KR100975820B1

KR100975820B1 - Ｂ 세포의 활성화를 위한 세포성 ｃｄ40ｌ을 발현하는세포주

Info

Publication number: KR100975820B1
Application number: KR1020070129199A
Authority: KR
Inventors: 김태규; 박정용
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2007-12-12
Filing date: 2007-12-12
Publication date: 2010-08-16
Also published as: KR20090062096A

Abstract

본 발명은 B 세포의 활성화를 위한 세포성 CD40L을 발현하는 세포주에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는 CD4+ T 세포로부터 CD40L 유전자를 클로닝하고, 상기 클로닝된 CD40L 유전자를 발현벡터를 이용하여 HLA가 결핍된 세포로 형질도입시켜 얻은, B 세포 증식 및 항원제시능을 증가시키기 위한 세포성 CD40L을 발현하는 세포주에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, HLA가 결핍된 세포주에 CD40L 유전자를 형질도입하여 세포성 CD40L을 안정적으로 발현하는 세포주를 제조할 수 있으며, 이러한 CD40L을 안정적으로 발현하는 세포주를 이용하여 B 세포를 자극함으로써 증식능력 및 항원제시능력이 향상된 활성화된 B 세포를 얻을 수 있다. 따라서 본 발명의 세포주를 이용하여 증식 및 항원제시능이 향상된 B 세포를 함유하는 항바이러스 또는 항종양 치료제의 개발이 가능하게 될 것으로 기대된다.

항원제시능, B 세포, CD40L, 면역치료

Description

Ｂ 세포의 활성화를 위한 세포성 ＣＤ40Ｌ을 발현하는 세포주 {Cells expressing CD40L for activation of B cells}

본 발명은 B 세포의 활성화를 위한 세포성 CD40L을 발현하는 세포주에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 CD4+ T 세포로부터 CD40L 유전자를 클로닝하고, 상기 클로닝된 CD40L 유전자를 발현벡터를 이용하여 HLA가 결핍된 동물세포로 형질도입시켜 얻은, B 세포 증식 및 항원제시능을 증가시키기 위한 세포성 CD40L을 발현하는 세포주에 관한 것이다.

수지상세포(dendritic cell, DC)는 항원 포획, 처리, 제공 능력이 뛰어나 활성화된 B 세포 그리고 활성화된 대식세포를 포함하는 항원제공세포들 사이에서 가장 강력한 항원제공세포로 알려져 왔다(1,2). 항원과 결합된 수지상세포는 임상적으로 흑색종, 전립선암, 림프종, 신장세포 암과 같은 여러 암들의 치료를 위해 이용되었다(3-6). 하지만 수지상세포가 T 세포 반응을 강력하게 유도함에도 불구하고 말초 혈액에서의 한정된 개체수와 시험관내 증식의 어려움 등의 결점을 안고 있다. 수지상세포와는 대조적으로 활성화된 B 세포는 말초 혈액에서 쉽게 획득할 수 있고 시험관 내에서 증식이 가능하여 면역요법에 이점이 있다(7). 더구나 생체 밖에서 활성화된 B 세포는 항원 펩타이드나 종양 용해물의 자극에서 수지상세포와 유사하게 항원특이 T 세포 반응을 유도할 수 있는 능력을 가진다(2,8).

생체 내에서 입양면역반응동안 활성화된 CD4+ T 세포에 발현하는 CD40 ligand(CD40L)에 의해 활성신호를 받은 B 세포는 CD80, CD86, MHC class I과 class II가 수지상세포와 비슷한 수준으로 발현한다(9). 이전 연구들에서 수용성 CD40L, 항-CD40 항체 또는 CD40L 발현 세포주 같은 다양한 형태의 CD40-CD40L 결합을 통하여 시험관 내에서 B 세포 활성을 유도하였다(2,10,11). CD40-CD40L 결합에 의해서 증식된 B 세포는 시험관 내 항원 특이 세포독성 T 세포의 생성을 위한 기능적인 항원제공세포(APC)로 사용할 수 있다. 수용성 형태의 CD40L를 이용한 B 세포 활성은 NIH3T3/CD40L나 293T/CD40L 세포를 이용한 세포성 CD40L보다 시험관 내에서 항원 특이 T 세포를 생성시키는 능력이 낮았다. 그러나 이러한 세포성 CD40L를 이용한 자극법은 B 세포 자극 시 잠재적인 동종반응이나 이종반응을 야기할 수도 있다(10,11).

본 발명은 이종반응을 회피하기 위해 HLA가 결핍된 K562 세포주를 사용하여 CD40L를 안정적으로 발현하는 세포주(K562/CD40L)를 확립하였다. 이러한 K562/CD40L 세포주를 B 세포 자극에 이용하여 B 세포의 활성과 증식을 확인하고 활성화된 B 세포의 APC 기능을 확인하였다.

EBV(Ebstein Barr Virus) 림프성 세포주를 이용해 영구화시킨 B 세포들은 항 원 특이 T 세포들을 효과적으로 유도할 수 있었다(13,14). 비록 EBV-LCL(EBV-lymphoblastoid cell line)의 생성이 간단하고 항원제공세포 기능을 유지하지만 살아있는 바이러스 이용에 관한 안정성의 문제점과 EBV-LCL를 확립하기 위해 4∼6주간이 기간이 필요하다는 단점이 있었다. 이전 연구들에서 B 세포 활성은 다양한 형태의 CD40L로 자극되었으며, 활성화된 B 세포는 시험관 내에서 바이러스와 종양항원 특이적인 세포독성 T 세포의 활성화와 면역반응을 유도하기 위한 항원제공세포로 이용되었다(2,8). 레트로바이러스 형질도입, 펩타이드 감작과 RNA 형질전환을 이용하여 활성화된 B 세포를 자극하여 면역반응을 유도하는 연구가 진행되었으며, 수지상세포와 비슷하게 항원 특이 CD8+ T 세포를 유도하였다(7,8,12). 다양한 형태의 B 세포 자극은 주로 수용성 CD40L와 세포성 CD40L의 두 가지 형태로 이용되어 왔다. 임상실험에서 시험관내 항원 특이 T 세포 유도를 위해 수용성 CD40L를 B 세포 활성에 이용되었지만 세포성 CD40L보다 자극 수준이 낮았다(2). 그러므로 세포성 CD40L을 발현하는 NIH3T3 세포주나 293T 세포주를 이용하여 B 세포의 증식을 유도하였으나 NIH3T3 세포에서의 이종반응과 293T 세포에서 동종반응이 야기 되는 문제점이 있었다(10-12).

이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 본 발명의 활성화된 B 세포는 말초 혈액에서 쉽게 획득할 수 있고 시험관 내에서 증식이 가능하며 면역치료에 사용이 용이하다는 장점이 있다. 더구나 생체 밖에서 활성화된 B 세포는 항원의 자극에서 수지상세포와 유사하게 항원특이 T 세포 반응을 유도할 수 있는 능력을 가짐을 확인하고, 본　발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 주된 목적은 증식능 및 항원제시능이 향상된 B 세포의 활성화를 위한 세포성 CD40L을 발현하는 세포주 및 그 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 증식능 및 항원제시능이 향상된 B 세포를 유효성분으로 함유하는 B 세포 매개성 면역치료제를 제공하는데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 CD4+ T 세포로부터 CD40L 유전자를 클로닝하고, 상기 클로닝된 CD40L 유전자를 발현벡터를 이용하여 HLA가 결핍된 동물세포로 형질도입시켜 얻은, B 세포 증식 및 항원제시능을 증가시키기 위한 세포성 CD40L을 발현하는 세포주를 제공한다.

본 발명의 세포주에서, 상기 CD40L 유전자는 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개, 래빗, 마우스, 래트, 기니피그, 햄스터 등의 동물로부터 유래된 CD40L 유전자일 수도 있으나, 포유동물로부터 유래된 CD40L 유전자로부터 발현된 세포성 CD40L이 인간 B 세포 자극 시 잠재적인 동종반응이나 이종반응을 야기할 수도 있는 가능성을 고려한다면, 서열번호 1의 염기서열을 갖는 인간 CD40L 유전자인 것이 바람직하다.

본 발명의 세포주에서, 상기 세포주는 상기 클로닝된 CD40L 유전자를 형질도입 시킬 수 있는 어떠한 동물세포도 가능하나, 인간 B 세포 자극 시 이종반응을 회 피하기 위하여 인간 백혈구 항체(human leukocyte antigen, HLA)가 결핍된 동물세포가 바람직하며, 더욱 바람직하게는 인간 만성 골수백혈병으로부터 유래된 K562(ATCC CCL 243)세포가 적당하다. 본 발명의 실시예에서 사용된 K562 세포는 HLA 분자가 발현되지 않으며 부유세포배양이 가능하므로 배양이 용이하다는 장점을 가지고 있다.

본 발명에서, 상기 클로닝된 CD40L 유전자는 발현벡터에 삽입되어 발현된다. 여기서, “발현벡터”란 상기 클로닝된 CD40L 유전자가 삽입 또는 도입될 수 있는 플라스미드, 바이러스 또는 기타 매개체를 의미한다. 본 발명에 따라 클로닝된 CD40L 유전자 서열은 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있으며, 상기 작동 가능하게 연결된 유전자 서열과 발현 조절 서열은 선택 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함될 수 있다. “작동 가능하게 연결(poerably linked)”된다는 것은 적절한 분자가 발현 조절 서열에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 발현 조절 서열일 수 있다. 상기 “발현 조절 서열(expression control sequence)”이란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 폴리뉴크레오티드 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리포좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전시 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 상기 플라스미드의 예로는 대장균 유래 플라스미드(pBR322, pBR325, pUC118 및 pUC119, pET-22b(+)), 바실러스 서브틸리스 유래 플라스미드(pUB110 및 pTP5) 및 효모 유래 플라스미드(YEp13, YEp24 및 YCp50) 등이 있으며 상기 바이러스는 레트로바이러스, 아데노바이러스 또는 백시니아 바이러스와 같은 동물 바이러스, 배큘로바이러스와 같은 곤충 바이러스가 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 CD40L 유전자를 숙주세포에 도입시키는데 적합한 벡터를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 CD40L 발현 유도가 용이하도록 디자인된 벡터를 사용할 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예서는, 프로모터와 neomycin 저항성 유전자를 포함하는 발현벡터 pcDNA3/Neo(Invitrogen, Carlsbad, CA, 미국)에 삽입하여 도 1a의 개열지도를 갖는 pcDNA3/CD40L을 제작하였다.

본 발명의 CD40L 유전자를 포함하는 재조합벡터는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 숙주세포에 도입할 수 있다. 상기 본 발명에 따른 재조합 벡터를 숙주세포에 도입하는 방법으로는, 이에 한정되지는 않으나, 염화칼슘(CaCl₂) 및 열쇼크(heat shock) 방법, 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스터(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 전기천공법(electroporation) 및 PEG(polyethylenglycol)에 의한 침전법 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는, 상기 pcDNA3/CD40L 재조합벡터를 NucleofectorTM kit V(Amaxa Biosystems, 독일)를 사용하여 K562 세포 내로 형질도입시켰다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 세포주와의 혼합배양에 의해 활성화된 B 세포를 제공한다.

본 발명의 활성화된 B 세포에서, 상기 활성화된 B 세포는 항원제공능이 향상된 것을 특징으로 한다.

본 발명에서 “혼합배양”은, B 세포를 활성화시키기 위하여 웰 플레이트(well plate) 상 필요로 하는 성장인자(growth factors) 또는 사이토카인(cytokines)의 존재 하에서 혼합배양용 배지에서 B 세포와 본 발명의 세포주를 함께 배양하는 것을 의미한다.

본 발명의 세포주에 의해 활성화된 B 세포는 APC 기능과 연관성이 있는 CD54, CD80, CD86 및 HLA class II의 발현이 증가하였다(도 3 참조). 본 발명의 활성화된 B 세포(B-K562/CD40L 세포)는 말초혈액 B 세포(Peripheral Blood B cell, PBB)나 B-K562세포 보다 T 세포의 증식을 현저히 증가하였다 (도 4a 참조). 여기서, PBB는 자극시키지 않은 말초혈액 B 세포, B-K562는 단순히 K562세포로만 자극시킨 B 세포, 그리고 B-K562/CD40L은 본 발명에 따른 K562/CD40L로 자극시킨 B 세포를 의미한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 활성화된 B 세포를 유효성분으로 함유하는 B 세포 매개성 항바이러스 면역치료제를 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 활성화된 B 세포를 유효성분으로 함유하는 B 세포 매개성 항종양 면역치료제를 제공한다.

본 발명에서“B 세포 매개성 면역치료제”란 면역세포와 면역 관련 조직의 기능을 복원 또는 향상시키기 위하여 살아있는 자가(autologous), 동 종(allogenic), 또는 이종(xenogenic) B 세포를 체외에서 증식 혹은 선별하거나 다른 방법으로 B 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 행위를 통해 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 신개념 의약품을 말한다. 구체적으로는 환자 자신이나 타인 또는 다른 동물의 B 세포를 채취하여 증식시키거나 활성화 시켜 면역치료에 이용하는 등 적용범위가 넓고, 각종 난치성 질환의 치료에 무한한 가능성을 가지고 있다.

또한, 상기 “항종양 또는 항바이러스 면역치료제”는 면역시스템을 유도하는데 있어 B 세포를 이용하는 것으로, 본 발명에서 활성화된 B 세포에 항종양 또는 항바이러스 항원을 탑재시킨 후, 상기 종양 또는 바이러스에 대하여 특이적으로 작용하는 T 세포의 자극 및 증식을 목적으로 투여하는, 상기 항원이 탑재되어 활성화된 B 세포를 포함하는 약학적 조성물을 의미한다. 면역치료에 사용되는 B 세포는 환자의 말초혈액으로부터 분리된 단핵구세포에서 분화된 B 세포를 사용하며, 환자 유래 B 세포를 활성화 시킨 뒤, 다시 환자에 투여함으로서 면역치료의 효과를 얻을 수 있다.

본 발명의 항종양 또는 항바이러스 면역치료제는 당업계에 일반적인 제형, 예컨대 주사제의 형태로 제조될 수 있으며, 외과수술적으로 예상투여 부위에 직접 이식하거나, 정맥에 투여된 후 예상 투여부위로 이동할 수 있다. 본 발명의 면역치료제는 질병의 유형, 투여경로, 환자의 나이 및 성, 및 질병의 정도에 따라 적절히 선택될 수 있으나, 바람직하게는 평균 성인의 경우, 1× 10⁶ ~ 10¹¹ 세포를 투여한 다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 세포성 CD40L을 발현하는 K562 세포주의 제조방법을 제공한다:

a) CD4+ T 세포의 cDNA로부터 제한효소 EcoRI과 NotI을 이용하여 CD40L을 클로닝하는 단계; 및

b) 상기 클로닝된 CD40L을 발현벡터에 삽입한 후, K562 세포 안으로 형질 도입하는 단계.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 세포주와 B 세포를 혼합배양 함으로써, 시험관내에서 B 세포의 증식 및 항원제시능을 증가시키는 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 시험관내에서 B 세포의 증식 및 항원제시능을 증가시키는 방법은, 상기 B 세포와 본 발명의 세포주의 혼합배양을 1:1 내지 1:4 세포수 비율로 수행하는 것이 좋으나, 바람직하게는 1:2 내지 1:4, 더욱 바람직하게는 1:2의 세포수 비율로 수행하는 것이 적당하다.

본 발명의 실시예에서 확인된 혼합배양 비율인 1:0.25, 1:0.5, 1:1, 1:2 및 1:4에서 B 세포와 본 발명의 세포주는 뭉치는 현상을 보였는데, 1:0.25 와 1:0.5 비율에서 B 세포의 증식은 유도되지 못하였다. 흥미로운 점은 1:2와 1:4 비율에서 B 세포에서 뭉치는 정도가 크고 증식도 강하게 유도되었으나(도 2a와 2b), 1:4 비율의 B 세포 자극에서는 많은 K562/CD40L 잔유물이 생겨서 반복적인 자극에는 부적합하여, 본 발명의 실시예에서는 B 세포와 K562/CD40L을 1:2의 비율로 혼합배양함 으로써 B 세포를 자극하였다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1. CD19+ B 세포의 분리

백혈구 성분채집술(leukapheresis)과 비등차 분획법(Ficoll-Paque density gradient)(Parmacia, Piscataway, NJ)을 이용하여 건강한 공여자의 말초혈액 단핵구세포(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)를 획득하였다. MACS CD19 Microbeads isolation kit (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)를 이용하여 CD19+ B 세포를 분리하였다. B 세포의 순도는 유세포분석(flow cytometry analysis)(Becton Dickinson, Immunocytometry system, CA, USA)으로 검사하였으며 모든 실험들에서 90% 이상을 유지하였다(data not shown).

실시예 2. CD4+ T 세포(CD40L 발현세포)의 분리

백혈구 성분채집술(leukapheresis)과 비등차 분획법(Ficoll-Paque density gradient)(Parmacia, Piscataway, NJ)을 이용하여 건강한 공여자의 말초혈액 단핵구세포(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)를 획득하였다. MACS CD4 Microbeads isolation kit (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)를 이용하여 CD4+ T 세포를 분리하였다.

실시예 3. 인간 CD40L 유전자 클로닝

인간 CD40L(human CD40 ligand) 유전자의 PCR 증폭 주형을 위해, 우선 실시예 2에서 분리된 CD40L 발현세포(CD4+ T cell)의 mRNA를 주형으로 Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit(Roche)를 이용하여 cDNA를 준비하였다. 상기 cDNA를 주형으로 하기 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 95℃에서 5분 1회, 95℃에서 30초, 57℃에서 30초, 72℃에서 40초를 30회 반복, 72℃에서 10분 1회 조건으로 실시하였다. PCR로 획득된 인간 CD40L DNA를 제한효소인 EcoRI과 NotI으로 절단 후 프로모터(SV40ori)와 neomycin 저항성 유전자를 함유한 pcDNA3/Neo (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)안으로 클로닝을 하였다(pcDNA3/CD40L, 도 1a). 클로닝된 유전자는 염기서열분석으로 확인하였다(서열번호 1 참조).

상기 PCR에 사용된 프라이머 서열은 다음과 같다.

CD40L-F 5'-GCGGGCGGAATTCATGATCGAAACATACAACC-3',

CD40L-R 5'-GCGGGCCATATGTCAGAGTTTGAGTAAGCCAAG-3'

실시예 4. CD40L를 발현하는 K562 세포주 확립

B 세포의 증식을 유도하기 위해 K562/CD40L 세포주를 확립하였다. CD40L를 발현하는 K562 세포주(pcDNA3/CD40L)는 K562 세포(ATCC CCL 243) 안으로 Nucleofector^TM kit V (Amaxa Biosystems, Germany)를 이용하여 실시예 3에서 제조된 재조합벡터 pcDNA3/CD40L를 형질도입 함으로써 제조하였다(도 1a). CD40L이 형질도입된 K562세포들은 10% FBS (Sigma, St. Louis, Mo., USA), 2 mM 글루타민(glutamine; Gibco/BRL, Gaithersburg, MD), 100 U/ml 페니실린(penicillin; Cambrex Bio Science)이 함유된 RPMI1640(Cambrex Bio Science, Walkersvile, MD USA)에서 배양되었으며, 1 mg/ml G418 (Duchefa, Hearlem, The Nethelands)과 CD40L 항체를 이용한 유세포 분류기(fluorescence-activated cell sorting, FACS)에 의해 선별되었다. 실험이 진행되는 동안 K562 세포에서 CD40L의 발현은 안정적(± 10%)이었다. CD40L 형질도입 된 K562 세포는 상기와 같이 G418 약제와 CD40L 항체를 이용한 유세포 분류기를 이용해 선별하였으며, 선별된 K562/CD40L 세포주의 CD40L의 발현량은 6개월 이후에도 80% 이상을 유지하였다(도 1b).

실시예 5. 수지상세포의 생성

수지상세포는 종래의 방법과 동일하게 생성하였다(2). 간략히 기술하면, MACS CD14 Microbeads isolation kit (Miltenyi Biotec)을 이용하여 PBMC로부터 CD14+ 단핵구(CD14+는 monocyte 마커)를 획득하였고, IL-4(Endogen, Woburn, MA)와 GM-CSF(Endogen, Rockford, IL, USA)와 함께 10% RPMI1640에서 7일 동안 배양하였다. 배양액은 4일째에 추가적으로 공급하였으며, 7일째에 50 ng/ml GM-CSF, 10 ng/ml tumor necrosis factor (TNF)-α(Endogen), 1μg/ml LPS (Sigma) 그리고 10 ng/ml IL-4를 이용해 24시간 동안 성숙을 유도하였다(monocyte에서 수지상세포 유도).

실시예 6. K562/CD40L에 의한 B 세포 활성화

실시예 1에서 분리된 B 세포 (5× 10⁵ cells/ml)는 100Gy로 조사된 K562/CD40L와 함께 12-well plates (Nunc, Rochester, NY, USA)에서 20 ng/ml IL-4를 첨가한 10% Iscove’s modified Dulbecco’s medium (IMDM)(Cambrex)를 이용하여 배양하였다. 증식된 B 세포는 3∼4일에 채취하여 증가된 수를 측정하였다. 그 후에 조사된 K562/CD40L와 활성화된 B 세포(5× 10⁵ cells/well)를 새로운 배양액과 함께 다시 배양하였다. 세포수와 생존율은 Trypan Blue 염색법에 의해 측정되었고, 비등차 분획법을 이용하여 사멸된 B 세포와 K562/CD40L의 잔유물을 제거한 후, 이용할 때까지 액체질소에서 보관하였다.

K562/CD40L과 B 세포의 비율에 따른 B 세포의 활성화 정도를 측정하기 위하여 IL-4(20 ng/ml)를 첨가한 상태에서 고정된 수의 B 세포와 K562/CD40L의 비율을 1：0.25에서 1：4로 조절하여 자극시켰다. 모든 비율의 자극에서 K562/CD40L과 B 세포는 뭉치는 현상을 보였다. 하지만 1：0.25나 1：0.5 비율에서 B 세포의 증식은 유도되지 못하였다. 흥미로운 점은 1：2와 1：4 비율에서 B 세포에서 뭉치는 정도가 크고 증식도 강하게 유도되었으나(도 2a와 2b), 1：4 비율의 B 세포 자극에서는 많은 K562/CD40L 잔유물이 생겨서 반복적인 자극에는 부적합하여, 본 발명에서는 K562/CD40L을 1：2의 비율로 B 세포를 자극하였다. 14일 동안 K562/CD40L로 자극시킨 B 세포(B-K562/CD40L)는 6배정도 증가 되었으나, 말초혈액 B 세포와 K562만으로 자극시킨 B(B-K562)세포는 모두 사멸되었다(도 2c).

또한, K562/CD40L은 B 세포를 14일 동안 자극하여 3배 증가시켰고, CD40 항체로 자극한 증식보다 현저히 높았다 (도 2c). 종래 CD40L를 발현하는 S2 세포주를 이용한 자극에서 B 세포를 활성화시키긴 하였지만 높은 증식을 유도하지 못한 것(11)과 달리 본 발명의 K562/CD40L는 높은 증식을 유도하였다. 이러한 결과는 K562 세포에는 CD54 (ICAM-1), CD58 (LFA-3)과 αVβ3 (vitronectin 수용체) 등과 같은 세포결합에 관여하는 세포부착분자들이 발현하기 때문에, 세포간에 강한 결합력이 작용하여 효과적인 자극이 이루어진 것으로 예측된다.

실시예 7. K562/CD40L에 의한 B 세포의 항원제공분자 발현

PE-conjugated anti-CD154/CD40L, anti-CD54, anti-CD80, anti-CD86 및 anti-HLA Class II (BD Pharmingen, San Diego, CA)를 이용하여 K562와 활성화된 B 세포의 보조자극분자들과 활성 표지자들의 발현을 측정하였다. 표현형은 유세포 분석기를 이용하여 종래의 방법으로 분석하였다(11). 간략히 기술하면, 100 ul PBS(Cambrex)안의 1백만 개의 세포들은 2% FBS가 함유된 PBS로 두 번 세척한 후 0.5μg 단클론 항체(PE-conjugated anti-CD154/CD40L, anti-CD54, anti-CD80, anti-CD86 및 anti-HLA Class II의 단클론항체)를 20분 동안 4℃에서 염색시켰다. 염색된 세포를 세척 후 1% 파라포름알데히드(Paraformaldehyde)가 함유된 PBS로 고 정시켰다. 유세포 분석은 실시예 4에서 언급한 유세포 분석기와 CellQuest software(BD Biosciences)를 이용하여 수행하였다.

즉, B 세포에서 APC 기능과 연관성이 있는 표현형의 변화를 측정하기 위하여 자극시키지 않은 말초혈액 B 세포와 7일 동안 활성화 시킨 B 세포에서 CD54, CD80, CD86 그리고 HLA class II의 발현을 측정하였다. 말초혈액 B 세포와 비교하여 B-K562/CD40L 세포에서 CD54, CD80, CD86 그리고 HLA class II 발현량이 증가하였다(도 3). 이들 발현은 자극 1일 후부터 증가되기 시작하였다(data not shown).

실시예 8. B-K562/CD40L 세포의 항원제공능을 확인하기 위한 혼합 림프구 반응(mixed lymphocyte reaction)

혼합 림프구 반응(mixed lymphocyte reaction, MLR)은 XTT assay (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)를 이용하여 종래의 방법으로 생존한 T 세포를 측정하였다(11). 간략히 기술하면, MACS CD4 Microbeads isolation kit (Miltenyi Biotec)를 이용하여 CD4+ T 세포를 분리하였다. 분리된 동종 T 세포(1× 10⁵)는 동일한 수의 활성화된 B 세포와 96-well flat-bottomed tissue culture plates (Falcon, Bedford, MA)에서 6일 동안 배양을 하였다. 흡광도는 490 nm에서 ThermoMax microplate reader (Molecular Devices, Palo Alto, CA, USA)로 측정하였다.

B-K562/CD40L 세포의 항원제공능을 확인하기 위하여, 혼합림프구 반응을 측 정한 결과, 도 4a에서와 같이, T 세포의 증식은 말초혈액 B 세포나 B-K562 세포에서보다 B-K562/CD40L 세포에 의해서 상당한 증가를 보였다. 하지만 이러한 B 세포를 이용한 T 세포 증식은 성숙 수지상세포(mature Dendritic Cell, mDC)보다는 낮은 수준이었다.

이러한 항원제공세포로서 B-K562/CD40L 세포를 이용한 MLR 분석법을 통해서 K562/CD40L에 의해 활성화된 B 세포가 성숙 수지상세포보다는 낮았지만, 높은 T 세포 증식을 유한다는 것을 확인하였다(도 4a). 또한 실시예 4에서, 활성화된 B 세포의 표면분자를 분석한 결과를 통해 K562/CD40L로 자극했을 때 수용성 CD40L나 다른 세포성 CD40L로 자극했을 때와 비교하여 CD54와 CD80은 동일한 수준으로 발현하였으며 CD86과 HLA class II는 높게 발현하는 걸 확인하였다(도 3).

실시예 9. 바이러스 항원 자극에 의한 IFN-γ 발현 림프구의 측정

ELISPOT assay는 종래의 방법으로 수행하였다(8). 간략히 기술하면, ELISPOT kit (BD biosciences)를 사용하였다. 7일 동안 K562/CD40L에 의해 활성화된 B 세포에 인간 거대 세포바이러스(human cytomegalovirus, HCMV)인 pp65 HLA-A*0201 결합 펩타이드 495∼503 (NLVPMVATV)(10μg/ml)을 결합시킨 후 자극세포로 이용하였다. MACS CD8 Microbeads isolation kit (Miltenyi Biotec)를 이용하여 CD8+ T 세포를 분리하였다. 분리된 CD8+ T 세포(5× 10⁴ cells/well)는 활성화된 B 세포(5× 10³ cells/well)와 함께 혼합하였다. 혼합된 세포들은 U-bottomed 96-well plate (Falcon)에서 100μl 배양액에 4시간 동안 배양되었다. Spot들을 나타내기 위하여 streptavidin-HRP와 기질을 이용하였으며 ELISPOT reader (AID, Jessup, MD)를 이용하여 측정하였다.

또한 B-K562/CD40L 세포에 항원을 감작시킨 후 CD8+ T 세포를 자극시켜 T 세포 면역반응의 점화(priming)를 유도하였다. 성인 80∼90%가 면역화 되어있어 넓은 면역반응을 일으키는 HCMV 항원인 pp65를 사용하였다. 도 4b의 ELISPOT 검사법에서 pp65가 감작된 B 세포는 CD8+ T (5× 10⁴)에서 성숙 수지상세포 만큼 IFN-γ 분비하는 T 세포의 높은 증가를 유도하였다. 더구나 단일 T 세포에서 분비하는 IFN-γ 양은 K562/CD40L-B 세포와 성숙 수지상세포가 유사하였다.

상기 HCMV항원인 pp65 펩타이드를 이용한 ELISPOT 검사법을 통해서, K562/CD40L-B 세포가 성숙 수지상세포보다 IFN-γ의 분비하는 세포수는 적었지만 단일세포에서 분비하는 IFN-γ 양에서는 큰 차이를 보이지 않았다(도 4b). 종래의 알려진 방법(19)으로 활성화된 B 세포는 성숙 수지상세포보다 낮은 항원제공능을 가진다고 알려졌지만, 본 발명의 K562/CD40L에 의해 자극된 B 세포는 더 높은 항원제공능을 보였다.

통계학적 처리

모든 결과들은 mean± SE로 표현하였으며, 각 실험군 간의 통계학적 유의성은 Student's t-test에 의하여 검정하였다. 통계적 유의성은 p-value＜0.05인 경우 에만 인정하였다. 통계분석은 SigmaPlot 2000 software(SPSS Inc. Chicago, IL, USA)를 이용하였다.

이상 설명한 바와 같이, HLA가 결핍된 세포주에 CD40L을 형질도입 함으로써 세포성 CD40L을 안정적으로 발현하는 세포주를 얻을 수 있으며, 이러한 CD40L을 발현하는 세포주는 증식능력 및 항원제시능력이 향상된 활성화된 B 세포를 제조하는 데 이용될 수 있다. 따라서 본 발명의 세포주 또는 그에 의해 활성화된 B 세포는 항바이러스 또는 항종양 면역치료제로서 사용될 수 있으며, 향후 면역치료 분야에서 B 세포의 항원제공세포(antigen presenting cell)로서의 다양한 적용을 기대할 수 있다.

[참고문헌]

도 1a는 본 발명에 따른 CD40L 유전자가 클로닝된 pcDNA3/CD40L 재조합벡터의 개열지도이다.

도 1b는 본 발명에 따른 K562/CD40L 세포주에서 CD40L 발현률을 유세포 분류기를 이용하여 확인한 것이다.

도 2a는 본 발명에 따른 K562/CD40L 세포주와 B 세포간의 자극 비율을 확인한 것이다.

도 2b는 본 발명에 따른 K562/CD40L 세포주에 의해 자극된 B 세포의 형태를 분석한 것이다.

도 2c는 본 발명에 따른 K562/CD40L 세포주에 의해 자극된 B 세포와 수용성 CD40L에 의해 자극된 B 세포의 14일 동안 B 세포의 증식을 비교한 그래프이다.

도 3은 본 발명에 따라 활성화된 B 세포의 CD54, CD80, CD86 및 HLA class II 표현형을 유세포 분류기를 이용하여 분석한 결과이다.

도 4a는 본 발명에 따른 K562/CD40L로 활성화된 B 세포, 말초혈액 B 세포, B-K562 세포 및 성숙 수지상세포에 의한 동종이계 T 세포의 증식을 비교한 결과이다.

도 4b는 본 발명에 따른 K562/CD40L로 활성화된 B 세포, 말초혈액 B 세포, B-K562 세포 및 성숙 수지상세포에 의한 인터페론 감마 분비 T 세포의 유도를 비교한 결과이다.

<110> Korea University Industry and Academy Cooperation Foundation <120> Cells expressing CD40L for activation of B cells <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 786 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atgatcgaaa catacaacca aacttctccc cgatctgcgg ccactggact gcccatcagc 60 atgaaaattt ttatgtattt acttactgtt tttcttatca cccagatgat tgggtcagca 120 ctttttgctg tgtatcttca tagaaggctg gacaagatag aagatgaaag gaatcttcat 180 gaagattttg tattcatgaa aacgatacag agatgcaaca caggagaaag atccttatcc 240 ttactgaact gtgaggagat taaaagccag tttgaaggct ttgtgaagga tataatgtta 300 aacaaagagg agacgaagaa agaaaacagc tttgaaatgc aaaaaggtga tcagaatcct 360 caaattgcgg cacatgtcat aagtgaggcc agcagtaaaa caacatctgt gttacagtgg 420 gctgaaaaag gatactacac catgagcaac aacttggtaa ccctggaaaa tgggaaacag 480 ctgaccgtta aaagacaagg actctattat atctatgccc aagtcacctt ctgttccaat 540 cgggaagctt cgagtcaagc tccatttata gccagcctct gcctaaagtc ccccggtaga 600 ttcgagagaa tcttactcag agctgcaaat acccacagtt ccgccaaacc ttgcgggcaa 660 caatccattc acttgggagg agtatttgaa ttgcaaccag gtgcttcggt gtttgtcaat 720 gtgactgatc caagccaagt gagccatggc actggcttca cgtcctttgg cttactcaaa 780 ctctga 786

Claims

CD4+ T 세포로부터 CD40L 유전자를 클로닝하고, 상기 클로닝된 CD40L 유전자를 발현벡터를 이용하여 K562(ATCC CCL 243)세포로 형질도입시켜 얻은, B 세포 증식 및 항원제시능을 증가시키기 위한 세포성 CD40L을 발현하는 세포주.
제 1항에 있어서, 상기 CD40L은 서열번호 1의 염기서열을 갖는 인간 CD40L 유전자인 것을 특징으로 하는 세포주.
삭제
제 1항에 있어서, 상기 발현벡터는 도 1a의 개열지도를 갖는 pcDNA3/CD40L인 것을 특징으로 하는 세포주.
삭제
삭제
삭제
삭제
하기 단계를 포함하는 세포성 CD40L을 발현하는 K562 세포주의 제조방법:

a) CD4+ T 세포의 cDNA로부터 제한효소 EcoRI과 NotI을 이용하여 CD40L을 클로닝하는 단계; 및

b) 상기 클로닝된 CD40L을 발현벡터에 삽입한 후, K562 세포안으로 형질 도입하는 단계.
제 1항의 세포주와 B 세포를 혼합배양 함으로써 시험관내에서 B 세포의 증식 및 항원제시능을 증가시키는 방법.
제 10항에 있어서, 상기 B 세포와 세포주의 혼합배양은 1:1 내지 1:4인 것을 특징으로 하는 방법.