CN114181971A - 一种靶向trbc1 car-t细胞的制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种靶向TRBC1CAR‑T细胞的制备方法与应用，包括如下步骤：(1)构建携带TRBC1‑CAR及抗体或细胞因子基因的重组慢病毒质粒；(2)将携带TRBC1‑CAR及抗体或细胞因子基因的重组慢病毒质粒及辅助质粒转染宿主细胞，制备可感染T细胞的重组慢病毒载体；(3)从供者提供的外周血中分离PBMC，使用磁珠分离、活化T细胞；(4)将步骤(2)所得的重组慢病毒载体转导进入T细胞，产生表达TRBC1‑CAR的同时分泌抗体或细胞因子的CAR‑T细胞；(5)将步骤(4)所得细胞体外培养；(6)将步骤(5)所得细胞大量扩增；(7)收集CAR‑T细胞。本发明该CAR‑T细胞表达TRBC1‑CAR同时可以分泌抗体或细胞因子，能更好的克服肿瘤微环境的免疫抑制，增强CAR‑T细胞对肿瘤细胞的杀伤能力。

Description

一种靶向TRBC1 CAR-T细胞的制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，特别是涉及一种靶向TRBC1 CAR-T细胞的制备方法。
背景技术
嵌合抗原修饰的T细胞(ChimericAntigen Receptor modifiedT cell，CAR-T) 是一种经过基因改造的T细胞，利用基因转导技术将含有肿瘤抗原特异性识别单链抗体(scFv)和T细胞激活基序的CAR导入患者T细胞，使得这些转导了CAR的T细胞能直接识别癌细胞表面抗原而活化，进而杀死癌细胞。正是因为CAR-T细胞杀伤癌细胞不需要借助抗原递呈，而大大提高癌细胞杀伤效率。
2012年美国宾夕法尼亚大学Carl June教授使用靶向CD19的嵌合抗原受体修饰的T细胞治愈白血病患儿EmilyWhitehead，2017年美国FDA又突破性批准两款CAR-T细胞药物用于B细胞白血病和淋巴瘤治疗，成为细胞治疗领域的一个里程碑。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是提供一种靶向TRBC1 CAR-T细胞的制备方法与应用，该CAR-T细胞表达TRBC1-CAR同时可以分泌抗体或细胞因子，能更好的克服肿瘤微环境的免疫抑制，增强CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤能力。
为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：一种靶向TRBC1 CAR-T细胞的制备方法，包括如下步骤：
(1)构建携带TRBC1-CAR及抗体或细胞因子基因的重组慢病毒质粒；
(2)将携带TRBC1-CAR及抗体或细胞因子基因的重组慢病毒质粒及辅助质粒转染宿主细胞，制备可感染T细胞的重组慢病毒载体；
(3)从供者提供的外周血中分离PBMC，使用磁珠分离、活化T细胞；
(4)将步骤(2)所得的重组慢病毒载体转导进入T细胞，产生表达 TRBC1-CAR的同时分泌抗体或细胞因子的CAR-T细胞；
(5)将步骤(4)所得细胞体外培养；
(6)将步骤(5)所得细胞大量扩增；
(7)收集表达TRBC1-CAR的同时分泌抗体或细胞因子的CAR-T细胞。
进一步地说，所述抗体为PD-1抗体。
进一步地说，所述细胞因子为IL18细胞因子。
进一步地说，所述TRBC1-CAR所包含的scFv区域为优化密码子后得到的序列，如SEQ ID NO.1所示。
进一步地说，所述重组慢病毒质粒是靶向TRBC1抗原且分泌IL18细胞因子的慢病毒转基因质粒。
进一步地说，所述重组慢病毒质粒是第三代慢病毒转基因质粒。
进一步地说，所述重组慢病毒载体依此包含CMV启动子序列、TRBC1 单链抗体、C-myc表位标记、CD8α嵌合受体跨膜区、胞内信号传导区、EF1 启动子序列、IL2SS序列、PD-1抗体序列。
进一步地说，步骤(2)中所述的重组慢病毒载体将靶向TRBC1抗原的嵌合抗原受体表达在T细胞表面，同时能够分泌IL18细胞因子。
进一步地说，所述宿主细胞为293FT细胞或293T细胞。
一种靶向TRBC1 CAR-T细胞，用于制备抗肿瘤的细胞治疗药物，特别是靶向TRBC1阳性的肿瘤干细胞的细胞治疗药物。
本发明的有益效果：
本发明通过表达TRBC1-CAR而识别和结合肿瘤细胞表面高表达的 TRBC1的糖蛋白，并通过胞内信号传导区将信号传入T细胞，从而活化T细胞，促进T细胞分泌细胞因子，该细胞因子进而可以杀伤高表达TRBC1的肿瘤细胞。此外，构建一种CAR-T细胞还可以分泌PD-1抗体，阻断PD-1对效应细胞活性的抑制。
具体实施方式
下面对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
实施例1制备表达TRBC1-CAR的同时分泌PD-1抗体的CAR-T细胞
制备方法如下：
一、优化密码子：准备TRBC1嵌合抗原受体(CAR)，进行密码子优化，使之更易于在人体细胞内表达，密码子优化后地序列为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
二、构建携带TRBC1-CAR及抗体基因的慢病毒质粒：
通过基因合成获得TRBC1-CD8-CD28-4-1BBL-CD3ζ+EF1+anti PD1基因，且基因两端分别带有SanB1/Sall酶切位点。所述TRBC1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，EF1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，CD8、 CD28、4-1BBL、CD3ζ等基因的核苷酸序列分别如SEQID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示。SnaB1/Sall双酶切 pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP载体，通过in-Fusion技术将各基因片段克隆至载体中，挑选阳性克隆测序。鉴定正确的质粒扩大培养。获得靶向TRBC1且分泌PD-1抗体的慢病毒载体，命名为pCDH-CMV-TRBC1-Myc-EF1- anti-PD1-3rd质粒。
三、携带TRBC1-CAR及抗体基因的重组慢病毒质粒感染293FT细胞，制备可感染T细胞的重组慢病毒载体；
1. 293FT细胞长到80％时，提前1h换无双抗培养液；
2.配置lipo2000(40μL)+1.5ml OptimMEM，混匀，静置5min；
3.配置质粒混合液：准备一支无菌的5mL离心管加入1.5mL无血清 Opti-MEM培养液、辅助质粒(pRSV-Rev、pCMV-VSV-G、pMDLg-pRRE，和慢病毒表达质粒pCDH-CMV-TRBC1-Myc-EF1-anti-PD1-3rd，充分吹打混匀；
4.Coating dish：10％Ploy-L-Lys+80％PBS，3ml/10cm dish，37℃10 min；
5.将lipo2000和质粒一起混匀，静置20min；
6. 1X TE消化293FT细胞，37℃消化1min；
7. 1000rpm离心3min收集细胞，PBS或DMEM清洗一次；
8.将Ploy-L-Lys coating好的dish用PBS清洗3次；
9.向coating好的dish中加入5ml DMEM；
10.向每个dish中加入3ml lipo2000和质粒的混合液；
11.向每个dish中加入3ml用DMEN重悬的293FT细胞，充分混匀，均匀铺版，37℃培养；
12. 12h后换液，DMEM含10％FBS，无双抗；
13. 36h后观察细胞中荧光表达情况；
14.收集细胞培养液，4℃保存；
15.向培养皿中加入8ml培养液，继续37℃培养，生产病毒；
16. 36h后收集培养液；
17. 4500rpm离心5min；
18. 0.45μm滤膜过滤；
19.将滤液放入超速离心管中，18000rpm离心3h；
20.弃上清，沉淀用DMEM重悬；
21.再用1ml DMEN洗一次，将重悬液加入真空超速离心管中，共6-7ml；
22.向离心管底部加3ml 20％蔗糖溶液；
23. 24000rpm离心2h；
24.弃上清，吸干液体；
25.用100μl PBS重悬沉淀；
26. 4℃摇床溶解；
27.-80℃保存；
28.有限稀释法感染293FT细胞测定包装有重组载体的慢病毒滴度。
四、从供者提供的外周血中分离PBMC；
1.用抗凝管采集健康人外周血15mL，室温静止30min；
2. 400g离心30min，吸出血浆备用；
3.用PBS稀释抗凝血(1:1)混匀，依据样品体积取15mL离心管，按1:2 加入淋巴细胞分离液(Ficoll)，血液样本缓慢加入Ficoll，速度尽量缓慢，450g 离心，25min；
4.离心结束后，小心吸取淋巴细胞分离液上方的白膜层，转入一个新的 15mL离心管中，加入PBS，300g离心10min，弃上清；
5.再次加入10mL PBS重悬细胞，160g离心15min，弃上清；
6.最后加入10mL的RPMI培养基重悬，300g离心10min，弃上清即得到PBMC。
五、使用磁珠分离、活化T细胞：
1.以约1×106/mL密度加入淋巴细胞培养液培养，并按照磁珠：细胞比例为1:1加入同时包被有抗CD3和CD28抗体的磁珠和终浓度为300U/mL的重组人IL-2刺激培养48h；
2.Retronectin包被24孔板，每孔加入380μL 5μg/mL的Retronectin溶液 (PBS)，4℃孵育过夜；
3.去除24孔板中的Retronectin溶液(PBS)，1mL PBS洗2次。
六、采用步骤(3)所得的重组慢病毒载体转导进入T细胞，产生表达 TRBC1-CAR的同时分泌PD-1抗体的CAR-T细胞：
1.在转染前1h，步骤(5)所得培养液中补加终浓度为10μg/mL的 Polybrene以提高转染效率，将细胞接种于包被了Retronectin的24孔板中，每孔细胞数目3×105，培养液体积600μL；
2.按照MOI＝10，在PBMCs细胞中加入浓缩后的慢病毒，32℃，1800rpm，离心40min后，转移至细胞培养箱中培养。
七、将步骤(6)所得细胞体外培养：按照MOI＝10，在PBMCs细胞中加入浓缩后的慢病毒，32℃，1800rpm，离心40min后，转移至细胞培养箱中培养。
八、将步骤(7)所得细胞大量扩增：感染后的细胞每隔一天采用5×105/mL 的密度进行传代，同时在淋巴细胞培养液中补加终浓度为300U/mL的重组人 IL-2。
九、取部分细胞悬液，加入BFA 24h后，ELISA检测上清液中PD-1的分泌情况，与对照组相比实验组分泌PD-1抗体，说明成功制得表达TRBC1-CAR 且分泌PD-1抗体的CAR-T细胞，将细胞扩大培养并冻存。
十、培养7天后收集细胞，获得表达TRBC1-CAR且分泌PD-1抗体的 CAR-T细胞。
实施例2：制备表达TRBC1-CAR的同时分泌IL18的CAR-T细胞
制备方法如下：
一、优化密码子：准备TRBC1嵌合抗原受体(CAR)，即TRBC1-CAR，进行密码子优化，使之更易于在人体细胞内表达，密码子优化后地序列为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
二、构建携带TRBC1-CAR及细胞因子基因的慢病毒载体骨架。
通过基因合成获得TRBC1-CD8-CD28-4-1BBL-CD3ζ+NFAT+IL18基因，且基因两端分别带有SanB1/Sall酶切位点。所述NFAT基因的核苷酸序列如 SEQ ID NO.6所示，CD8、CD28、4-1BBL、CD3ζ等基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQIDNO.5所示。SnaB1/Sall 双酶切pCDH-CMV-MCS-NFAT-copGFP载体，通过IN-Fusion技术将各基因片段克隆至载体中，挑选阳性克隆测序。鉴定正确的质粒扩大培养。获得靶向TRBC1且分泌IL-12细胞因子的慢病毒载体，命名为 pCDH-CMV-TRBC1-Myc-NFAT-IL18-3rd质粒。
三、携带TRBC1-CAR及细胞因子基因的重组慢病毒质粒感染293FT细胞，制备可感染T细胞的重组慢病毒载体。
1. 293FT细胞长到80％时，提前1h换无双抗培养液；
2.配置lipo2000(40μL)+1.5ml OptimMEM，混匀，静置5min；
3.配置质粒混合液：准备一支无菌的5mL离心管加入1.5mL无血清 Opti-MEM培养液、辅助质粒(pRSV-Rev、pCMV-VSV-G、pMDLg-pRRE，和慢病毒表达质粒pCDH-CMV-TRBC1-Myc-NFAT-IL18-3rd，充分吹打混匀；
4.Coating dish：10％Ploy-L-Lys+80％PBS，3ml/10cm dish，37℃10 min；
5.将lipo2000和质粒一起混匀，静置20min；
6. 1x TE消化293FT细胞，37℃消化1min；
7. 1000rpm离心3min收集细胞，PBS或DMEM清洗一次；
8.将Ploy-L-Lys coating好的dish用PBS清洗3次；
9.向coating好的dish中加入5ml DMEM；
10.向每个dish中加入3ml lipo2000和质粒的混合液；
11.向每个dish中加入3ml用DMEN重悬的293FT细胞，充分混匀，均匀铺版，37℃培养；
12. 12h后换液，DMEM含10％FBS，无双抗；
13. 36后观察细胞中荧光表达情况；
14.收集细胞培养液，4℃保存；
15.向培养皿中加入8ml培养液，继续37℃培养，生产病毒；
16. 36h后收集培养液；
17. 4500离心5min；
18. 0.45m滤膜过滤；
19.将滤液放入超速离心管中，18000rpm离心3h；
20.弃上清，沉淀用DMEM重悬；
21.再用1ml DMEN洗一次，将重悬液加入真空超速离心管中，共6-7ml；
22.向离心管底部加3ml 20％蔗糖溶液；
23. 24000rpm离心2h；
24.弃上清，吸干液体；
25.用100μl PBS重悬沉淀；
26. 4℃摇床溶解；
27.-80℃保存；
28.有限稀释法感染293FT细胞测定包装有重组载体的慢病毒滴度。
四、从供者提供的外周血中分离PBMC。
1.用抗凝管采集健康人外周血15mL，室温静止30min；
2. 400g离心30min，吸出血浆备用；
3.用PBS稀释抗凝血(1:1)混匀，依据样品体积取15mL离心管，按1:2 加入淋巴细胞分离液(Ficoll)，血液样本缓慢加入Ficoll，速度尽量缓慢，450g 离心，25min；
4.离心结束后，小心吸取淋巴细胞分离液上方的白膜层，转入一个新的 15mL离心管中，加入PBS，300g离心10min，弃上清；
5.再次加入10mL PBS重悬细胞，160g离心15min，弃上清；
6.最后加入10mL的RPMI培养基重悬，300g离心10min，弃上清即得到PBMC。
五、使用磁珠分离、活化T细胞。
1.以约1×106/mL密度加入淋巴细胞培养液培养，并按照磁珠：细胞比例为1:1加入同时包被有抗CD3和CD28抗体的磁珠和终浓度为300U/mL的重组人IL-2刺激培养48h；
2.Retronectin包被24孔板，每孔加入380μL 5μg/mL的Retronectin溶液(PBS)，4℃孵育过夜；
3.去除24孔板中的Retronectin溶液(PBS)，1mL PBS洗2次。
六、采用步骤三所得的重组慢病毒载体转导进入T细胞，产生表达 TRBC1-CAR的同时分泌细胞因子IL18的CAR-T细胞。
1.在转染前1h，步骤(5)所得培养液中补加终浓度为10μg/mL的 Polybrene以提高转染效率，将细胞接种于包被了Retronectin的24孔板中，每孔细胞数目3×105，培养液体积600μL；
2.按照MOI＝10，在PBMCs细胞中加入浓缩后的慢病毒，32℃，1800rpm，离心40min后，转移至细胞培养箱中培养。
七、将步骤六所得细胞体外培养：按照MOI＝10，在PBMCs细胞中加入浓缩后的慢病毒，32℃，1800rpm，离心40min后，转移至细胞培养箱中培养。
八、将步骤七所得细胞大量扩增：感染后的细胞每隔一天采用5×105/mL 的密度进行传代，同时在淋巴细胞培养液中补加终浓度为300U/mL的重组人 IL-2。
九、取部分细胞悬液，与靶细胞U251-TRBC1共培养后，再用PMA刺激两天，ELISA检测上清液中IL18的分泌情况，与对照组相比IL18的分泌增强，说明成功制得表达TRBC1-CAR且分泌细胞因子IL-12的CAR-T细胞。
十、培养7天后收集细胞，获得表达TRBC1-CAR且分泌细胞因子IL-12 的CAR-T细胞。
实施例3制备的表达TRBC1-CAR的同时分泌IL18的CAR-T细胞和表达TRBC1-CAR的同时分泌PD-1抗体的CAR-T细胞体外杀伤验证
分别培养Raji细胞和效应细胞表达TRBC1-CAR的同时分泌IL18的 CAR-T细胞和表达TRBC1-CAR的同时分泌PD-1抗体的CAR-T细胞和表达 TRBC1-CAR的CAR-T细胞。
收集靶细胞Raji4×105cells和效应细胞(CAR-T细胞)各3×106cells， 300g，离心10min，慢升慢降，弃上清；用1ml PBS溶液分别重悬靶细胞和效应细胞，300g，离心10min，慢升慢降，弃上清；重复一次；用700μl培养基(AIM-V培养基+10％FBS)重悬效应细胞，用2ml培养基(1640培养基 +10％FBS)重悬靶细胞。
设置效靶比为0.31:1、0.63:1、2.5:1、5:1的实验孔，并设置对照组，每组3个复孔，37℃5％CO2培养箱中培养2h；500g，离心5min，慢升慢降平板离心；取每个孔的20μl上清到新96孔板中，并且每孔加入50μl底物溶液，室温避光孵育15min；每孔加入50μl终止液，酶标仪检测490nm吸光度。不同效靶比条件下，表达TRBC1-CAR的同时分泌IL18的CAR-T细胞和表达TRBC1-CAR的同时分泌PD-1抗体的CAR-T细胞在Raji靶细胞中杀伤效率明显强于表达TRBC1-CAR的CAR-T细胞，当效靶比为5:1时，本发明制得的表达TRBC1-CAR的同时分泌IL18的CAR-T细胞和表达TRBC1-CAR 的同时分泌PD-1抗体的CAR-T细胞肿瘤杀伤能力分别为56％和60％。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Figure RE-GDA0003507077240000101
Figure RE-GDA0003507077240000111
Figure RE-GDA0003507077240000121
Figure RE-GDA0003507077240000131
序列表
<110> 东莞市麦亘生物科技有限公司
<120> 一种靶向TRBC1 CAR-T细胞的制备方法与应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 762
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgctgctgc tggtgacctc tctgctgctc tgcgaactgc ctttctgctg atccctcagg 60
tgcagctgca gcagtcagga gcagaactcg tgagaccagg agcctcagtg gcaaggccag 120
cggctacacc ttcagcgact tcgagatgca ttgggtgaag cagacaccag tgcacggcct 180
cgagtggatt ggcgatatcg acccaggcac aggcgataca gcctacaacc tgaagttcaa 240
accctgacca ccgataagag cagcagcacc gcctacatgg agctgagaag cctgaccagc 300
gaggacagcg ccgtgtacta ttgcaccctg ggagccttcg tgtattgggg acagggcaca 360
ctggtgacag tgtccgccgc taaaaccacc cctaagctgg gtttagcgag gctagagtgg 420
acgtggtggt gacacagacc cctctgtctc tgccagtgtc cttcggcgat tctcttgccg 480
gagctctcag agcctggcca acagctacgg caacacctac ctgtcttggt acctgcacaa 540
gcccggacag agccctcagc cggcatctcc aaccggttca gcggcgtgcc agacagattc 600
agcggaagcg gcagcggcac agacttcacc ctgaagatca gcaccatcaa gcccgaggac 660
ctgggcatgt actattgcct gcagggcacc caccagcctt atacctttgg cggaggcacc 720
aagctggaga tcaagagagc cgacgccgct gcagccggat ct 762
<210> 2
<211> 219
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ttcgtccccg tgttcctgcc acaactaccc ctgctccacg accacctact ccagcaccta 60
ccatcgcaag tcagcccctg tcactgcgac ctgaggcttg ccggccagca gctggaggag 120
cagtgcacac gacttcgcat gcgatatcta catttgggca ccactggctg gaacctgtgg 180
ggtcctgctg ctgagcctgg tcatcaccct cacagaaat 219
<210> 3
<211> 103
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gctcccgact gctgcattcc gactacatga acatgacacc tcggagacca gaaagcatta 60
ccagccatat gccccaccca gggatttcgc agcctatcgg agc 103
<210> 4
<211> 121
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cggttcagcg tcgtgaaaag aaactgctgt acatcttcaa gcagcctttt atgcgcccag 60
tgcagacaac tcaggaggaa gacggatgct cttgtcggtt gaggaaggag gctgcgagct 120
g 121
<210> 5
<211> 299
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tcagccggag cgccgatgca ccagcatatc agcagggaca gaatcagctg tacaacgagc 60
tgaatctggg caggcgcgag gaatatgacg tgctggataa gcgacgagga aaatgggagg 120
aaaacccaga aggaagaacc ctcaggaggg gctgtataat gaactgcaga aagacaagat 180
ggctgaggca tacagcgaaa ttggaatgaa aggagagcgc cgacggggga agggacacga 240
cagggactgt caaccgccac taaagatacc tacgacgcac tgcacatgca ccaagatga 299
<210> 6
<211> 464
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gagggacagc agcccccagg gatgtaatta cgtccctccc ccgctagggg gcagcagcga 60
gccgcccggg gctccgctcc ggtccggcgc tccccccgca tccccgagcc ggggacagcc 120
cgggcacggg gaaggtggca cgggatcgct ttcctctgaa cgcttctcgc tgctctttga 180
gcctgcagac acctgggggg atacggggaa ggaaaaactg tttcatacag aaggcgggag 240
gaaaaactgt ttcatacaga aggcgggagg aaaaactgtt tcatacagaa ggcgggagga 300
aaaactgttt catacagaag aaactgtttc atacagaagg cgggaggaaa aactgtttca 360
tacagaaggc gattttgaca cccccataat atttttccag ataaattgca tctcttgttc 420
aagagttccc tatcactctc tttaatcact actcacagta ctgc 464
<210> 7
<211> 896
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gtgaggtctt aggctctggc aaaaccctgt caaagagttt ggagatgctg gccagtacac 60
ctgtcacaaa ggaggcgagg ttctaagcca ttcgctcctg ctgcttcaca aaaaggaaga 120
tggaatttgg tccactgaga ccagaaagaa cccaaaaata agacctttct aagatgcgag 180
gccaagaatt attctggacg tttcacctgc tggtggctga cgacaatcag tactgatttg 240
acattcagag cagaggctct tctgaccccc aaggggtgac gtgcggagct gctacactct 300
ctgcagagga gtcagagggg acaacaagga gtatgagtac tcagtgggga cagtgcctgc 360
ccagctgctg aggagagtct gcccattgag gtcatggtgg atgccgttca caagctcaag 420
tatgaaaact acaccagcag cttcttctca tcaaacctga cccacccaag aacttgcagc 480
tgaagccatt aaagaattct cggcaggtgg aggtcagctg ggagtaccct gacacctgga 540
gtactccttc tccctgacat tctgcgttca ggtccagggc aagagcaaga gagaaaagaa 600
agatagagtc ttcacggaca agacctcagc cacggtcatc tgccgcaaaa atgccagcgg 660
gcccaggacc gctactatag ctcatcttgg agcgaatggg catctgtgcc ctgcaggggc 720
ggaggcggaa gcggaggcgg aggaagcgca gcagaaacct ccccgtggcc actccagacc 780
caggaatgtt cccatgcctt caccactccc aaaacctgct gagggccgct ccagaaggcc 840
agacaaactc tagaatttta cccttgcact tctgaagaga ttgatcatga agatat 896

Claims (10)

1.一种靶向TRBC1 CAR-T细胞的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)构建携带TRBC1-CAR及抗体或细胞因子基因的重组慢病毒质粒；
(2)将携带TRBC1-CAR及抗体或细胞因子基因的重组慢病毒质粒及辅助质粒转染宿主细胞，制备可感染T细胞的重组慢病毒载体；
(3)从供者提供的外周血中分离PBMC，使用磁珠分离、活化T细胞；
(4)将步骤(2)所得的重组慢病毒载体转导进入T细胞，产生表达TRBC1-CAR的同时分泌抗体或细胞因子的CAR-T细胞；
(5)将步骤(4)所得细胞体外培养；
(6)将步骤(5)所得细胞大量扩增；
(7)收集表达TRBC1-CAR的同时分泌抗体或细胞因子的CAR-T细胞。
2.根据权利要求1所述的一种靶向TRBC1 CAR-T细胞的制备方法，其特征在于：所述抗体为PD-1抗体。
3.根据权利要求1所述的一种靶向TRBC1 CAR-T细胞的制备方法，其特征在于：所述细胞因子为IL18细胞因子。
4.根据权利要求1所述的一种靶向TRBC1 CAR-T细胞的制备方法，其特征在于：所述TRBC1-CAR所包含的scFv区域为优化密码子后得到的序列，如SEQ ID NO.1所示。
5.根据权利要求1所述的一种靶向TRBC1 CAR-T细胞的制备方法，其特征在于：所述重组慢病毒质粒是靶向TRBC1抗原且分泌IL18细胞因子的慢病毒转基因质粒。
6.根据权利要求1所述的一种靶向TRBC1 CAR-T细胞的制备方法，其特征在于：所述重组慢病毒质粒是第三代慢病毒转基因质粒。
7.根据权利要求1所述的一种靶向TRBC1 CAR-T细胞的制备方法，其特征在于：所述重组慢病毒载体依此包含CMV启动子序列、TRBC1单链抗体、C-myc表位标记、CD8α嵌合受体跨膜区、胞内信号传导区、EF1启动子序列、IL2SS序列、PD-1抗体序列。
8.根据权利要求1所述的一种靶向TRBC1 CAR-T细胞的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述的重组慢病毒载体将靶向TRBC1抗原的嵌合抗原受体表达在T细胞表面，同时能够分泌IL18细胞因子。
9.根据权利要求1所述的一种靶向TRBC1 CAR-T细胞的制备方法，其特征在于：所述宿主细胞为293FT细胞或293T细胞。
10.一种靶向TRBC1 CAR-T细胞，用于制备抗肿瘤的细胞治疗药物，特别是靶向TRBC1阳性的肿瘤干细胞的细胞治疗药物。
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