CN112625142A

CN112625142A - Cxcl9修饰的car-t结构及其应用

Info

Publication number: CN112625142A
Application number: CN202110145836.0A
Authority: CN
Inventors: 张毅; 田永贵
Original assignee: First Affiliated Hospital of Zhengzhou University
Current assignee: First Affiliated Hospital of Zhengzhou University
Priority date: 2021-02-03
Filing date: 2021-02-03
Publication date: 2021-04-09
Anticipated expiration: 2041-02-03
Also published as: CN112625142B

Abstract

本申请属于肿瘤免疫治疗技术领域，具体涉及一种CXCL9修饰的CAR‑T结构及其应用专利申请事宜。所述CXCL9修饰的CAR‑T结构meso‑CAR‑CXCL9，具体结构为：CD8a‑meso‑CD28‑CD3Zeta‑P2A‑CXCL9。本申请中，发明人以肺癌模型为例，基于间皮素设计获得了CAR‑T‑CXCL9细胞。初步实验结果表明，与常规的CAR‑T细胞相比，改造后细胞具有更强的细胞因子分泌和细胞毒性的能力，可以明显增加肿瘤部位的免疫细胞浸润，并抑制了血管生成，进一步地，改造后的CAR‑T‑CXCL9细胞疗法减缓了肿瘤的生长，延长了小鼠的存活率，表现出优异的抗肿瘤活性。

Description

CXCL9修饰的CAR-T结构及其应用

技术领域

本申请属于肿瘤免疫治疗技术领域，具体涉及一种CXCL9修饰的CAR-T结构及其应用专利申请事宜。

背景技术

肿瘤的免疫疗法中，CAR-T（Chimeric Antigen Receptor T，嵌合抗原受体T）免疫疗法在治疗血液恶性肿瘤方面表现出良好的临床疗效，其中，靶向CD19的CAR-T细胞已被批准用于治疗CD19阳性淋巴瘤或白血病。但针对实体瘤的CAR-T细胞疗法受多种挑战的阻碍，尚未取得预期的疗效。其主要原因在于：T细胞在肿瘤部位的迁移和积累是实现其效应功能的第一步，但是实体瘤的隐蔽位置和复杂的微环境使免疫细胞难以进入。因此，如何改善实体瘤中肿瘤内T细胞浸润效果是解决CAR-T细胞疗法在实体瘤中应用的重要前提。

已有研究认为，趋化因子及其受体在T细胞的迁移中起着至关重要的作用。而趋化因子在肿瘤部位的表达又与T细胞浸润、肿瘤控制和患者预后密切相关。因此，对于趋化因子-趋化因子受体网络的研究，对于控制T细胞迁移具有十分重要的技术意义。

现有技术研究表明，CXCL9（干扰素γ诱导单核因子）作为CXC家族一员，在免疫细胞趋化中有重要作用，CXCL9的受体是CXCR3，其主要表达在活化的T细胞和NK细胞上。另外，CXCL9可以促进效应Th1和Th17细胞的极化，从而增强免疫应答和抗肿瘤作用。此外，还有报道认为，没有ELR（Glu-Leu-Arg）序列的CXCL9通过抑制血管生成，从而可以延迟肿瘤的进展；另外，研究认为CXCL9可用作预测患者免疫反应的生物标志物，其表达与肿瘤患者的预后更好相关。

总之，目前关于CXCL9在肿瘤中作用的相关研究主要是通过构建过表达CXCL9肿瘤模型，诱导CXCL9在肿瘤中高表达或在肿瘤内注射重组CXCL9蛋白来抑制肿瘤生长的研究方式来确定其具体用途或者应用效果的。但尚未见到将CXCL9与CAR-T技术联合应用的相关报道。

发明内容

基于现有CXCL9和CAR-T技术研究，本申请目的在于提供一种利用CXCL9修饰改造CAR-T结构，从而为免疫细胞浸润及增强CAR-T细胞的抗肿瘤效果奠定一定技术基础。

本申请的技术方案详述如下。

CXCL9修饰的CAR-T结构，将其命名为：meso-CAR-CXCL9，具体结构为：依次连接的人CD8a分子信号肽（CD8a）、人间皮素抗体来源的scFv（meso）、人CD28分子跨膜区与CD28分子胞内区（CD28）、人CD3z分子胞内区（CD3Zeta），P2A连接序列（P2A）、CXCL9 CDS区序列（CXCL9）；即：CD8a—meso—CD28—CD3Zeta（CD3ζ）—P2A—CXCL9；

各片段的具体序列结构为：

人CD8a分子信号肽（CD8a）序列（63bp，SEQ ID No.1）：

ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCG；

人间皮素抗体来源的scFv（meso）序列（873bp，SEQ ID No.2）：

CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGCGGCCTGGGGCCTCAGTGCAGGTTTCCTGCAGGGCATCTGGATACTCCATCAACACCTACTATATGCAATGGGTGCGACAGGCCCCTGGAGCAGGGCTTGAGTGGATGGGAGTAATCAACCCTAGTGGTGTCACAAGCTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACCTTGACCAATGACACGTCCACGAACACAGTCTACATGCAGCTGAACAGCCTGACATCTGCAGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGATGGGCATTGTGGGGGGATTTCGGGATGGACGTCTGGGGCAAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCCGGTGGTGGTGGTTCCGACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTATTGGAGACAGAGTCACCATCACCTGCCGGGCCAGTGAGGGTATTTATCACTGGTTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCAGGGAAAGCCCCTAAACTCCTGATCTATAAGGCCTCTAGTTTAGCCAGTGGGGCCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTTATTACTGCCAACAATATAGTAATTATCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGGAGATCAAAACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGAT；

人CD28分子跨膜区与CD28分子胞内区（CD28）序列（204bp，SEQ ID No.3）：

TTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC；

人CD3z分子胞内区（CD3Zeta）序列（336bp，SEQ ID No.4）：

AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC；

P2A连接序列（66bp，SEQ ID No.5）：

GGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCT；

人CXCL9基因（CDS区）序列（375bp，SEQ ID No.6）：

ATGAAGAAAAGTGGTGTTCTTTTCCTCTTGGGCATCATCTTGCTGGTTCTGATTGGAGTGCAAGGAACCCCAGTAGTGAGAAAGGGTCGCTGTTCCTGCATCAGCACCAACCAAGGGACTATCCACCTACAATCCTTGAAAGACCTTAAACAATTTGCCCCAAGCCCTTCCTGCGAGAAAATTGAAATCATTGCTACACTGAAGAATGGAGTTCAAACATGTCTAAACCCAGATTCAGCAGATGTGAAGGAACTGATTAAAAAGTGGGAGAAACAGGTCAGCCAAAAGAAAAAGCAAAAGAATGGGAAAAAACATCAAAAAAAGAAAGTTCTGAAAGTTCGAAAATCTCAACGTTCTCGTCAAAAGAAGACTACA。

也即，meso-CAR-CXCL9序列（1917bp）为：

ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGCGGCCTGGGGCCTCAGTGCAGGTTTCCTGCAGGGCATCTGGATACTCCATCAACACCTACTATATGCAATGGGTGCGACAGGCCCCTGGAGCAGGGCTTGAGTGGATGGGAGTAATCAACCCTAGTGGTGTCACAAGCTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACCTTGACCAATGACACGTCCACGAACACAGTCTACATGCAGCTGAACAGCCTGACATCTGCAGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGATGGGCATTGTGGGGGGATTTCGGGATGGACGTCTGGGGCAAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCCGGTGGTGGTGGTTCCGACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTATTGGAGACAGAGTCACCATCACCTGCCGGGCCAGTGAGGGTATTTATCACTGGTTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCAGGGAAAGCCCCTAAACTCCTGATCTATAAGGCCTCTAGTTTAGCCAGTGGGGCCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTTATTACTGCCAACAATATAGTAATTATCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGGAGATCAAAACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCGGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCTATGAAGAAAAGTGGTGTTCTTTTCCTCTTGGGCATCATCTTGCTGGTTCTGATTGGAGTGCAAGGAACCCCAGTAGTGAGAAAGGGTCGCTGTTCCTGCATCAGCACCAACCAAGGGACTATCCACCTACAATCCTTGAAAGACCTTAAACAATTTGCCCCAAGCCCTTCCTGCGAGAAAATTGAAATCATTGCTACACTGAAGAATGGAGTTCAAACATGTCTAAACCCAGATTCAGCAGATGTGAAGGAACTGATTAAAAAGTGGGAGAAACAGGTCAGCCAAAAGAAAAAGCAAAAGAATGGGAAAAAACATCAAAAAAAGAAAGTTCTGAAAGTTCGAAAATCTCAACGTTCTCGTCAAAAGAAGACTACA。

含有所述CXCL9修饰的CAR-T结构meso-CAR-CXCL9的重组质粒，以pCDH-EF1-conGFP质粒为表达载体，重组有meso-CAR-CXCL9结构。

所述CXCL9修饰的CAR-T结构meso-CAR-CXCL9在制备抗肿瘤药剂中的应用，用于抑制肿瘤细胞血管生成，同时对肺癌相关肿瘤具有抑制作用；所述肺癌具体例如为表达间皮素肺癌细胞系H322、A549相关肺癌。

基于已有研究，发明人认为，CAR-T细胞在实体瘤治疗中的不尽人意与肿瘤微环境中浸润性T细胞的积累不足高度相关，而鉴于CXCL9在调节T细胞迁移和抑制肿瘤血管生成中的关键性作用，发明人利用趋化因子CXCL9来修饰改造CAR-T细胞，以获得表达CXCL9的CAR T细胞（CAR-T-CXCL9）。

为此，本申请中，发明人以肺癌模型为例，基于间皮素设计获得了CAR-T-CXCL9细胞（meso-CAR-CXCL9）。初步实验结果表明，与常规的CAR-T细胞相比，改造后的CAR-T-CXCL9细胞具有更强的细胞因子分泌和细胞毒性的能力，可以明显增加肿瘤部位的免疫细胞浸润，并抑制了血管生成，进一步地，改造后的CAR-T-CXCL9细胞疗法减缓了肿瘤的生长，延长了小鼠的存活率，表现出优异的抗肿瘤活性。这为CAR-T技术在实体瘤中的应用奠定了一定技术基础，同时也为其他肿瘤的治疗提供了较好的借鉴和参考。

附图说明

图1为 CAR-T结构改造、转染效率及CXCL9表达情况，其中：A，两种不同CAR分子meso-CAR、meso-CAR-CXCL9结构示意图；B，流式细胞术检测CAR T细胞的转染效率结果；C和D分别为CAR T细胞胞质和培养上清中CXCL9的表达情况，其中UTD为未转染的T细胞；

图2为CAR T细胞的CD4亚群极化及细胞因子的表达情况，其中：A，CAR T细胞中CD4亚群Th1和Th17的极化比例；B，流式细胞术检测CAR T细胞中效应细胞因子的表达；

图3为CAR T细胞对不同肿瘤细胞（A549和H322）的杀伤效率结果图；

图4为CAR T细胞上清的transwell结果；

图5为 HUVEC的血管生成情况，其中A图为显微观察结果，B图为具体统计结果；

图6为小鼠肺癌模型检测不同T细胞的抗肿瘤效果，其中：A，不同时间点小鼠的肿瘤荧光图；B，荧光统计图。

具体实施方式

下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明。在介绍具体实施例前，就下述实施例中部分实验背景情况简要介绍说明如下。

生物材料：

CXCL9修饰改造的CAR结构（meso-CAR-CXCL9）由中国上海Sangon Biotech合成，并以pCDH-EF1-conGFP质粒（购自Systembio公司）为表达载体，将合成的meso-CAR-CXCL9编码序列DNA整合重组进入pCDH-EF1-conGFP质粒中；

人肺癌细胞系（H322和A549）、人脐静脉内皮细胞HUVEC和人胚胎肾细胞系293T均从中科院上海细胞库中获得；

实验过程中，所有细胞系均在含有10%胎牛血清（同时根据需要添加有100 U / mL青霉素和/或100μg/ mL链霉素）的DMEM或RPMI-1640培养基（Gibco）中培养；

实验试剂：

CD3/CD28 活化beads购自Miltenyi Biotec公司；

流式抗体购自BioLegend公司；

LEGENDplex TM人促炎性趋化因子试剂盒购自BioLegend公司；

5µm Transwell板购自康宁Coring公司；

基质胶购自BD Biosciences公司；

5周龄的雌性NOD / SCID小鼠从北京维通利华公司获得；

实验仪器：

BD流式细胞仪（BD, BD FACSCanto II）、C6流式细胞仪（BD，BD Accuri®C6Plus），BIO-RAD温度梯度PCR仪（BIO-RAD，C1000 Touch）、电泳仪（北京六一生物科技有限公司，DYY-6D）、蓝光切胶仪（Sangon Biotech，G500312 EQU312）、荧光显微镜（OLYMPUS，IX73）等仪器均为本领域常用设备，不再赘述。

实施例1

本申请利用CXCL9修饰改造CAR-T细胞的改造方法，以肺癌模型为例，基于间皮素靶点设计嵌合抗原受体，利用CXCL9来修饰改造CAR-T细胞，先设计特定的CAR结构，然后再对T细胞进行标记，具体过程简介如下。

（一）CAR结构设计

基于第二代CAR结构设计靶向间皮素的CAR（meso-CAR），具体为依次连接的：人CD8a分子信号肽（CD8a）、人间皮素抗体来源的scFv、人CD28分子跨膜区与CD28分子胞内区、人CD3z分子胞内区（CD3Zeta），即：CD8a—meso—CD28—CD3Zeta（CD3ζ）；

也即，CXCL9修饰后CAR（meso-CAR-CXCL9）结构为：依次连接的人CD8a分子信号肽（CD8a）、人间皮素抗体来源的scFv、人CD28分子跨膜区与CD28分子胞内区、人CD3z分子胞内区（CD3Zeta），P2A连接序列（P2A）、CXCL9 CDS区序列（CXCL9）；即：CD8a—meso—CD28—CD3Zeta（CD3ζ）—P2A—CXCL9。

各片段的具体序列结构为：

人CD8a分子信号肽（CD8a）序列（63bp，SEQ ID No.1）：

ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCG；

人间皮素抗体来源的scFv序列（873bp，SEQ ID No.2）：

人CD3z分子胞内区（CD3Zeta）序列（336bp，SEQ ID No.4）：

P2A连接序列（66bp，SEQ ID No.5）：

GGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCT；

人CXCL9基因（CDS区）序列（375bp，SEQ ID No.6）：

也即，meso-CAR全长序列为（1476bp）：

ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGCGGCCTGGGGCCTCAGTGCAGGTTTCCTGCAGGGCATCTGGATACTCCATCAACACCTACTATATGCAATGGGTGCGACAGGCCCCTGGAGCAGGGCTTGAGTGGATGGGAGTAATCAACCCTAGTGGTGTCACAAGCTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACCTTGACCAATGACACGTCCACGAACACAGTCTACATGCAGCTGAACAGCCTGACATCTGCAGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGATGGGCATTGTGGGGGGATTTCGGGATGGACGTCTGGGGCAAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCCGGTGGTGGTGGTTCCGACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTATTGGAGACAGAGTCACCATCACCTGCCGGGCCAGTGAGGGTATTTATCACTGGTTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCAGGGAAAGCCCCTAAACTCCTGATCTATAAGGCCTCTAGTTTAGCCAGTGGGGCCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTTATTACTGCCAACAATATAGTAATTATCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGGAGATCAAAACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC

meso-CAR-CXCL9序列（1917bp）：

基于间皮素的CAR结构（meso-CAR）及CXCL9修饰改造CAR结构（meso-CAR-CXCL9）设计如图1A所示。基于此结构设计及上述序列，发明人委托中国上海Sangon Biotech合成了相关序列。随后，以pCDH-EF1-conGFP质粒为表达载体，使用限制性内切酶EcoR I(NEB)在37℃对其进行酶切，然后利用In-Fusion HD Cloning Kits(宝生物)将合成的编码序列DNA整合重组进入pCDH-EF1-conGFP质粒中。最后，将连接产物转化感受态细胞，筛选、扩大培养后进一步提取质粒，即可获得可表达meso-CAR或meso-CAR-CXCL9的重组慢病毒表达质粒（相关操作参考现有技术常规操作即可，不再赘述）。

作为对照，发明人以未结合CXCL9的CAR结构同步进行相关实验。

（二）CAR-T细胞制备

首先，进行慢病毒包装，以293T细胞作为初步待转染细胞，具体操作而言：

六孔板铺板并在37℃、5%CO₂培养箱孵育以培养293T细胞（DMEM培养基）24h，将培养基更换为OPTI-MEM培养基；

再将1.5g构建的慢病毒表达质粒（步骤（一）所构建）、1.5g包装质粒psPAX2、和1g质粒PMD2.G，以及脂质体转染试剂8 µL进行混合，以对目的细胞293T进行转染；

转染12小时后更换为正常的DMEM培养基；

继续培养48小时后收取病毒上清（即为包装完成的病毒样颗粒），1500rpm离心10分钟，取上清-80℃保存备用，以用于感染T细胞。

随后，制备CD3⁺ T细胞，具体操作而言：

采用密度梯度离心方法，从人外周血分离获得单个核细胞；

采用T细胞分离磁珠进行分离以获得纯化的CD3⁺T细胞；

将纯化得到的T细胞在24孔细胞培养板中用含有100 IU/mL IL-2的RPMI-1640进行培养；

使用前，将T细胞用CD3/CD28活化beads (1µL/10⁷ cells)进行刺激活化2天。

最后，将收集的病毒感染T细胞，具体操作而言：

利用24孔细胞培养板，每孔加活化2天后的T细胞（10⁶/孔），同时每孔加入收集的病毒上清1mL与polybrene（8μg/mL），孵育过夜以进行感染；

24小时后，更换为正常的含有100 IU/mLIL-2的RPMI-1640进行培养。

病毒感染后五天，通过流式细胞术检测绿色荧光蛋白（GFP）以分析转染效率（结果如图1B所示）。作为对照，发明人以未转导的CD3⁺ T细胞（UTD）同步进行相关实验。

通过检测T细胞GFP的表达来计算统计相关转染效率，结果表明：基于间皮素的CAR-T细胞（CARTmeso）转染效率为34.8%，而CXCL9修饰改造CAR-T细胞（CARTmeso-CXCL9）转染效率为39.2%，这一结果表明所构建的CAR表达质粒被包装成慢病毒颗粒后都能成功感染T细胞，并得到了较好表达，可以用于后续实验。

实施例2

利用实施例1所制备的CAR-T细胞，发明人进一步进行了相关细胞实验和动物实验分析，下面就相关实验项目及实验结果介绍分析如下。

（一）趋化因子CXCL9的表达分析

首先，收集病毒感染5天后T细胞，利用流式细胞术对T细胞胞质中CXCL9的表达情况进行检测。

结果如图1C所示，分析可以看出：

未转导的T细胞（UTD）和CARTmeso细胞中CXCL9表达为10%~16%，而CARTmeso-CXCL9细胞中CXCL9表达达到30%~50%，表明改造的CARTmeso-CXCL9细胞成功过表达CXCL9。

随后，测定T细胞趋化因子CXCL9的分泌水平，具体操作时：分别收集UTD细胞、CARTmeso或CARTmeso-CXCL9细胞的上清液，并用LEGENDplex TM人促炎性趋化因子试剂盒（BioLegend, 740003）检测T细胞趋化因子的分泌。

结果如图1D所示，分析可以看出：

未转导的T细胞（UTD）和CARTmeso细胞分泌CXCL9浓度为30~200pg/mL，而CARTmeso-CXCL9细胞泌CXCL9浓度达到60000~150000 pg/mL，表明改造的CARTmeso-CXCL9细胞成功过表达CXCL9，并得到了较好表达，可以用于后续实验。

（二）CAR-T细胞功能分析

首先，检测T细胞中CD4⁺ T细胞的极化情况，具体而言：收集病毒感染5天后的T细胞，用含有2%血清的PBS洗涤收集的T细胞，细胞中加入1μL CD3和CD4流式抗体(BioLegend)进行表面染色，避光于4°C孵育20分钟；然后将细胞分别与400μL、4%多聚甲醛和1mL破膜剂在4°C孵育30分钟；接下来将细胞与1μL内因子抗体(BioLegend)染色(IFN-γ、IL-17)；使用流式细胞仪分析所有样品。

结果如图2A所示，分析可以看出：

UTD和CARTmeso细胞中CD4⁺ IFN--γ⁺和CD4⁺ IL-17⁺比例均在10%~15%，CARTmeso-CXCL9细胞CD4⁺ IFN--γ⁺和CD4⁺ IL-17⁺比例分别在20%~30%，CARTmeso-CXCL9细胞中效应细胞Th1和Th17的极化增加，表明过表达CXCL9增加CARTmeso-CXCL9细胞中效应细胞亚群Th1和Th17的分化，促进免疫应答。

随后，分析T细胞功能性细胞因子的表达，具体而言：将 H322细胞与T细胞按照效靶比1：1共孵育6小时；用含有2%血清的PBS洗涤收集的T细胞，细胞中加入1μL CD3流式抗体进行表面染色，避光于4°C孵育20分钟；然后将细胞分别与4%多聚甲醛和破膜剂在4°C孵育30分钟；接下来将细胞与1μL细胞因子抗体(BioLegend)染色(IFN-γ、IL-17和TNF-α)；使用流式细胞仪分析所有样品。

结果如图2B所示，分析可以看出：

与肿瘤细胞共孵育之后，相比于UTD细胞，CARTmeso细胞表达功能分子的能力增加，而CARTmeso-CXCL9细胞的功能分子的表达比CARTmeso细胞更高，说明在CXCL9存在情况下，CARTmeso-CXCL9细胞的效应功能增加。具体例如：与肿瘤细胞共孵育6小时后，UTD表达IFN-γ为20~30%，TNF-a为10~16%，IL-17为15~25%，CARTmeso细胞表达IFN-γ为30~40%，TNF-α为10~25%，IL-17为15~30%，而CARTmeso-CXCL9细胞表达量增加，IFN-γ为40~50%，TNF-α为20~35%，IL-17为30~40%。

（三）CAR-T细胞的细胞毒性测定

以不同间皮素表达情况的肿瘤细胞作为实验对象，以CAR-T细胞作为实验“药剂”，通过肿瘤细胞凋亡来检测和评价所构建的CAR的技术效果。具体实验过程简介如下。

分别用高表达间皮素的人肺癌细胞系H322和低表达间皮素的人肺癌细胞系A549作为靶细胞，以不同处理的T细胞作为效应细胞(UTD、CARTmeso、CARTmeso-CXCL9)，按照不同的效靶比(1：1、5：1、10：1)将T细胞与靶细胞于96孔板中共孵育6小时，每组设置三个复孔。

孵育结束后，收集共孵育后细胞上清液，将细胞沉淀物用Annexin V- bindingbuffer (BioLegend)重悬，随后加入1µL Annexin V antibody (BioLegend)，4℃的避光环境中孵育20分钟；上机前再加入1µL Propidium(碘化丙碇，Sigma)。采用流式细胞仪上机检测分析。

结果如图3所示，可以看出：

即使针对不同的肿瘤细胞，相比于UTD细胞，CARTmeso细胞均可以有效的特异性杀伤高表达间皮素的肿瘤细胞，而在相同比例下CARTmeso-CXCL9细胞的杀伤效果比CARTmeso细胞更好，这一结果说明：在CXCL9存在情况下，CARTmeso-CXCL9细胞对于肿瘤细胞的清除效果更好。具体例如：在效靶比为10：1情况下，其差异效果更为明显，CARTmeso细胞对高表达间皮素的肿瘤细胞的清除效果在30~40%，而CARTmeso-CXCL9细胞对高表达间皮素的肿瘤细胞的清除效果可达到50%以上。

（四）Transwell实验

实验时，在具有5 µm孔径聚碳酸酯膜的24孔transwell板（Corning Inc，Coring）中评估了CD3⁺T细胞的迁移能力。具体操作而言：

将600μL的T或CAR T细胞的培养上清液添加至transwell板的下室中，200μLRPMI-1640培养基重悬的活化的T细胞补充到上室中（每孔5×10⁵个细胞）；将24孔板在37℃、5%CO₂的培养箱中培养3小时；通过流式细胞术计算下室中的细胞以确定T细胞迁移的差异。

结果如图4所示，可以看出：

UTD和CARTmeso培养上清作为下室时，上室细胞迁移率为0.8~1.4，CARTmeso-CXCL9的细胞培养上清作为下室时，上室细胞迁移率为1.4~3.6，CARTmeso-CXCL9的细胞培养上清液中存在明显的T细胞积累，表明CARTmeso-CXCL9细胞具有募集活化T细胞的能力。

（五）HUVEC血管形成实验

具体操作而言：

将 96 孔板和无菌枪头放入-20℃提前预冷，将分装好保存于-20℃的基质胶（BDBiosciences）放置于 4 ℃冰箱中，使其从固态变为液态；

将基质胶与无血清 RPMI-1640 以 1：1 的比例充分混合稀释，将50μL/孔基质胶与培养基混合物加入到预冷96孔板中，37°C放置30分钟；

用100μL T或CAR T细胞的培养上清重悬3×10⁴个HUVEC细胞并接种到每个孔中；在37℃、5%CO₂的培养箱中培养4小时后观察管腔的形成。

结果如图5所示，分析可以看出：

显微镜观察结果表明，与UTD和CARTmeso培养上清相比，CARTmeso-CXCL9的培养上清液处理形成的血管明显更少（图5A）；同时统计血管形成数量表明（图5B），UTD和CARTmeso培养上清孵育HUVEC细胞形成血管数为90~160，而CARTmeso-CXCL9的培养上清液的为50~70，CARTmeso-CXCL9的细胞培养上清液大大减少了管腔的形成，表明CARTmeso-CXCL9细胞抑制血管生成。

（六）小鼠肿瘤生长的动物实验

在上述实验基础上，发明人进一步进行了小鼠动物实验，具体过程简要介绍如下。

对5周龄雌性NOD / SCID免疫缺陷小鼠，皮下注射PBS重悬的1×10⁵表达荧光素酶的H322细胞 (100µL)，构建小鼠肺癌荷瘤模型；

3天后，分别给小鼠静脉输注6×10⁶ UTD、CARTmeso细胞、CARTmeso-CXCL9细胞以及等体积的PBS进行治疗（每组4只）。

实验过程中利用小动物活体成像设备检测肿瘤表达的荧光变化（每7天拍摄一次生物发光照片）。

利用小动物活体成像设备检测肿瘤表达的荧光变化时，首先用3%异氟醚(RWD生命科学)在诱导室内麻醉小鼠；然后每只小鼠用注射器腹腔注射100uL 的d -荧光素溶液(0.15mg/mL, Yeasen Biotech Co.，Ltd.)，10分钟后利用动物活体成像设备IVIS Lumina,Series Ⅲ spectrometer (Caliper Life Science) 检测荧光，最后利用live image4.3.1 software (PerkinElmer, Waltham, MA, USA)进行分析。

结果如图6所示。结果统计及分析可以看出：

在PBS和UTD治疗组中，两者没有差异，在治疗的第14天已经有小鼠死亡，第21天两组小鼠已经全部死亡，经过CARTmeso和CARTmeso-CXCL9细胞治疗的小鼠在21天仍然全部存活，经过CARTmeso细胞治疗的小鼠肿瘤荧光达到1.6×10¹¹左右，经过CARTmeso-CXCL9细胞治疗的小鼠肿瘤荧光控制在8×10¹⁰级别，各组之间进行对比，前两组之前没有差异，后两组与前两组有明显差异，荧光明显降低，而CARTmeso-CXCL9细胞治疗组相对于CARTmeso细胞治疗组荧光进一步降低，表明CARTmeso-CXCL9细胞显示出优越的抗肿瘤能力。

综上结果而言，利用CXCL9来修饰改造CAR-T细胞后，可以改善CAR-T细胞的免疫功能并延迟肿瘤的生长。其增强抗肿瘤效果主要体现在如下三个方面：首先，CXCL9介导了Th1/Th17细胞的分化并促进CAR-T细胞的效应分子分泌；其次，CART-CXCL9细胞吸引T细胞迁移至肿瘤部位，并发挥效应功能；最后，CART-CXCL9细胞抑制血管生成以抑制肿瘤的生长。基于这些结果，可为CAR-T技术在实体瘤中的应用奠定一定技术基础。

SEQUENCE LISTING

<110> 郑州大学第一附属医院

<120> CXCL9修饰的CAR-T结构及其应用

<130> none

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 63

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccg 63

<210> 2

<211> 873

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 2

caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagcggc ctggggcctc agtgcaggtt 60

tcctgcaggg catctggata ctccatcaac acctactata tgcaatgggt gcgacaggcc 120

cctggagcag ggcttgagtg gatgggagta atcaacccta gtggtgtcac aagctacgca 180

cagaagttcc agggcagagt caccttgacc aatgacacgt ccacgaacac agtctacatg 240

cagctgaaca gcctgacatc tgcagacacg gccgtgtatt actgtgcgag atgggcattg 300

tggggggatt tcgggatgga cgtctggggc aagggaaccc tggtcaccgt ctcctcaggt 360

ggtggtggtt ctggtggtgg tggttctggt ggtggtggtt ccggtggtgg tggttccgac 420

atccagatga cccagtctcc ttccaccctg tctgcatcta ttggagacag agtcaccatc 480

acctgccggg ccagtgaggg tatttatcac tggttggcct ggtatcagca gaagccaggg 540

aaagccccta aactcctgat ctataaggcc tctagtttag ccagtggggc cccatcaagg 600

ttcagcggca gtggatctgg gacagatttc actctcacca tcagcagcct gcagcctgat 660

gattttgcaa cttattactg ccaacaatat agtaattatc cgctcacttt cggcggaggg 720

accaagctgg agatcaaaac cacgacgcca gcgccgcgac caccaacacc ggcgcccacc 780

atcgcgtcgc agcccctgtc cctgcgccca gaggcgtgcc ggccagcggc ggggggcgca 840

gtgcacacga gggggctgga cttcgcctgt gat 873

<210> 3

<211> 204

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 3

ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg 60

gcctttatta ttttctgggt gaggagtaag aggagcaggc tcctgcacag tgactacatg 120

aacatgactc cccgccgccc cgggcccacc cgcaagcatt accagcccta tgccccacca 180

cgcgacttcg cagcctatcg ctcc 204

<210> 4

<211> 336

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 4

agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60

tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120

cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180

gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240

cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300

tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336

<210> 5

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工设计

<400> 5

ggaagcggag ctactaactt cagcctgctg aagcaggctg gagacgtgga ggagaaccct 60

ggacct 66

<210> 6

<211> 375

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 6

atgaagaaaa gtggtgttct tttcctcttg ggcatcatct tgctggttct gattggagtg 60

caaggaaccc cagtagtgag aaagggtcgc tgttcctgca tcagcaccaa ccaagggact 120

atccacctac aatccttgaa agaccttaaa caatttgccc caagcccttc ctgcgagaaa 180

attgaaatca ttgctacact gaagaatgga gttcaaacat gtctaaaccc agattcagca 240

gatgtgaagg aactgattaa aaagtgggag aaacaggtca gccaaaagaa aaagcaaaag 300

aatgggaaaa aacatcaaaa aaagaaagtt ctgaaagttc gaaaatctca acgttctcgt 360

caaaagaaga ctaca 375

Claims

1.CXCL9修饰的CAR-T结构，其特征在于，将其命名为：meso-CAR-CXCL9，具体结构为：

依次连接的人CD8a分子信号肽CD8a、人间皮素抗体来源的scFv meso、人CD28分子跨膜区与CD28分子胞内区CD28、人CD3z分子胞内区CD3Zeta，P2A连接序列P2A、CXCL9的 CDS区序列CXCL9；

即：CD8a—meso—CD28—CD3Zeta—P2A—CXCL9；

各片段的具体序列结构为：

CD8a序列如SEQ ID No.1所示；

meso序列如SEQ ID No.2所示；

CD28序列如SEQ ID No.3所示；

CD3Zeta序列如SEQ ID No.4所示；

P2A序列如SEQ ID No.5所示；

CXCL9序列如SEQ ID No.6所示。

2.利用权利要求1所述含有所述CXCL9修饰的CAR-T结构所制备的重组质粒，其特征在于，以pCDH-EF1-conGFP质粒为表达载体，重组有meso-CAR-CXCL9结。

3.权利要求1所述CXCL9修饰的CAR-T结构在制备抗肿瘤药剂中的应用，其特征在于，用于抑制肿瘤细胞血管生成；同时对肺癌相关肿瘤具有抑制作用。

4.如权利要求3所述CXCL9修饰的CAR-T结构在制备抗肿瘤药剂中的应用，其特征在于，所述肺癌为表达间皮素相关肺癌。