。次に、リプログラミング因子の少なくとも１つによって結合したＨＤＦとｈｉＤＣ ｄ９との間の差次的に発現する遺伝子をプロットし、それらが下方制御された線維芽細胞遺伝子と、ＳＬＡＭＦ８及びＴＡＣＳＴＤ２を含む上方制御されたｃＤＣ１関連遺伝子との両方を含むことが観察された（図１１Ｅ）。ＰＵ．１、ＩＲＦ８、及びＢＡＴＦ３結合がオープンまたはクローズドクロマチン領域で生じるかどうかを調べるために、本発明者らは、公的に利用可能なＣｈＩＰ－ｓｅｑデータセットをＨＤＦ中のヒストンマークに対して利用し、ＣｈｒｏｍＨＭＭクロマチン分割（Ｅｒｎｓｔ ａｎｄ Ｋｅｌｌｉｓ ２０１２）を視覚化のために用いた。ＰＩＢ共結合ピークは、主にプロモーター及びエンハンサー領域で濃縮されていることが観察された（図１１Ｆ）。Ｈ３Ｋ４ｍｅ１、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３、及びＨ３Ｋ２７ｍｅ３、またはＨ３Ｋ４ｍｅ１及びＨ３Ｋ２７ｍｅ３のいずれかでマークされた二価クロマチンに関連するピークの小さな割合（１２％）も観察された。
結論
まとめると、我々のデータは、ＰＵ．１が主にオープンクロマチン部位に位置する活性プロモーター及びエンハンサーに結合し、ＩＲＦ８及びＢＡＴＦ３を動員し、元の線維芽細胞遺伝子をサイレンシングし、ｃＤＣ１転写プログラムを徐々に課すモデルを支援する（図１１Ｇ）。
実施例１３．マウス及びヒトのがん細胞の効率的なＤＣリプログラミング
本発明者らは、ＰＵ．１、ＩＲＦ８、及びＢＡＴＦ３の異所性発現が、マウス及びヒトの線維芽細胞にｃＤＣ１様の運命を誘導することを考慮して、がん細胞におけるＴＦの同一の組み合わせの強制発現は、それらを抗原提示ｃＤＣ１に変換し、腫瘍免疫の主要な問題の１つである抗原提示機構の喪失を上回ると仮定した。
方法
がん細胞リプログラミング
がん細胞株を６ウェルプレートに６００００細胞／ｍＬの密度で播種し、ポリブレン（８μｇ／ｍＬ）を補充したＳＦＦＶ－ＰＩＢ－ＧＦＰレンチウイルス上清とともに一晩インキュベートした。培養期間にわたって、２日ごとに培地を交換した。細胞が８０～９０％コンフルエントに達するたびに、１０ｃｍプレート上で１：６の希釈で細胞を播種した。フローサイトメトリーを用いて、マウス及びヒトのがん細胞のＤＣリプログラミング効率を調べた。
Ｔ細胞プライミング及び抗原交差提示アッセイ
ＯＴ－Ｉマウスの脾臓由来のＣＤ８＋Ｔ細胞を、ナイーブマウスＣＤ８＋Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を用いて濃縮した。濃縮されたＣＤ８＋Ｔ細胞を、製造業者のプロトコールに従ってＣＴＶで標識した。ＭＡＣＳで選別したリプログラミングされた細胞、リプログラミングされていないがん細胞、ｅＧＦＰで形質導入されたがん細胞、及びＣＤ１０３＋ＢＭ－ＤＣを、ＯＶＡペプチド（ＳＩＩＮＦＥＫＬ、Ｔ細胞プライミングアッセイ）またはタンパク質（交差提示アッセイ）とともに３７℃でインキュベートした。ＯＶＡ発現細胞は、外因性ＯＶＡとともにインキュベートしなかった。示されている場合には、ポリ（Ｉ：Ｃ）またはＩＦＮ－γの存在下で細胞を一晩インキュベートした。５×１０３個の抗原提示細胞を、９６ウェル丸底の未処理の組織培養プレート中で、１×１０５個のＣＴＶ標識ＯＴ－Ｉ ＣＤ８＋Ｔ細胞とともにインキュベートした。３日間の共培養の後、Ｔ細胞を収集し、生存率（固定可能な生細胞識別色素ｅＦｌｕｏｒ－５２０、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ８α、ＴＣＲ－β、及びＣＤ４４について染色し、フローサイトメトリーによって分析した。Ｔ細胞の増殖（ＣＴＶの希釈）及び活性化（ＣＤ４４発現）を、生きた単一のＴＣＲ－β＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞をゲーティングすることによって決定した。データプロットのための閾値は、生きた細胞ゲーティング内で１０００個のイベントで固定された。
Ｔ細胞殺傷アッセイ
ＯＴ－Ｉマウスの脾臓由来のＣＤ８＋Ｔ細胞を、製造業者のプロトコールに従ってマウスＣＤ８＋Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して濃縮した。６ウェルの未処理プレートに抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８を２×１０－３ｍｇ ｍＬ－１で２時間、３７℃でコーティングし、３回洗浄した後、１ｍＬ当たり１×１０６のＴ細胞を、マウスＩＬ－２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、１００Ｕ ｍＬ－１）及びマウスＩＬ－１２ｐ７０（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、２．５×１０－３ｍｇ ｍＬ－１）で補充したコンプリート増殖培地（ＲＰＭＩ）に播種した。２４時間の活性化の後、Ｔ細胞を、マウスＩＬ－２を補充した新たなコンプリートＲＰＭＩ中の１×１０６細胞／ｍＬで新たな未処理プレート上に４８時間再び播種して、Ｔ細胞の拡大を可能にした。ＭＡＣＳで選別されたリプログラミングされたｍＯｒａｎｇｅ＋Ｂ１６－ＯＶＡ細胞またはＩＦＮ－γで処理された細胞を、蛍光を発しないＢ１６－ＯＶＡ（ｍＯｒａｎｇｅ－）で同じ数で播種し、その２４時間後Ｔ細胞と共培養した。拡大したＴ細胞を、０：１、１：１、５：１、１０：１のＴ細胞対標的細胞の比で添加した。ＯＶＡを発現しないＢ１６細胞を用いてアッセイ特異性を評価した。フローサイトメトリー分析のために、細胞を再懸濁し、生存率（ＤＡＰＩ）及び抗ＣＤ３について染色し、Ｔ細胞との共培養後の指定された時点で測定した。
腫瘍誘発及び注射
Ｂ１６－ＯＶＡ腫瘍は、２～５×１０５腫瘍細胞の６週齢～１０週齢のＣ５７ＢＬ／６メスの右側腹部内へ皮下注射によって確立された。リプログラミングされた腫瘍－ＡＰＣを、Ｂ１６をＳＦＦＶ－ＰＩＢで形質導入することによって生成させた。形質導入５日後及び腫瘍確立７日目後、１０日目後、及び１３日目後に、腫瘍－ＡＰＣを抗ＭＨＣ－ＩＩ抗体を含むＭＡＣＳで精製し、２×１０５～３×１０５細胞を、１００μＬのＰＢＳに再懸濁し、腫瘍内注射した。ＰＢＳまたは対照のレンチウイルスで形質導入した細胞を対照として腫瘍に注入した。注射前２４時間、腫瘍細胞または腫瘍－ＡＰＣをポリ（Ｉ：Ｃ）で刺激し、ＯＶＡで負荷した。マウスは、生存について追跡し、腫瘍のサイズを、終端点まで腫瘍形成後２日ごとにキャリパーで測定した［体積＝π／６×Ｌ×Ｗ×Ｈ］。マウスは、腫瘍が体積１５００ｍｍ３を超えると屠殺した。
結果
まず、ＳＦＦＶ－ＰＩＢ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰレンチウイルス上清を使用して、３ＬＬ及びＢ１６、それぞれマウス肺腺癌及び黒色腫細胞においてＰＩＢを過剰発現させた。両方のマウスがん細胞株は、Ｃ５７ＢＬ／６背景に由来し、腫瘍免疫のための同系マウスモデルで広く使用されている。形質導入後９日目にＭＨＣ－ＩＩ及びＣＤ４５の二重陽性集団の出現が観察された（図１２Ａ）。最近のＣＲＩＳＰＲスクリーニングアプローチは、抗腫瘍免疫及び細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）感受性の解除におけるＩＦＮ－γシグナル伝達の重要性を浮き彫りにしている。興味深いことに、ＩＦＮ及びＳＴＩＮＧ経路の遺伝子シグネチャが、ＰＩＢで形質導入されたＢ１６とＬＬＣ細胞の両方で上方制御され（図１２Ｂ）、リプログラミングの間に得られた免疫原性プロファイルを示唆している。本発明者らは、腫瘍－ＡＰＣが免疫原性を発現し、内因性発現抗原を提示するかどうかをさらに調べるために、オボアルブミン（ＯＶＡ）を発現するＢ１６細胞株（Ｂ１６－ＯＶＡ）を利用した。磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）濃縮ＣＤ４５＋ＭＨＣ－ＩＩ＋ＯＶＡ発現腫瘍ＡＰＣを、ナイーブＯＴ－Ｉ ＣＤ８＋Ｔ細胞と共培養してプライミングを評価した。対照のｅＧＦＰ導入Ｂ１６－ＯＶＡ及びＬＬＣ－ＯＶＡ細胞は、ＩＦＮ－γまたはＰ（Ｉ：Ｃ）刺激後に低いＯＶＡ抗原提示能力を示したが、腫瘍－ＡＰＣは、ＩＦＮ－γまたはＰ（Ｉ：Ｃ）処理に依存せずに、ナイーブＯＴ－Ｉ ＣＤ８＋Ｔ細胞をプライミングするのに著しく効率的であった（図１２Ｃ）。次に、腫瘍－ＡＰＣがＣＴＬ殺傷を起こしやすくなるか否かを評価するために、蛍光タンパク質ｍＯｒａｎｇｅを発現するＢ１６－ＯＶＡ細胞を利用した。腫瘍－ＡＰＣを生成するか、またはＩＦＮ－γ（標的、ｍＯｒａｎｇｅ＋）で処理したＢ１６－ＯＶＡ細胞を、未処理のＢ１６－ＯＶＡ細胞（非標的、ｍＯｒａｎｇｅ－）と混合し、３日間共培養し、活性化ＯＴ－Ｉ ＣＤ８＋Ｔ細胞の比率を増加させた。まず、腫瘍－ＡＰＣは、未処理のＢ１６－ＯＶＡ細胞よりもＣＤ８＋Ｔ細胞に殺傷されやすいことが観察された（図１２Ｄ）。さらに、腫瘍－ＡＰＣは、特に低い（１：１）比でのＩＦＮ－γ刺激Ｂ１６－ＯＶＡ細胞（１２．３１±７．１％）よりもＴ細胞（４２．４２±６．２％）により効率的に殺傷された。興味深いことに、標的集団ではない集団が腫瘍－ＡＰＣ共培養において、より高いＴ細胞対標的細胞比及びより後の時点（７２時間）で殺傷されることも観察された。こうしたバイスタンダー殺傷効果は、リプログラミングされた細胞によるＴ細胞の持続的な活性化を反映している可能性があり、非標的がん細胞のクリアランスを増大させることができる。次に、本発明者らは、ＯＶＡタンパク質を用いたパルス処理後の腫瘍－ＡＰＣの交差提示を評価した。驚くべきことに、腫瘍－ＡＰＣはＣＤ８＋Ｔ細胞に抗原を交差提示する能力を確立し、これはＴＬＲ３刺激によってさらに強化される（６３．５±８．５対２７．５±２０．９％）ことが観察された（図１２Ｅ）。次いで本発明者らは、ＯＶＡで負荷された腫瘍－ＡＰＣが、確立されたＢ１６－ＯＶＡ腫瘍における腫瘍内注入後にインビボで腫瘍増殖制御を誘発するか否かを調べた（図１２Ｆ）。注目すべきことに、腫瘍－ＡＰＣの注射は、ＰＢＳまたは対照ウイルスを注射したマウスと比較した場合、腫瘍増殖の減少と生存率の大幅な改善をもたらした（図１２Ｇ～Ｈ）。
次に、ｃＤＣ１運命がヒトがん細胞に直接誘導され得るかどうかを評価するために、ＰＵ．１、ＩＲＦ８、及びＢＡＴＦ３の発現を２８株のヒト癌細胞株のパネルで実施した。９日後、造血拘束性及び抗原提示能力を反映する、ＣＤ４５及びＨＬＡ－ＤＲを同時に発現する形質導入ＥＧＦＰ＋細胞のパーセンテージとしてのリプログラミング効率を評価した（図１３Ａ～Ｂ）。ｈＰＩＢ－ＩＲＥＳ－ＥＧＦＰで形質導入されたすべての細胞株で、リプログラミングされたＣＤ４５＋ＨＬＡ－ＤＲ＋細胞の出現が観察されたが、ＥＧＦＰ形質導入対照では観察されず、ｃＤＣ１リプログラミングがヒトがん細胞に広く適用できることを示唆した。さらに、これらのデータから、ｃＤＣ１のリプログラミング効率は、形質導入レベル及び増殖速度とは無関係に、がん細胞株全体にわたって、０．２±０．１％～９４．５±７．６％の範囲にあることが判明した。興味深いことに、肺癌及び乳癌由来のがん細胞株では低いリプログラミング効率にもかかわらず、ＣＤ４５またはＨＬＡ－ＤＲ発現のいずれかを獲得した大きな細胞集団が検出されたが、これは、樹状細胞の特徴を獲得した部分的にリプログラミングされた細胞を表す可能性がある（図１３Ａ～図１３Ｂ）。ヒト癌細胞由来ＣＤ４５＋ＨＬＡ－ＤＲ＋細胞は、ＣＬＥＣ９Ａ（５９．１±３．６％）、ＣＤ２２６（６７．５±１．８％）及びＣＤ１１ｃ（５４．４±３．６％）を含むｃＤＣ１表面マーカーを発現した（図１３Ｃ）。ナイーブＴ細胞の生産的な活性化が共刺激分子の発現を必要とすることを考慮して、ＣＤ４０、ＣＤ８０、及びＣＤ８６の表面発現を評価した。ヒトがん細胞由来ＣＤ４５＋ＨＬＡ－ＤＲ＋細胞は、これらの共刺激分子を４日目から始まって９日目まで徐々に増加させて発現させた。重要なことに、腫瘍－ＡＰＣは、ＴＬＲ３／４トリガに応答し（ＬＰＳ及びポリＩ：Ｃ）、特にＣＤ４０において、共刺激分子の表面発現を増加させる（８８．２±３．８％対３１．３±１．８％）（図１３Ｄ、Ｅ）。
腫瘍－ＡＰＣを療法に変換するための重要な考慮事項は、リプログラミングがヒト原発性がん細胞において誘発され得るかどうかである（図１３Ｆ、Ｇ）。原発性がん細胞のｃＤＣ１リプログラミングを検証するために、黒色腫、肺癌、扁桃癌、舌癌、膵臓癌、乳癌及びＰＤＸ由来の膀胱癌ならびに肺癌関連線維芽細胞（ＣＡＦ）を有する患者から得られた７つの異なる腫瘍から１７個の試料を採取した。ｈＰＩＢによる形質導入の際に、すべての原発性がん細胞が主要な表現型変化を示し、ＣＤ４５及びＨＬＡ－ＤＲの発現を開始すると、リプログラミングが反映された。リプログラミング効率は、０．６％±０．４～４７．０％±２．０の範囲であった。同じ腫瘍タイプからの試料は、同様の表現型プロファイルを示し、患者間で比較的小さいばらつきを示した。興味深いことに、細胞株のパネルと比較した場合、初代細胞は、肺癌細胞株（０．５％±０．１）及び初代細胞（４７．０％±２．０）によって示されるように、リプログラミングに対する耐性が低かった。これらのデータは、リプログラミングを制限するエピジェネティックな障壁は、初代細胞では強化されていないことを示唆しており、ヒト腫瘍に対するｃＤＣ１リプログラミングの広い適用可能性への道を開いている（図１３Ｆ、Ｇ）。
結論
これらのデータは、ＰＵ．１、ＩＲＦ８、及びＢＡＴＦ３がマウス及びヒトのがん細胞を、腫瘍抗原を提示し、抗腫瘍免疫応答を誘導することができるｃＤＣ１様細胞にリプログラミングし得るという仮説を裏付けている。本発明者らはまた、ｃＤＣ１へのリプログラミングは、種及び組織を横断して保存されており、患者からの初代がん細胞から実現可能であることを検証した。
実施例１４．エピジェネティックな修飾剤は、ｃＤＣ１のリプログラミング効率を増強する。
本発明者らは、ＰＵ．１、ＩＲＦ８、及びＢＡＴＦ３の異所性発現が、転写及びエピジェネティックな変化を強いることによって、非関連細胞型においてｃＤＣ１様の運命を誘導することを考慮して、エピジェネティック修飾剤、すなわちヒストン脱アセチル化酵素阻害によって、ｃＤＣ１のリプログラミングの効率を高めることができるものと仮説を立てた。
方法
ＡＴＡＣ－ｓｅｑライブラリ調製
リプログラミングにより誘導されるエピジェネティックな変化を調べるために、ＦＡＣＳで所定の集団から５，０００～１０，０００個の細胞を分離し、処理して配列決定ライブラリを調製した。品質は、高感度ＤＮＡチップ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して評価され、ライブラリは、ＮｅｘｔＳｅｑ ５００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）上でＮｅｘｔＳｅｑ ５００／５５０ Ｈｉｇｈ Ｏｕｔｐｕｔ Ｋｉｔ（１５０サイクル）を使用して配列決定された。
ＡＴＡＣ－ｓｅｑデータ分析
合計で１，３８４，５９２，９２６個のＡＴＡＣ－ｓｅｑ読み取りを得て、約４６７０万個の読み取りのメジアン試料カバレッジを得た。Ｉｌｌｕｍｉｎａユニバーサルアダプターを除去するために、アダプター除去モードを設定してＮＧｍｅｒｇｅ６１を使用した。読み取りを、ＨＩＳＡＴ２ ｖ２．０．４６２を使用してＧＲＣｈ３８参照ゲノムに以下のパラメータ：－－ｖｅｒｙ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ －ｋ ２０でマッピングした。ピーク呼出しは、Ｇｅｎｒｉｃｈ（ｖ０．６．１、ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｊｓｈ５８／Ｇｅｎｒｉｃｈで入手可能、パラメータ：－ｍ ３０ －ｊ －ｙ －ｒ －ｅ ｃｈｒＭ）によってそれぞれの試料に対して個別に実行された。すべての試料についての組み合わされたピークリストを、ＰＥＰＡＴＡＣｒ Ｒライブラリを使用することによって得た。最後に、ｂｅｄｔｏｏｌｓ ｍｕｌｔｉｃｏｖ５６で組み合わされたピークリストの読み出し回数を計算した。得られた読み取りカウントをＲパッケージＤＥＳｅｑ２５２で処理し、ＲＬＥ法を用いて正規化した。ＰＣＡは、ＤＥＳｅｑ２パッケージからのｐｌｏｔＰＣＡ関数を用いて実施した。ピーク注釈にはＣｈＩＰｓｅｅｋｅｒ Ｒライブラリ６４を使用した。一般的なクロマチン変化をマッピングするために、腫瘍－ＡＰＣ遺伝子発現シグネチャについて記載されているＡＴＡＣ－ｓｅｑデータの修正された手順を使用した。簡潔に述べると、腫瘍－ＡＰＣシグネチャに由来する個々の遺伝子に関連するそれぞれのピークについて、９日目と０日目との間の平均差を算出し、これを、個々の表現型／リプログラミングの時点について、ｃＤＣ１と０日目との間の差に合わせて正規化した。その後、本発明者らは、リプログラミングのそれぞれの表現型／時点について個別に、正規化ピーク値の中央値を取得し、プロットした。ゲノムトラックについては、ｄｅｅｐｔｏｏｌｓによりｂａｍファイルからｂｉｇｗｉｇファイルが作成された。ＷａｓｈＵエピゲノム型ブラウザを使用してゲノムトラックを調査した。モチーフの発見のために、デフォルトパラメータでＨＯＭＥＲ６７からのｆｉｎｄＭｏｔｉｆｓＧｅｎｏｍｅ．ｐｌ手順を差次的ＡＴＡＣ－ｓｅｑピークに使用した。差次的ＡＴＡＣ－ｓｅｑピークについての機能濃縮分析を、ＧＯ生物学的プロセスオントロジーを使用してＧｒｅａｔ ｓｏｆｔｗａｒｅ６８によって行った。
リプログラミング効率におけるエピジェネティック修正剤の効果の評価
対照としてがん細胞株をＰＩＢ－ＩＲＥＳ－ＥＧＦＰレンチウイルス粒子またはＥＧＦＰで形質導入し、リプログラミング１日目から４日目までＶＰＡの存在下または非存在下で培養し、ＣＤ４５＋、及びＭＨＣ－ＩＩまたはＨＬＡ－ＤＲの表面発現により、リプログラミング９日目の生きたＥＧＦＰ＋細胞でのフローサイトメトリーによりリプログラミング効率を定量化した。その後、リプログラミングされた細胞を、先に記載したように分析した。
結果
転写レベル及びエピジェネティックレベルでのヒトがん細胞リプログラミングの動態をマッピングするために、経時変化に沿ってリプログラミングされた（ＣＤ４５＋ＨＬＡ－ＤＲ＋）及び部分的にリプログラミングされた（ＣＤ４５－ＨＬＡ－ＤＲ＋）Ｔ９８Ｇ細胞を、ｍＲＮＡ配列決定及びトランスポザーゼアクセス可能クロマチン（ＡＴＡＣ）配列決定についてのアッセイを用いてプロファイルした（図１４Ａ）。ＰＣＡは、すべてのリプログラミングステージ（３日目、５日目、７日目、及び９日目）を親細胞から分離し、７日目及び９日目は、最も天然のｃＤＣ１にマッピングし、ｃＤＣ１転写プログラムの漸進的な取得を示した（図１４Ｂ）。これに一致して、部分的にリプログラミングされた細胞は、経時変化において遅延し、これらの細胞がリプログラミングを成功させる途中にあるという概念を裏付けた。興味深いことに、ヒト胚線維芽細胞（ＨＥＦ）のリプログラミングは、同様のリプログラミング軌跡に従い（図１４Ｂ）、悪性及び非がん性初代細胞全体でリプログラミングダイナミクスが保存されていることを示している。差次的オープンクロマチン領域のＰＣＡは、エピジェネティックリモデリングが迅速に発生し、０日目と３日目との間に大きな変化（６２％の変動）を伴い、その後の時点（３日目、５日目、７日目、９日目）で微調整を行い、細胞をｃＤＣ１のオープンクロマチンパターンに近づけたことを実証した（図１４Ｂ）。これらの観察を確認するために、本発明者らは、腫瘍－ＡＰＣ遺伝子シグネチャと、経時変化上のマップされた変化とを利用した。実際、シグネチャは転写レベルで徐々に課され、クロマチンレベルで迅速に確立された（図１４Ｃ）。これらのデータは、ｈＰＩＢを介したリプログラミングが、迅速なエピジェネティックなリモデリングに続いてｃＤＣ１転写プログラムの段階的な再配線を誘発することを示している。
ｃＤＣ１のリプログラミング効率がエピジェネティックな障壁によって制限されていたか否かを試験するために、Ｂ１６及びＬＬＣ細胞をバルプロ酸（ＶＰＡ）で処理し、９日目にリプログラミング効率を評価した。ＶＰＡ処理により、ＬＬＣ中で約３倍（４５．９±２５．５％対１５．８±４．７９％）かつＢ１６細胞中で約５倍（２９．９±１９．３％対５．９±４．８％）、ＣＤ４５＋ＭＨＣ－ＩＩ＋腫瘍－ＡＰＣの発生が促進された（図１５Ａ～Ｂ）。また、本発明者らは、ＶＰＡの存在下での形質導入された細胞が、ＭＨＣ－Ｉを上方制御することを確認した（図１５Ｃ）。このことは、より多くのがん細胞集団が免疫原性になることを示している。機能的には、ＶＰＡの存在下で生成された腫瘍－ＡＰＣは、ＯＴ－Ｉ ＣＤ８＋Ｔ細胞に内在性抗原を提示し（図１５Ｄ）、Ｔ細胞介在性細胞傷害性の標的となり（図１５Ｅ）、かつ外来抗原でインキュベートした後にプライミングしたナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞になった（図１５Ｆ）。次に、ＶＰＡ処理がヒトがん細胞のｃＤＣ１リプログラミングに及ぼす影響を調べた。ＶＰＡ処理は、試験したすべての株でリプログラミング効率を増加させることが観察された（図１５Ｇ）。
結論
このデータは、ｃＤＣ１リプログラミング中のクロマチンのアクセシビリティを促進することによって、がん細胞のリプログラミングを強化できることを示している。
実施例１４．ＳＰＩＢ及びＳＰＩＣは、ｃＤＣ１リプログラミングにおけるＰＵ．１の役割を補償する。
ヒトゲノムは、複数のファミリー及びサブファミリーで編成されたほぼ２０００個の異なる転写因子をコードする。著しい相同性を共有する転写因子は、通常、転写因子の同じファミリー／サブファミリーに含まれる。特定の条件下では、転写因子は、同じファミリーまたはサブファミリーからの特定の転写因子の欠如を補償することができる。これに関して、本発明者らは、ＰＵ．１、ＩＲＦ８、及びＢＡＴＦ３からの相同体が、ｃＤＣ１リプログラミングにおけるその役割を補償し得ると仮定した。概念実証として、ＳＰＩＢ及びＳＰＩＣ、２つのＰＵ．１ホモログが、ｃＤＣ１リプログラミングにおけるＰＵ．１の役割を置き換える能力が試験された。
方法
ＳＰＩＢ及びＳＰＩＣのコード領域をｐＦＵＷ－ＴｅｔＯプラスミド中に個々にクローンニングした。構成的に活性なヒトユビキチンＣプロモーターの制御下にある、個々の転写因子または逆テトラサイクリントランスアクチベーターＭ２ｒｔＴＡ（ｐＦＵＷ－ＵｂＣ－Ｍ２ｒｔＴＡ）をコードするレンチウイルス粒子を共形質導入に使用した（Ｒｏｓａ ｅｔ ａｌ．２０１８）。転写因子過剰発現の９日後に、Ｃｌｅｃ９ａ－ｔｄＴｏｍａｔｏマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）のフローサイトメトリーにより、リプログラミングの効率を評価した。
結果
本発明者らは、ｃＤＣ１リプログラミングの文脈において、ＳＰＩＢとＳＰＩＣの両方がＰＵ．１に取って代わることができることを観察した（図１６Ａ）。重要なことに、ＳＰＩＢ及びＳＰＩＣ単独では、形質導入されたＭＥＦにおいてＤＣ特異的レポーターを活性化することができなかった。興味深いことに、ＳＰＩＢ誘導レポーター活性化は、ＰＵ．１またはＳＰＩＣより大きい程度で、ｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞の約８．１４±１．１６％を示したが、ＰＵ．１及びＳＰＩＣは、それぞれ２．８７±０．１８％及び１．４６±０．７３％しか示さなかった。
次に、ｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞におけるＣＤ４５及びＭＨＣ－ＩＩの発現を分析した。驚くべきことに、ＳＰＩＢは、ＰＵ．１（１７．１５±２．０４％）と比較して、ＣＤ４５とＭＨＣ－ＩＩを共発現するｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞（３３．６３±３．７６％）において２倍の増加を示した（図１６Ｂ）。
結論
これらのデータは、ＳＰＩＢ及びＳＰＩＣがｃＤＣ１リプログラミングにおけるＰＵ．１の役割を補償できることを示唆している。
実施例１５．アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルスにより媒介されるＰＵ．１、ＩＲＦ８、及びＢＡＴＦ３の送達により、健康な細胞及びがん細胞のｃＤＣ１リプログラミングが可能になる。
細胞型特異的転写因子の過剰発現に基づく細胞のリプログラミング戦略は、従来、レトロウイルスまたはレンチウイルスベクターの使用に依存していた。それにもかかわらず、これらのウイルスベクターの組込みの性質により、臨床用途にとって安全性の懸念が高まる。非組込み型ウイルス系の使用は、これらの安全上の懸念を迂回して治療用途のために標的細胞に転写因子を送達するための良好な代替手段である。ここで、本発明者らは、非組込み型アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を介して媒介されるＰＵ．１、ＩＲＦ８、及びＢＡＴＦ３の送達により、非血縁の細胞型でｃＤＣ１のリプログラミングが可能となると仮定した。
方法
細胞リプログラミング
Ｃｌｅｃ９ａ－ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターマウス、Ｂ２９０５マウス黒色腫細胞株、ＩＧＲ－３９黒色腫及びＴ９８Ｇ膠芽細胞腫ヒト細胞株及び２７７８ヒト原発性黒色腫細胞から単離されたマウス胎児線維芽細胞を１２ウェルプレートの１２，５００個の細胞／ウェルの密度で播種し、それぞれ、５０，０００個のＲＮＡコピー／細胞、５，０００個の感染単位／細胞、及び２５０，０００個のゲノムコピー／細胞の感染多重度を使用して、ＰＩＢ－ＧＦＰまたはＧＦＰのみをコードする、レンチウイルス（Ｌｅｎｔｉ）、アデノウイルス（Ａｄ５もしくはＡｄ５／Ｆ３５）またはＡＡＶ（ＡＡＶ－ＤＪもしくはＡＡＶ２－ＱｕａｄＹＦ）とともに一晩インキュベートした。細胞をレンチウイルスでインキュベートした際に、培地にポリブレン（８μｇ／ｍＬ）を補充した。培養期間にわたって、培地を２日ごとに交換した。ＣＤ４５及びＭＨＣ－ＩＩまたはＨＬＡ－ＤＲの表面発現に従って、ｃＤＣ１リプログラミング効率を、生、ＧＦＰ＋細胞の９日目のリプログラミング時にフローサイトメトリーによって定量化した。
結果
本発明者らは、アデノウイルスとＰＩＢ－ＧＦＰをコードするＡＡＶとが、Ｃｌｅｃ９ａ－ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターの活性化（図１７Ａ）と、マウス胚線維芽細胞におけるＣＤ４５及びＭＨＣ－ＩＩの表面発現（図１７Ｂ）とを誘導できることを観察した。予想通り、ＧＦＰをコードするウイルスベクターを用いて形質導入された細胞では、ｔｄＴｏｍａｔｏ発現は観察されなかった。次に、本発明者らは、アデノウイルスと、ＰＩＢ－ＧＦＰをコードするＡＡＶベクターとが、マウス及びヒトのがん細胞をリプログラミングできるかどうかについて検討した。Ｂ２９０５マウス黒色腫がん細胞（図１７Ｃ）におけるＣＤ４５及びＭＨＣ－ＩＩ、ならびにヒトがん細胞株（ＩＧＲ－３９及びＴ９８Ｇ）及びヒト原発性黒色腫細胞２７７８（図１７Ｄ）におけるＣＤ４５及びＨＬＡ－ＤＲの表面発現が観察された。
結論
これらのデータは、アデノウイルス及びＡＡＶによって媒介されるＰＵ．１、ＩＲＦ８、及びＢＡＴＦ３の送達により、健康な細胞及びがん細胞、マウス細胞及びヒトの細胞型でのｃＤＣ１リプログラミングが可能になることを示唆している。

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Ｋ．Ｈｏｎｄａ，Ｈ．Ｙａｎａｉ，Ｈ．Ｎｅｇｉｓｈｉ，Ｍ．Ａｓａｇｉｒｉ，Ｍ．Ｓａｔｏ，Ｔ．Ｍｉｚｕｔａｎｉ，Ｎ．Ｓｈｉｍａｄａ，Ｙ．Ｏｈｂａ，Ａ．Ｔａｋａｏｋａ，Ｎ．Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｔ．Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，ＩＲＦ－７ ｉｓ ｔｈｅ ｍａｓｔｅｒ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｔｙｐｅ－Ｉ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ． Ｎａｔｕｒｅ．４３４，７７２－７７７（２００５）．
Ｍ．Ｈｕｂｅｒｔ，Ｅ．Ｇｏｂｂｉｎｉ，Ｃ．Ｃｏｕｉｌｌａｕｌｔ，Ｔ．－Ｐ． Ｖ．Ｍａｎｈ，Ａ．－Ｃ． Ｄｏｆｆｉｎ，Ｊ．Ｂｅｒｔｈｅｔ，Ｃ．Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ｖ．Ｏｌｌｉｏｎ，Ｊ．Ｋｉｅｌｂａｓｓａ，Ｃ．Ｓａｊｏｕｓ，Ｉ．Ｔｒｅｉｌｌｅｕｘ，Ｏ．Ｔｒｅｄａｎ，Ｂ．Ｄｕｂｏｉｓ，Ｍ．Ｄａｌｏｄ，Ｎ．Ｂｅｎｄｒｉｓｓ－Ｖｅｒｍａｒｅ，Ｃ．Ｃａｕｘ，Ｊ．Ｖａｌｌａｄｅａｕ－Ｇｕｉｌｅｍｏｎｄ，ＩＦＮ－ＩＩＩ ｉｓ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ｃＤＣ１ ａｎｄ ｐｒｅｄｉｃｔｓ ｇｏｏｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｏｕｔｃｏｍｅ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ．Ｓｃｉ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５，ｅａａｖ３９４２（２０２０）．
Ｓ．Ｋｉｍ，Ｐ．Ｂａｇａｄｉａ，Ｄ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｈｉｇｈ Ａｍｏｕｎｔ ｏｆ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ ＩＲＦ８ Ｅｎｇａｇｅｓ ＡＰ１－ＩＲＦ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｅｎｈａｎｃｅｒｓ ｔｏ Ｄｉｒｅｃｔ Ｔｙｐｅ １ Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｉｄｅｎｔｉｔｙ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，５３（４），７５９－７７４（２０２０）．
Ｇ．Ｌａ Ｍａｎｎｏ，Ｒ．Ｓｏｌｄａｔｏｖ，Ａ．Ｚｅｉｓｅｌ，Ｅ．Ｂｒａｕｎ，Ｈ．Ｈｏｃｈｇｅｒｎｅｒ，Ｖ．Ｐｅｔｕｋｈｏｖ，Ｋ．Ｌｉｄｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，Ｍ．Ｅ．Ｋａｓｔｒｉｔｉ，Ｐ．Ｌｏｎｎｅｒｂｅｒｇ，Ａ．Ｆｕｒｌａｎ，Ｊ．Ｆａｎ，Ｌ．Ｅ．Ｂｏｒｍ，Ｚ．Ｌｉｕ，Ｄ．ｖａｎ Ｂｒｕｇｇｅｎ，Ｊ．Ｇｕｏ，Ｘ．Ｈｅ，Ｒ．Ｂａｒｋｅｒ，Ｅ．Ｓｕｎｄｓｔｒｏｍ，Ｇ．Ｃａｓｔｅｌｏ－Ｂｒａｎｃｏ，Ｐ．Ｃｒａｍｅｒ，Ｉ．Ａｄａｍｅｙｋｏ，Ｓ．Ｌｉｎｎａｒｓｓｏｎ，Ｐ．Ｖ．Ｋｈａｒｃｈｅｎｋｏ，ＲＮＡ ｖｅｌｏｃｉｔｙ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ ５６０，４９４－４９８（２０１８）．
Ｈ．Ｌａｕｔｅｒｂａｃｈ，Ｂ．Ｂａｔｈｋｅ，Ｓ．Ｇｉｌｌｅｓ，Ｃ．Ｔｒａｉｄｌ－Ｈｏｆｆｍａｎｎ，Ｃ．Ａ．Ｌｕｂｅｒ，Ｇ．Ｆｅｊｅｒ，Ｍ．Ａ．Ｆｒｅｕｄｅｎｂｅｒｇ，Ｇ．Ｍ．Ｄａｖｅｙ，Ｄ．Ｖｒｅｍｅｃ，Ａ．Ｋａｌｌｉｅｓ，Ｌ．Ｗｕ，Ｋ．Ｓｈｏｒｔｍａｎ，Ｐ．Ｃｈａｐｌｉｎ，Ｍ．Ｓｕｔｅｒ，Ｍ．Ｏ’Ｋｅｅｆｆｅ，Ｈ．Ｈｏｃｈｒｅｉｎ，Ｍｏｕｓｅ ＣＤ８ａｌｐｈａ＋ ＤＣｓ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ＢＤＣＡ３＋ ＤＣｓ ａｒｅ ｍａｊｏｒ ｐｒｏｄｕｃｅｒｓ ｏｆ ＩＦＮ－ｌａｍｂｄａ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｐｏｌｙ ＩＣ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０７，２７０３－２７１７（２０１０）．
Ｈ．Ｌｉ，Ｒ．Ｇｈａｚａｎｆａｒｉ，Ｄ．Ｚａｃｈａｒａｋｉ，Ｎ．Ｄｉｔｚｅｌ，Ｊ．Ｉｓｅｒｎ，Ｍ．Ｅｋｂｌｏｍ，Ｓ．Ｍｅｎｄｅｚ－Ｆｅｒｒｅｒ，Ｍ．Ｋａｓｓｅｍ，Ｓ．Ｓｃｈｅｄｉｎｇ，Ｌｏｗ／ｎｅｇａｔｉｖｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＰＤＧＦＲ－α ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ｔｈｅ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｐｒｉｍａｒｙ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ａｄｕｌｔ ｈｕｍａｎ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ．Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｒｅｐｏｒｔｓ ３，９６５－９７４（２０１４）．
Ｍ．Ｍａｙｏｕｘ，Ａ．Ｒｏｌｌｅｒ，Ｖ．Ｐｕｌｋｏ，Ｓ．Ｓａｍｍｉｃｈｅｌｉ，Ｓ．Ｃｈｅｎ，Ｅ．Ｓｕｍ，Ｃ．Ｊｏｓｔ，Ｍ．Ｆ．Ｆｒａｎｓｅｎ，Ｒ．Ｂ．Ｂｕｓｅｒ，Ｍ．Ｋｏｗａｎｅｔｚ，Ｋ．Ｒｏｍｍｅｌ，Ｉ．Ｍａｔｏｓ，Ｓ．Ｃｏｌｏｍｂｅｔｔｉ，Ａ．Ｂｅｌｏｕｓｏｖ，Ｖ．Ｋａｒａｎｉｋａｓ，Ｆ．Ｏｓｓｅｎｄｏｒｐ，Ｐ．Ｓ．Ｈｅｇｄｅ，Ｄ．Ｓ．Ｃｈｅｎ，Ｐ．Ｕｍａｎａ，Ｍ．Ｐｅｒｒｏ，Ｃ．Ｋｌｅｉｎ，Ｗ．Ｘｕ，Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｄｉｃｔａｔｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ＰＤ－Ｌ１ ｂｌｏｃｋａｄｅ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ． Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ． Ｍｅｄ．１２，ｅａａｖ７４３１（２０２０）．
Ｊ．Ｍｉｎｄｅｒｊａｈｎ，Ａ．Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ａ．Ｆｕｃｈｓ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｇｏｖｅｒｎｉｎｇ ｔｈｅ ｐｉｏｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ ｒｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｃａｐａｂｉｌｉｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｎｏｎ－ｃｌａｓｓｉｃａｌ ｐｉｏｎｅｅｒ ＰＵ．１．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ １１，４０２（２０２０）．
Ｍｕｒｐｈｙ，Ｔ．，Ｔｕｓｓｉｗａｎｄ，Ｒ．＆ Ｍｕｒｐｈｙ，Ｋ．Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｔｈｒｏｕｇｈ ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ：ＢＡＴＦ－ＩＲＦ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｃｏｎｔｒｏｌ ｉｍｍｕｎｅ－ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｎｅｔｗｏｒｋｓ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３，４９９－５０９（２０１３）．
Ｈ．Ａ．Ｐｌｉｎｅｒ，Ｊ．Ｓｈｅｎｄｕｒｅ，Ｃ．Ｔｒａｐｎｅｌｌ，Ｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｅｎａｂｌｅｓ ｒａｐｉｄ ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌ ａｔｌａｓｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄｓ １６，９８３－９８６（２０１９）．
Ｌ．Ｆ．Ｐｏｕｌｉｎ，Ｍ．Ｓａｌｉｏ，Ｅ．Ｇｒｉｅｓｓｉｎｇｅｒ，Ｆ．Ａｎｊｏｓ－Ａｆｏｎｓｏ，Ｌ．Ｃｒａｃｉｕｎ，Ｊ．Ｌ．Ｃｈｅｎ，Ａ．Ｍ．Ｋｅｌｌｅｒ，Ｏ．Ｊｏｆｆｒｅ，Ｓ．Ｚｅｌｅｎａｙ，Ｅ．Ｎｙｅ，Ａ．Ｌｅ Ｍｏｉｎｅ，Ｆ．Ｆａｕｒｅ，Ｖ．Ｄｏｎｃｋｉｅｒ，Ｄ．Ｓａｎｃｈｏ，Ｖ．Ｃｅｒｕｎｄｏｌｏ，Ｄ．Ｂｏｎｎｅｔ，Ｃ．Ｒｅｉｓ ｅ Ｓｏｕｓａ，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＤＮＧＲ－１＋ ＢＤＣＡ３＋ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ ａｓ ｐｕｔａｔｉｖｅ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔｓ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ＣＤ８ａｌｐｈａ＋ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０７，１２６１－１２７１（２０１０）．
Ｃ．Ｆ．Ｐｉｒｅｓ，Ｆ．Ｆ．Ｒｏｓａ，Ｉ．Ｋｕｒｏｃｈｋｉｎ，Ｃ．－Ｆ． Ｐｅｒｅｉｒａ． Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ａｎｄ Ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｗｉｔｈ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０１９ １０：２８０９．
Ｆ．Ｆ．Ｒｏｓａ，Ｃ．Ｆ．Ｐｉｒｅｓ，Ｉ．Ｋｕｒｏｃｈｋｉｎ，Ａ．Ｍ．Ｇｏｍｅｓ，Ａ．Ｇ．Ｆｅｒｒｅｉｒａ，Ｌ．Ｇ．Ｐａｌｍａ，Ｋ．Ｓｈａｉｖ，Ｌ．Ｓｏｌａｎａｓ，Ｃ．Ａｚｅｎｈａ，Ｄ．Ｐａｐａｔｓｅｎｋｏ，Ｏ．Ｓｃｈｕｌｚ，Ｃ．Ｒｅｉｓ ｅ Ｓｏｕｓａ，Ｃ．－Ｆ． Ｐｅｒｅｉｒａ，Ｄｉｒｅｃｔ Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｏｆ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｉｎｔｏ Ａｎｔｉｇｅｎ－Ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０１８ Ｄｅｃ ７；３（３０）， （２０１８）．
Ｆ．Ｆ．Ｒｏｓａ，Ｃ．Ｆ．Ｐｉｒｅｓ，Ｏ．Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎｏｖａ，Ｃ．－Ｆ． Ｐｅｒｅｉｒａ，Ｄｉｒｅｃｔ Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｏｆ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｔｏ Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ Ｔｙｐｅ １ Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ ｂｙ Ｅｎｆｏｒｃｅｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒｓ．Ｂｉｏ－ｐｒｏｔｏｃｏｌ １０，ｅ３６１９（２０２０）
Ｈ．Ｓａｌｍｏｎ，Ｊ．Ｉｄｏｙａｇａ，Ａ．Ｒａｈｍａｎ，Ｍ．Ｌｅｂｏｅｕｆ，Ｒ．Ｒｅｍａｒｋ，Ｓ．Ｊｏｒｄａｎ，Ｍ．Ｃａｓａｎｏｖａ－Ａｃｅｂｅｓ，Ｍ．Ｋｈｕｄｏｙｎａｚａｒｏｖａ，Ｊ．Ａｇｕｄｏ，Ｎ．Ｔｕｎｇ，Ｓ．Ｃｈａｋａｒｏｖ，Ｃ．Ｒｉｖｅｒａ，Ｂ．Ｈｏｇｓｔａｄ，Ｍ．Ｂｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｄ．Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，Ｓ．Ｇｎｊａｔｉｃ，Ｎ．Ｂｈａｒｄｗａｊ，Ａｎｎａ Ｋ．Ｐａｌｕｃｋａ，Ｂｒｉａｎ Ｄ．Ｂｒｏｗｎ，Ｊ．Ｂｒｏｄｙ，Ｆ．Ｇｉｎｈｏｕｘ，Ｍ．Ｍｅｒａｄ，Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ａｎｄ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＤ１０３＋ Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ ａｔ ｔｈｅ Ｔｕｍｏｒ Ｓｉｔｅ Ｅｎｈａｎｃｅｓ Ｔｕｍｏｒ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ＰＤ－Ｌ１ ａｎｄ ＢＲＡＦ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４４，９２４－９３８（２０１６）．
Ａ．Ｓｃｈａｍｂａｃｈ，Ｊ．Ｂｏｈｎｅ，Ｓ．Ｃｈａｎｄｒａ，Ｅ．Ｗｉｌｌ，Ｇ．Ｐ．Ｍａｒｇｉｓｏｎ，Ｄ．Ａ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｃ．Ｂａｕｍ，Ｅｑｕａｌ ｐｏｔｅｎｃｙ ｏｆ ｇａｍｍａｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ａｎｄ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ＳＩＮ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｏ６－ｍｅｔｈｙｌｇｕａｎｉｎｅ－ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｉｎ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｃｅｌｌｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ．１３，３９１－４００（２００６）．
Ｐ．Ｓｅｅ，Ｃ．－Ａ． Ｄｕｔｅｒｔｒｅ，Ｊ．Ｃｈｅｎ，Ｐ．Ｇｕｅｎｔｈｅｒ，Ｎ．ＭｃＧｏｖｅｒｎ，Ｓ．Ｅ．Ｉｒａｃ，Ｍ．Ｇｕｎａｗａｎ，Ｍ．Ｂｅｙｅｒ，Ｋ．Ｈａｅｎｄｌｅｒ，Ｋ．Ｄｕａｎ，Ｈ．Ｒ．Ｂ．Ｓｕｍａｔｏｈ，Ｎ．Ｒｕｆｆｉｎ，Ｍ．Ｊｏｕｖｅ，Ｅ．Ｇｅａ－Ｍａｌｌｏｒｑｕｉ，Ｒ．Ｃ．Ｍ．Ｈｅｎｎｅｋａｍ，Ｔ．Ｌｉｍ，Ｃ．Ｃ．Ｙｉｐ，Ｍ．Ｗｅｎ，Ｂ．Ｍａｌｌｅｒｅｔ，Ｉ．Ｌｏｗ，Ｎ．Ｂ．Ｓｈａｄａｎ，Ｃ．Ｆ．Ｓ．Ｆｅｎ，Ａ．Ｔａｙ，Ｊ．Ｌｕｍ，Ｆ．Ｚｏｌｅｚｚｉ，Ａ．Ｌａｒｂｉ，Ｍ．Ｐｏｉｄｉｎｇｅｒ，Ｊ．Ｋ．Ｙ．Ｃｈａｎ，Ｑ．Ｃｈｅｎ，Ｌ．Ｒｅｎｉａ，Ｍ．Ｈａｎｉｆｆａ，Ｐ．Ｂｅｎａｒｏｃｈ，Ａ．Ｓｃｈｌｉｔｚｅｒ，Ｊ．Ｌ．Ｓｃｈｕｌｔｚｅ，Ｅ．Ｗ．Ｎｅｗｅｌｌ，Ｆ．Ｇｉｎｈｏｕｘ，Ｍａｐｐｉｎｇ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ＤＣ ｌｉｎｅａｇｅ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．３５６，ｅａａｇ３００９（２０１７）．
Ｃ．Ａ．Ｓｏｍｍｅｒ，Ｍ．Ｓｔａｄｔｆｅｌｄ，Ｇ．Ｊ．Ｍｕｒｐｈｙ，Ｋ．Ｈｏｃｈｅｄｌｉｎｇｅｒ，Ｄ．Ｎ．Ｋｏｔｔｏｎ，Ｇ．Ｍｏｓｔｏｓｌａｖｓｋｙ，Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ ａ Ｓｉｎｇｌｅ Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｃａｓｓｅｔｔｅ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．２７，５４３－５４９（２００９）．
Ｓ．Ｓｏｎｔａｇ，Ｍ．Ｆｏｅｒｓｔｅｒ，Ｊ．Ｑｉｎ，Ｐ．Ｗａｎｅｋ，Ｓ．Ｍｉｔｚｋａ，Ｈ．Ｍ．Ｓｃｈｕｅｌｅｒ，Ｓ．Ｋｏｓｃｈｍｉｅｄｅｒ，Ｓ．Ｒｏｓｅ－Ｊｏｈｎ，Ｋ．Ｓｅｒｅ，Ｍ．Ｚｅｎｋｅ，Ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ ＩＲＦ８ Ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ Ｈｕｍａｎ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ ａｎｄ Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｗｉｔｈ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｉＰＳ Ｃｅｌｌｓ．Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ（Ｄａｙｔｏｎ，Ｏｈｉｏ）３５，８９８－９０８（２０１７）
Ｓ．Ｓｐｒａｎｇｅｒ，Ｄ．Ｄａｉ，Ｂ．Ｈｏｒｔｏｎ，Ｔ．Ｆ．Ｇａｊｅｗｓｋｉ，Ｔｕｍｏｒ－Ｒｅｓｉｄｉｎｇ Ｂａｔｆ３ Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ Ａｒｅ Ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ ａｎｄ Ａｄｏｐｔｉｖｅ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ３１，７１１－７２３．ｅ７１４（２０１７）．
Ｐｒａｆｕｌｌａｋｕｍａｒ Ｔａｉｌｏｒ，Ｔｏｍｏｈｉｋｏ Ｔａｍｕｒａ，Ｈｅｒｂｅｒｔ Ｃ．Ｍｏｒｓｅ，Ｋｅｉｋｏ Ｏｚａｔｏ；Ｔｈｅ ＢＸＨ２ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ ＩＲＦ８ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｉｍｐａｉｒｓ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ ｓｕｂｓｅｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ．Ｂｌｏｏｄ ２００８；１１１（４）：１９４２－１９４５．
Ｙ．Ｔｏｍａｒｕ，Ｒ．Ｈａｓｅｇａｗａ，Ｔ．Ｓｕｚｕｋｉ，Ｔ．Ｓａｔｏ，Ａ．Ｋｕｂｏｓａｋｉ，Ｍ．Ｓｕｚｕｋｉ，Ｈ．Ｋａｗａｊｉ，Ａ．Ｒ．Ｒ．Ｆｏｒｒｅｓｔ，Ｙ．Ｈａｙａｓｈｉｚａｋｉ，ＦＡＮＴＯＭ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ，Ｊ．Ｗ．Ｓｈｉｎ，Ｈ．Ｓｕｚｕｋｉ，Ａ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｏｆ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｉｃ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｎｅｔｗｏｒｋ ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓ ｔｒａｎｓ －ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４２，８９０５－８９１３（２０１４）．
Ｂ．Ｔｒｅｕｔｌｅｉｎ，Ｑ．Ｙ．Ｌｅｅ，Ｊ．Ｇ．Ｃａｍｐ，Ｍ．Ｍａｌｌ，Ｗ．Ｋｏｈ，Ｓ．Ａ．Ｍ．Ｓｈａｒｉａｔｉ，Ｓ．Ｓｉｍ，Ｎ．Ｆ．Ｎｅｆｆ，Ｊ．Ｍ．Ｓｋｏｔｈｅｉｍ，Ｍ．Ｗｅｒｎｉｇ，Ｓ．Ｒ．Ｑｕａｋｅ，Ｄｉｓｓｅｃｔｉｎｇ ｄｉｒｅｃｔ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｆｒｏｍ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｔｏ ｎｅｕｒｏｎ ｕｓｉｎｇ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ＲＮＡ－ｓｅｑ．Ｎａｔｕｒｅ．５３４，３９１－３９５（２０１６）．
Ｒ．Ｔｕｓｓｉｗａｎｄ，Ｗ．－Ｌ． Ｌｅｅ，Ｔ．Ｌ．Ｍｕｒｐｈｙ，Ｍ．Ｍａｓｈａｙｅｋｈｉ，Ｗ．Ｋｃ，Ｊ．Ｃ．Ａｌｂｒｉｎｇ，Ａ．Ｔ．Ｓａｔｐａｔｈｙ，Ｊ．Ａ．Ｒｏｔｏｎｄｏ，Ｂ．Ｔ．Ｅｄｅｌｓｏｎ，Ｎ．Ｍ．Ｋｒｅｔｚｅｒ，Ｘ．Ｗｕ，Ｌ．Ａ．Ｗｅｉｓｓ，Ｅ．Ｇｌａｓｍａｃｈｅｒ，Ｐ．Ｌｉ，Ｗ．Ｌｉａｏ，Ｍ．Ｂｅｈｎｋｅ，Ｓ．Ｓ．Ｋ．Ｌａｍ，Ｃ．Ｔ．Ａｕｒｔｈｕｒ，Ｗ．Ｊ．Ｌｅｏｎａｒｄ，Ｈ．Ｓｉｎｇｈ，Ｃ．Ｌ．Ｓｔａｌｌｉｎｇｓ，Ｌ．Ｄ．Ｓｉｂｌｅｙ，Ｒ．Ｄ．Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，Ｋ．Ｍ．Ｍｕｒｐｈｙ，Ｃｏｍｐｅｎｓａｔｏｒｙ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ＢＡＴＦ－ＩＲＦ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ．４９０，５０２－５０７（２０１２）．
Ａ．－Ｃ． Ｖｉｌｌａｎｉ，Ｒ．Ｓａｔｉｊａ，Ｇ．Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，Ｓ．Ｓａｒｋｉｚｏｖａ，Ｋ．Ｓｈｅｋｈａｒ，Ｊ．Ｆｌｅｔｃｈｅｒ，Ｍ．Ｇｒｉｅｓｂｅｃｋ，Ａ．Ｂｕｔｌｅｒ，Ｓ．Ｚｈｅｎｇ，Ｓ．Ｌａｚｏ，Ｌ．Ｊａｒｄｉｎｅ，Ｄ．Ｄｉｘｏｎ，Ｅ．Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎ，Ｅ．Ｎｉｌｓｓｏｎ，Ｉ．Ｇｒｕｎｄｂｅｒｇ，Ｄ．ＭｃＤｏｎａｌｄ，Ａ．Ｆｉｌｂｙ，Ｗ．Ｌｉ，Ｐ．Ｌ．Ｄｅ Ｊａｇｅｒ，Ｏ．Ｒｏｚｅｎｂｌａｔｔ－Ｒｏｓｅｎ，Ａ．Ａ．Ｌａｎｅ，Ｍ．Ｈａｎｉｆｆａ，Ａ．Ｒｅｇｅｖ，Ｎ．Ｈａｃｏｈｅｎ，Ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ＲＮＡ－ｓｅｑ ｒｅｖｅａｌｓ ｎｅｗ ｔｙｐｅｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｂｌｏｏｄ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ，ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ，ａｎｄ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）３５６， （２０１７）．
Ｓ．Ｋ．Ｗｃｕｌｅｋ，Ｆ．Ｊ．Ｃｕｅｔｏ，Ａ．Ｍ．Ｍｕｊａｌ，Ｉ．Ｍｅｌｅｒｏ，Ｍ．Ｆ．Ｋｒｕｍｍｅｌ，Ｄ．Ｓａｎｃｈｏ，Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｎａｔｕｒｅ ｒｅｖｉｅｗｓ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， （２０１９）．
Ｙ．Ｚｈｏｕ，Ｚ．Ｌｉｕ，Ｊ．Ｄ．Ｗｅｌｃｈ，Ｘ．Ｇａｏ，Ｌ．Ｗａｎｇ，Ｔ．Ｇａｒｂｕｔｔ，Ｂ．Ｋｅｅｐｅｒｓ，Ｈ．Ｍａ，Ｊ．Ｆ．Ｐｒｉｎｓ，Ｗ．Ｓｈｅｎ，Ｊ．Ｌｉｕ，Ｌ．Ｑｉａｎ，Ｓｉｎｇｌｅ－Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃ Ａｎａｌｙｓｅｓ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｆａｔｅ Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｓ ｄｕｒｉｎｇ Ｈｕｍａｎ Ｃａｒｄｉａｃ Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．２５，１４９－１６４．ｅ９（２０１９）．
項目
１． 発現時に転写因子：
ｉ）ＢＡＴＦ３、または、配列番号１０（ＢＡＴＦ３）と少なくとも７０％同一、配列番号１０（ＢＡＴＦ３）と、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％同一である、その生物学的に活性なバリアント、
ｉｉ）ＩＲＦ８、または、配列番号１１（ＩＲＦ８）と少なくとも７０％同一、配列番号１１（ＩＲＦ８）と、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％同一である、その生物学的に活性なバリアント、及び
ｉｉｉ）ＰＵ．１、または、配列番号１２（ＰＵ．１）と少なくとも７０％同一、配列番号１２（ＰＵ．１）と、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％同一である、その生物学的に活性なバリアント、
をコードする１つ以上のコンストラクトまたはベクターを含む組成物であって、前記１つ以上のコンストラクトまたはベクターは、前記転写因子の転写を制御することが可能なプロモーター領域を含み、前記プロモーター領域は、脾臓病巣形成ウイルス（ＳＦＦＶ）プロモーター、ＭＮＤ（骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、陰性制御領域欠失、ｄｌ５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換）プロモーター、ＣＡＧ（ＣＭＶ初期エンハンサー／ニワトリβアクチン）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ユビキチンＣ（ＵｂＣ）プロモーター、ＥＦ－１アルファ（ＥＦ－１α）プロモーター、ＥＦ－１アルファショート（ＥＦ１Ｓ）プロモーター、ＥＦ－１アルファとイントロン（ＥＦ１ｉ）プロモーター、ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、または実質的に同じ効果を示すプロモーターを含む、前記組成物。
２． 発現時に：
ａ）ＩＲＦ７、または、配列番号２１（ＩＲＦ７）と少なくとも７０％同一、配列番号２１（ＩＲＦ７）と、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％同一である、その生物学的に活性なバリアント、
ｂ）ＢＡＴＦ、または、配列番号１９（ＢＡＴＦ）と少なくとも７０％同一、配列番号１９（ＢＡＴＦ）と、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％同一である、その生物学的に活性なバリアント、
ｃ）ＳＰＩＢ、または、配列番号２３（ＳＰＩＢ）と少なくとも７０％同一、配列番号２３（ＳＰＩＢ）と、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％同一である、その生物学的に活性なバリアント、
ｄ）ＳＰＩＣ、または、配列番号２５（ＳＰＩＣ）と少なくとも７０％同一、配列番号２５（ＳＰＩＣ）と、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％同一である、その生物学的に活性なバリアント、
から選択される１つ以上の転写因子をコードする１つ以上のコンストラクトまたはベクターをさらに含み、前記１つ以上のコンストラクトまたはベクターは、前記転写因子の転写を制御することが可能なプロモーター領域を含み、前記プロモーター領域は、脾臓病巣形成ウイルス（ＳＦＦＶ）プロモーター、ＭＮＤ（骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、陰性制御領域欠失、ｄｌ５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換）プロモーター、ＣＡＧ（ＣＭＶ初期エンハンサー／ニワトリβアクチン）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ユビキチンＣ（ＵｂＣ）プロモーター、ＥＦ－１アルファ（ＥＦ－１α）プロモーター、ＥＦ－１アルファショート（ＥＦ１Ｓ）プロモーター、ＥＦ－１アルファとイントロン（ＥＦ１ｉ）プロモーター、ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、または実質的に同じ効果を示すプロモーターを含む、項目１に記載の組成物。
３．
ａ）前記ＳＦＦＶプロモーターが、配列番号１と少なくとも８０％同一、配列番号１と、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなり、
ｂ）前記ＭＮＤプロモーターが、配列番号２と少なくとも８０％同一、配列番号２と、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなり、
ｃ） 前記ＣＡＧプロモーターが、配列番号３と少なくとも８０％同一、配列番号３と、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなり、
ｄ）前記ＣＭＶプロモーターが、配列番号４と少なくとも８０％同一、配列番号４と、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなり、
ｅ）前記ＵｂＣプロモーターが、配列番号５と少なくとも８０％同一、配列番号５と、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなり、
ｆ）前記ＥＦ－１αプロモーターが、配列番号６と少なくとも８０％同一、配列番号６と、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなり、
ｇ）前記ＥＦ１Ｓプロモーターが、配列番号７と少なくとも８０％同一、配列番号７と、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなり、
ｈ）前記ＥＦ１ｉプロモーターが、配列番号８と少なくとも８０％同一、配列番号８と、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなり、
ｉ）前記ＰＧＫプロモーターが、配列番号９と少なくとも８０％同一、配列番号９と、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる、項目１または２のいずれか１項に記載の組成物。
４． 前記組成物が、
ａ）発現時に転写因子ＢＡＴＦ３、ＩＲＦ８、及びＰＵ．１をコードする１つのコンストラクトまたはベクター、
ｂ）発現時に転写因子ＢＡＴＦ３、ＩＲＦ８、及びＳＰＩＢをコードする１つのコンストラクトまたはベクター、
ｃ）発現時に転写因子ＢＡＴＦ３及びＩＲＦ８をコードする第１のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＰＵ．１をコードする第２のコンストラクトまたはベクター、
ｄ）発現時に転写因子ＢＡＴＦ３及びＩＲＦ８をコードする第１のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＳＰＩＢをコードする第２のコンストラクトまたはベクター、
ｅ）発現時に転写因子ＢＡＴＦ３をコードする第１のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＩＲＦ８及びＰＵ．１をコードする第２のコンストラクトまたはベクター、
ｆ）発現時に転写因子ＢＡＴＦ３をコードする第１のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＩＲＦ８及びＳＰＩＢをコードする第２のコンストラクトまたはベクター、
ｇ）発現時に転写因子ＩＲＦ８をコードする第１のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＢＡＴＦ３及びＰＵ．１をコードする第２のコンストラクトまたはベクター、
ｈ）発現時に転写因子ＩＲＦ８をコードする第１のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＢＡＴＦ３及びＳＰＩＢをコードする第２のコンストラクトまたはベクター、
ｉ）発現時に転写因子ＢＡＴＦ３をコードする第１のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＩＲＦ８をコードする第２のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＰＵ．１をコードする第３のコンストラクトまたはベクター、
及び／または、
ｊ）発現時に転写因子ＢＡＴＦ３をコードする第１のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＩＲＦ８をコードする第２のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＳＰＩＢをコードする第３のコンストラクトまたはベクター、
を含む、先行項目のいずれか１項に記載の組成物。
５． 前記組成物が、
ａ）発現時に転写因子ＢＡＴＦ３、ＩＲＦ８、ＰＵ．１、及びＩＲＦ７をコードする１つのコンストラクトまたはベクター、
ｂ）発現時に転写因子ＢＡＴＦ３及びＩＲＦ８をコードする第１のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＰＵ．１及びＩＲＦ７をコードする第２のコンストラクトまたはベクター、
ｃ）発現時に転写因子ＢＡＴＦ３及びＰＵ．１をコードする第１のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＩＲＦ８及びＩＲＦ７をコードする第２のコンストラクトまたはベクター、
ｄ）発現時に転写因子ＰＵ．１及びＩＲＦ８をコードする第１のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＢＡＴＦ３及びＩＲＦ７をコードする第２のコンストラクトまたはベクター、
ｅ）発現時に転写因子ＢＡＴＦ３、ＩＲＦ８、及びＰＵ．１をコードする第１のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＩＲＦ７をコードする第２のコンストラクトまたはベクター、
ｆ）発現時に転写因子ＢＡＴＦ３をコードする第１のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＩＲＦ８、ＰＵ．１、及びＩＲＦ７をコードする第２のコンストラクトまたはベクター、
ｇ）発現時に転写因子ＩＲＦ８をコードする第１のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＢＡＴＦ３、ＰＵ．１、及びＩＲＦ７をコードする第２のコンストラクトまたはベクター、
ｈ）発現時に転写因子ＰＵ．１をコードする第１のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＢＡＴＦ３、ＩＲＦ８、及びＩＲＦ７をコードする第２のコンストラクトまたはベクター、
及び／または、
ｉ）発現時に転写因子ＢＡＴＦ３をコードする第１のコンストラクトまたはベクター、発現時に転写因子ＩＲＦ８をコードする第２のコンストラクトまたはベクター、発現時に転写因子ＰＵ．１をコードする第３のコンストラクトまたはベクター、及び発現時に転写因子ＩＲＦ７をコードする第４のコンストラクトまたはベクター、
を含む、先行項目のいずれか１項に記載の組成物。
６． 前記組成物が、
ａ）発現時に転写因子ＢＡＴＦ３、ＩＲＦ８、ＰＵ．１、及びＢＡＴＦをコードする１つのコンストラクトまたはベクター、
ｂ）発現時に転写因子ＢＡＴＦ３及びＩＲＦ８をコードする第１のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＰＵ．１及びＢＡＴＦをコードする第２のコンストラクトまたはベクター、
ｃ）発現時に転写因子ＢＡＴＦ３及びＰＵ．１をコードする第１のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＩＲＦ８及びＢＡＴＦをコードする第２のコンストラクトまたはベクター、
ｄ）発現時に転写因子ＰＵ．１及びＩＲＦ８をコードする第１のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＢＡＴＦ３及びＢＡＴＦをコードする第２のコンストラクトまたはベクター、
ｅ）発現時に転写因子ＢＡＴＦ３、ＩＲＦ８、及びＰＵ．１をコードする第１のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＢＡＴＦをコードする第２のコンストラクトまたはベクター、
ｆ）発現時に転写因子ＢＡＴＦ３をコードする第１のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＩＲＦ８、ＰＵ．１、及びＢＡＴＦをコードする第２のコンストラクトまたはベクター、
ｇ）発現時に転写因子ＩＲＦ８をコードする第１のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＢＡＴＦ３、ＰＵ．１、及びＢＡＴＦをコードする第２のコンストラクトまたはベクター、
ｈ）発現時に転写因子ＰＵ．１をコードする第１のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＢＡＴＦ３、ＩＲＦ８、及びＢＡＴＦをコードする第２のコンストラクトまたはベクター、
及び／または、
ｉ）発現時に転写因子ＢＡＴＦ３をコードする第１のコンストラクトまたはベクター、発現時に転写因子ＩＲＦ８をコードする第２のコンストラクトまたはベクター、発現時に転写因子ＰＵ．１をコードする第３のコンストラクトまたはベクター、及び発現時に転写因子ＢＡＴＦをコードする第４のコンストラクトまたはベクター、
を含む、先行項目のいずれか１項に記載の組成物。
７． ＢＡＴＦ３が、配列番号１４に対して少なくとも９０％の配列同一性、配列番号１４に対して、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列にコードされる、先行項目のいずれか１項に記載の組成物。
８． ＩＲＦ８が、配列番号１５に対して少なくとも９０％の配列同一性、配列番号１５に対して、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列にコードされる、先行項目のいずれか１項に記載の組成物。
９． ＰＵ．１が、配列番号１６に対して少なくとも９０％の配列同一性、配列番号１６に対して、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列にコードされる、先行項目のいずれか１項に記載の組成物。
１０． ＢＡＴＦが、配列番号１８に対して少なくとも９０％の配列同一性、配列番号１８に対して、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列にコードされる、先行項目のいずれか１項に記載の組成物。
１１． ＩＲＦ７が、配列番号２０に対して少なくとも９０％の配列同一性、配列番号２０に対して、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列にコードされる、先行項目のいずれか１項に記載の組成物。
１２． ＳＰＩＢが、配列番号２２に対して少なくとも９０％の配列同一性、配列番号２２に対して、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列にコードされる、先行項目のいずれか１項に記載の組成物。
１３． ＳＰＩＣが、配列番号２４に対して少なくとも９０％の配列同一性、配列番号２４に対して、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列にコードされる、先行項目のいずれか１項に記載の組成物。
１４． 前記１つ以上のコンストラクトまたはベクターが、発現時に、転写因子ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質アルファ（ＣＥＢＰα）、または、配列番号１３（ＣＥＢＰα）と少なくとも７０％同一、配列番号１３と、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％同一である、その生物学的に活性なバリアントをさらにコードする、先行項目のいずれか１項に記載の組成物。
１５． ＣＥＢＰαが、配列番号１７に対して少なくとも９０％の配列同一性、配列番号１７に対して、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列にコードされる、先行項目のいずれか１項に記載の組成物。
１６． 前記１つ以上のコンストラクトまたはベクターが、少なくとも３つのコード領域のうちの少なくとも２つに作動可能に連結されている自己切断ペプチドをさらに含み、したがって単一のオープンリーディングフレームを形成する、先行項目のいずれか１項に記載の組成物。
１７． 前記自己切断ペプチドが、２Ａペプチドである、項目１６に記載の組成物。
１８． 前記２Ａペプチドが、ウマ鼻炎Ａウイルス（Ｅ２Ａ）、口蹄疫ウイルス（Ｆ２Ａ）、ブタテシオウイルス－１（Ｐ２Ａ）及びトセアシグナ（Ｔｈｏｓｅａ ｓｉｇｎａ）ウイルス（Ｔ２Ａ）ペプチドからなる群から選択される、項目１７に記載の組成物。
１９． 前記１つ以上のコンストラクトまたはベクターが、ウイルスベクターである、先行項目のいずれか１項に記載の組成物。
２０． 前記１つ以上のコンストラクトまたはベクターが、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、パラミクソウイルス科ベクター、ラブドウイルスベクター、アルファウイルスベクター及びフラビウイルスベクターからなる群から選択されるウイルスベクターである、先行項目のいずれか１項に記載の組成物。
２１． 前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクターである、項目２０に記載の組成物。
２２． 前記アデノウイルスベクターが、野生型Ａｄベクター、ハイブリッドＡｄベクター、及び変異体Ａｄベクターからなる群から選択される、項目２０に記載の組成物。
２３． 前記野生型ＡｄベクターがＡｄ５であり、前記ハイブリッドＡｄベクターがＡｄ５／Ｆ３５である、項目２２に記載の組成物。
２４． 前記アデノ随伴ウイルスベクターが、野生型ＡＡＶベクター、ハイブリッドＡＡＶベクター、及び変異体ＡＡＶベクターからなる群から選択される、項目２０に記載の組成物。
２５． 前記ハイブリッドＡＡＶベクターがＡＡＶ－ＤＪであり、前記変異体ＡＡＶベクターがＡＡＶ２－ＱｕａｄＹＦである、項目２４に記載の組成物。
２６． 前記１つ以上のコンストラクトまたはベクターが、プラスミドである、先行項目のいずれか１項に記載の組成物。
２７． 前記１つ以上のコンストラクトまたはベクターの骨格が、ＦＵＷ、ｐＲＲＬ－ｃＰＰＴ、ｐＲＬＬ、ｐＣＣＬ、ｐＣＬＬ、ｐＨＡＧＥ２、ｐＷＰＸＬ、ｐＬＫＯ、ｐＨＩＶ、ｐＬＬ、ｐＣＤＨ、及びｐＬｅｎｔｉからなる群から選択される、先行項目のいずれか１項に記載の組成物。
２８． 前記１つ以上のコンストラクトまたはベクターが、転写後調節エレメント（ＰＲＥ）配列をさらに含む、先行項目のいずれか１項に記載の組成物。
２９． 前記ＰＲＥ配列がウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）である、項目２８に記載の組成物。
３０． 前記１つ以上のコンストラクトまたはベクターが、中央ポリプリン配列（ｃＰＰＴ）をさらに含む、先行項目のいずれか１項に記載の組成物。
３１． 前記１つ以上のコンストラクトまたはベクターが、５’及び３’の末端反復をさらに含む、先行項目のいずれか１項に記載の組成物。
３２． 前記５’及び３’の末端反復のうちの少なくとも一方が、レンチウイルスの長末端反復または３’長末端反復のＵ３を部分的に欠失した自己不活性化（ＳＩＮ）デザインである、項目３１に記載の組成物。
３３． 前記１つ以上のコンストラクトまたはベクターが、ヌクレオカプシドタンパク質パッケージング標的部位をさらに含む、先行項目のいずれか１項に記載の組成物。
３４． 前記タンパク質パッケージング標的部位が、ＨＩＶ－１ ｐｓｉ配列を含む、項目３３に記載の組成物。
３５． 前記１つ以上のコンストラクトまたはベクターが、ＲＥＶタンパク質応答エレメント（ＲＲＥ）をさらに含む、先行項目のいずれか１項に記載の組成物。
３６． ＩＦΝβ、ＩＦΝγ、ＴＮＦα、ＩＦΝα、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＣＤ４０Ｉ、Ｆｌｔ３Ｉ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮ－λ１、ＩＦＮ－ω、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－１５、プロスタグランジン２、ＳＣＦ、及びオンコスタチンＭ（ＯＭ）からなる群から選択される、１種以上のサイトカインをさらに含む、先行項目のいずれか１項に記載の組成物。
３７． ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤などの１つ以上のエピジェネティック修飾剤をさらに含む、先行項目のいずれか１項に記載の組成物。
３８． 前記１つ以上のヒストン脱アセチル化酵素阻害剤が、バルプロ酸である、項目３７に記載の組成物。
３９． 前記組成物が医薬組成物である、先行項目のいずれか１項に記載の組成物。
４０． 先行項目のいずれか１項に記載の１つ以上のコンストラクトまたはベクターを含む、細胞。
４１． 前記細胞が、ヒト細胞またはマウス細胞などの哺乳動物細胞である、項目４０に記載の細胞。
４２． 前記細胞が、幹細胞、分化細胞、及びがん細胞からなる群から選択され、
ａ）前記幹細胞が、多能性幹細胞及び複能性幹細胞、例えば間葉系幹細胞または造血幹細胞からなる群から選択され、
ｂ）前記分化細胞が、線維芽細胞などの任意の体細胞または単球などの造血細胞である、
項目４０～４１のいずれか１項に記載の細胞。
４３． 前記細胞が、リプログラミングされたヒト１型通常型樹状細胞などのヒト樹状細胞または抗原提示細胞である、項目４０～４２のいずれか１項に記載の細胞。
４４． 前記細胞が、表１の表面マーカーから選択される１つ以上の表面マーカーをさらに発現する、項目４０～４３のいずれか１項に記載の細胞。
４５． 前記細胞が、表１に列挙された１つ以上の表面マーカーについて陽性である、項目４０～４４のいずれか１項に記載の細胞。
４６． 前記細胞が、ＣＤ２２６陽性である、項目４０～４５のいずれか１項に記載の細胞。
４７． 細胞を樹状細胞または抗原提示細胞にリプログラミングまたは誘導する方法であって、前記方法が、以下の：
ｃ）細胞を、項目１～３２のいずれか１項に記載のコンストラクトまたはベクターを含む組成物で形質導入するステップと、
ｄ）転写因子を発現させ、
それによって、リプログラミングまたは誘導された細胞が得られるステップと、
を含む、前記方法。
４８． 前記リプログラミングまたは誘導は、インビボ、インビトロ、またはエクスビボである、項目４７に記載の方法。
４９． 前記方法が、形質導入された細胞を細胞培地中で培養するステップをさらに含み、前記ステップは、前記転写因子の発現の前または後に行われる、項目４７～４８のいずれか１項に記載の方法。
５０． 前記形質導入された細胞を、ＩＦΝβ、ＩＦΝγ、ＴＮＦα、ＩＦΝα、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＣＤ４０Ｉ、Ｆｌｔ３Ｉ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮ－λ１、ＩＦＮ－ω、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－１５、プロスタグランジン２、ＳＣＦ、及びオンコスタチンＭ（ＯＭ）からなる群から選択される１種以上のサイトカインを含む細胞培地中で培養することをさらに含む、項目４７～４９のいずれか１項に記載の方法。
５１． 前記形質導入された細胞を、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤などの１つ以上のエピジェネティック修飾剤を含む細胞培地中で培養することをさらに含む、項目４７～５０のいずれか１項に記載の方法。
５２． 前記ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤が、バルプロ酸である、項目５１に記載の方法。
５３． 前記細胞が、ヒト細胞またはマウス細胞などの哺乳動物細胞である、項目４７～５２のいずれか１項に記載の方法。
５４． 前記細胞が、幹細胞、分化細胞、及びがん細胞からなる群から選択され、
ｅ）前記幹細胞が、多能性幹細胞及び複能性幹細胞、例えば間葉系幹細胞または造血幹細胞からなる群から選択され、
ｆ）前記分化細胞が、線維芽細胞などの任意の体細胞または単球などの造血細胞である、
項目４７～５３のいずれか１項に記載の方法。
５５． 前記形質導入された細胞を、少なくとも２日間、例えば少なくとも５日間、例えば少なくとも８日間、例えば少なくとも１０日間、例えば少なくとも１２日間培養する、項目４７～５４のいずれか１項に記載の方法。
５６． 得られるリプログラミングまたは誘導された細胞が、１型の通常型樹状細胞である、項目４７～５５のいずれか１項に記載の方法。
５７． 得られるリプログラミングまたは誘導された細胞が、クラスタ分化４５（ＣＤ４５）陽性である、項目４７～５６のいずれか１項に記載の方法。
５８． 得られるリプログラミングまたは誘導された細胞が、Ｘ－Ｃモチーフケモカインレセプター１（ＸＣＲ１）陽性である、項目４７～５７のいずれか１項に記載の方法。
５９． 得られるリプログラミングまたは誘導された細胞が、クラスタ分化２２６（ＣＤ２２６）陽性である、項目４７～５８のいずれか１
６０． 得られるリプログラミングまたは誘導された細胞が、ヒト白血球抗原－ＤＲアイソタイプ（ＨＬＡ－ＤＲ）陽性である、項目４７～５９のいずれか１項に記載の方法。
６１． 項目４７～６０のいずれか１項に規定された方法に従って得られるリプログラミングまたは誘導された細胞。
６２． 前記細胞が、１型通常型樹状細胞などの樹状細胞または抗原提示細胞である、項目６１に記載のリプログラミングまたは誘導された細胞。
６３． 得られるリプログラミングまたは誘導された細胞が、表１に列挙された１つ以上の表面マーカーについて陽性である、項目６１～６２のいずれか１項に記載のリプログラミングまたは誘導された細胞。
６４． 得られるリプログラミングまたは誘導された細胞が、ＣＤ４５、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ１４１、ＣＬＥＣ９Ａ、ＸＣＲ１、及び／またはＣＤ２２６陽性である、項目６１～６３のいずれか１項に記載のリプログラミングまたは誘導された細胞。
６５． 医療における使用のための、項目１～３９のいずれか１項に記載の組成物、項目４０～４６のいずれか１項に記載の細胞、及び／または項目６１～６４のいずれか１項に記載のリプログラミングまたは誘導された細胞。
６６． がんまたは感染症の治療における使用のための、項目１～３９のいずれか１項に記載の組成物、項目４０～４６のいずれか１項に記載の細胞、及び／または項目６１～６４のいずれか１項に記載のリプログラミングまたは誘導された細胞。
６７． 前記がんが、基底細胞癌、子宮頸異形成、肉腫、生殖細胞腫瘍、網膜芽細胞腫、膠芽細胞腫、リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、血液癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、食道癌、子宮癌、膣癌、乳癌、頭頸部癌、胃癌、口腔癌、上咽頭癌、気管癌、喉頭癌、気管支癌、細気管支癌、肺癌、胸膜癌、膀胱尿路上皮癌、管腔臓器癌、食道癌、胃癌、胆管癌、腸癌、結腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、膀胱癌、尿管癌、腎臓癌、肝臓癌、胆嚢癌、脾臓癌、脳癌、リンパ系癌、骨癌、膵臓癌、白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、皮膚癌、黒色腫または骨髄腫からなる群から選択され、好ましくは、前記がんが、黒色腫、頭頸部癌、乳癌、結腸直腸癌、肝臓癌、リンパ腫、膀胱尿路上皮癌、膵臓癌及び神経膠芽腫からなる群から選択される、項目６６に記載の組成物、細胞、及び／またはリプログラミングされた細胞。
６８． がんまたは感染症を治療する方法であって、前記方法が、それを必要とする個体に、項目１～３８のいずれか１項に記載の組成物、項目４０～４６のいずれか１項に記載の細胞、項目３９に記載の医薬組成物、及び／または項目６１～６４のいずれか１項に記載のリプログラミングまたは誘導された細胞を投与することを含む、前記方法。
６９． がんまたは感染症を治療するための医薬を製造するための、項目１～３８のいずれか１項に記載の組成物、項目４０～４６のいずれか１項に記載の細胞、項目３９に記載の医薬組成物、及び／または項目６１～６４のいずれか１項に記載のリプログラミングまたは誘導された細胞の使用。

Claims (69)

  1. 発現時に転写因子：
    ａ）ＢＡＴＦ３、または、配列番号１０（ＢＡＴＦ３）と少なくとも７０％同一、配列番号１０（ＢＡＴＦ３）と、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％同一である、その生物学的に活性なバリアント、
    ｂ）ＩＲＦ８、または、配列番号１１（ＩＲＦ８）と少なくとも７０％同一、配列番号１１（ＩＲＦ８）と、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％同一である、その生物学的に活性なバリアント、及び
    ｃ）ＰＵ．１、または、配列番号１２（ＰＵ．１）と少なくとも７０％同一、配列番号１２（ＰＵ．１）と、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％同一である、その生物学的に活性なバリアント、
    をコードする１つ以上のコンストラクトまたはベクターを含む組成物であって、前記１つ以上のコンストラクトまたはベクターが、前記転写因子の転写を制御することが可能なプロモーター領域を含み、前記プロモーター領域は、脾臓病巣形成ウイルス（ＳＦＦＶ）プロモーターを含む、前記組成物。
  2. 発現時に：
    ａ）ＩＲＦ７、または、配列番号２１（ＩＲＦ７）と少なくとも７０％同一、配列番号２１（ＩＲＦ７）と、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％同一である、その生物学的に活性なバリアント、
    ｂ）ＢＡＴＦ、または、配列番号１９（ＢＡＴＦ）と少なくとも７０％同一、配列番号１９（ＢＡＴＦ）と、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％同一である、その生物学的に活性なバリアント、
    ｃ）ＳＰＩＢ、または、配列番号２３（ＳＰＩＢ）と少なくとも７０％同一、配列番号２３（ＳＰＩＢ）と、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％同一である、その生物学的に活性なバリアント、
    ｄ）ＳＰＩＣ、または、配列番号２５（ＳＰＩＣ）と少なくとも７０％同一、配列番号２５（ＳＰＩＣ）と、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％同一である、その生物学的に活性なバリアント、
    から選択される１つ以上の転写因子をコードする１つ以上のコンストラクトまたはベクターをさらに含み、前記１つ以上のコンストラクトまたはベクターが、前記転写因子の転写を制御することが可能なプロモーター領域を含み、前記プロモーター領域が、脾臓病巣形成ウイルス（ＳＦＦＶ）プロモーターを含む、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記ＳＦＦＶプロモーターが、配列番号１と少なくとも８０％同一、配列番号１と、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる、請求項１または２のいずれか１項に記載の組成物。
  4. 前記組成物が、
    ａ）発現時に転写因子ＢＡＴＦ３、ＩＲＦ８、及びＰＵ．１をコードする１つのコンストラクトまたはベクター、
    ｂ）発現時に転写因子ＢＡＴＦ３、ＩＲＦ８、及びＳＰＩＢをコードする１つのコンストラクトまたはベクター、
    ｃ）発現時に転写因子ＢＡＴＦ３及びＩＲＦ８をコードする第１のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＰＵ．１をコードする第２のコンストラクトまたはベクター、
    ｄ）発現時に転写因子ＢＡＴＦ３及びＩＲＦ８をコードする第１のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＳＰＩＢをコードする第２のコンストラクトまたはベクター、
    ｅ）発現時に転写因子ＢＡＴＦ３をコードする第１のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＩＲＦ８及びＰＵ．１をコードする第２のコンストラクトまたはベクター、
    ｆ）発現時に転写因子ＢＡＴＦ３をコードする第１のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＩＲＦ８及びＳＰＩＢをコードする第２のコンストラクトまたはベクター、
    ｇ）発現時に転写因子ＩＲＦ８をコードする第１のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＢＡＴＦ３及びＰＵ．１をコードする第２のコンストラクトまたはベクター、
    ｈ）発現時に転写因子ＩＲＦ８をコードする第１のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＢＡＴＦ３及びＳＰＩＢをコードする第２のコンストラクトまたはベクター、
    ｉ）発現時に転写因子ＢＡＴＦ３をコードする第１のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＩＲＦ８をコードする第２のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＰＵ．１をコードする第３のコンストラクトまたはベクター、
    及び／または、
    ｊ）発現時に転写因子ＢＡＴＦ３をコードする第１のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＩＲＦ８をコードする第２のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＳＰＩＢをコードする第３のコンストラクトまたはベクター、
    を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  5. 前記組成物が、
    ａ）発現時に転写因子ＢＡＴＦ３、ＩＲＦ８、ＰＵ．１、及びＩＲＦ７をコードする１つのコンストラクトまたはベクター、
    ｂ）発現時に転写因子ＢＡＴＦ３及びＩＲＦ８をコードする第１のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＰＵ．１及びＩＲＦ７をコードする第２のコンストラクトまたはベクター、
    ｃ）発現時に転写因子ＢＡＴＦ３及びＰＵ．１をコードする第１のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＩＲＦ８及びＩＲＦ７をコードする第２のコンストラクトまたはベクター、
    ｄ）発現時に転写因子ＰＵ．１及びＩＲＦ８をコードする第１のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＢＡＴＦ３及びＩＲＦ７をコードする第２のコンストラクトまたはベクター、
    ｅ）発現時に転写因子ＢＡＴＦ３、ＩＲＦ８、及びＰＵ．１をコードする第１のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＩＲＦ７をコードする第２のコンストラクトまたはベクター、
    ｆ）発現時に転写因子ＢＡＴＦ３をコードする第１のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＩＲＦ８、ＰＵ．１、及びＩＲＦ７をコードする第２のコンストラクトまたはベクター、
    ｇ）発現時に転写因子ＩＲＦ８をコードする第１のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＢＡＴＦ３、ＰＵ．１、及びＩＲＦ７をコードする第２のコンストラクトまたはベクター、
    ｈ）発現時に転写因子ＰＵ．１をコードする第１のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＢＡＴＦ３、ＩＲＦ８、及びＩＲＦ７をコードする第２のコンストラクトまたはベクター、
    及び／または、
    ｉ）発現時に転写因子ＢＡＴＦ３をコードする第１のコンストラクトまたはベクター、発現時に転写因子ＩＲＦ８をコードする第２のコンストラクトまたはベクター、発現時に転写因子ＰＵ．１をコードする第３のコンストラクトまたはベクター、及び発現時に転写因子ＩＲＦ７をコードする第４のコンストラクトまたはベクター、
    を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  6. 前記組成物が、
    ａ）発現時に転写因子ＢＡＴＦ３、ＩＲＦ８、ＰＵ．１、及びＢＡＴＦをコードする１つのコンストラクトまたはベクター、
    ｂ）発現時に転写因子ＢＡＴＦ３及びＩＲＦ８をコードする第１のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＰＵ．１及びＢＡＴＦをコードする第２のコンストラクトまたはベクター、
    ｃ）発現時に転写因子ＢＡＴＦ３及びＰＵ．１をコードする第１のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＩＲＦ８及びＢＡＴＦをコードする第２のコンストラクトまたはベクター、
    ｄ）発現時に転写因子ＰＵ．１及びＩＲＦ８をコードする第１のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＢＡＴＦ３及びＢＡＴＦをコードする第２のコンストラクトまたはベクター、
    ｅ）発現時に転写因子ＢＡＴＦ３、ＩＲＦ８、及びＰＵ．１をコードする第１のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＢＡＴＦをコードする第２のコンストラクトまたはベクター、
    ｆ）発現時に転写因子ＢＡＴＦ３をコードする第１のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＩＲＦ８、ＰＵ．１、及びＢＡＴＦをコードする第２のコンストラクトまたはベクター、
    ｇ）発現時に転写因子ＩＲＦ８をコードする第１のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＢＡＴＦ３、ＰＵ．１、及びＢＡＴＦをコードする第２のコンストラクトまたはベクター、
    ｈ）発現時に転写因子ＰＵ．１をコードする第１のコンストラクトまたはベクターと、発現時に転写因子ＢＡＴＦ３、ＩＲＦ８、及びＢＡＴＦをコードする第２のコンストラクトまたはベクター、
    及び／または、
    ｉ）発現時に転写因子ＢＡＴＦ３をコードする第１のコンストラクトまたはベクター、発現時に転写因子ＩＲＦ８をコードする第２のコンストラクトまたはベクター、発現時に転写因子ＰＵ．１をコードする第３のコンストラクトまたはベクター、及び発現時に転写因子ＢＡＴＦをコードする第４のコンストラクトまたはベクター、
    を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  7. ＢＡＴＦ３が、配列番号１４に対して少なくとも９０％の配列同一性、配列番号１４に対して、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列にコードされる、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  8. ＩＲＦ８が、配列番号１５に対して少なくとも９０％の配列同一性、配列番号１５に対して、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列にコードされる、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  9. ＰＵ．１が、配列番号１６に対して少なくとも９０％の配列同一性、配列番号１６に対して、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列にコードされる、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  10. ＢＡＴＦが、配列番号１８に対して少なくとも９０％の配列同一性、配列番号１８に対して、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列にコードされる、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  11. ＩＲＦ７が、配列番号２０に対して少なくとも９０％の配列同一性、配列番号２０に対して、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列にコードされる、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  12. ＳＰＩＢが、配列番号２２に対して少なくとも９０％の配列同一性、配列番号２２に対して、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列にコードされる、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  13. ＳＰＩＣが、配列番号２４に対して少なくとも９０％の配列同一性、配列番号２４に対して、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列にコードされる、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  14. 前記１つ以上のコンストラクトまたはベクターが、発現時に転写因子ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質アルファ（ＣΕΒΡα）、または、配列番号１３（ＣＥＢＰα）と少なくとも７０％同一、配列番号１３と、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％同一である、その生物学的に活性なバリアントをさらにコードする、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  15. ＣＥＢＰαが、配列番号１７に対して少なくとも９０％の配列同一性、配列番号１７に対して、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列にコードされる、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  16. 前記１つ以上のコンストラクトまたはベクターが、少なくとも３つのコード領域のうちの少なくとも２つに作動可能に連結されている自己切断ペプチドをさらに含み、したがって単一のオープンリーディングフレームを形成する、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  17. 前記自己切断ペプチドが、２Ａペプチドである、請求項１６に記載の組成物。
  18. 前記２Ａペプチドが、ウマ鼻炎Ａウイルス（Ｅ２Ａ）、口蹄疫ウイルス（Ｆ２Ａ）、ブタテシオウイルス－１（Ｐ２Ａ）及びトセアシグナ（Ｔｈｏｓｅａ ｓｉｇｎａ）ウイルス（Ｔ２Ａ）ペプチドからなる群から選択される、請求項１７に記載の組成物。
  19. 前記１つ以上のコンストラクトまたはベクターが、ウイルスベクターである、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  20. 前記１つ以上のコンストラクトまたはベクターが、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、パラミクソウイルス科ベクター、ラブドウイルスベクター、アルファウイルスベクター及びフラビウイルスベクターからなる群から選択されるウイルスベクターである、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  21. 前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクターである、請求項２０に記載の組成物。
  22. 前記アデノウイルスベクターが、野生型Ａｄベクター、ハイブリッドＡｄベクター、及び変異体Ａｄベクターからなる群から選択される、請求項２０に記載の組成物。
  23. 前記野生型ＡｄベクターがＡｄ５であり、前記ハイブリッドＡｄベクターがＡｄ５／Ｆ３５である、請求項２２に記載の組成物。
  24. 前記アデノ随伴ウイルスベクターが、野生型ＡＡＶベクター、ハイブリッドＡＡＶベクター、及び変異体ＡＡＶベクターからなる群から選択される、請求項２０に記載の組成物。
  25. 前記ハイブリッドＡＡＶベクターがＡＡＶ－ＤＪであり、前記変異体ＡＡＶベクターがＡＡＶ２－ＱｕａｄＹＦである、請求項２４に記載の組成物。
  26. 前記１つ以上のコンストラクトまたはベクターが、プラスミドである、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  27. 前記１つ以上のコンストラクトまたはベクターの骨格が、ＦＵＷ、ｐＲＲＬ－ｃＰＰＴ、ｐＲＬＬ、ｐＣＣＬ、ｐＣＬＬ、ｐＨＡＧＥ２、ｐＷＰＸＬ、ｐＬＫＯ、ｐＨＩＶ、ｐＬＬ、ｐＣＤＨ、及びｐＬｅｎｔｉからなる群から選択される、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  28. 前記１つ以上のコンストラクトまたはベクターが、転写後調節エレメント（ＰＲＥ）配列をさらに含む、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  29. 前記ＰＲＥ配列がウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）である、請求項２８に記載の組成物。
  30. 前記１つ以上のコンストラクトまたはベクターが、中央ポリプリン配列（ｃＰＰＴ）をさらに含む、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  31. 前記１つ以上のコンストラクトまたはベクターが、５’及び３’の末端反復をさらに含む、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  32. 前記５’及び３’の末端反復のうちの少なくとも一方が、レンチウイルスの長末端反復または３’長末端反復のＵ３を部分的に欠失した自己不活性化（ＳＩＮ）デザインである、請求項３１に記載の組成物。
  33. 前記１つ以上のコンストラクトまたはベクターが、ヌクレオカプシドタンパク質パッケージング標的部位をさらに含む、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  34. 前記タンパク質パッケージング標的部位が、ＨＩＶ－１ ｐｓｉ配列を含む、請求項３３に記載の組成物。
  35. 前記１つ以上のコンストラクトまたはベクターが、ＲＥＶタンパク質応答エレメント（ＲＲＥ）をさらに含む、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  36. ＩＦΝβ、ＩＦΝγ、ＴＮＦα、ＩＦΝα、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＣＤ４０Ｉ、Ｆｌｔ３Ｉ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮ－λ１、ＩＦＮ－ω、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－１５、プロスタグランジン２、ＳＣＦ、及びオンコスタチンＭ（ＯＭ）からなる群から選択される、１種以上のサイトカインをさらに含む、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  37. ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤などの１つ以上のエピジェネティック修飾剤をさらに含む、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  38. 前記１つ以上のヒストン脱アセチル化酵素阻害剤が、バルプロ酸である、請求項３７に記載の組成物。
  39. 前記組成物が医薬組成物である、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  40. 先行請求項のいずれか１項に記載の１つ以上のコンストラクトまたはベクターを含む、細胞。
  41. 前記細胞が、ヒト細胞またはマウス細胞などの哺乳動物細胞である、請求項４０に記載の細胞。
  42. 前記細胞が、幹細胞、分化細胞、及びがん細胞からなる群から選択され、
    ａ）前記幹細胞が、多能性幹細胞及び複能性幹細胞、例えば間葉系幹細胞または造血幹細胞からなる群から選択され、
    ｂ）前記分化細胞が、線維芽細胞などの任意の体細胞または単球などの造血細胞である、
    請求項４０～４１のいずれか１項に記載の細胞。
  43. 前記細胞が、リプログラミングされたヒト１型通常型樹状細胞などのヒト樹状細胞または抗原提示細胞である、請求項４０～４２のいずれか１項に記載の細胞。
  44. 前記細胞が、表１の表面マーカーから選択される１つ以上の表面マーカーをさらに発現する、請求項４０～４３のいずれか１項に記載の細胞。
  45. 前記細胞が、表１に列挙された１つ以上の表面マーカーについて陽性である、請求項４０～４４のいずれか１項に記載の細胞。
  46. 前記細胞が、ＣＤ２２６陽性である、請求項４０～４５のいずれか１項に記載の細胞。
  47. 細胞を樹状細胞または抗原提示細胞にリプログラミングまたは誘導する方法であって、前記方法が、以下の：
    ａ）細胞を、請求項１～３２のいずれか１項に記載のコンストラクトまたはベクターを含む組成物で形質導入するステップと、
    ｂ）転写因子を発現させ、
    それによって、リプログラミングまたは誘導された細胞が得られるステップと、
    を含む、前記方法。
  48. 前記リプログラミングまたは誘導は、インビボ、インビトロ、またはエクスビボである、請求項４７に記載の方法。
  49. 前記方法が、形質導入された細胞を細胞培地中で培養するステップをさらに含み、前記ステップは、前記転写因子の発現の前または後に行われる、請求項４７～４８のいずれか１項に記載の方法。
  50. 前記形質導入された細胞を、ＩＦΝβ、ＩＦΝγ、ＴＮＦα、ＩＦΝα、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＣＤ４０Ｉ、Ｆｌｔ３Ｉ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮ－λ１、ＩＦＮ－ω、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－１５、プロスタグランジン２、ＳＣＦ、及びオンコスタチンＭ（ＯＭ）からなる群から選択される、１種以上のサイトカインを含む細胞培地中で培養することをさらに含む、請求項４７～４９のいずれか１項に記載の方法。
  51. 前記形質導入された細胞を、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤などの１つ以上のエピジェネティック修飾剤を含む細胞培地中で培養することをさらに含む、請求項４７～５０のいずれか１項に記載の方法。
  52. 前記ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤が、バルプロ酸である、請求項５１に記載の方法。
  53. 前記細胞が、ヒト細胞またはマウス細胞などの哺乳動物細胞である、請求項４７～５２のいずれか１項に記載の方法。
  54. 前記細胞が、幹細胞、分化細胞、及びがん細胞からなる群から選択され、
    ａ）前記幹細胞が、多能性幹細胞及び複能性幹細胞、例えば間葉系幹細胞または造血幹細胞からなる群から選択され、
    ｂ）前記分化細胞が、線維芽細胞などの任意の体細胞または単球などの造血細胞である、
    請求項４７～５３のいずれか１項に記載の方法。
  55. 前記形質導入された細胞を、少なくとも２日間、例えば少なくとも５日間、例えば少なくとも８日間、例えば少なくとも１０日間、例えば少なくとも１２日間培養する、請求項４７～５４のいずれか１項に記載の方法。
  56. 得られるリプログラミングまたは誘導された細胞が、１型の通常型樹状細胞である、請求項４７～５５のいずれか１項に記載の方法。
  57. 得られるリプログラミングまたは誘導された細胞が、クラスタ分化４５（ＣＤ４５）陽性である、請求項４７～５６のいずれか１項に記載の方法。
  58. 得られるリプログラミングまたは誘導された細胞が、クラスタ分化２２６（ＣＤ２２６）陽性である、請求項４７～５７のいずれか１項に記載の方法。
  59. 得られるリプログラミングまたは誘導された細胞が、ヒト白血球抗原－ＤＲアイソタイプ（ＨＬＡ－ＤＲ）陽性である、請求項４７～５８のいずれか１項に記載の方法。
  60. 請求項４７～５９のいずれか１項に規定された方法に従って得られるリプログラミングまたは誘導された細胞。
  61. 前記細胞が、１型通常型樹状細胞などの樹状細胞または抗原提示細胞である、請求項６０に記載のリプログラミングまたは誘導された細胞。
  62. 得られるリプログラミングまたは誘導された細胞が、表１に列挙された１つ以上の表面マーカーについて陽性である、請求項６０～６１のいずれか１項に記載のリプログラミングまたは誘導された細胞。
  63. 得られるリプログラミングまたは誘導された細胞が、ＣＤ４５、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ１４１、ＣＬＥＣ９Ａ、ＸＣＲ１、及び／またはＣＤ２２６陽性である、請求項６０～６２のいずれか１項に記載のリプログラミングまたは誘導された細胞。
  64. 医療における使用のための、請求項１～３９のいずれか１項に記載の組成物、請求項４０～４６のいずれか１項に記載の細胞、及び／または請求項６０～６３のいずれか１項に記載のリプログラミングまたは誘導された細胞。
  65. がんまたは感染症の治療における使用のための、請求項１～３９のいずれか１項に記載の組成物、請求項４０～４６のいずれか１項に記載の細胞、及び／または請求項６０～６３のいずれか１項に記載のリプログラミングまたは誘導された細胞。
  66. 前記がんが、基底細胞癌、子宮頸異形成、肉腫、生殖細胞腫瘍、網膜芽細胞腫、膠芽細胞腫、リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、血液癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、食道癌、子宮癌、膣癌、乳癌、頭頸部癌、胃癌、口腔癌、上咽頭癌、気管癌、喉頭癌、気管支癌、細気管支癌、肺癌、胸膜癌、尿路上皮癌、管腔臓器癌、食道癌、胃癌、胆管癌、腸癌、結腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、膀胱癌、尿管癌、腎臓癌、肝臓癌、胆嚢癌、脾臓癌、脳癌、リンパ系癌、骨癌、膵臓癌、白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、皮膚癌、黒色腫、及び骨髄腫からなる群から選択される、請求項６５に記載の組成物、細胞、及び／またはリプログラミングされた細胞。
  67. 前記がんが、黒色腫、頭頸部癌、乳癌、結腸直腸癌、肝臓癌、リンパ腫、膀胱尿路上皮癌、膵臓癌、及び膠芽細胞腫からなる群から選択される、請求項６６に記載の組成物、細胞、及び／またはリプログラミングされた細胞。
  68. がんまたは感染症を治療する方法であって、前記方法が、それを必要とする個体に、請求項１～３８のいずれか１項に記載の組成物、請求項４０～４６のいずれか１項に記載の細胞、請求項３９に記載の医薬組成物、及び／または請求項６０～６３のいずれか１項に記載のリプログラミングまたは誘導された細胞を投与することを含む、前記方法。
  69. がんまたは感染症を治療するための医薬を製造するための、請求項１～３８のいずれか１項に記載の組成物、請求項４０～４６のいずれか１項に記載の細胞、請求項３９に記載の医薬組成物、及び／または請求項６０～６３のいずれか１項に記載のリプログラミングまたは誘導された細胞の使用。
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