CN114621328A

CN114621328A - 一种SARS-CoV-2病毒的免疫原、药物组合物及其应用

Info

Publication number: CN114621328A
Application number: CN202011454071.0A
Authority: CN
Inventors: 覃勉; 慕婷; 米歇尔·克莱因; 赵萍; 徐龙; 杜林森; 吴克
Original assignee: Bravovax Co ltd
Current assignee: Bravovax Co ltd
Priority date: 2020-12-10
Filing date: 2020-12-10
Publication date: 2022-06-14

Abstract

本申请公开了一种SARS‑CoV‑2病毒的免疫原、药物组合物及其应用，所述免疫原包括多种蛋白，所述多种蛋白可以装配形成SARS‑CoV‑2病毒样颗粒，所述多种蛋白包括：SARS‑CoV‑2病毒的全长S蛋白或S蛋白RBD结构域或PreS蛋白，所述S蛋白或S蛋白RBD结构域或PreS蛋白能够展示于所述SARS‑CoV‑2病毒样颗粒的包膜上，从而赋予所述SARS‑CoV‑2病毒样颗粒良好的免疫递呈效果，能够诱导机体产生高滴度的中和抗体，刺激机体产生理想的免疫应答反应，达到有效预防COVID‑19的目的。

Description

一种SARS-CoV-2病毒的免疫原、药物组合物及其应用

技术领域

本申请涉及生物制药领域，具体涉及一种SARS-CoV-2病毒的免疫原、药物组合物及其应用。

背景技术

新型冠状病毒(SARS-CoV-2，简称新冠病毒)是一种可引起人新型冠状病毒肺炎(COVID-19，简称新冠肺炎)的新发呼吸道病原体。SARS-CoV-2具有较强的传染性和较长的潜伏期。对于COVID-19，目前尚无证实有效的治疗方法和预防疫苗。

目前有研究发现，新型冠状病毒SARS-CoV-2包括棘突蛋白(Spike,S蛋白)、包膜蛋白 (Envelope,E蛋白)、膜蛋白(Membrane/matrix,M蛋白)和核衣壳蛋白(Nucleocapsid,N蛋白) 四个结构蛋白。其中，S蛋白包括S1亚基，所述S1亚基上具有RBD(Receptor bindingdomain, RBD)结构域，通过RBD结构域与人体细胞上的ACE2受体蛋白相结合，使得SARS-CoV-2 感染人体细胞，即：SARS-CoV-2的S蛋白是决定SARS-CoV-2入侵人体细胞的关键蛋白。因此，针对S蛋白的中和抗体可阻断SARS-CoV-2入侵人体细胞，S蛋白、S蛋白的亚基或RBD可作为靶抗原用于制备疫苗。

COVID-19疫苗是预防COVID-19、防止COVID-19疫情蔓延的有效措施之一。病毒样颗粒(Virus-like particles,VLPs)疫苗作为一种新型的基因工程疫苗，其具有强大的免疫优势：表面结构规则，大小合适，不含核酸，不能自主复制，不具有传染性，保持了病毒抗原蛋白的天然构象，从而易于被免疫系统识别并产生很好的免疫效果，并且VLPs疫苗在血清中的半衰期较长，具有质量稳定、安全可靠的优点。当前，快速研制出能够提升群体免疫水平，并且阻断COVID-19传播的疫苗已成为最为紧迫的重大需求，针对COVID-19的VLPs疫苗是一个重要的研发方向。

发明内容

本申请提供了一种SARS-CoV-2病毒的免疫原、药物组合物及其应用。

第一方面，本申请提供了一种SARS-CoV-2病毒的免疫原，所述免疫原包括多种蛋白，所述多种蛋白包括：SARS-CoV-2病毒的全长S蛋白或S蛋白RBD结构域或PreS蛋白中的任一种，以及下述蛋白中的至少一种：

(a)SARS-CoV-2病毒的M蛋白，其氨基酸序列包括如SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列；

(b)SARS-CoV-2病毒的N蛋白抗原表位融合的M蛋白，其氨基酸序列包括如SEQ IDNO.6或SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列；

(c)SARS-CoV-2病毒的E蛋白，其氨基酸序列包括如SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列；

(d)SARS-CoV-2病毒的N蛋白抗原表位融合的E蛋白，其氨基酸序列包括如SEQ IDNO.9或SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列；

其中，所述全长S蛋白的氨基酸序列包括如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，所述S蛋白RBD结构域的氨基酸序列包括如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，所述PreS蛋白的氨基酸序列包括如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。

所述多种蛋白可以具有以下组合：

(1)所述全长S蛋白和所述M蛋白；

(2)所述全长S蛋白和所述N蛋白抗原表位融合的M蛋白；

(3)所述全长S蛋白和所述E蛋白；

(4)所述全长S蛋白和所述N蛋白抗原表位融合的E蛋白；

(5)所述全长S蛋白、所述M蛋白和所述E蛋白；

(6)所述全长S蛋白、所述N蛋白抗原表位融合的M蛋白和所述E蛋白；

(7)所述全长S蛋白、所述M蛋白和所述N蛋白抗原表位融合的E蛋白；

(8)所述全长S蛋白、所述N蛋白抗原表位融合的M蛋白和所述N蛋白抗原表位融合的E蛋白；

(9)所述S蛋白RBD结构域和所述M蛋白；

(10)所述S蛋白RBD结构域和所述N蛋白抗原表位融合的M蛋白；

(11)所述S蛋白RBD结构域和所述E蛋白；

(12)所述S蛋白RBD结构域和所述N蛋白抗原表位融合的E蛋白；

(13)所述S蛋白RBD结构域、所述M蛋白和所述E蛋白；

(14)所述S蛋白RBD结构域、所述N蛋白抗原表位融合的M蛋白和所述E蛋白；

(15)所述S蛋白RBD结构域、所述M蛋白和所述N蛋白抗原表位融合的E蛋白；

(16)所述S蛋白RBD结构域、所述N蛋白抗原表位融合的M蛋白和所述N蛋白抗原表位融合的E蛋白；

(17)所述PreS蛋白和所述M蛋白；

(18)所述PreS蛋白和所述N蛋白抗原表位融合的M蛋白；

(19)所述PreS蛋白和所述E蛋白；

(20)所述PreS蛋白和所述N蛋白抗原表位融合的E蛋白；

(21)所述PreS蛋白、所述M蛋白和所述E蛋白；

(22)所述PreS蛋白、所述N蛋白抗原表位融合的M蛋白和所述E蛋白；

(23)所述PreS蛋白、所述M蛋白和所述N蛋白抗原表位融合的E蛋白；

(24)所述PreS蛋白、所述N蛋白抗原表位融合的M蛋白和所述N蛋白抗原表位融合的 E蛋白。

在本申请的一些实施例中，所述N蛋白抗原表位融合的M蛋白包括SARS-CoV-2病毒的M蛋白、柔性连接肽以及SARS-CoV-2病毒的N蛋白中诱导T细胞免疫的抗原表位，所述抗原表位通过所述柔性连接肽连接于所述M蛋白的N端或C端。其中，所述抗原表位为 CD8⁺T细胞识别的表位或CD4⁺T细胞识别的表位。

在本申请的一些实施例中，所述N蛋白抗原表位融合的E蛋白包括SARS-CoV-2病毒的E蛋白、柔性连接肽以及SARS-CoV-2病毒的N蛋白中诱导T细胞免疫的抗原表位，所述抗原表位通过所述柔性连接肽连接于所述E蛋白的N端或C端。其中，所述抗原表位为 CD8⁺T细胞识别的表位或CD4⁺T细胞识别的表位。

在本申请的一些实施例中，所述柔性连接肽的氨基酸序列包括如SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列。

第二方面，本申请提供了一种核酸分子，所述核酸分子包括：编码第一方面中所述的免疫原的多种蛋白的核苷酸序列。

在本申请的一些实施例中，编码所述多种蛋白的核苷酸序列为融合的重组基因片段，或者编码所述多种蛋白的核苷酸序列包括编码所述多种蛋白中任一蛋白的核苷酸序列。

第三方面，本申请提供了一种表达盒，所述表达盒包括：如第二方面中所述的核酸分子。

第四方面，本申请提供了一种表达载体，所述表达载体包括：载体，以及装载于所述载体上的如第二方面中所述的核酸分子、或如第三方面中所述的表达盒。

在本申请的一些实施例中，所述载体为复制缺陷型黑猩猩腺病毒，所述复制缺陷型黑猩猩腺病毒为基因组中缺失E1编码区和E3编码区的黑猩猩腺病毒68型(chimpanzeeadenovirus type68,AdC68)，其不能在正常人体细胞中复制生产，只能在HEK293、Vero等细胞中复制生产，具有高度的安全性。此外，AdC68型黑猩猩腺病毒在人体中不含有预存抗体，从而排除预存抗体对疫苗功效的抑制作用。

进一步地，所述载体可以为pAdC68XY3。

第五方面，本申请提供了一种转化体，所述转化体包括表达系统，以及如第二方面中所述的核酸分子、或如第三方面中所述的表达盒、或如第四方面中所述的表达载体。

在本申请的一些实施例中，所述表达系统为真核生物或原核生物。作为所述表达系统的真核生物例如可以是酵母、真菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞、植物细胞，所述哺乳动物细胞例如可以是COS(绿猴细胞系)、CHO(中国仓鼠卵巢细胞系)、小鼠细胞和人类细胞等。作为所述表达系统的原核生物例如可以是大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等。

第六方面，本申请提供了一种SARS-CoV-2病毒样颗粒，所述SARS-CoV-2病毒样颗粒由多种蛋白装配形成，所述多种蛋白包括：SARS-CoV-2病毒的全长S蛋白或S蛋白RBD 结构域或PreS蛋白中的任一种，以及下述蛋白中的至少一种：

其中，所述全长S蛋白的氨基酸序列包括如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，所述S蛋白RBD结构域的氨基酸序列包括如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，所述PreS蛋白的氨基酸序列包括具有如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。

第七方面，本申请提供了一种SARS-CoV-2病毒样颗粒的制备方法，用于制备如第六方面中所述的SARS-CoV-2病毒样颗粒，所述制备方法包括：经表达系统表达所述多种蛋白，装配形成所述SARS-CoV-2病毒样颗粒。

在本申请的一些实施例中，所述多种蛋白为融合蛋白，所述制备方法包括如下步骤：

将编码所述多种蛋白中各种蛋白的核苷酸序列通过接头序列连接，获得融合的基因重组片段；

将所述融合的基因重组片段经表达系统表达，获得融合蛋白；以及

所述融合蛋白自行装配形成所述SARS-CoV-2病毒样颗粒。

在本申请的一些实施例中，当所述多种蛋白形成融合蛋白时，编码所述多种蛋白中任一种蛋白的核苷酸序列分别处于独立的表达框，或者编码所述多种蛋白中至少两种蛋白的核苷酸序列串联至同一个表达框。。

在本申请的一些实施例中，所述多种蛋白中的任一种蛋白彼此独立地表达，例如，所述制备方法包括如下步骤：

制备多个表达载体，各个所述表达载体分别装载有编码所述多种蛋白中任一种蛋白的核苷酸序列；

将所述多个表达载体导入同一个表达系统表达，获得所述多种蛋白；以及

所述多种蛋白自行装配形成所述SARS-CoV-2病毒样颗粒。

在本申请的一些实施例中，所述多种蛋白包括至少一种融合蛋白和一种非融合蛋白，其中，所述融合蛋白包括至少两种不同的蛋白，编码所述融合蛋白的核苷酸序列和编码所述非融合蛋白的核苷酸序列彼此独立地装载于不同的表达载体，例如，所述制备方法包括如下步骤：

制备第一表达载体，所述第一表达载体装载有编码所述融合蛋白的核苷酸序列，其中编码所述融合蛋白的核苷酸序列是将编码所述融合蛋白中各种蛋白的核苷酸序列通过接头序列连接，获得的融合的基因重组片段；

制备第二表达载体，所述第二表达载体装载有编码非融合蛋白的核苷酸序列；

将所述第一表达载体和所述第二表达载体导入同一个表达系统表达，获得所述多种蛋白；以及

所述多种蛋白自行装配形成所述SARS-CoV-2病毒样颗粒。

第八方面，本申请提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括如第一方面中所述的免疫原、如第二方面中所述的核酸分子、或如第三方面中所述的表达盒、或如第四方面中所述的表达载体、或如第五方面中所述的转化体、或如第六方面中所述的SARS-CoV-2病毒样颗粒、或如第七方面中所述的制备方法制得的SARS-CoV-2病毒样颗粒。

在本申请的一些实施例中，所述药物组合物还包括：药学上可接受的佐剂和/或辅料。

佐剂是指通过增强巨噬细胞活性促进机体T细胞或B细胞的反应，参与半抗原或抗原免疫应答的天然的或合成的物质。佐剂能增强药物组合物的特异性免疫反应，从而提升药物组合物的免疫效果。可与本申请的药物组合物共同施用的佐剂包括但不限于干扰素、趋化因子、肿瘤坏死因子、颗粒溶素、乳铁蛋白、卵白蛋白和白细胞介素。

辅料是指生产药物组合物和调配处方时所用的赋形剂和附加剂，具有赋形、保护活性成分、提高稳定性、增溶、助溶、缓控释等重要功能，以使药物组合物达到一定的保质期和生物利用度，从而提高药物组合物的安全性和有效性。可与本申请的药物组合物共同施用的辅料包括但不限于糖、蛋白、氨基酸和高分子聚合物。

在本申请的一些实施例中，所述药物组合物为适用于肌内、皮下或粘膜施用的剂型。

在本申请的一些实施例中，适用于粘膜施用的所述药物组合物的剂型为口服剂、气溶胶吸入剂、滴鼻剂以及喷雾剂中的至少一种。

在本申请的一些实施例中，适用于肌内或皮下施用的所述药物组合物的剂型为注射剂。

本领域技术人员可以理解的是，本申请还提供了所述药物组合物的免疫方式，包括：鼻喷给药、滴鼻给药、气溶胶吸入式给药、肌肉注射、皮下注射、口服给药等。优选采用鼻喷给药的免疫方式。

第九方面，本申请提供了如第一方面中所述的免疫原、如第二方面中所述的核酸分子、或如第三方面中所述的表达盒、或如第四方面中所述的表达载体、或如第五方面中所述的转化体、或如第六方面中所述的SARS-CoV-2病毒样颗粒、或如第七方面中所述的制备方法制得的SARS-CoV-2病毒样颗粒、或如第八方面中所述的药物组合物在制备用于治疗或预防 SARS-CoV-2病毒感染的疫苗和/或药物中的用途。

本领域技术人员可以理解的是，本申请还提供了一种治疗或预防SARS-CoV-2病毒感染的方法，包括：给予对象有效量的如第一方面中所述的免疫原、或如第二方面中所述的核酸分子，或如第三方面中所述的表达盒、或如第四方面中所述的表达载体、或如第五方面中所述的转化体、或如第六方面中所述的SARS-CoV-2病毒样颗粒、或如第七方面中所述的制备方法制得的SARS-CoV-2病毒样颗粒、或如第八方面中所述的药物组合物，以达到治疗或预防SARS-CoV-2病毒感染的目的，所述给予包括鼻喷、滴鼻、气溶胶吸入、肌肉注射、皮下注射以及口服中的一种或多种给药方式。

本申请提供了一种SARS-CoV-2病毒的免疫原、药物组合物及其应用，所述免疫原包括多种蛋白，所述多种蛋白可以装配形成SARS-CoV-2病毒样颗粒，S蛋白或S蛋白RBD结构域或PreS蛋白展示于所述SARS-CoV-2病毒样颗粒的包膜上，从而赋予所述SARS-CoV-2 病毒样颗粒良好的免疫递呈效果，能够诱导机体产生高滴度的中和抗体，刺激机体产生理想的免疫应答反应，达到治疗或预防SARS-CoV-2病毒感染的目的。所述SARS-CoV-2病毒的免疫原、包含编码所述免疫原的核苷酸序列的生物材料(如：核酸分子、表达盒、表达载体、转化体等)以及所述SARS-CoV-2病毒样颗粒可以制成用于治疗或预防SARS-CoV-2病毒感染的疫苗和/或药物，所述疫苗和/或药物可以采用成熟的生产工艺进行规模化生产，以快速满足市场需求。

附图说明

下面结合附图，通过对本申请的具体实施方式详细描述，将使本申请的技术方案及其它有益效果显而易见。

图1为本申请实施例1中VLP1融合蛋白的结构示意图。

图2为本申请实施例2中VLP2融合蛋白的结构示意图。

具体实施方式

下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如 Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989) 中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。下列实施例中涉及的动物实验在GLP(Good Laboratory Practice)实验室条件下开展，并按照“动物福利伦理审查实验室动物指南”处理动物。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用，但不能限制本申请的内容。

本申请中的术语“S蛋白”可以来源于已知的任何SARS-CoV-2病毒株，在本申请实施例中，S蛋白来源于毒株SARS-CoV-2，全长具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。SARS-CoV-2 的S蛋白包括S1亚基，所述S1亚基上具有RBD(Receptor binding domain,RBD)结构域，通过 RBD结构域与人体细胞上的ACE2受体蛋白相结合，使得SARS-CoV-2感染人体细胞。

本申请中的术语“PreS蛋白”是指一种稳定呈现SARS-CoV-2病毒的全长S蛋白在与人体细胞上的ACE2受体蛋白结合前构象的蛋白，可以是已知的任何SARS-CoV-2病毒株的野生型 S蛋白经优化而形成的，所述优化例如可以是点突变。在本申请实施例中，PreS蛋白是来源于毒株SARS-CoV-2的野生型S蛋白经点突变而形成的，具有如SEQ ID NO.3或SEQ IDNO.4 所示的氨基酸序列。

本申请中的术语“融合蛋白”是指有目的地将两段以上编码功能蛋白的基因连接在一起以形成融合的重组基因片段，并由同一调控序列控制所述融合的重组基因片段表达后所得的蛋白质产物。在本申请实施例中，VLP1融合蛋白是由VLP1基因片段编码，所述VLP1基因片段是在人工条件下，将编码SARS-CoV-2病毒的全长S蛋白的核苷酸序列、编码SARS-CoV-2 病毒的M蛋白的核苷酸序列以及编码SARS-CoV-2病毒的E蛋白的核苷酸序列通过接头序列连接在一起而获得的融合的重组基因片段。

本申请中的术语“核酸分子”是指由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物，例如可以是通过聚合酶链式反应(PCR)或通过体外翻译产生的脱氧核糖核酸(DNA)片段、核糖核酸(RNA) 片段以及寡核苷酸片段中的任意一种，以及通过连接、切割、内切核酸酶作用或外切核酸酶作用中的任意一种或多种产生的片段，可以是单链的或双链的。在本申请实施例中，VLP1 基因片段和VLP2基因片段均属于核酸分子。

本申请中的术语“HEK293”是指人胚胎肾细胞293，其是一个衍生自人胚胎肾细胞的细胞系，具有极少表达细胞外配体所需的内生受体、易转染的特性，分为293A、293T等类型，其中，293A用来包装腺病毒。在本申请实施例中，将HEK293细胞作为pAdC68XY3-VLP1 重组腺病毒质粒的转染细胞，以包装产生rAdC68XY3-VLP1重组腺病毒；另外，将HEK293 细胞作为rAdC68XY3-VLP1重组腺病毒的表达系统，以表达产生VLP1融合蛋白。

本申请中的术语“Vero”是指非洲绿猴肾细胞，其是从非洲绿猴的肾脏上皮细胞中分离培养出来的异倍体细胞。在本申请实施例中，将Vero细胞作为rAdC68XY3-VLP1重组腺病毒的表达系统，以表达产生VLP1融合蛋白。

本申请的术语“表达框”是指开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)，其包含一段可以编码目的蛋白的核苷酸序列，并且该核苷酸序列上具有起始密码子和终止密码子。

本申请的术语“表达盒”包含表达目的蛋白所需的必要元件，包括在表达系统中转录和翻译过程中所必需的元件，所述表达盒可以包括启动子、表达框和终止子，所述启动子和终止子没有特别的限定，可以是本领域已知的能够实现目的蛋白表达的启动子和终止子，其中启动子可以是原核的或真核的，例如可以是Lacl、LacZ、pLacT、ptac、T3或T7噬菌体RNA聚合酶启动子、CMV启动子、HSV胸苷激酶启动子、SV40启动子、小鼠金属硫蛋白–L启动子等，所述表达盒还可以任选地包括增强子或其他表达调控元件。

本申请中的术语“载体”是指能够运输另一种核酸的核酸分子，例如可以是质粒、病毒、粘粒等，所述病毒例如可以是腺病毒、安卡拉牛痘病毒(MVA)、水泡性口炎病毒(VSV)等，所述腺病毒例如可以是Ad5型人腺病毒、Ad26型人腺病毒、AdC3型黑猩猩腺病毒、AdC7型黑猩猩腺病毒、AdC68型黑猩猩腺病毒等。在本申请实施例中，基因组中缺失E1编码区和E3编码区的AdC68型黑猩猩腺病毒为VLP1基因片段或VLP2基因片段的载体。

本申请中的术语“表达载体”是指一种DNA构建体，其含有与合适的控制序列可操作地连接的核酸分子，所述控制序列能够实现所述核酸分子在合适的表达系统中表达。在本申请实施例中，rAdC68XY3-VLP1重组腺病毒和rAdC68XY3-VLP2重组腺病毒均属于表达载体。

本申请中的术语“表达系统”是指用于表达外源基因蛋白的一类宿主，例如可以是真核生物、原核生物、病毒等。在本申请实施例中，HEK293细胞和Vero细胞均属于表达系统。

本申请中的术语“转化体”是指接受了外源遗传物质(如：质粒DNA)而使遗传特性发生变化的一类表达系统。在本申请实施例中，接受了外源的酶切基因片段的HEK293细胞属于转化体。

本申请中的术语“病毒样颗粒”是指含有SARS-CoV-2病毒的一个或多个结构蛋白的空心颗粒，没有SARS-CoV-2病毒的核酸，不能自主复制，在形态上与真正的SARS-CoV-2病毒相同或相似，从而易于被免疫系统识别并产生很好的免疫效果。在本申请实施例中，VLP1含有SARS-CoV-2病毒的全长S蛋白、M蛋白和E蛋白；VLP2含有SARS-CoV-2病毒的全长S蛋白RBD结构域、M蛋白以及N蛋白抗原表位融合的E蛋白。

本申请中的术语“免疫原”是指可以刺激机体产生免疫应答的一类物质，在本申请实施例中，VLP1融合蛋白和VLP2融合蛋白均属于免疫原。

本申请中的术语“免疫”是指机体免疫系统识别自身与异己物质，并通过免疫应答排除抗原性异物，以维持机体生理平衡的功能，包括天然免疫和获得性免疫。例如，若对受试者注射本申请实施例的VLP1或VLP2，则会引起受试者机体的免疫应答反应。

本申请的术语“药物组合物”包括治疗目的的组合物和免疫/预防目的的组合物。所述治疗目的是指改善或减轻COVID-19的至少一种症状，可以延迟COVID-19的恶化或进展，或可以延迟或阻止其他相关疾病或并发症的发作。所述免疫/预防目的是指可以刺激或引起生物体产生免疫应答以达到预防SARS-CoV-2感染目的。所述药物组合物可以是包括一种或多种免疫原的组合物，例如：VLP1融合蛋白和VLP2融合蛋白。所述药物组合物还可以是包括核酸分子的组合物，所述核酸分子编码一种或多种的免疫原或免疫原性表位，并且所述核酸分子可以包括在载体(如：质粒、病毒)中而形成表达盒、表达载体、转化体等形式。所述药物组合物例如可以是疫苗，所述疫苗可以是mRNA疫苗、DNA疫苗、重组载体疫苗等类型。此外，所述药物组合物例如还可以是药物制剂。在一些实施例中，所述药物组合物包括VLP1和/或VLP2。

本申请的术语“对象”是指能够发生细胞免疫应答的任何生物体，包括人类和其他哺乳类动物，还包括已被SARS-CoV-2感染且尚未治愈、曾被SARS-CoV-2感染且已治愈或具有 SARS-CoV-2感染风险的任何个体。落入本申请范围内的合适的哺乳类动物包括但不限于：灵长类、家畜(例如羊、牛、马、猴、猪等)、实验室试验动物(例如兔、鼠等)、宠物(例如猫、狗等)和圈养野生动物(例如狼、狐狸、鹿等)。在一些实施例中，对象为试验小鼠。在一些实施例中，所述对象优选为人类。

本申请的术语“有效量”是指足以以统计上显著的方式导致正在治疗的疾病的一种或多种症状改善的给药剂量，或是能够刺激细胞免疫应答以达到预防疾病目的的给药剂量。有效量取决于众多因素，例如：药物的活性、采用的递送方式等，且可以由本领域技术人员根据对象的个体情况容易地确定。

本申请中的术语“湿转法”是通过将聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)的胶片浸入转印缓冲液中，使得经SDS-PAGE分离获得的蛋白质样品从胶片上转印至转印膜上而得以固定。例如：在一些实施方式中，将经SDS-PAGE分离获得的PreS蛋白从胶片上转印至转印膜上而得以固定。

除非另有说明，以下实施例中使用的培养基、试剂和溶液均为市售商品，或者可以通过本领域已知方法制备。

一、本申请实施例中涉及培养基的说明

(1)MEM培养基购自美国的Hyclone实验室。

(2)DMEM培养基购自美国的Hyclone实验室。

(3)LB培养基

每100mL的LB液体培养基中，包括：1.0g的蛋白胨，0.5g的酵母粉，以及1.0g的NaCl。对于LB固体培养基，是在LB液体培养基配方的基础上添加20g/L的琼脂。

二、本申请实施例中涉及细胞、质粒、病毒及动物的说明详见下表1:

表1本申请实施例中涉及细胞、质粒、病毒、融合蛋白及病毒样颗粒的说明

三、本申请实施例中涉及的基因片段、蛋白、试剂以及溶液的说明：

本申请实施例中涉及的除引物之外的基因片段由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

本申请实施例中涉及的所有引物是由武汉擎科生物技术有限公司合成。

本申请实施例中涉及的限制性内切酶(如：NotI、KpnI和PacI)、归位内切酶(如：PI-SceI 和I-CeuI)、连接酶(如：T4连接酶)、酶切缓冲液(10×NEB CutSmart buffer)、PCR反应混合液(2×PrimerSTAR mix)以及双蒸水(ddH₂O)均购自宝生物工程(大连)有限公司。

本申请实施例中涉及的胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、PCR产物回收试剂盒以及病毒 RNA/DNA提取试剂盒均购自美国的Axygen公司。

本申请实施例中涉及的Lipofectamine^TM2000试剂盒和ECL显色液购自赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)。

本申请实施例中涉及的PVDF(Polyvinylidene-Fluoride)膜购自美国默克(Merck)公司。

本申请实施例中涉及的辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG购自上海碧云天生物技术有限公司。

本申请实施例中涉及的S蛋白购自京天成公司。

本申请实施例中涉及的鼠抗S蛋白(S2亚基)单克隆抗体购自美国的GeneTex公司。

本申请实施例中涉及的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)购自美国的KPL公司。

下面结合实施例、对比例和实验例进一步说明本发明的技术方案和有益效果。

实施例1：制备用于表达VLP1融合蛋白的rAdC68XY3-VLP1重组腺病毒

本实施例提供了一种VLP1融合蛋白的制备方法，如图1所示，VLP1融合蛋白包括信号肽、SARS-CoV-2病毒的全长S蛋白、接头蛋白F-P2A、E蛋白和M蛋白，其中，所述全长S蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述M蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述E蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。

VLP1融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示，编码VLP 1融合蛋白的VLP1基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。当VLP1融合蛋白表达时，所述全长S蛋白、所述M蛋白和所述E蛋白通过同一个表达框进行表达。

1.1构建pShuttle-VLP1重组质粒

本实施例选择未插入外源基因的pShuttle-CMV质粒作为pShuttle-VLP1重组质粒的载体。pShuttle-CMV为穿梭型质粒，其上含有CMV增强子、CMV启动子、T7启动子、嵌合内含子和bGH poly(A)加尾信号，并具有NotI和KpnI双酶切位点，还具有卡那霉素 (Kanamycin,Kana)抗性。

所述构建pShuttle-VLP1重组质粒，包括如下步骤：

S1.11、在VLP1基因片段的起始密码子前面加入Kozak序列，并在编码全长S蛋白的N 端的核苷酸序列处添加编码Jev信号肽的核苷酸序列，最后在3’端和5’端分别添加NotI和 Kpn酶切位点，然后进行基因合成；

S1.12、采用NotI和KpnI限制性内切酶对步骤S1.11合成的基因片段进行双酶切，采用 1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切完全后，胶回收目的基因片段，双酶切后回收目的基因片段的操作根据胶回收试剂盒操作说明实施；

S1.13、采用NotI和KpnI限制性内切酶对pShuttle-CMV进行双酶切，采用1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切完全后，胶回收长度为4093bp的载体骨架，其中，双酶切后回收载体骨架的操作根据胶回收试剂盒操作说明实施；

S1.14、将步骤S1.12获得的目的基因片段，与步骤S1.13获得的载体骨架相混合，在 T4连接酶的作用下16℃连接过夜，获得pShuttle-VLP1连接产物；

S1.15、将步骤S1.14获得的pShuttle-VLP1连接产物转化至大肠杆菌TOP10感受态细胞中，涂布于含有100μg/mL卡那霉素抗性的LB平板上，37℃静置培养过夜，获得多个单菌落，其中，转化按照本领域常规的热激转化方式实施；

S1.16、挑取步骤1.15中的多个单菌落接种于含有100μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，获得多个菌液；

S1.17、对步骤1.16中的多个菌液分别进行质粒提取操作，将提取的质粒测序，测序结果正确的质粒即为pShuttle-VLP1重组质粒，其中，质粒提取操作根据质粒提取试剂盒操作说明实施。

1.2构建pAdC68XY3-VLP1重组腺病毒质粒

在本实施例中，选择自行构建的pShuttle-VLP1和商购的pAdC68XY3-GFP来构建pAdC68XY3-VLP1重组腺病毒质粒以作为表达载体，具体包括如下步骤：

S1.21、采用PI-SceI和I-CeuI归位内切酶对pShuttle-VLP1进行双酶切，采用1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切完全后，胶回收目的基因片段，其中，回收目的基因片段的操作根据胶回收试剂盒操作说明实施，目的基因片段包括VLP1基因片段和VLP1融合蛋白的表达框；

S1.22、采用PI-SceI和I-CeuI归位内切酶对pAdC68XY3-GFP进行双酶切，采用1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切完全后，胶回收长度为33062bp的载体骨架，其中，双酶切后回收载体骨架的操作根据胶回收试剂盒操作说明实施；

S1.23、将步骤1.21获得的目的基因片段，与步骤S1.22获得载体骨架混合，在T4连接酶的作用下16℃连接过夜，获得pAdC68XY3-VLP1连接产物；

S1.24、将pAdC68XY3-VLP1连接产物转化至大肠杆菌TOP10感受态细胞中，并涂布于含有100μg/mL氨苄青霉素(Ampicillin,Amp)抗性的LB平板上，37℃培养过夜，获得多个单菌落，其中，转化按照本领域常规的热激转化方式实施；

S1.25、挑取步骤1.24中的多个单菌落分别接种于含有100μg/mL氨苄青霉素抗性的LB 液体培养基中，37℃培养过夜，获得多个菌液；

S1.26、对步骤1.25中的多个菌液分别进行质粒提取操作，然后对提取的质粒测序，测序结果正确的质粒即为pAdC68XY3-VLP1重组腺病毒质粒，其中，质粒提取操作根据质粒提取试剂盒操作说明实施；

S1.27、将步骤1.26中测序结果正确的pAdC68XY3-VLP1重组腺病毒质粒转化至大肠杆菌TOP10感受态细胞中，并涂布于含有100μg/mL氨苄青霉素抗性的LB平板上，37℃培养过夜；挑取多个培养获得的单菌落接种于含有100μg/mL氨苄青霉素抗性的LB液体培养基中，37℃培养过夜，之后使用质粒提取试剂盒提取质粒后送测序公司测序。

1.3线性化处理pAdC68XY3-VLP1重组腺病毒质粒

采用PacI限制性内切酶对1.2中获得的pAdC68XY3-VLP1重组腺病毒质粒进行酶切，使得pAdC68XY3-VLP1重组腺病毒质粒线性化，其中，酶切温度为37℃，酶切时间为三小时，酶切体系详见下表2：

表2为pAdC68XY3-VLP1重组腺病毒质粒线性化的酶切体系

试剂	用量
		酶切缓冲液(10×NEB CutSmart buffer)	5μL
PacI限制性内切酶	5μL
		pAdC68XY3-VLP1重组腺病毒质粒	10μg
双蒸水(ddH<sub>2</sub>O)	补加至总体系为50μL
		总体系	50μL

酶切完成后，采用PCR产物回收试剂盒回收酶切产物，并采用微量核酸定量仪对回收的酶切基因片段进行定量分析。

1.4制备rAdC68XY3-VLP1重组腺病毒

对1.3中获得的酶切基因片段进行转染操作，采用Lipofectamine^TM2000试剂盒进行转染操作，并选择HEK293细胞作为表达系统。根据Lipofectamine^TM2000试剂盒的操作说明，将酶切基因片段转染于汇合度为60～70％的HEK293细胞内。

在Lipofectamine^TM2000试剂盒操作说明的“接种细胞”步骤中，用于培养HEK293细胞的培养基为MEM培养基，并在转染前两小时将并在转染前两小时将MEM培养基更换为DMEM培养基。转染五小时后，更换培养基为含10％(体积百分比)胎牛血清的DMEM培养基。

转染隔日，在倒置显微镜下观察细胞病变，直至60％的HEK293细胞出现噬斑时收集细胞。将收集的细胞在室温(25℃)与-80℃之间反复冻融三次，然后在1200×g的转速下离心五分钟，收集上清液，获得的上清液中包含rAdC68XY3-VLP1重组腺病毒，并将上清液分装后置于-80℃超低温冰箱保存备用。

1.5、鉴定rAdC68XY3-VLP1重组腺病毒基因组中的VLP1基因片段

以rAdC68XY3-VLP1重组腺病毒的全基因组作为模板，采用PCR技术扩增VLP1基因片段。针对VLP1基因片段设计用于PCR扩增的正向引物F1和反向引物R1，所述正向引物 F1如SEQ ID NO.14所示，所述反向引物R1如SEQ ID NO.15所示。采用病毒RNA/DNA 提取试剂盒对上述1.4中获得的上清液进行全基因组提取操作，具体操作参照操作说明进行，在此不再赘述。

其中，PCR反应体系详见下表3：

表3为PCR反应体系一览表

试剂	用量/μL
		PCR反应混合液(2×PrimerSTAR mix)	5.0
正向引物F1(10μM)	1.0
		反向引物R1(10μM)	0.5
模板	0.5
		双蒸水(ddH<sub>2</sub>O)	3.0
总体系	10

PCR反应程序具体为：①95℃预变性2min；②95℃变性15s；③45℃退火15s；④72℃延伸90s；⑤重复②～④30个循环；⑥72℃，5min。

PCR反应结束后，将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的条带并测序，测序结果正确代表目的条带即为VLP1基因片段。其中，所述切胶回收采用胶回收试剂盒进行，具体操作参照胶回收试剂盒中的操作说明实施，在此不再赘述。

1.6、rAdC68XY3-VLP1重组腺病毒表达VLP1融合蛋白

分别选择HEK293细胞和Vero细胞作为表达系统，以分别检测rAdC68XY3-VLP1重组腺病毒在HEK293细胞和Vero细胞中VLP1融合蛋白的表达。具体包括如下步骤：

S3.1、将表达系统按5×10⁵个/孔的接种量接种于六孔板的孔内，选用MEM培养基培养表达系统，以使表达系统在孔内增殖；

S3.2、当孔内表达系统的汇合率达到90％时，将rAdC68XY3-VLP1重组腺病毒接种于孔内，并设置阴性对照，在37℃的条件下静置培养；

S3.3、当37℃静置培养48h后，先将粘壁细胞刮于细胞培养液中，然后将细胞培养液离心，并收集上清液，将该上清液标记为细胞培养上清液；

S3.4、取80μL步骤S3.3中获得的细胞培养上清液，然后加入20μL五倍浓缩的 SDS-PAGE上样缓冲液(5×SDS-PAGE Loading Buffer)，并在100℃下煮沸五分钟，获得该细胞培养上清液的待检样品；

S3.5、结合聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹(Western Blot,WB)技术检测步骤S3.4中获得的待检样品中VLP1融合蛋白表达。

其中，在所述步骤S3.2中，当所述表达系统为HEK293细胞时，rAdC68XY3-VLP1重组腺病毒按照感染复数(Multiplicity Of Infection,MOI)0.2进行接种；当所述表达系统为Vero 细胞时，rAdC68XY3-VLP1重组腺病毒按照MOI 20进行接种。

在所述步骤S3.3中，当所述表达系统为HEK293细胞时，所述阴性对照即为未接种有 rAdC68XY3-PreS重组腺病毒的HEK293细胞；当所述表达系统为Vero细胞时，所述阴性对照即为未接种有rAdC68XY3-PreS重组腺病毒的Vero细胞。

在所述步骤S3.5中，结合SDS-PAGE和WB技术检测待检样品，具体包括如下步骤：

S3.51、将所述待检样品进行8％SDS-PAGE电泳；

S3.52、电泳结束后，利用湿转法将目的VLP1融合蛋白转印至PVDF膜上；

S3.53、将附着有VLP1融合蛋白的PVDF膜浸泡于含5％(质量百分比)脱脂奶粉的PBST 溶液中，在4℃下封闭过夜；

S3.54、采用PBST溶液清洗完成步骤S3.63的PVDF膜两次，然后将PVDF膜浸泡于鼠抗S蛋白(S2亚基)单克隆抗体稀释液(稀释比例为1:2000)中，在37℃下孵育一小时；

S3.55、采用PBST溶液清洗完成步骤S3.64的PVDF膜两次，然后将PVDF膜浸泡于辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG稀释液(稀释比例为1:5000)中，在37℃下孵育一小时；

S3.56、采用PBST溶液清洗完成步骤S3.65的PVDF膜两次，然后将ECL显色液加至于PVDF膜的附着有VLP1融合蛋白的一面上，化学发光法显色。

其中，在所述步骤S3.51中，10％SDS-PAGE电泳的条件为：①保持电压100V二十分钟；②保持电压160V一小时二十分钟。

在所述步骤S3.54中，可用兔抗anti-RBD多克隆抗体稀释液(稀释比例为1:2000)替代所述鼠抗S蛋白(S2亚基)单克隆抗体稀释液(稀释比例为1:2000)。

在所述步骤S3.55中，可用HRP标记的羊抗兔IgG稀释液(稀释比例为1:5000)替代所述HRP标记的羊抗鼠IgG稀释液(稀释比例为1:5000)。

需要说明的是，利用WB技术检测各个待检样品也可通过商品化的Western BlotECL化学发光法显色试剂盒进行。

经rAdC68XY3-VLP1重组腺病毒感染后，HEK293细胞和Vero细胞的待检样品中均能成功检测到VLP1融合蛋白的表达，并且rAdC68XY3-VLP1重组腺病毒在HEK293细胞和 Vero细胞中表达VLP1融合蛋白后，VLP1融合蛋白能够自行组装形成VLP1。

实施例2：制备用于表达VLP2融合蛋白的rAdC68XY3-VLP2重组腺病毒

本实施例提供了一种VLP2融合蛋白的制备方法，如图2所示，VLP2融合蛋白包括SARS-CoV-2病毒的S蛋白RBD结构域、M蛋白以及N蛋白抗原表位融合的E蛋白组成，其中，所述全长S蛋白RBD结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述M蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.5所示，所述N蛋白抗原表位融合的E蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。所述N蛋白抗原表位融合的E蛋白由SARS-CoV-2病毒的E蛋白、柔性连接肽以及SARS-CoV-2病毒的N蛋白中诱导T细胞免疫的抗原表位组成，所述抗原表位通过所述柔性连接肽连接于所述E蛋白的C端，所述柔性连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，其中，所述抗原表位为CD4⁺T细胞识别的表位。

编码VLP2融合蛋白的VLP2基因片段为融合的重组基因片段，VLP2基因片段具有第一表达框和第二表达框，其中，S蛋白RBD结构域和M蛋白通过第一表达框进行表达，N 蛋白抗原表位融合的E蛋白单独通过第二表达框进行表达。第一表达框的核苷酸序列如SEQ IDNO.16所示，对应表达的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示；第二表达框的核苷酸序列如 SEQID NO.18所示，对应表达的氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示，并且第二表达框前采用 EF1a启动子。

VLP2融合蛋白的制备方法参照实施例1中VLP1融合蛋白的制备方法进行，依次进行步骤：构建pShuttle-VLP2重组质粒、构建pAdC68XY3-VLP2重组腺病毒质粒、线性化处理pAdC68XY3-VLP2重组腺病毒质粒、制备rAdC68XY3-VLP2重组腺病毒、鉴定 rAdC68XY3-VLP2重组腺病毒基因组中的VLP2基因片段以及rAdC68XY3-VLP2重组腺病毒表达VLP2融合蛋白，其中，采用正向引物F1和反向引物R1鉴定VLP2基因片段。需要说明的是，rAdC68XY3-VLP2重组腺病毒在表达系统(如HEK293细胞和Vero细胞)中表达 VLP2融合蛋白后，VLP2融合蛋白能够在表达系统内自行组装形成VLP2。

以上对本发明所提供的一种SARS-CoV-2病毒的免疫原、药物组合物及其应用，进行了详细介绍。本文中应用了具体个例对本申请的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本申请的技术方案及其核心思想；本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本申请实施例的技术方案的范围。

序列表

<110> 武汉博沃生物科技有限公司

<120> 一种SARS-CoV-2病毒的免疫原、药物组合物及其应用

<130> WH200320

<141> 2020-12-09

<160> 19

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1285

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Gly Lys Arg Ser Ala Gly Ser Ile Met Trp Leu Ala Ser Leu Ala

1 5 10 15

Val Val Ile Ala Cys Ala Gly Ala Ser Gln Cys Val Asn Leu Thr Thr

20 25 30

Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe Thr Arg Gly Val

35 40 45

Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu His Ser Thr Gln

50 55 60

Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp Phe His Ala Ile

65 70 75 80

His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp Asn Pro Val Leu

85 90 95

Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu Lys Ser Asn Ile

100 105 110

Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser Lys Thr Gln Ser

115 120 125

Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile Lys Val Cys Glu

130 135 140

Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr Tyr His Lys Asn

145 150 155 160

Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr Ser Ser Ala Asn

165 170 175

Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu Met Asp Leu Glu

180 185 190

Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn

195 200 205

Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr Pro Ile Asn Leu

210 215 220

Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu Pro Leu Val Asp

225 230 235 240

Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr Leu Leu Ala Leu

245 250 255

His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser Gly Trp Thr Ala

260 265 270

Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro Arg Thr Phe Leu

275 280 285

Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala Val Asp Cys Ala

290 295 300

Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys Ser Phe Thr Val

305 310 315 320

Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val Gln Pro Thr Glu

325 330 335

Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu

340 345 350

Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys

355 360 365

Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala

370 375 380

Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn

385 390 395 400

Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly

405 410 415

Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp

420 425 430

Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp

435 440 445

Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu

450 455 460

Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile

465 470 475 480

Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu

485 490 495

Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr

500 505 510

Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu

515 520 525

Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn

530 535 540

Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly

545 550 555 560

Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu Pro Phe Gln Gln

565 570 575

Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val Arg Asp Pro Gln

580 585 590

Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe Gly Gly Val Ser

595 600 605

Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val Ala Val Leu Tyr

610 615 620

Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile His Ala Asp Gln

625 630 635 640

Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser Asn Val Phe Gln

645 650 655

Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val Asn Asn Ser Tyr

660 665 670

Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala Ser Tyr Gln Thr

675 680 685

Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala Ser Gln Ser Ile

690 695 700

Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser Val Ala Tyr Ser

705 710 715 720

Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile Ser Val Thr Thr

725 730 735

Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val Asp Cys Thr Met

740 745 750

Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu Leu Leu Gln Tyr

755 760 765

Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr Gly Ile Ala Val

770 775 780

Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln Val Lys Gln Ile

785 790 795 800

Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe Asn Phe Ser Gln

805 810 815

Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser Phe Ile Glu Asp

820 825 830

Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly Phe Ile Lys Gln

835 840 845

Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp Leu Ile Cys Ala

850 855 860

Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu Leu Thr Asp Glu

865 870 875 880

Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly Thr Ile Thr Ser

885 890 895

Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile Pro Phe Ala Met

900 905 910

Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr Gln Asn Val Leu

915 920 925

Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn Ser Ala Ile Gly

930 935 940

Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala Leu Gly Lys Leu

945 950 955 960

Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn Thr Leu Val Lys

965 970 975

Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val Leu Asn Asp Ile

980 985 990

Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln Ile Asp Arg Leu

995 1000 1005

Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val Thr Gln Gln Leu

1010 1015 1020

Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu Ala Ala Thr Lys

1025 1030 1035 1040

Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val Asp Phe Cys Gly

1045 1050 1055

Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ser Ala Pro His Gly Val

1060 1065 1070

Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ala Gln Glu Lys Asn Phe Thr

1075 1080 1085

Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Asp Gly Lys Ala His Phe Pro Arg Glu

1090 1095 1100

Gly Val Phe Val Ser Asn Gly Thr His Trp Phe Val Thr Gln Arg Asn

1105 1110 1115 1120

Phe Tyr Glu Pro Gln Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly

1125 1130 1135

Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro

1140 1145 1150

Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe

1155 1160 1165

Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile

1170 1175 1180

Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu

1185 1190 1195 1200

Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly

1205 1210 1215

Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile Trp Leu Gly Phe

1220 1225 1230

Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile Met Leu Cys Cys

1235 1240 1245

Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Cys Cys Ser Cys Gly Ser

1250 1255 1260

Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro Val Leu Lys Gly Val

1265 1270 1275 1280

Lys Leu His Tyr Thr

1285

<210> 2

<211> 192

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr

1 5 10 15

Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys

20 25 30

Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe

35 40 45

Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr

50 55 60

Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln

65 70 75 80

Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu

85 90 95

Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu

100 105 110

Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg

115 120 125

Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr

130 135 140

Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr

145 150 155 160

Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr

165 170 175

Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro

180 185 190

<210> 3

<211> 1273

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val

1 5 10 15

Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe

20 25 30

Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu

35 40 45

His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp

50 55 60

Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp

65 70 75 80

Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu

85 90 95

Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser

100 105 110

Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile

115 120 125

Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr

130 135 140

Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr

145 150 155 160

Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu

165 170 175

Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe

180 185 190

Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr

195 200 205

Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu

210 215 220

Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr

225 230 235 240

Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser

245 250 255

Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro

260 265 270

Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala

275 280 285

Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys

290 295 300

Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val

305 310 315 320

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Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu

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Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro

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Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe

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Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn

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Met Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Cys Cys

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<211> 1261

<212> PRT

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325 330 335

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370 375 380

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Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn

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<212> PRT

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<400> 5

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<400> 6

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<212> PRT

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<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 9

Met Leu Leu Asn Lys His Ile Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Gly Gly

1 5 10 15

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Tyr Ser Phe

20 25 30

Val Ser Glu Glu Thr Gly Thr Leu Ile Val Asn Ser Val Leu Leu Phe

35 40 45

Leu Ala Phe Val Val Phe Leu Leu Val Thr Leu Ala Ile Leu Thr Ala

50 55 60

Leu Arg Leu Cys Ala Tyr Cys Cys Asn Ile Val Asn Val Ser Leu Val

65 70 75 80

Lys Pro Ser Phe Tyr Val Tyr Ser Arg Val Lys Asn Leu Asn Ser Ser

85 90 95

Arg Val Pro Asp Leu Leu Val

100

<210> 10

<211> 103

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 10

Met Tyr Ser Phe Val Ser Glu Glu Thr Gly Thr Leu Ile Val Asn Ser

1 5 10 15

Val Leu Leu Phe Leu Ala Phe Val Val Phe Leu Leu Val Thr Leu Ala

20 25 30

Ile Leu Thr Ala Leu Arg Leu Cys Ala Tyr Cys Cys Asn Ile Val Asn

35 40 45

Val Ser Leu Val Lys Pro Ser Phe Tyr Val Tyr Ser Arg Val Lys Asn

50 55 60

Leu Asn Ser Ser Arg Val Pro Asp Leu Leu Val Gly Gly Gly Gly Ser

65 70 75 80

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Leu Asn Lys His Ile

85 90 95

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100

<210> 11

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 11

Leu Leu Asn Lys His Ile Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro

1 5 10

<210> 12

<211> 1634

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 12

Met Gly Lys Arg Ser Ala Gly Ser Ile Met Trp Leu Ala Ser Leu Ala

1 5 10 15

Val Val Ile Ala Cys Ala Gly Ala Ser Gln Cys Val Asn Leu Thr Thr

20 25 30

Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe Thr Arg Gly Val

35 40 45

Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu His Ser Thr Gln

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Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp Phe His Ala Ile

65 70 75 80

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100 105 110

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Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile Lys Val Cys Glu

130 135 140

Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr Tyr His Lys Asn

145 150 155 160

Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr Ser Ser Ala Asn

165 170 175

Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu Met Asp Leu Glu

180 185 190

Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn

195 200 205

Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr Pro Ile Asn Leu

210 215 220

Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu Pro Leu Val Asp

225 230 235 240

Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr Leu Leu Ala Leu

245 250 255

His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser Gly Trp Thr Ala

260 265 270

Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro Arg Thr Phe Leu

275 280 285

Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala Val Asp Cys Ala

290 295 300

Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys Ser Phe Thr Val

305 310 315 320

Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val Gln Pro Thr Glu

325 330 335

Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu

340 345 350

Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys

355 360 365

Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala

370 375 380

Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn

385 390 395 400

Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly

405 410 415

Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp

420 425 430

Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp

435 440 445

Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu

450 455 460

Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile

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485 490 495

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Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn

530 535 540

Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly

545 550 555 560

Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu Pro Phe Gln Gln

565 570 575

Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val Arg Asp Pro Gln

580 585 590

Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe Gly Gly Val Ser

595 600 605

Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val Ala Val Leu Tyr

610 615 620

Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile His Ala Asp Gln

625 630 635 640

Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser Asn Val Phe Gln

645 650 655

Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val Asn Asn Ser Tyr

660 665 670

Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala Ser Tyr Gln Thr

675 680 685

Gln Thr Asn Ser Pro Gly Ser Ala Ser Ser Val Ala Ser Gln Ser Ile

690 695 700

Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser Val Ala Tyr Ser

705 710 715 720

Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile Ser Val Thr Thr

725 730 735

Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val Asp Cys Thr Met

740 745 750

Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu Leu Leu Gln Tyr

755 760 765

Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr Gly Ile Ala Val

770 775 780

Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln Val Lys Gln Ile

785 790 795 800

Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe Asn Phe Ser Gln

805 810 815

Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser Phe Ile Glu Asp

820 825 830

Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly Phe Ile Lys Gln

835 840 845

Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp Leu Ile Cys Ala

850 855 860

Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu Leu Thr Asp Glu

865 870 875 880

Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly Thr Ile Thr Ser

885 890 895

Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile Pro Phe Ala Met

900 905 910

Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr Gln Asn Val Leu

915 920 925

Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn Ser Ala Ile Gly

930 935 940

Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala Leu Gly Lys Leu

945 950 955 960

Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn Thr Leu Val Lys

965 970 975

Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val Leu Asn Asp Ile

980 985 990

Leu Ser Arg Leu Asp Pro Pro Glu Ala Glu Val Gln Ile Asp Arg Leu

995 1000 1005

Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val Thr Gln Gln Leu

1010 1015 1020

Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu Ala Ala Thr Lys

1025 1030 1035 1040

Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val Asp Phe Cys Gly

1045 1050 1055

Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ser Ala Pro His Gly Val

1060 1065 1070

Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ala Gln Glu Lys Asn Phe Thr

1075 1080 1085

Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Asp Gly Lys Ala His Phe Pro Arg Glu

1090 1095 1100

Gly Val Phe Val Ser Asn Gly Thr His Trp Phe Val Thr Gln Arg Asn

1105 1110 1115 1120

Phe Tyr Glu Pro Gln Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly

1125 1130 1135

Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro

1140 1145 1150

Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe

1155 1160 1165

Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile

1170 1175 1180

Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu

1185 1190 1195 1200

Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly

1205 1210 1215

Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile Trp Leu Gly Phe

1220 1225 1230

Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile Met Leu Cys Cys

1235 1240 1245

Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Cys Cys Ser Cys Gly Ser

1250 1255 1260

Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro Val Leu Lys Gly Val

1265 1270 1275 1280

Lys Leu His Tyr Thr Arg Ala Arg Arg Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe

1285 1290 1295

Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met

1300 1305 1310

Tyr Ser Phe Val Ser Glu Glu Thr Gly Thr Leu Ile Val Asn Ser Val

1315 1320 1325

Leu Leu Phe Leu Ala Phe Val Val Phe Leu Leu Val Thr Leu Ala Ile

1330 1335 1340

Leu Thr Ala Leu Arg Leu Cys Ala Tyr Cys Cys Asn Ile Val Asn Val

1345 1350 1355 1360

Ser Leu Val Lys Pro Ser Phe Tyr Val Tyr Ser Arg Val Lys Asn Leu

1365 1370 1375

Asn Ser Ser Arg Val Pro Asp Leu Leu Val Arg Ala Arg Arg Gly Ser

1380 1385 1390

Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu

1395 1400 1405

Asn Pro Gly Pro Met Ala Asp Ser Asn Gly Thr Ile Thr Val Glu Glu

1410 1415 1420

Leu Lys Lys Leu Leu Glu Gln Trp Asn Leu Val Ile Gly Phe Leu Phe

1425 1430 1435 1440

Leu Thr Trp Ile Cys Leu Leu Gln Phe Ala Tyr Ala Asn Arg Asn Arg

1445 1450 1455

Phe Leu Tyr Ile Ile Lys Leu Ile Phe Leu Trp Leu Leu Trp Pro Val

1460 1465 1470

Thr Leu Ala Cys Phe Val Leu Ala Ala Val Tyr Arg Ile Asn Trp Ile

1475 1480 1485

Thr Gly Gly Ile Ala Ile Ala Met Ala Cys Leu Val Gly Leu Met Trp

1490 1495 1500

Leu Ser Tyr Phe Ile Ala Ser Phe Arg Leu Phe Ala Arg Thr Arg Ser

1505 1510 1515 1520

Met Trp Ser Phe Asn Pro Glu Thr Asn Ile Leu Leu Asn Val Pro Leu

1525 1530 1535

His Gly Thr Ile Leu Thr Arg Pro Leu Leu Glu Ser Glu Leu Val Ile

1540 1545 1550

Gly Ala Val Ile Leu Arg Gly His Leu Arg Ile Ala Gly His His Leu

1555 1560 1565

Gly Arg Cys Asp Ile Lys Asp Leu Pro Lys Glu Ile Thr Val Ala Thr

1570 1575 1580

Ser Arg Thr Leu Ser Tyr Tyr Lys Leu Gly Ala Ser Gln Arg Val Ala

1585 1590 1595 1600

Gly Asp Ser Gly Phe Ala Ala Tyr Ser Arg Tyr Arg Ile Gly Asn Tyr

1605 1610 1615

Lys Leu Asn Thr Asp His Ser Ser Ser Ser Asp Asn Ile Ala Leu Leu

1620 1625 1630

Val Gln

<210> 13

<211> 4905

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

atgggcaaga ggtccgccgg cagcatcatg tggctggcct ccctggccgt cgtgattgcc 60

tgcgccggcg cttctcagtg tgtgaatctg acaacacgga cccagctgcc tcccgcctat 120

accaactcct tcaccagggg ggtgtactac cctgataagg tgtttcggtc atctgtgctg 180

catagcaccc aggatctgtt cctgcccttc tttagcaacg tgacttggtt ccacgccatc 240

cacgtgagtg gcacaaatgg aaccaagagg ttcgacaatc ctgtgctgcc tttcaacgac 300

ggagtgtact tcgccagcac tgaaaagtcc aatatcatta ggggctggat ctttggcaca 360

accctggact ccaaaaccca gtccctgctg atcgtgaaca acgccaccaa cgttgtgatt 420

aaggtgtgtg agtttcagtt ttgcaatgac cccttccttg gcgtgtatta tcataagaat 480

aataagtctt ggatggagtc tgagttcaga gtgtactcct cagccaataa ttgcaccttc 540

gaatacgtga gccagccatt cctgatggat ctggagggta aacagggcaa ttttaagaac 600

ctgcgcgaat ttgtgtttaa gaatattgat ggatatttca agatctactc taaacatacc 660

cccatcaatc tcgtgagaga tctgccacag ggctttagcg ccctggaacc actcgtggac 720

ctgccaatcg gcatcaatat tacacggttc cagacccttc tggccctgca tcggtcttac 780

ctgacccctg gcgatagttc ctccggctgg actgccgggg ccgccgccta ttacgtggga 840

tacctgcagc ccaggacatt tctcctgaaa tataatgaga acggcaccat caccgacgca 900

gtggattgtg ctctggaccc actgtccgag accaaatgca cactgaagtc tttcacagtg 960

gagaaaggca tctatcagac ttccaacttt cgcgttcagc ccacagagag catcgttagg 1020

tttcctaata tcactaacct gtgcccattc ggagaagtgt ttaatgccac caggttcgcc 1080

agtgtctacg cttggaaccg caagaggatt tctaactgcg tcgccgacta ctcagtgctg 1140

tacaacagcg ctagtttctc cacattcaaa tgttacggag tgtctccaac caagctgaat 1200

gacctgtgtt tcactaacgt gtacgccgat agtttcgtta tcagaggcga cgaggtgcgc 1260

cagatcgctc ccggacagac tggcaaaatt gctgactaca actacaagct ccctgacgac 1320

ttcaccgggt gcgtgattgc atggaacagc aacaatctgg attccaaagt aggagggaat 1380

tataactacc tgtaccgcct ctttagaaag tccaacctga aaccctttga aagggatatt 1440

tccacagaga tctatcaggc cggctctacc ccttgtaacg gcgtggaggg ctttaattgt 1500

tactttcctc tgcagagcta tgggttccag ccaacaaatg gcgtgggcta tcagccatat 1560

agggtggtgg tgctgagttt cgaactcctg catgcccctg ctaccgtgtg cggccctaag 1620

aagtctacca atctggtgaa aaataagtgc gtgaacttta acttcaatgg cctgacagga 1680

accggcgtgc tgacagaaag caacaaaaag ttcctgcctt tccagcaatt cggcagagat 1740

atcgccgata ccactgacgc tgtgagagac ccccagaccc tggagattct cgacataaca 1800

ccctgctcct tcggcggagt gagcgtcatt acaccaggaa caaacacttc caatcaggtg 1860

gccgtgctgt atcaggatgt gaactgtaca gaggtgcctg tggcaatcca cgctgaccag 1920

ctgaccccaa cctggcgggt ttatagtaca ggtagtaatg tgtttcagac aagagccggt 1980

tgcctgattg gggccgaaca cgttaacaat tcttacgaat gtgacatccc tatcggagcc 2040

ggcatttgcg cctcctatca aacccagacc aacagcccag gaagtgctag cagcgtggct 2100

agtcagtcca tcatcgcata tactatgagt ctgggagccg agaatagcgt ggcctactcc 2160

aataacagca ttgccatccc aaccaatttt accatctctg tgaccactga gattctgcca 2220

gtgtcaatga ctaaaacctc agttgattgc acaatgtata tctgtggcga ctctaccgag 2280

tgctctaacc tgctcctgca gtatgggtct ttttgtaccc agctgaacag ggctctgacc 2340

ggaattgccg tggagcagga taaaaacact caagaggtgt tcgcacaggt gaagcagatc 2400

tataagactc cccctatcaa ggatttcgga ggcttcaact tcagccagat cctgcctgac 2460

ccatccaaac ccagcaagag atcctttatt gaagatctgc tgttcaacaa ggtgaccctc 2520

gccgacgccg gctttatcaa gcagtacggt gactgcctgg gggacattgc cgctagagat 2580

ctcatttgcg ctcagaagtt taacggcctg accgtgctgc caccactcct caccgatgag 2640

atgatcgccc agtatacttc tgccctgctg gctggcacca tcacctccgg atggaccttc 2700

ggcgccggcg cagcactgca gatcccattc gccatgcaga tggcttatcg cttcaatggg 2760

atcggcgtga cccagaatgt gctgtacgag aatcagaagc tgatcgccaa ccagtttaat 2820

agcgccatcg gaaagatcca ggacagcctg agcagcactg ccagcgctct gggcaagctc 2880

caggacgttg tgaaccagaa cgctcaggcc ctgaacactc tggtgaaaca gctgtcatcc 2940

aattttggag ccatcagttc agtcctgaat gatatcctgt ctagactgga cccacccgag 3000

gctgaggttc agatcgaccg gctgatcacc ggcagactgc agagcctcca gacttatgtg 3060

acccagcagc tgatcagggc cgccgagatt agagccagcg ccaacctcgc tgctaccaaa 3120

atgagcgagt gcgttctggg acagtctaag cgcgtggact tttgtgggaa aggataccac 3180

ctgatgagct ttcctcagag cgctcctcat ggcgtggtgt tcctgcacgt gacttatgtg 3240

cctgcccagg aaaagaactt cacaacggcc cctgccattt gtcacgacgg aaaggcccac 3300

ttcccacgcg aaggcgtgtt tgtgtctaat ggaactcact ggttcgtgac tcagagaaat 3360

ttctatgagc cacagattat cacaactgat aacacctttg tgagcgggaa ttgtgacgtg 3420

gttatcggca ttgtgaataa taccgtctat gaccccctgc agccagaact ggacagcttt 3480

aaggaagagc tggataagta cttcaagaac cacacatccc cagacgtgga tctgggggac 3540

atcagtggca tcaacgcctc tgtggtgaat atccagaagg agatcgatcg gctgaatgag 3600

gtggccaaga acctgaacga gtctctgatc gacctgcagg agctggggaa atacgagcag 3660

tatatcaagt ggccctggta catctggctg gggtttatcg ctggactgat tgctatcgtg 3720

atggtgacca tcatgctgtg ttgcatgact agctgctgta gctgcctgaa gggatgttgc 3780

agctgcggca gctgctgtaa gttcgatgag gacgactctg agccagtgct gaaaggcgtg 3840

aaactgcact acaccagagc cagacggggg agcggcgcca ccaactttag cctgctgaag 3900

caggccggcg acgtggagga gaaccccggc cccatgtact ccttcgtgag cgaggagacc 3960

ggcaccctga tcgtgaactc cgtgctgctg ttcctggcct tcgtcgtgtt cctgctggtg 4020

accctggcca tcctgaccgc cctgagactg tgcgcctact gctgcaacat cgtgaacgtg 4080

agcctggtga agcccagctt ctacgtgtac tccagggtga agaacctgaa cagctccaga 4140

gtgcccgacc tgctggtgag agcccggaga ggcagcggcg ccaccaactt cagcctgctg 4200

aagcaggccg gcgacgtgga ggagaacccc ggacccatgg ccgacagcaa cggcaccatc 4260

accgtggagg agctgaagaa gctgctggag cagtggaacc tggtcatcgg cttcctgttc 4320

ctgacctgga tctgcctgct gcagttcgcc tacgccaata ggaacaggtt cctgtacatc 4380

atcaagctga tcttcctgtg gctgctgtgg cccgtgaccc tggcctgctt cgtgctggcc 4440

gccgtgtacc ggatcaactg gatcaccggc ggcatcgcca tcgccatggc ctgcctggtg 4500

ggcctgatgt ggctcagcta ttttattgct agttttagac tgtttgctag gactagaagc 4560

atgtggagct ttaatcctga gactaatatt ctgctgaacg tgccactgca cggcacaatc 4620

ctgactagac ccctgttaga aagtgaactc gtgatcggcg cagtgatcct gcgcggccac 4680

ctgagaatcg ccggccacca tctgggccgg tgtgacatca aagatctgcc taaagagata 4740

acagtagcca ctagtagaac cctgagctac tataaattag gagcctcaca gcgcgtagca 4800

ggtgactcgg gatttgcagc ctactctaga tataggatag gtaactataa gctgaacact 4860

gaccatagta gtagctctga taatatagca ctgttagtgc aatag 4905

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

ctgcagaagt tggtcgtgag gcac 24

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

ttatcactag gtgtagtgca 20

<210> 16

<211> 1359

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

atgggcaaga gaagcgccgg cagcatcatg tggctggcca gcctggccgt cgtgatcgcc 60

tgcgcagggg cccctaacat tactaacctg tgccccttcg gtgaggtctt taacgccacc 120

cggttcgcct cagtgtacgc ctggaatagg aaacggatta gtaactgtgt agctgactat 180

agcgtgctgt acaatagcgc ttcttttagc acttttaagt gctacggcgt gagccccact 240

aagctgaatg acctgtgctt caccaacgtg tacgccgact ccttcgtgat tagaggcgat 300

gaggtgagac agatcgcccc tggccagacc ggcaagattg ctgactacaa ctacaagctg 360

cccgacgact ttaccggctg cgtgatcgcc tggaactcca acaacctgga tagcaaggtg 420

gggggcaact acaactacct gtacagactg ttcaggaagt ccaacctgaa gcccttcgag 480

agagatatca gcaccgagat ctaccaggcc ggcagcaccc cctgcaacgg cgtggagggc 540

ttcaactgct acttccctct gcagtcctac ggcttccagc ccaccaatgg cgtgggctac 600

cagccctaca gagtggtggt gctgagcttc gagctgctgc acgccccagg gggcggcggc 660

tcaggcggcg gcggctctgg cggcggcggc agcgccgact ccaacggcac catcaccgtg 720

gaggagttaa agaagctgct ggagcagtgg aatctggtca tcggcttcct gttcctgacc 780

tggatctgcc tgctgcagtt cgcctacgca aatcggaata ggttcctgta tataatcaag 840

ctgatctttc tgtggctcct gtggcccgtg accctggcct gcttcgtgct ggccgctgtg 900

tacaggatca actggatcac cggcggcatc gccatcgcca tggcctgcct ggtgggcctg 960

atgtggctga gctacttcat cgccagcttt cggctgttcg ccagaacccg cagcatgtgg 1020

tccttcaacc ctgagaccaa catcctgctg aacgtgcccc tgcacggcac catcctgacc 1080

cggcccctgc tggagtccga gctcgtgatc ggcgccgtga tcctgagggg ccacctgaga 1140

atcgccggcc accacctggg ccggtgcgac atcaaggacc tgcctaagga gatcaccgtg 1200

gccaccagca gaacactgag ctactacaag ctgggcgcca gccagagagt ggccggcgac 1260

tctggcttcg ccgcctactc tagatataga attggcaact acaagctgaa caccgaccac 1320

agcagcagca gcgataacat cgccctgctg gtgcagtaa 1359

<210> 17

<211> 452

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 17

Met Gly Lys Arg Ser Ala Gly Ser Ile Met Trp Leu Ala Ser Leu Ala

1 5 10 15

Val Val Ile Ala Cys Ala Gly Ala Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro

20 25 30

Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp

35 40 45

Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr

50 55 60

Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr

65 70 75 80

Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val

85 90 95

Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys

100 105 110

Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val

115 120 125

Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr

130 135 140

Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu

145 150 155 160

Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn

165 170 175

Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe

180 185 190

Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu

195 200 205

Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

210 215 220

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Asp Ser Asn Gly Thr Ile Thr Val

225 230 235 240

Glu Glu Leu Lys Lys Leu Leu Glu Gln Trp Asn Leu Val Ile Gly Phe

245 250 255

Leu Phe Leu Thr Trp Ile Cys Leu Leu Gln Phe Ala Tyr Ala Asn Arg

260 265 270

Asn Arg Phe Leu Tyr Ile Ile Lys Leu Ile Phe Leu Trp Leu Leu Trp

275 280 285

Pro Val Thr Leu Ala Cys Phe Val Leu Ala Ala Val Tyr Arg Ile Asn

290 295 300

Trp Ile Thr Gly Gly Ile Ala Ile Ala Met Ala Cys Leu Val Gly Leu

305 310 315 320

Met Trp Leu Ser Tyr Phe Ile Ala Ser Phe Arg Leu Phe Ala Arg Thr

325 330 335

Arg Ser Met Trp Ser Phe Asn Pro Glu Thr Asn Ile Leu Leu Asn Val

340 345 350

Pro Leu His Gly Thr Ile Leu Thr Arg Pro Leu Leu Glu Ser Glu Leu

355 360 365

Val Ile Gly Ala Val Ile Leu Arg Gly His Leu Arg Ile Ala Gly His

370 375 380

His Leu Gly Arg Cys Asp Ile Lys Asp Leu Pro Lys Glu Ile Thr Val

385 390 395 400

Ala Thr Ser Arg Thr Leu Ser Tyr Tyr Lys Leu Gly Ala Ser Gln Arg

405 410 415

Val Ala Gly Asp Ser Gly Phe Ala Ala Tyr Ser Arg Tyr Arg Ile Gly

420 425 430

Asn Tyr Lys Leu Asn Thr Asp His Ser Ser Ser Ser Asp Asn Ile Ala

435 440 445

Leu Leu Val Gln

450

<210> 18

<211> 312

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

atgcttctga ataagcacat cgatgcctat aaaacatttc caggaggagg cggctctggc 60

ggcggaggct ctggcggcgg cggctcttac agctttgtgt ctgaggaaac aggcacactg 120

atcgtgaata gcgtgctgct gtttctggct tttgtggtgt tcctgctggt gacactggcc 180

atcctgaccg ccctgagact gtgtgcttat tgctgtaata ttgtgaatgt gtctctggtg 240

aaacctagct tttatgtgta ctctagagtg aaaaatctga attcttctag agtgcctgat 300

ctgctggtgt aa 312

<210> 19

<211> 103

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 19

Met Leu Leu Asn Lys His Ile Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Gly Gly

1 5 10 15

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Tyr Ser Phe

20 25 30

Val Ser Glu Glu Thr Gly Thr Leu Ile Val Asn Ser Val Leu Leu Phe

35 40 45

Leu Ala Phe Val Val Phe Leu Leu Val Thr Leu Ala Ile Leu Thr Ala

50 55 60

Leu Arg Leu Cys Ala Tyr Cys Cys Asn Ile Val Asn Val Ser Leu Val

65 70 75 80

Lys Pro Ser Phe Tyr Val Tyr Ser Arg Val Lys Asn Leu Asn Ser Ser

85 90 95

Arg Val Pro Asp Leu Leu Val

100

Claims

1.一种SARS-CoV-2病毒的免疫原，其特征在于，包括多种蛋白，所述多种蛋白包括：SARS-CoV-2病毒的全长S蛋白或S蛋白RBD结构域或PreS蛋白中的任一种，以及下述蛋白(a)-(d)中的至少一种：

(b)SARS-CoV-2病毒的N蛋白抗原表位融合的M蛋白，其氨基酸序列包括如SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列；

(d)SARS-CoV-2病毒的N蛋白抗原表位融合的E蛋白，其氨基酸序列包括如SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列；

其中，所述全长S蛋白的氨基酸序列包括如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，所述S蛋白RBD结构域的氨基酸序列包括如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，所述PreS蛋白的氨基酸序列包括如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列；

优选地，所述N蛋白抗原表位融合的M蛋白包括SARS-CoV-2病毒的M蛋白、柔性连接肽以及SARS-CoV-2病毒的N蛋白中诱导T细胞免疫的抗原表位，所述抗原表位通过所述柔性连接肽连接于所述M蛋白的N端或C端；

优选地，所述N蛋白抗原表位融合的E蛋白包括SARS-CoV-2病毒的E蛋白、柔性连接肽以及SARS-CoV-2病毒的N蛋白中诱导T细胞免疫的抗原表位，所述抗原表位通过所述柔性连接肽连接于所述E蛋白的N端或C端；

优选地，所述柔性连接肽的氨基酸序列包括如SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列。

2.一种核酸分子，其特征在于，包括：编码如权利要求1中所述的免疫原的多种蛋白的核苷酸序列；

优选地，编码所述多种蛋白的核苷酸序列为融合的重组基因片段，或者编码所述多种蛋白的核苷酸序列包括编码所述多种蛋白中任一蛋白的核苷酸序列。

3.一种表达盒，其特征在于，包括：如权利要求2中所述的核酸分子。

4.一种表达载体，其特征在于，包括：载体，以及如权利要求2中所述的核酸分子或如权利要求3中所述的表达盒；

优选地，所述载体为复制缺陷型黑猩猩腺病毒载体，所述复制缺陷型黑猩猩腺病毒载体为基因组中缺失E1编码区和E3编码区的AdC68型黑猩猩腺病毒。

5.一种转化体，其特征在于，包括：表达系统，以及如权利要求2中所述的核酸分子、或如权利要求3中所述的表达盒、或如权利要求4中所述的表达载体；

优选地，所述表达系统为原核生物或真核生物。

6.一种SARS-CoV-2病毒样颗粒，其特征在于，由多种蛋白装配形成，所述多种蛋白包括：SARS-CoV-2病毒的全长S蛋白或S蛋白RBD结构域或PreS蛋白中的任一种，以及下述蛋白(a)-(d)中的至少一种：

7.一种SARS-CoV-2病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，用于制备如权利要求6中所述的SARS-CoV-2病毒样颗粒，所述制备方法包括：经表达系统表达所述多种蛋白，装配形成所述SARS-CoV-2病毒样颗粒；

优选地，所述多种蛋白形成融合蛋白，所述制备方法包括如下步骤：

所述融合蛋白装配形成所述SARS-CoV-2病毒样颗粒；

优选地，当所述多种蛋白形成融合蛋白时，编码所述多种蛋白中任一种蛋白的核苷酸序列分别处于独立的表达框，或者编码所述多种蛋白中至少两种蛋白的核苷酸序列串联至同一个表达框。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述多种蛋白中任一种蛋白独立地表达，例如，所述制备方法包括如下步骤：

所述多种蛋白自行装配形成所述SARS-CoV-2病毒样颗粒；

优选地，所述多种蛋白包括至少一种融合蛋白和一种非融合蛋白，其中，所述融合蛋白包括至少两种不同的蛋白，编码所述融合蛋白的核苷酸序列和编码所述非融合蛋白的核苷酸序列彼此独立地装载于不同的表达载体，例如，所述制备方法包括如下步骤：

所述多种蛋白自行装配形成所述SARS-CoV-2病毒样颗粒。

9.一种药物组合物，其特征在于，包括：如权利要求1中所述的免疫原、或如权利要求2中所述的核酸分子、或如权利要求3中所述的表达盒、或如权利要求4中所述的表达载体、或如权利要求5中所述的转化体、或如权利要求6中所述的SARS-CoV-2病毒样颗粒、或如权利要求7或8中所述的制备方法制得的SARS-CoV-2病毒样颗粒；

优选地，所述药物组合物还包括：药学上可接受的佐剂和/或辅料；

优选地，所述药物组合物为适用于肌内、皮下或粘膜施用的剂型；

优选地，适用于粘膜施用的所述药物组合物的剂型为口服剂、气溶胶吸入剂、滴鼻剂以及喷雾剂中的至少一种；

优选地，适用于肌内或皮下施用的所述药物组合物的剂型为注射剂。

10.根据权利要求1中所述的免疫原、或如权利要求2中所述的核酸分子、或如权利要求3中所述的表达盒、或如权利要求4中所述的表达载体、或如权利要求5中所述的转化体、或如权利要求6中所述的SARS-CoV-2病毒样颗粒、或如权利要求7或8中所述的制备方法制得的SARS-CoV-2病毒样颗粒、或如权利要求9中所述的药物组合物在制备用于治疗或预防SARS-CoV-2病毒感染的疫苗和/或药物中的用途。