ES2325303T3 - Vectores adenoviricos lanzadera con e1b suprimida. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para crear un vector adenovírico, comprendiendo dicho procedimiento las siguientes etapas: (i) introducir sitios de clonación únicos en la región E1b adenovírica que permitan la deleción selectiva del o de los genes de la región E1b; (ii) suprimir uno o más genes de la región E1b seleccionados del grupo formado por 55k; 19k y 55k; 19k, 55k y pIX; y pIX; y (iii) sustituir dicho o dichos genes de E1b por un gen heterólogo de modo que dicho gen heterólogo esté bajo el control del promotor E1b endógeno, y de modo que el gen heterólogo presente sustancialmente el patrón de expresión temporal del o de los genes de la región E1b suprimidos.
Description
Vectores adenovíricos lanzadera con E1B
suprimida.
Esta invención se refiere a vectores
adenovíricos y a procedimientos para hacer y usar dichos vectores.
Más en particular, esta invención se refiere a vectores
adenovíricos lanzadera mejorados que contienen mutaciones en la
región E1B que permiten la supresión de la región entera, o genes
seleccionados de la misma, y la sustitución por una secuencia de
ADN heteróloga, de modo que dicha secuencia de ADN heteróloga está
bajo el control del promotor E1b endógeno.
Los adenovirus son una familia de virus que
producen infección benigna en el tracto respiratorio en seres
humanos. Se han identificado aproximadamente 45 serotipos. Las cepas
5 y 2 del subgrupo C son dos cepas que se han usado para hacer
vectores porque su composición molecular está bien caracterizada,
aunque la experiencia clínica con vacunas de adenovirus es con las
cepas 4, 7 y 21 (véase, por ejemplo, Takafuji, J. Inf. Dis.
140: 48-53 (1979)). Los adenovirus son virus de ADN
bicatenarios, icosaédricos sin envoltura. El genoma tiene un tamaño
de aproximadamente 36 kb y codifica aproximadamente 40 polipéptidos
de tamaños variados, incluyendo proteínas tempranas y tardías.
Después de unirse a una célula diana a través de una proteína de
fibra de la cápsida, el virus se internaliza en los endosomas,
escapando finalmente la cápsida relativamente intacta cuando migra
al núcleo. En el poro nuclear, la cápsida se disocia y el ADN vírico
se mueve al núcleo de la célula y se transcriben las proteínas
tempranas, que dan como resultado la replicación del ADN y la
transcripción de los genes tardíos que codifican las proteínas de
la cápsida. La replicación se produce normalmente en el núcleo de
la célula, aunque no exclusivamente, sin integración en el ADN del
huésped. Se montan nuevas partículas de virus en el núcleo y se
produce la lisis de las células huésped, aproximadamente 36 h
después de la infección, liberando el virus. Los adenovirus
infectan a una amplia variedad de tipos de células, y se ha
observado la transducción en células replicativas y no
replicativas.
En los últimos años, los adenovirus humanos se
han hecho populares como vehículos para la transferencia de genes a
células de mamífero, porque los virus usan la maquinaria de la
célula huésped para sintetizar el ADN, ARN y proteínas víricos y
porque se han definido bien la transcripción de genes, organización
genómica y la identidad del ADN en el adenovirus. Se conocen los
vectores adenovíricos y su uso facilita el estudio de la función de
las proteínas en células de mamíferos y permite la producción de
productos génicos. Además, los vectores adenovíricos se pueden usar
como vacunas de virus recombinantes. El procedimiento habitual para
hacer un vector adenovírico es sustituir la región E1 del genoma
del virus por un transgén dirigido por un promotor exógeno
seleccionado, que normalmente contiene un potenciador fuerte. Las
sustituciones y/o deleciones también se han hecho en las regiones
E3 y E4. Las sustituciones en la región E1 son particularmente
ventajosas porque las proteínas E1 tienen propiedades oncogénicas y
líticas.
La modificación del genoma vírico puede llevarse
a cabo usando recombinación o usando técnicas de biología
molecular. Este último procedimiento normalmente aprovecha un sitio
Cla-1 único en el extremo izquierdo del genoma de
la cepa 5 del adenovirus ("Ad-5") que altera la
región E1A, y las secuencias terminales de la izquierda necesarias
para la encapsidación y que contiene un origen de replicación, a
aproximadamente 900 pares de bases del extremo 5' del genoma.
También se construye un vector de expresión plasmídico que tiene un
sitio Cla-1 único secuencia abajo del transgén
deseado y una copia de las secuencias terminales adenovíricas
secuencia arriba. Este vector se corta y se liga al fragmento
adenovírico negativo E1 y se transfecta a células de riñón 293
humanas inmortalizadas por la expresión constitutiva de proteínas
E1A y E1B, para proporcionar funciones E1 en trans. Se seleccionan
y criban los recombinantes de las placas, se vuelven a purificar y
después se usan para generar grandes cantidades de vector
adenovírico recombinante purificado. Los rendimientos pueden ser
tan altos como 10^{12} a 10^{13} partículas/ml. Véase,
Stratford-Perricaudet, J. Clin. Invest. 90:
626-30 (1992). Sin embargo, este procedimiento tiene
varios problemas, que se discuten en la publicación de patente PCT
nº WO 96/25507, publicada el 22 de agosto de 1996 (Solicitud
internacional nº PCT/US96/02336).
En otro procedimiento, se insertan genes
extraños en la región E1 (véase, McGrory, Virology 163:
614-17 (1988)), en la región E3 (véase, Hanke,
Virology 177: 437-44 (1990) y Bett, J.
Virol. 67: 5911-21 (1993)) o en la región E3 de
un vector con E1 suprimida. Brevemente, este procedimiento usa la
sustitución de secuencias de ADN genómicas del adenovirus por otro
fragmento de ADN para crear un plásmido que contiene una secuencia
genómica que supera el límite de empaquetamiento de los viriones de
adenovirus. Después, la "construcción" se puede propagar como
un plásmido (pJM17), que se puede rescatar como viriones infecciosos
cuando el fragmento extraño se sustituye por recombinación homóloga
por otro fragmento de ADN suficientemente pequeño para permitir el
empaquetamiento. Para más información general sobre estos vectores y
sus usos, véase, Hitt, "Construction and propagation of human
adenovirus vectors". En: Cell Biology: a Laboratory Handbook, J.
Celis (ed), Academic Press, N.Y, 1995; véase Graham, "Adenovirus
based expression vectors and recombinant vacines". En: Vaccines:
New Approaches to Immunological Problems. R.W. Ellis (ed),
Butterworth, páginas 363-390, 1992, y véase Graham,
"Manipulation of adenovirus vectors". En: Methods in Molecular
Biology, Vol. 7: Gene Transfer and Expression Techniques. E.J.
Murry and J.M. Walker (eds) Humana Press Inc., Clifton, N.J.,
páginas 109-128, 1991.
Los vectores adenovíricos diseñados y
construidos originalmente reducían la replicación del virus por
deleción o mutación de partes de la región E1A y E1B. La desventaja
de este procedimiento era que el empaquetamiento en las cápsidas
víricas no era eficaz, debido al aumento del tamaño del genoma por
la adición del transgén y se reducía simultáneamente la titulación
de reserva de virus. Las deleciones en la región E3 aumentaban la
cantidad de ADN heterogéneo que se podía insertar en el vector, pero
se creía que se necesitaba la expresión del gen E3 para ayudar a
las células infectadas por virus a evitar la respuesta inmunitaria
del huésped.
Por lo tanto, sería ventajoso proporcionar un
vector adenovírico mejorado que permita inserciones grandes de ADN
heterogéneo sin sacrificar la eficacia del empaquetamiento o la
inmunidad protectora.
En un aspecto, la invención proporciona un
procedimiento para crear un vector adenovírico, comprendiendo dicho
procedimiento las siguientes etapas:
(i) introducir sitios de clonación únicos en la
región E1b del adenovirus que permitan la deleción selectiva del o
de los genes de la región E1b;
(ii) suprimir uno o más genes de la región E1b
seleccionados del grupo formado por 55k; 19k y 55k; 19k, 55k y pIX;
y pIX; y
(iii) sustituir dicho o dichos genes de E1b
suprimidos por un gen heterólogo de modo que dicho gen heterólogo
esté bajo el control del promotor E1b endógeno, y de modo que dicho
gen heterólogo presente sustancialmente el patrón de expresión
temporal del o de los genes de la región E1b suprimida.
\vskip1.000000\baselineskip
En un segundo aspecto, la invención proporciona
un vector lanzadera de E1B en el que se puede suprimir el gen
adenovírico 55K y sustituirlo por un gen heterólogo de interés.
En otro aspecto, la invención proporciona un
vector lanzadera de E1B en el que se pueden suprimir los genes de
la región E1b, 19K y 55K, y sustituirlos por un gen heterólogo de
interés.
En otro aspecto, la invención proporciona un
vector lanzadera de E1B en el que se pueden suprimir los genes 19K,
55K y pIX, o se puede suprimir el gen pIX, y sustituirlos por un gen
heterólogo de interés.
En un aspecto adicional de la invención, el gen
heterólogo codifica una citoquina, incluyendo las interleuquinas,
factor alfa de necrosis tumoral, interferón gamma, o proteínas
reguladoras del ciclo celular, incluyendo p 16 o ras, o proteínas
que inducen el suicidio celular o la apoptosis, o activadores de
profármacos, incluyendo citosina desaminasa o timidina quinasa, o
una quimioquina incluyendo proteínas inhibidoras de macrófagos
(mip), incluyendo mip-3 alfa. El patrón de
expresión temporal del gen heterólogo es similar al gen adenovírico
endógeno al que sustituye.
En el presente documento se describen vectores
lanzadera de E1B en los que dichos vectores también tienen
mutaciones en algún otro sitio en el genoma adenovírico,
preferiblemente en las regiones E1A, E3 y/o E4.
En el presente documento también se describen
procedimientos en los que los vectores lanzadera de E1B se usan
para el tratamiento o prevención beneficiosos de una enfermedad.
Los vectores lanzadera de E1B se pueden
administrar a un paciente en una cantidad terapéuticamente eficaz
en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Estos y otros objetos de
la presente invención se harán evidentes para el experto en la
materia tras leer la descripción de los diferentes aspectos de la
invención en la siguiente memoria descriptiva. Los aspectos
anteriores y otros aspectos de la invención se explican con mayor
detalle en los dibujos, descripción detallada y ejemplos que se
presentan a continuación.
Figura 1. Muestra el mapa de restricción del
plásmido p\Delta55K.
Figura 2. Muestra el mapa de restricción del
plásmido p\DeltaE1B.
Figura 3. Muestra el mapa de restricción del
plásmido p\DeltaE1B/pIX.
Figura 4. Muestra el mapa de restricción del
plásmido p\DeltaE1B/CD.
Figura 5. Muestra el mapa de restricción del
plásmido p\Delta55K/CD.
Figura 6. Muestra análisis por cromatografía en
capa fina de la actividad de la citosina desaminasa de lisatos de
células A549 infectadas por adenovirus recombinantes. Los lisatos se
prepararon en los tiempos especificados después de infectar las
células con los siguientes virus: Ad5, E1B/CD y 55K/CD.
Figura 7a. Muestra el análisis northern del ARN
de CD preparado a partir de los lisatos de células A549. Los
lisatos se prepararon y se hibridaron con una sonda de CD
radiomarcada en los tiempos especificados después de infectar las
células con los siguientes virus: Ad5, E1B/CD y 55K/CD.
Figura 7b. Muestra el análisis northern del ARN
de 55K adenovírico preparado a partir de los lisatos de células
A549. Las transferencias usadas para el ensayo del ARN de CD (Fig.
7a) se volvieron a usar aquí. Las transferencias se separaron y se
volvieron a hibridar con una sonda específica para 55K
radiomarcada.
Figura 8. Muestra el mapa de restricción del
plásmido p\DeltaKmTNF.
Figura 9. Muestra la producción de mTNF en
células 293 infectadas con p\DeltaKmTNF y ensayadas en tiempos
diferentes.
Figura 10. Muestra en forma de diagrama la
generación de los vectores lanzadera de E1B de la invención.
Salvo que se define lo contrario, todos los
términos técnicos y científicos usados en el presente documento
tienen el mismo significado que entiende normalmente un experto en
la materia a la que pertenece esta invención. En general, la
nomenclatura usada en el presente documento y en los procedimientos
de laboratorio descritos a continuación, es bien conocida y se usa
habitualmente en la materia.
Se usan técnicas estándar para los
procedimientos de ácido nucleico recombinante, síntesis de
polinucleótidos, y cultivo y transformación microbianos (p. ej.,
electroporación, lipofección). En general, las reacciones
enzimáticas y las etapas de purificación se llevan a cabo de acuerdo
con las especificaciones del fabricante. Las técnicas y
procedimientos se llevan a cabo en general de acuerdo con
procedimientos convencionales en la técnica y diferentes
referencias generales (véase en general, Sambrook y col.,
"Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2ª edición (1989)
Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.) que
se proporcionan a lo largo de este documento. La nomenclatura usada
en el presente documento y en los procedimientos de laboratorio en
química analítica, química orgánica sintética y formulación
farmacéutica descritos a continuación, es la conocida y usada
habitualmente en la materia. Se usan técnicas estándar para la
síntesis química, análisis químicos, formulación farmacéutica y
suministro, y tratamiento de los pacientes.
Los expertos en la materia también reconocerán
publicaciones que faciliten la ingeniería genética del adenovirus
de la invención para producir los vectores lanzadera de E1b de la
invención. Estas incluye el trabajo de Hitt, M., y col
"Construction and propagation of human adenovirus vectors". En:
Cell Biology: a Laboratory Handbook; J. Celis (Ed), Academic Press,
NY. (1996); Graham, F.L. y Prevec, L. "Adenovirus based expression
vectors and recombinant vaccines". En: Vaccines: New Approaches
to Immunological Problems. R.W. Ellis (ed) Butterworth. páginas.
363-390; y Graham, F.L. y Prevec, L. "Manipulation
of adenovirus vectors". En: Methods in Molecular Biology, Vol.
7: Gene Transfer and Expression Techniques. E.J. Murray y J.M.
Walker (eds) Humana Press Inc., Clifton, N. J. páginas
109-128, 1991. Los materiales y procedimientos
descritos en estos artículos se usan o se pueden usar a
continuación.
En las fórmulas que representan realizaciones
específicas seleccionadas de la presente invención, los grupos
amino y carboxi terminales, aunque a menudo no se muestran
específicamente, se entiende que están en la forma que se presupone
a los valores de pH fisiológico, salvo que se especifique lo
contrario. Por lo tanto, se entiende que a pH fisiológico están
presentes el NH_{2}^{+} terminal y CO terminal aunque no se
muestre y especifique necesariamente, sea en los ejemplos
específicos o en las fórmulas genéricas. En la notación de
polipéptidos usada en el presente documento, el extremo izquierdo de
la molécula es el extremo amino terminal y el extremo derecho es el
extremo carboxi terminal, de acuerdo con el uso estándar y convenio.
Por supuesto, las sales de adición básicas y ácidas, incluyendo las
que se forman a valores de pH no fisiológicos, también están
incluidas en los compuestos de la invención. Los restos de
aminoácidos descritos en el presente documento preferiblemente
están en la forma isomérica "L". Los estereoisómeros (p. ej.,
aminoácidos D) de los 20 aminoácidos convencionales, aminoácidos no
naturales tales como aminoácidos a,a-distribuidos,
N-alquilaminoácidos, ácido láctico y otros
aminoácidos no convencionales, también pueden ser componentes
adecuados para los polipéptidos de la presente invención, con la
condición de que el polipéptido retenga la propiedad funcional
deseada. Para los péptidos mostrados, cada resto codificado, cuando
sea adecuado, se representa por una designación de 3 letras, que
corresponde al nombre trivial del aminoácido convencional, de
acuerdo con la nomenclatura de polipéptidos estándar (descrita en
J. Biol. Chem., 243: 3552-59 (1969) y
adoptada en el Título 37 CFR \NAK 1.822(b)(2)). Los grupos
funcionales libres, incluyendo los de los extremos carboxi o amino,
denominados sustituyentes que no interfieren, también se pueden
modificar por amidación, acilación u otra sustitución, que puede,
por ejemplo, cambiar la solubilidad de los compuestos sin afectar a
su actividad.
Como se usa a lo largo de esta descripción, las
siguientes expresiones, salvo que se indique lo contrario, se
entenderá que tienen los siguientes significados:
- La expresión "proteína aislada" usada en el presente documento, significa una proteína de ADNc, ARN recombinante, o de origen sintético o alguna combinación de los mismos, que en virtud de su origen, la "proteína aislada" (1) no está asociada con proteínas encontradas en la naturaleza, (2) no tiene otras proteínas de la misma fuente, p. ej., no tiene proteínas humanas, (3) es expresada por una célula de una especie diferente, o (4) no se encuentra en la naturaleza.
- El término "natural" tal como se usa en el presente documento cuando se aplica a un objeto, se refiere al hecho de que un objeto se puede encontrar en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia de polipéptido o polinucleótido que está presente en un organismo (incluyendo virus) que se puede aislar de una fuente en la naturaleza y que no ha sido modificado intencionadamente por el hombre en el laboratorio, es natural.
- El término "adenovirus" como se usa en el presente documento, indica aproximadamente 47 subtipos de adenovirus aislados de seres humanos, así como de otros muchos mamíferos y aves. Véase, Strauss, "Adenovirus infections in humans", en The Adenoviruses, Ginsberg, ed., Plenum Press, New York, NY, pp. 451-596 (1984). El término se aplica preferiblemente a 2 serotipos humanos Ad2 y Ad5.
- El término "polinucleótido" usado en el presente documento significa una forma polimérica de nucleótidos de al menos 10 bases de longitud, ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido. El término incluye formas mono y bicatenarias de ADN.
- El término "oligonucleótido" usado en el presente documento, incluye nucleótidos naturales y modificados unidos entre sí por enlaces de oligonucleótidos naturales y no naturales. Los oligonucleótidos son un subconjunto de polinucleótidos de 200 bases o menos de longitud. Los oligonucleótidos preferidos tienen de 10 a 60 bases de longitud. Los oligonucleótidos normalmente son monocatenarios, p. ej., para las sondas; aunque los oligonucleótidos pueden ser bicatenarios, p. ej., para usar en la construcción de un gen mutante. Los oligonucleótidos de la invención pueden ser oligonucleótidos homosentido o antisentido.
- La expresión "nucleótidos naturales" usada en el presente documento incluye desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos.
- La expresión "nucleótidos modificados" usada en el presente documento, incluye nucleótidos con grupos azúcar modificados o sustituidos y similares, conocidos en la técnica.
Tal como se usa en el presente documento, los
términos "marcador" o "marcado" se refieren a la
incorporación de un marcador detectable, p. ej., por incorporación
de un aminoácido radiomarcado o la unión a un polipéptido con
restos biotinilo, que se puede detectar con avidina marcada (p. ej.,
estreptavidina que contiene un marcador fluorescente o actividad
enzimática que se puede detectar por procedimientos ópticos o
colorimétricos). Se conocen en la técnica diferentes procedimientos
de marcaje de polipéptidos y glicoproteínas y se pueden usar. Los
ejemplos de marcadores para polipéptidos incluyen, pero no se
limitan a los siguientes: radioisótopos (p. ej., ^{3}H, ^{14}C,
^{35}S, ^{125}I, ^{131}I), marcadores fluorescentes (p. ej.,
FITC, rodamina, lantánido-fósforo), marcadores
enzimáticos (p. ej., peroxidasa de rábano picante,
b-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina),
quimioluminiscentes, grupos biotinilo, epítopos de polipéptidos
predeterminados reconocidos por un indicador secundario (p. ej.,
secuencias de pares de cremallera de leucina, sitios de unión para
anticuerpos secundarios, dominios de unión de metales, etiquetas de
epítopos). En algunas realizaciones, los marcadores están unidos
por brazos espaciadores de diferentes longitudes para reducir el
potencial impedimento estérico.
La expresión "homología de secuencia" usada
en el presente documento, describe la proporción de correspondencias
de bases entre 2 secuencias de ácido nucleico o la proporción de
correspondencias de aminoácidos entre 2 secuencias de aminoácidos.
Cuando la homología de secuencia se expresa como un porcentaje, p.
ej., 50%, el porcentaje indica la proporción de correspondencias a
lo largo de la longitud de la secuencia que se compara con alguna
otra secuencia. Los huecos (en cualquiera de las dos secuencias)
están permitidos para maximizar la correspondencia; normalmente se
usan longitudes de huecos de 15 bases o menos, prefiriéndose 6 bases
o menos, y es más preferido 2 bases o menos.
La expresión "corresponde a" se usa en el
presente documento para indicar que una secuencia de polinucleótido
es homóloga (es decir, es idéntica, no estrictamente evolutivamente
relacionada) a toda o una parte de una secuencia de polinucleótido
de referencia, o que una secuencia de polipéptido es idéntica a una
secuencia de polipéptido de referencia. En contraposición, la
expresión "complementaria de" se usa en el presente documento
para indicar que la secuencia complementaria es homóloga a toda o
una parte de una secuencia de polinucleótido de referencia. Como
ilustración, la secuencia de nucleótidos "TATAC" corresponde a
la secuencia de referencia "TATAC" y es complementaria de una
secuencia de referencia "GTATA".
Las siguientes expresiones se usan para
describir las relaciones de secuencia entre dos o más
polinucleótidos: "secuencia de referencia", "ventana de
comparación", "identidad de secuencia", "porcentaje de
identidad de secuencia" e "identidad sustancial". Una
"secuencia de referencia" es una secuencia definida usada como
base para una comparación de secuencias; una secuencia de
referencia puede ser un subconjunto de una secuencia más larga, por
ejemplo, como segmento de un ADNc de longitud completa o secuencia
génica dada en un listado de secuencias, puede comprender una
secuencia de ADNc o génica completa. En general, una secuencia de
referencia tiene al menos 20 nucleótidos de longitud, con
frecuencia al menos 25 nucleótidos de longitud y a menudo al menos
50 nucleótidos de longitud. Puesto que dos polinucleótidos puede
cada una (1) comprender una secuencia (es decir, una parte de la
secuencia del polinucleótido completo) que es similar entre los dos
polinucleótidos, y (2) además puede comprender una secuencia que es
divergente entre los dos polinucleótidos, las comparaciones de
secuencias entre dos (o más) polinucleótidos normalmente se realizan
comparando las secuencias de los dos polinucleótidos a lo largo de
una "ventana de comparación" para identificar y comparar
regiones locales de similitud de secuencia. Una "ventana de
comparación", tal como se usa en el presente documento, se
refiere a un segmento conceptual de al menos 20 posiciones de
nucleótidos contiguas, en la que una secuencia de polinucleótido se
puede comparar con una secuencia de referencia de al menos 20
nucleótidos contiguos y en el que la parte de la secuencia de
polinucleótido en la ventana de comparación puede comprender
adiciones o deleciones (es decir, huecos) de 20 por ciento o menos
comparado con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones
o deleciones) para el alineamiento óptimo de las dos secuencias. El
alineamiento óptimo de secuencias para alinear una ventana de
comparación se puede realizar mediante el algoritmo de homología
local de Smith y Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482,
por el algoritmo de homología de Needleman y Wunsch (1970) J.
Mol. Biol. 48: 443, por el procedimiento de búsqueda de
similitud de Pearson y Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci.
(U.S.A.) 85: 2444, por implementaciones computerizadas de estos
algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en el paquete de software
de Wisconsin Genetics Release 7.0, Genetics Computer Group, 575
Science Dr., Madison, WI), o por inspección, y se selecciona el
mejor alineamiento (es decir, que da como resultado el porcentaje
de homología más alto a lo largo de la ventana de comparación)
generado por los diferentes procedimientos. La expresión
"identidad de secuencia" significa que dos secuencias de
polinucleótidos son idénticas (es decir, en una base de nucleótido
por nucleótido) a lo largo de la ventaja de comparación. La
expresión "porcentaje de identidad de secuencia" se calcula
comparando dos secuencias alineadas de forma óptima a lo largo de la
ventana de comparación, determinando el número de posiciones en las
que se encuentran bases del ácido nucleico idénticas (p. ej., A, T,
C, G, U o I) en ambas secuencias, para dar el número de posiciones
que se corresponden, dividiendo el número de posiciones que se
corresponden entre el número total de posiciones en la ventana de
comparación (es decir, el tamaño de la ventana) y multiplicando el
resultado por 100, para dar el porcentaje de identidad de
secuencia. La expresión "sustancialmente idéntica" tal como se
usa en el presente documento indica una característica de una
secuencia de polinucleótido, en el que el polinucleótido comprende
una secuencia que tiene al menos 85 por ciento de identidad de
secuencia, preferiblemente al menos 90 a 95 por ciento de identidad
de secuencia, más habitualmente al menos 99 por ciento de identidad
de secuencia, comparado con una secuencia de referencia a lo largo
de una ventana de comparación de al menos 20 posiciones de
nucleótidos, con frecuencia a lo largo de una ventana de al menos
25-50 nucleótidos, en el que el porcentaje de
identidad de secuencia se calcula comparando la secuencia de
referencia con la secuencia de polinucleótido que puede incluir
deleciones o adiciones con un total de 20 por ciento o menos de la
secuencia de referencia a lo largo de la ventana de comparación. La
secuencia de referencia puede ser un subconjunto de una secuencia
más larga.
Tal como se usa en el presente documento,
"sustancialmente puro" significa que una especie objetivo es la
especie predominante presente (es decir, en una base molar, es más
abundante que cualquier otra especie individual en la comparación),
y preferiblemente una fracción sustancialmente purificada es una
composición en la que la especie objeto comprende al menos
aproximadamente 50 por ciento (en una base molar) de todas las
especies macromoleculares presentes. En general, una composición
sustancialmente pura comprenderá más de aproximadamente 80 por
ciento de todas las especies macromoleculares presentes en la
composición, más preferiblemente más de aproximadamente 85%, 90%,
95% y 99%. Lo más preferiblemente, la especie objeto está purificada
esencialmente hasta homogeneidad (no se pueden detectar especies
contaminantes en la composición por procedimientos de detección
habituales), en la que la composición consiste esencialmente en una
sola especie macromolecular.
Cuando se aplica a polipéptidos, la expresión
"identidad sustancial" significa que dos secuencias de
péptidos, cuando se alinean de forma óptima, tal como por el
programa GAP o BESTFIT usando los pesos de huecos por defecto,
comparten al menos 80 por ciento de identidad de secuencia,
preferiblemente al menos 90 por ciento de identidad de secuencia,
más preferiblemente al menos 95 por ciento de identidad de
secuencia, y lo más preferiblemente al menos 99 por ciento de
identidad de secuencia. Preferiblemente, las posiciones de los
restos que no son idénticos difieren en sustituciones conservativas
de aminoácidos. Las sustituciones conservativas de aminoácidos se
refieren a la intercambiabilidad de restos que tienen cadenas
laterales similares. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos que
tienen cadenas laterales alifáticas son glicina, alanina, valina,
leucina e isoleucina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas
laterales alifáticas con hidroxilo son serina y treonina; un grupo
de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen amida son
asparagina y glutamina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas
laterales aromáticas son fenilalanina, tirosina y triptófano; un
grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas son
lisina, arginina e histidina; y un grupo de aminoácidos que tienen
cadenas laterales que contienen azufre son cisteína y metionina.
Los grupos de sustitución conservativa de aminoácidos preferidos
son: valina-leucina-isoleucina,
fenilalanina-tirosina,
lisina-arginina, alanina-valina,
glutámico-aspártico y
asparagina-glutamina.
La expresión "fragmento de polipéptido" o
"fragmento de péptido" tal como se usa en el presente
documento, se refiere a un polipéptido que tiene una deleción
amino-terminal y/o carboxi-terminal,
pero en el que el resto de la secuencia de aminoácidos es idéntica
a las posiciones correspondientes en la secuencia natural deducida,
por ejemplo, de una secuencia de ADNc de longitud completa. Los
fragmentos normalmente son de 8-10 aminoácidos de
longitud, preferiblemente al menos 10-20 aminoácidos
de longitud e incluso más preferiblemente 20-70
aminoácidos de longitud.
Otros términos y expresiones químicas en el
presente documento, se usan de acuerdo con el uso convencional en
la técnica, como se ilustra en The McGraw-Hill
Dictionary of Chemical Terms (ed. Parker, S., 1985),
McGraw-Hill, San Francisco, incorporado en el
presente documento por referencia.
La producción de proteínas a partir de genes
clonados por ingeniería genética se conoce bien. Véase, por ejemplo,
la patente de EE.UU. número 4.761.371 de Bell y col., de la columna
6, línea 3 a la columna 9, línea 65. Por lo tanto, la siguiente
discusión se propone como una revisión de este campo, y no se
pretende reflejar el estado completo de la técnica.
El ADN que codifica proteínas que se puede
insertar en las construcciones adenovíricas de la presente
invención, se puede obtener, a la vista de la presente descripción,
por síntesis química, por cribado de transcritos inversos de ARNm
de células o cultivos de líneas celulares adecuados, por cribado de
genotecas de células adecuadas, o por combinación de estos
procedimientos, como se ilustra a continuación. El cribado de ARNm o
ADN genómico se puede llevar a cabo con sondas de oligonucleótido
generadas a partir de información de secuencias génicas conocidas.
Las sondas se pueden marcar con un grupo detectable tal como un
grupo fluorescente, un átomo radiactivo o un grupo
quimioluminiscente de acuerdo con procedimientos conocidos y usados
en ensayos de hibridación convencionales, como se describe con
mayor detalle en los siguientes ejemplos.
En una alternativa, una secuencia génica se
puede recuperar por el uso del procedimiento de la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR). Véanse las patentes de EE.UU. número
4.683.195 de Mullis y col. y 4.683.202 de Mullis.
Un vector es una construcción de ADN replicable,
y se usan para amplificar ADN que codifica una proteína deseada y/o
para expresar el ADN que codifica la proteína. Un vector de
expresión es una construcción de ADN replicable en la que una
secuencia de ADN que codifica una proteína de interés está
operativamente unida a secuencias de control adecuadas capaces de
realizar la expresión de la proteína en un huésped adecuado. La
necesidad de dichas secuencias de control variará dependiendo del
huésped seleccionado y del procedimiento de transformación elegido.
En general, las secuencias de control incluyen un promotor de la
transcripción, una secuencia operadora opcional para controlar la
transcripción, una secuencia que codifica los sitios de unión al
ribosoma del ARNm adecuado, y secuencias que controlan la
terminación de la transcripción y la traducción. Los vectores de
amplificación no requieren dominios de control de la expresión. Lo
que se necesita es la capacidad de replicare en un huésped, que
normalmente se la confiere un origen de replicación y un gen de
selección para facilitar el reconocimiento de los
transformantes.
Los vectores útiles para llevar a la práctica la
presente invención incluyen plásmidos, virus (incluyendo fagos) y
fragmentos de ADN intercambiables (es decir, fragmentos integrables
en el genoma del huésped por recombinación homóloga). El vector se
replica y funciona independientemente del genoma del huésped, o en
algunos casos, puede integrarse en el genoma. Los vectores
adecuados contendrán replicones y secuencias de control que se
obtienen de especies compatibles con el huésped de expresión
pretendido. Las células huésped transformadas son células que se
han transformado o transfectado con los vectores construidos usando
técnicas de ADN recombinante.
Las regiones de ADN están operativamente unidas
cuando están funcionalmente relacionadas entre sí. Por ejemplo: un
promotor está operativamente unido a una secuencia codificante si
controla la transcripción de la secuencia; un sitio de unión al
ribosoma está operativamente unido a una secuencia codificante si
está colocada de forma que permita la traducción. En general,
operativamente unido significa contiguo, y en el caso de secuencias
líder, contiguo y en el marco de lectura. Una realización preferida
de promotor de la presente invención en los casos en los que alguna
región E1b del ADN es suprimida y se sustituye por ADN extraño, es
la expresión del ADN extraño a partir del promotor E1B endógeno.
También se observará que se puede usar un promotor específico de
tejido que está operativamente unido al ADN extraño.
Las células huésped adecuadas incluyen
procariotas, células de levaduras, o células de eucariotas
superiores. Los procariotas incluyen organismos Gram negativos y
Gram positivos, por ejemplo, Escherichia coli (E.
coli) o Bacilli. Las células eucariotas superiores
incluyen líneas celulares establecidas de origen mamífero como se
describe a continuación. Las células huésped de ejemplo son DH5a,
E. coli W3110 (ATCC 27,325), E. coli B, E.
coli X1776 (ATCC 31.537) y E. coli 294 (ATCC 31.446).
Están disponibles una amplia variedad de
vectores microbianos adecuados, y pueden tener aplicaciones en la
construcción de los presentes vectores adenovíricos. En general, un
vector microbiano contendrá un origen de replicación reconocido por
el huésped pretendido, un promotor que funcionará en el huésped y un
gen de selección de fenotipo tal como un gen que codifica proteínas
que confieren resistencia a antibióticos o que suministran un
requisito autotrófico. Se fabricarán construcciones similares para
otros huéspedes. E. coli normalmente se transforma usando
pBR322. Véase Bolivar y col., Gene 2, 95(1977). pBR322
contiene genes para la resistencia a la ampicilina y la
tetraciclina y por lo tanto proporciona un medio fácil para
identificar células transformadas. Los vectores de expresión deben
contener un promotor que sea reconocido por el organismo huésped.
Esto, en general, significa un promotor obtenido del huésped
pretendido. Los promotores usados más habitualmente en los vectores
de expresión microbianos recombinantes incluyen los sistemas
promotores de beta-lactamasa (penicilinasa) y
lactosa (Chang y col., Nature 275, 615 (1978); y Goeddel y
col., Nucleic Acids Res. 8, 4057 (1980) y solicitud de
publicación de EPO número 36.776) y el promotor tac (H. De
Boer y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 21 (1983)).
Aunque estos se usan habitualmente, otros promotores microbianos
son adecuados. Se han publicado los detalles relativos a las
secuencias de nucleótidos de muchos promotores, lo que permite al
experto en la materia ligarlos operativamente a ADN en plásmidos o
vectores víricos (Siebenlist y col., Cell 20, 269,
1980)).
Los cultivos de células obtenidas de organismos
multicelulares son un huésped deseable para la síntesis de
proteínas recombinantes. En principio, se puede trabajar con
cualquier cultivo de células eucariotas superiores, sean de cultivo
de vertebrado o invertebrado. Sin embargo, se prefieren las células
de mamífero. La propagación de dichas células en el cultivo celular
se ha convertido en un procedimiento rutinario. Véase, "Tissue
Culture", Academic Press, Kruse and Paterson, editors (1973).
Son ejemplos de líneas de células huésped las células VERO y HeLa,
líneas de células de ovario de hámster chino (CHO), y líneas de
células FL5.12, WI138, BHK, COS-7 CV, y MDCK. Los
vectores de expresión de dichas células normalmente incluyen (si es
necesario) un origen de replicación, un promotor situado secuencia
arriba del gen que se va a expresar, junto con un sitio de unión al
ribosoma, sitio de empalme de ARN (si se usa ADN genómico que
contiene intrón), un sitio de poliadenilación, y una secuencia de
terminación de la transcripción.
Un origen de replicación se puede proporcionar
construyendo el vector para que incluya un origen exógeno, tal como
el que puede obtenerse de SV40 u otra fuente vírica (p. ej.,
Polioma, Adenovirus, VSV, o BPV), o se puede proporcionar mediante
el mecanismo de replicación de cromosomas de la célula huésped. Si
el vector está integrado en el cromosoma de la célula huésped, este
último puede ser suficiente.
Las secuencias de control de la transcripción y
la traducción en los vectores de expresión que se van a usar en las
células de vertebrados transformadoras a menudo son proporcionadas
por fuentes víricas. Se puede usar una variedad de elementos
promotores constitutivos víricos y de mamífero. Véase, Mittal y
col., (1993) Virus Research, vol. 28, pp.
67-90. Por ejemplo, los promotores usados
habitualmente se obtiene de polioma, CMV, y virus de simio 40
(SV40). Véase, p. ej., la patente de EE.UU. número 4.599.308. Los
promotores temprano y tardío son útiles porque ambos se pueden
obtener ambos de virus en forma de un fragmento que también contiene
el origen de replicación vírico de SV40. Véase, Fiers y col.,
Nature 273, 113 (1978).
En el presente documento se describen
procedimientos para crear nuevos vectores lanzadera adenovíricos,
competentes para la replicación, que tienen sitios de clonación
únicos en la región E1B que permiten la deleción selectiva de los
siguientes genes o grupos de genes: 55K; 19K y 55K; 19K, 55K, pIX; y
pIX.
Los vectores lanzadera adenovíricos de la
invención retienen el promotor E1B endógeno que favorece la
expresión de genes heterólogos insertados en los vectores lanzadera
de E1B.
Para generar los vectores lanzadera de E1B
descritos en el presente documento, se puede adoptar la siguiente
estrategia usando un plásmido adecuado que contiene el genoma
adenovírico. El plásmido preferido es pXC1, que se puede obtener en
Microbix Biosystems, Toronto, Canadá. Véase también la descripción
técnica de Microbix Biosystems "Gene Transfer with Adenovirus
Vectors." Aunque se usó pXCI como material de partida para
producir los vectores lanzadera de E1B de la invención, se puede
usar cualquier vector adenovírico conocido en la técnica, si
contiene los siguientes elementos: inicio en el extremo 5', una ITR
(repetición terminal invertida) en 5', una señal de encapsidación
adenovírica y una secuencia potenciadora de E1A, una secuencia
promotora, un promotor de adenovirus o un promotor extraño, una
secuencia líder tripartita, una señal de poli A y un segmento de
ADN que corresponde a un segmento de un genoma adenovírico.
Para generar los vectores lanzadera de E1B de la
invención, se quitaron los sitios de restricción Bgl II y Bam HI,
nucleótidos 3328 y 9875 respectivamente, de pXC1 con el fin de crear
sitios de restricción de Bgl II y Bam HI únicos que faciliten la
eliminación de los genes de E1B deseados. Este plásmido se denomina
en el presente documento \DeltaBam/Bgl pXC1.
Usando \DeltaBam/Bgl pXC1 se puede generar un
vector lanzadera de E1B que permite eliminar tanto el gen 19K como
el 55K, y opcionalmente sustituirlos por un gen heterólogo,
alterando el codón de metionina iniciador para el gen
E1B-19K, creando un nuevo sitio de restricción, y un
segundo sitio de restricción secuencia arriba del codón de parada
de E1B-55K. Los sitios de restricción preferidos son
como se ha indicado antes, Bam HI y Bgl II. Este plásmido se
denomina p\DeltaE1B.
Usando \DeltaBam/Bgl pXC1 se puede generar un
vector lanzadera de E1B que permita eliminar el gen 55K, y
opcionalmente sustituirlo por un gen heterólogo, mientras que se
retiene el gen E1B-19K, mediante la mutación del
codón de inicio del gen 55K y adicionalmente incorporando un codón
de parada en la secuencia que codifica el gen
E1B-55K, preferiblemente en el tercer aminoácido, y
creando un segundo sitio de restricción secuencia arriba del codón
de parada E1B-55K, como en el vector \DeltaE1B.
Ninguna mutación, ni la mutación en el codón de inicio ni en el
codón de parada, altera la secuencia de aminoácidos en la secuencia
que codifica E1B-19K que se superpone. Este
plásmido se denomina p\DeltaE1B-55K.
Usando p\DeltaE1B se puede crear el plásmido
p\DeltaE1B/pIX que permite la eliminación del gen pIX, y
opcionalmente la sustitución por un gen heterólogo, mientras que se
retienen los genes E1B-19K y 55K, o
E1B-19K y una parte del gen 55K, o se puede
eliminar la región E1B entera, es decir, los tres genes; 19, 55K y
pIX. El procedimiento preferido por el que se construye este
plásmido es la introducción de un sitio de restricción Swa 1 único
en el codón de parada para pIX.
El procedimiento preferido para construir un
vector lanzadera de E1B adenovírico que contiene ADN heterólogo que
codifica una secuencia de polipéptido, es poner en contacto los
vectores lanzadera plasmídicos con un plásmido genómico Ad5
adenovírico, circular que no se puede empaquetar, en condiciones
adecuadas para la recombinación homóloga. El vector adenovírico
producido así, se aísla en forma de partículas víricas infecciosas.
El plásmido genómico adenovírico Ad5 preferiblemente es pJM 17,
pBHGE3, pBHG10 o pBHG11, o un derivado de los mismos. Para
información adicional de estos vector y sus usos, véase Hitt,
"Construction and propagation of human adenovirus vectors".
En: Cell Biology: a Laboratory Handbook, J. Celis (ed), Academic
Press, N.Y, 1995; véase Graham, "Adenovirus based expression
vectors and recombinant vacines". En: Vaccines: New Approaches to
Immunological Problems. R.W. Ellis (ed), Butterworth, pp
363-390, 1992, y véase Graham, "Manipulation of
adenovirus vectors". En: Methods in Molecular Biology, Vol. 7:
Gene Transfer and Expression Techniques. E.J. Murry and J.M. Walker
(eds) Humana Press Inc., Clifton, N.J., pp 109-128,
1991.
En las realizaciones descritas antes, las
construcciones de vectores lanzadera adenovíricos pueden comprender
además un origen de replicación, una secuencia de nucleótidos que
codifica un marcador seleccionable y/o un ADN heterólogo que
codifica una secuencia de polipéptido insertada entre los sitios de
las endonucleasas de restricción Bam HI y Bgl II o entre los sitios
de las endonucleasas de restricción Swa 1 y Bam HI. Las secuencias
de polipéptidos preferidas, o fragmentos de las mismas que codifican
péptidos biológicamente activos, incluyen las que codifican
proteínas inmunomoduladoras y activadores de profármacos (es decir,
citosina desaminasa, timidina quinasa, patentes de EE.UU. nº
5.358.866 y 5.677.178). Los ejemplos de los anterior incluirían
interleuquina 2, patentes de EE.UU. nº 4.738.927 ó 5.641.665;
interleuquina 7, patentes de EE.UU. nº 4.965.195 ó 5.328.988; e
interleuquina 12, patente de EE.UU. nº 5.457.038; factor alfa de
necrosis tumoral, patentes de EE.UU. nº 4.677.063 ó 5.773.582;
interferón gamma, patentes de EE.UU. nº 4.727.138 ó 4.762.791; o
GM-CSF, patentes de EE.UU. nº 5.393.870 ó
5.391.485. Las proteínas inmunomoduladoras adicionales incluyen
además proteínas inflamatorias de macrófagos, incluyendo
MIP-3 alfa, (Véase, Well, T.N. y Peitsch, MC.J.
Leukoc. Biol. vol 61 (5): páginas 545-50,
1997). Se puede usar cualquier marcador seleccionable conocido en la
técnica.
El promotor preferido para expresar genes
heterólogos insertados en un vector lanzadera de E1B es el promotor
endógeno E1B.
Se puede insertar una secuencia de ADN
heteróloga, que normalmente contiene un gen heterólogo, en el sitio
de clonación para producir un vector plasmídico, que después se usa
para producir un vector adenovírico por recombinación homóloga con
un adenovirus modificado, en el que una o más secuencias reguladoras
de la transcripción nativas se han suprimido y sustituido con la
secuencia reguladora de la transcripción deseada.
Aunque un gen heterólogo puede sustituir a
cualquiera de los tres genes de E1b, la región preferida para
sustituir es 55K. Una razón por la que es preferida esta región es
que la presencia de un gen heterólogo adecuado con actividad
antitumoral conferirá al virus actividad antitumoral potenciada
frente a la ejercida por el virus solo. Se sabe que el adenovirus
que tiene deleciones o mutaciones en E1b, y por lo tanto no puede
expresar 55K, confiere al virus la capacidad de replicarse con
preferencia en células que son funcionalmente defectuosas en el
supresor tumoral p53 comparado con células normales. Algunas células
neoplásicas son o puede convertirse en defectuosas en la función de
p53 de muchas formas, incluyendo un defecto en aquellas proteínas
que interaccionan con p53; es decir, un defecto en la ruta de p53
que hace a p53 funcionalmente inactivo. Dentro de la definición de
células neoplásicas están incluidas las células que carecen de
función de p53, pero no son claramente neoplásicas. Véase la
patente de EE.UU. 5.677.178. Los ejemplos de células en la última
categoría serían células asociadas con el síndrome de Barrett o
leucoplasia. Realmente, los vectores de la presente invención tienen
aplicaciones para una variedad de enfermedades que resultan de la
inactivación funcional de p53. Por lo tanto, un vector lanzadera de
E1B de la presente invención que tiene suprimido 55K y que lo ha
sustituido por una proteína heteróloga con actividad celular
antineoplásica, será eficaz para el tratamiento de la neoplasia.
Dichos vectores lanzadera también tendrán aplicaciones para el
tratamiento de otras afecciones médicas en las que el supresor
tumoral p53 es funcionalmente inactivo.
Un gen heterólogo preferido con actividad
anticancerígena es la citosina desaminasa, y se puede insertar
preferiblemente en pDE1B para crear pDE1B/CD o en
pDE1B-55K para crear pDE1B-55K/CD. A
partir de estos plásmidos, se generar fácilmente los
correspondientes virus por cotransfección de células 293 con el
vector del extremo derecho adenovírico pJM17, usando el
procedimiento estándar del fosfato. Los virus resultantes se
denominan en el presente documento DE1B/CD y \DeltaE1B55K/CD. El
virus \DeltaE1B55K/CD es útil como medio para matar
preferiblemente células que carecen de la función de p53,
incluyendo células tumorales, en cuanto que el virus ejercerá
efectos citopáticos víricos que son potenciados por el efecto de la
citosina desaminasa en presencia de
5-fluorocitosina. La citosina desaminasa convierte
la 5-fluorocitosina (5FC) en
5-fluorouracilo (5FU) y el 5FU es tóxico para las
células de mamífero. Véase, las patentes de EE.UU. nº 5.624.830 y
5.358.866.
Los mutantes adenovíricos de la invención
normalmente se propagan como cepas víricas en una línea celular (p.
ej., la línea celular 293 ATCC nº CRL 1573, American Type Culture
Collection, Rockville, MD; Graham y col. (1977) J. Gen.
Virol. 36: 59, o células A549) que puede proporcionar
determinadas funciones víricas deseadas, si es necesario, en trans
para apoyar la replicación y formación de viriones mutantes
infecciosos. Las células 293 humanas, que son células de riñón
embrionario humano transformadas con genes de E1A/E1B adenovíricos,
representan las líneas celulares permisivas útiles. Se puede usar
otras líneas celulares que permiten propagarse a los vectores
adenovíricos de replicación deficiente, por ejemplo, células
HeLa.
También se describen en el presente documento
composiciones farmacéuticas. Dichas composiciones farmacéuticas
comprenden una construcción de vector adenovírico de la invención en
una cantidad terapéuticamente eficaz y un vehículo
farmacéuticamente aceptable. La expresión "farmacéuticamente
aceptable" significa un material que no interfiere con la
eficacia de la actividad biológica de los principios activos y que
no es tóxico para el huésped al que se administra. Un vehículo
farmacéuticamente aceptable puede contener o comprender un compuesto
fisiológicamente aceptable que actúa para estabilizar la
composición o para aumentar o disminuir la absorción del principio
activo. Dicho compuesto puede incluir, por ejemplo, hidratos de
carbono tales como glucosa, sacarosa o dextranos, antioxidantes
tales como ácido ascórbico o glutatión, agentes quelantes, proteínas
de bajo peso molecular u otros estabilizantes o excipientes. Otros
compuestos aceptables incluyen agentes humectantes, agentes
emulsionantes, agentes de dispersión o conservantes tales como fenol
o ácido ascórbico. El experto en la materia es consciente de que la
elección de un vehículo farmacéuticamente aceptable depende de la
vía de administración y de las características fisicoquímicas
particulares del principio activo. Se pueden encontrar ejemplos de
vehículos, estabilizantes o adyuvantes en Martin, Remington's Pharm.
Sci., 15ª ed. (Mack Publ Co, Easton, 1975).
Los vectores de la invención preferiblemente se
formularán en disolución a pH neutro, de aproximadamente 6,5 a
aproximadamente 8,5, más preferiblemente de aproximadamente 7 a 8,
con un excipiente para hacer la disolución isotónica, por ejemplo
manitol o cloruro sódico, con pH tamponado con disoluciones tampón
reconocidas en la técnica. La cantidad de principio activo
dependerá de la gravedad de la afección, la vía de administración,
la edad y el peso del paciente y la afección física del paciente, la
actividad biológica del principio activo y finalmente lo decidirá
el profesional sanitario o médico que lo atiende. Actualmente se
contempla que la composición farmacéutica contendrá de
aproximadamente 10^{3} a aproximadamente 10^{5} partículas
víricas, preferiblemente aproximadamente 10^{11} partículas
víricas. Cuando se lleva a la práctica el procedimiento o
tratamiento de la invención, se administra una cantidad
terapéuticamente eficaz del vector a un mamífero. Por cantidad
terapéuticamente eficaz, los autores de la invención se refieren a
la cantidad total de cada principio activo de la composición, que
es suficiente para mostrar un beneficio significativo al paciente.
Cuando se aplica a un principio activo individual, administrado
sólo, la expresión se refiere a ese ingrediente solo. Cuando se
aplica a una combinación, el término se refiere a las cantidades
combinadas de los principios activos que dan como resultado el
efecto terapéutico, se administren de forma combinada, seriada o
simultánea. Los modos de administrar un producto farmacéutico que
contiene el vector de la invención, son conocidos en la materia, e
incluyen, por ejemplo, la administración oral, administración
intratumoral y administración intravenosa, intramuscular o
intraperitoneal.
Los adenovirus de la invención, o el ADN
contenido en los mismos, pueden suministrarse a células neoplásicas
por suministro de liposomas o inmunoliposomas; dicho suministro se
puede dirigir selectivamente a células neoplásicas basándose en una
propiedad de superficie celular presente en la población de células
neoplásicas (p. ej., la presencia de una proteína de superficie
celular que se une a una inmunoglobulina en un inmunoliposoma).
Normalmente, se encapsula una suspensión acuosa que contiene los
viriones en liposomas o inmunoliposomas. Por ejemplo, se puede
encapsular una suspensión de viriones adenovíricos en micelas para
formar inmunoliposomas por procedimientos convencionales (patente
de EE.UU. 5.043.164, patente de EE.UU. 4.957.735, patente de EE.UU.
4.925.661; Connor y Huang (1985) J. Cell Biol. 101: 582;
Lasic DD (1992) Nature 355: 279; Novel Drug Delivery
(eds. Prescott LF and Nimmo WS: Wiley, New York, 1989); Reddy y col.
(1992) J. Immunol. 148: página 1585). Se pueden usar
inmunoliposomas que comprenden un anticuerpo que se une
específicamente a un antígeno de célula de cáncer (p. ej., CALLA,
CEA) presente en las células de cáncer del individuo, para dirigir
los viriones o el ADN de virión a esas células.
Se pueden llevar a cabo administraciones únicas
o múltiples de las composiciones con los niveles de dosis y
patrones seleccionados por el médico que atiende. En cualquier caso,
las formulaciones farmacéuticas deben proporcionar una cantidad de
los adenovirus antineoplásicos de esta invención, suficiente para
tratar eficazmente al paciente.
La terapia adenovírica antineoplásica se puede
combinar con otros protocolos antineoplásicos, tales como
quimioterapia convencional o radiación. En el caso de que un
mutante adenovírico particular provoque una respuesta inmunitaria
que suprima la eficacia del virus, se puede llevar a cabo la
administración de fármacos inmunosupresores, incluyendo el
anticuerpo adecuado.
Será evidente, basándose en la discusión
anterior, que los vectores/virus adenovíricos descritos en el
presente documento, tienen múltiples usos incluyendo aplicaciones
en terapia génica. Por ejemplo, un gen que codifica una proteína
útil médicamente se puede clonar en la región E1B de los viriones de
la presente invención, y los viriones se pueden usar directamente
en los protocolos de terapia génica para tratar la enfermedad. En
otra realización de la invención, discutida antes, dichos viriones
mutantes pueden tener deleciones en E1B que codifica la proteína
55K, y haberlo sustituido por un gen con propiedades médicas
beneficiosas. Dichos genes pueden codificar citoquinas, incluyendo
interleuquinas, proteínas reguladoras del ciclo celular, incluyendo
p16 o ras, o proteínas que inducen el suicidio celular o apoptosis,
activadores de profármacos, incluyendo citosina desaminasa o
timidina quinasa. Además, se pueden usar el factor alfa de necrosis
tumoral, interferón gamma y mip-3 alfa.
\newpage
Los presentes vectores adenovíricos también se
pueden usar para expresar proteínas que son inmunógenos útiles, o
como una vacuna, y para transformar células que normalmente no
expresan una proteína particular, para que expresen después esta
proteína. Las células que expresan estas moléculas son útiles como
productos intermedios para hacer preparaciones de membrana celular
útiles para ensayos de unión, que a su vez son útiles para el
cribado de fármacos.
Las mutaciones en la región E1 descritas en el
presente documento, se pueden incorporar en mutantes adenovíricos
que tienen mutaciones fuera de la región E1B. Preferiblemente,
dichas mutaciones estarían en la región E1a del genoma del
adenovirus. En este caso, las mutaciones E1a preferidas conferirán
al vector lanzadera de E1B la capacidad de replicarse con
preferencia en células neoplásicas, comparado con células normales,
donde las células neoplásicas son funcionalmente defectuosas en el
producto génico supresor de tumor de retinoblastoma, o p105 Rb.
Dichas mutaciones inactivantes normalmente se producen en el dominio
E1a CR1 (aminoácidos 30-85 en Ad5: posiciones de
nucleótidos 697-790) y/o el dominio CR2 (aminoácidos
120-139 en Ad5; posiciones de nucleótidos
920-967), que están implicadas en la unión de la
proteína p105 RB. Rb defectuoso puede surgir de numerosas formas,
incluyendo un defecto en las proteínas que interaccionan con Rb; es
decir, un defecto en la ruta de Rb que convierte a Rb en
funcionalmente inactivo. Véase la patente de EE.UU. 5.677.178. Por
lo tanto, las mutaciones adenovíricas de E1b descritas en el
presente documento podrían combinarse, por ejemplo, con la deleción
de E1a en el adenovirus Ad5 NT dl 1010. El vector lanzadera de E1B
más preferidos con una deleción en E1a también tendrá E1B 55K
sustituido por un ADN heterólogo que codifica una proteína con
actividad celular antineoplásica. Este vector matará con
preferencia células neoplásicas que son funcionalmente defectuosas
en p53 y/o Rb, con actividad anticancerígena potenciada que surge de
la proteína codificada por el ADN heterólogo.
Los siguientes ejemplos son ilustrativos de
realizaciones específicas de la invención y diferentes usos de las
mismas. Se presentan sólo con propósitos de explicación, y no deben
considerarse como limitantes de la invención.
Los procedimientos para la construcción y
propagación de vectores adenovíricos humanos se conocen en la
técnica y se entiende que el experto en la materia los aplicará en
los ejemplos presentados a continuación. Estos incluirán el trabajo
de Hitt, M., y col. "Construction and propagation of human
adenovirus vectors". En: Cell Biology: a Laboratory Handbook; J.
Celis (Ed), Academic Press, N.Y. (1996); Graham, F.L. y Prevec, L.
"Adenovirus based expression vectors and recombinant
vaccines". En: Vaccines: New Approaches to Immunological
Problems. R.W. Ellis (ed)
Butterworth. pág. 363-390; y Graham, F.L. y Prevec, L. "Manipulation of adenovirus vectors". En: Methods in Molecular Biology, Vol. 7: Gene Transfer and Expression Techniques. E.J. Murray and J.M. Walker (eds) Humana Press Inc., Clifton, N.J. pág. 109-128, 1991. Los materiales y procedimientos descritos en estos artículos se usarán o se podrían usar a continuación.
Butterworth. pág. 363-390; y Graham, F.L. y Prevec, L. "Manipulation of adenovirus vectors". En: Methods in Molecular Biology, Vol. 7: Gene Transfer and Expression Techniques. E.J. Murray and J.M. Walker (eds) Humana Press Inc., Clifton, N.J. pág. 109-128, 1991. Los materiales y procedimientos descritos en estos artículos se usarán o se podrían usar a continuación.
\DeltaBam/BglpXC1
Se usó el plásmido pXCI (que se puede obtener en
Microbix Biosystems, Toronto, Canada. Véase también la descripción
técnica de Microbix Biosystems "Gene Transfer with Adenovirus
Vectors") como material de partida. Se quitaron los sitios
únicos de las endonucleasas de restricción para Bgl II (nucleótido
3328) y Bam HI (nucleótido 9875) de pXCI mediante digestión con la
endonucleasa de restricción y se rellenó con ADN polimerasa T4
(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) como describe Boehringer
Mannheim en la descripción del producto. Este plásmido modificado
servía como molde para la creación de los vectores lanzadera de E1B,
p\DeltaE1B, p\DeltaE1B-55K, y
p\DeltaE1B/pIX, como sigue.
Usando DBam/BglpXC1 como molde, se
insertó un conector de Bam HI (New England Biolabs, NEB nº 1071) en
el sitio de Eco NI en el nucleótido 1715, que altera el codón
iniciador de la metionina para el gen E1B-19K,
después de una digestión de restricción parcial con Eco NI y
reacción de relleno usando la ADN polimerasa T4. Esta construcción
intermedia llamada BampXC1 se usó como molde para crear un Bgl II
único en el nucleótido 3503, cuatro pares de bases secuencia arriba
del codón de parada de E1B-55K. El sitio de Bgl II
se diseñó usando el kit de Clonetech Advantage (Clonetech) y los
cebadores:
La parte en negrilla y subrayada de la secuencia
anterior indica el sitio Bgl II añadido que empieza en el
nucleótido 3503. Después de mutagénesis, se aisló un fragmento Kpn
I-Bst98I (que contiene los sitios Bgl II recién
creados) y se volvió a clonar en DBamppXC1 para crear el plásmido
pDE1B. La región E1B posteriormente se secuenció para confirmar las
mutaciones.
Los sitios Bam HI y Bgl II se pueden usar para
clonar el gen heterólogo de interés en la región E1B sustituyendo
los genes tanto 19K como 55K. Véase la Figura 1.
El plásmido \DeltaBam/BglpXC1 también
se modificó para permitir la sustitución de las secuencias que
codifican el gen E1B-55K mientras que se retienen
las secuencias que codifican E1B-19K, como sigue.
Usando el kit de Stratagene "Quick Change
Site-Directed Muatagenisis Kit", se introdujeron
las siguientes mutaciones.
1. Se modificó la metionina iniciadora del gen
E1B-55K, usando los cebadores
Los nucleótidos en negrilla y subrayados en la
secuencia anterior difieren de la secuencia natural. Estas
alteraciones de nucleótidos cambian el codón de inicio para el gen
E1B-55K a una valina y también ponen un codón de
parada en la secuencia que codifica E1B-55K, en el
tercer aminoácido, idéntico al del adenovirus dl1520 (Véase, Barker
y Berk, 1987, y patente de EE.UU. nº 5.677.178). Estas mutaciones no
alteran la secuencia de aminoácidos en la secuencia que codifica
E1B-19K que se superpone. Las mutaciones se cribaron
por secuenciacón, y el plásmido intermedio se denominó
\Delta55Kmet.
2. Usando \Delta55Kmet como molde, se
creó un sitio Bam HI directamente secuencia abajo de la secuencia
que codifica E1B-19K usando los
oligonucleótidos:
Los nucleótidos subrayados y en negrilla en las
secuencias anteriores alteran las potenciales metioninas iniciadoras
en el marco en la secuencia que codifica E1B-55K e
introducen un sitio de enzima de restricción Bam HI único 11 pb
secuencia abajo del codón de parada de E1B-19K. La
confirmación de la mutagénesis se hizo por digestión de restricción
con Bam HI. El intermedio se denominó \Delta55Kmet3'BamH1.
3. Usando \Delta55Kmet3'BamH1, se creó un
sitio Bgl II único en el nucleótido 3503, secuencia arriba del
codón de parada de E1B-55K, usando el kit de
Clonetech Advantage y los cebadores:
El sitio Bgl II está indicado por la parte en
negrilla y subrayada de la secuencia anterior. El fragmento
generado por PCR Xba-Bst981, que también contenía la
mutaciones introducidas por la mutagénesis de Stratagene, se volvió
a introducir en el vector \DeltaBam/BglpXC1 para crear el
plásmido p\Delta55K. El fragmento entero de
XbaI-Bst981 se secuenció para confirmar que las
mutaciones estaban presentes y limitadas solo a las modificaciones
mencionadas antes. Este vector se puede usar para clonar genes
heterólogos de interés en el lugar del gen 55K. Véase la Figura
2.
El vector p\DeltaE1B se modificó
más para permitir la clonación en el lugar del gen pIX que está
secuencia abajo del gen E1B-55K. Se creó un sitio de
restricción Swa 1 único en el codón de parada para pIX usando el
kit de Stratagene "Quick Change Site-Directed
Muatagenisis Kit" y los oligonucleótidos:
Los nucleótidos en negrilla en las secuencias
anteriores representan los cambios hechos para hacer el sitio Swa1.
Este vector se puede usar para clonar un gen heterólogo en el gen
pIX solo, o en la región E1B entera quitando los tres genes: 19K,
55K y pIX. Véase la figura 3.
\vskip1.000000\baselineskip
El gen de la citosina desaminasa (CD) de E.
coli del plásmido pCD2 (nº de acceso en ATCC 40999) se
modificó para eliminar el sitio Nde1. Se introdujo una mutación
conservativa para cambiar el sitio de restricción sin cambiar la
secuencia codificante de la proteína. Esto se hizo usando la
mutagénesis basada en la PCR para producir un cambio de T a C.
Además, el sitio de inicio bacteriano, GCG, se cambió al sitio de
mamífero, ATG. El gen de CD se amplificó usando la ADN polimerasa
Pfu de Stratagene (nº de catálogo 600154) y los siguientes
cebadores:
Las partes en negrilla de las secuencias indican
los sitios de restricción y no son parte del gen de CD. El producto
de la PCR se hizo digerir con las enzimas de restricción Bam HI y
Swa1 y se purificaron en gel usando el kit de extracción de Qiagen
QIA quick gel, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El
vector lanzadera p\DeltaE1B se cortó con Bam HI
después de una digestión de restricción con Bgl II y reacción de
relleno con la ADN polimerasa T4, como se ha descrito antes. El
vector digerido se purificó en gel como se ha mencionado. El
fragmento de la CD Bam-Swa se ligó en el vector
lanzadera de E1B preparado usando procedimientos de clonación
estándar para crear p\DeltaE1B/CD. La construcción
p\DeltaE1B/CD se secuenció para confirmar la
inserción de CD. Véase la Figura 4.
El fragmento de la CD BamHI-Swa
descrito antes se clonó en el vector lanzadera p\Delta55K
que se preparó con Bgl II y Bam HI de la misma forma que el vector
lanzadera p\DeltaE1B, para crear el plásmido
p\Delta55K/CD. La construcción p\Delta55K/CD se
secuenció para confirmar la inserción de CD. Véase la Figura 5.
\vskip1.000000\baselineskip
Se cotransfectaron células 293 con las
construcciones de CD p\DeltaE1B/CD o p\Delta55K/CD
y el vector del extremo derecho del adenovirus pJM17 (que se puede
obtener en Microbix Biosystems, Toronto, Canadá) usando el
procedimiento estándar del fosfato de calcio descrito por McGrory
W.J. y col., Virology vol. 163, páginas
614-617 (1988). Véase también la descripción técnica
de Microbix Biosystems "Gene Transfer with Adenovirus
Vectors". Se cogieron las placas que correspondían a
\DeltaE1B/CD o \Delta55K/CD y se cribó el gen de CD usando PCR
estándar y digestión con enzimas de restricción.
\vskip1.000000\baselineskip
Se ensayó la producción de citosina desaminasa
funcional usando los procedimientos descritos por Rogulski y col.,
Human Gene Ther., vol. 8 (1) páginas 73-85
(1997). Brevemente, se infectaron 2-4 millones de
células A549 en placas de 10 cm con una MDI de 10. Las células se
infectaron en 2 ml de DME más FBS al 2% y se incubaron durante 1
hora a 37ºC y CO_{2} al 5%. Después de 1 hora, se añadieron 8 ml
de medio y las células se recogieron a las 4, 8, 12 y 24 horas
después de infección. Se prepararon lisatos celulares y se incubaron
10 \mug de extracto y [^{14}C]citosina 5 mM en un
volumen de 20 \mul, a 37ºC durante 45 minutos. Las reacciones se
terminaron por adición de 20 \mul de una mezcla fría de citosina y
uracilo (0,4 mg/ml de cada uno). Se aplicaron como manchas
puntuales muestras de 10 \mul sobre una lámina de cromatografía en
capa fina (Baker nº 7009-04) y se desarrollaron en
una mezcla de 1-butanol/agua (86%/14%) hasta que el
frente estaba cerca de la parte superior. Los resultados de la
cromatografía en capa fina se muestran en la Figura 6. Esta claro
que tanto \DeltaE1B/CD como \Delta55K/CD expresan CD.
\vskip1.000000\baselineskip
Se infectaron células A549 con los virus con CD,
\DeltaE1B/CD como \Delta55K/CD, y AD5 como se ha descrito antes
en el ensayo de la CD. El ARN se hizo a partir de sedimentos
celulares usando el reactivo de Gibco/BRL Trizol, siguiendo el
protocolo recomendado. Se desarrollaron 10 \mug de ARN de cada
muestra en un gel de formaldehído al 1%/agarosa. El ARN se
transfirió a una membrana Hybond N (Amersham) usando los
procedimientos de transferencia Northern estándar. La transferencia
se hibridó con un fragmento BamHI-Bst981 de CD
purificado en gel, que se radiomarcó usando el kit de Amersham Redi
Prime. Los resultados radiográficos se muestran en la Figura 7a.
Está claro que AD5 solo no expresa mensaje para CD, mientras que
ambos virus que contienen CD si lo hacen.
La transferencia usada en el experimento
descrito antes se separó después de exposición de la película y se
volvió a hibridar con una sonda específica de 55K adenovírico, hecha
también usando el kit de marcaje de Amersham Redi Prime. Los
resultados se muestran en la Figura 7b. Como se esperaba, sólo AD5
es positivo para el mensaje de 55K, mientras que los dos virus que
contienen CD no lo son.
\vskip1.000000\baselineskip
El gen murino que codifica el factor de necrosis
tumoral (mTNF) se insertó en pD55K (Véase, la Figura 1) para crear
p\DeltaKmTNF. El gen del factor de necrosis tumoral murino (mTNF)
se obtuvo de un plásmido en depósito en la American Type Culture
Collection (ATCC nº 63169). Véase también, las patentes de EE.UU. nº
4.677.063 y 4.879.226. Este plásmido contiene el gen de mTNF entero
incluyendo la región codificante para la prosecuencia. El gen
entero de mTNF se extiende de 135 pb a 860 pb. Como se describe en
la solicitud de patente de EE.UU. nº de serie 00/290.732,
presentada el 13 de abril de 1999, la secuencia se amplificó por PCR
y se clonó en un vector denominado pG-mTNFBamSwa.
Para simplificar la construcción de p\DeltaKmTNF,
pG-mTNFBamSwa era la fuente del gen de mTNF.
Brevemente, p\DeltaKmTNF se preparó
escindiendo el gen de mTNF de pG-mTNFBamSwa con Bam
HI y Swa I, e insertándolo en p\Delta55K que se había cortado con
BamHI/BglII, y se hizo el extremo romo del sitio Bgl II para crear
p\DeltaKmTNF. El plásmido se muestra en la Figura 8.
\vskip1.000000\baselineskip
Se cotransfectaron células 293 con la
construcción de mTNF p\DeltaKmTNF y el vector del extremo derecho
adenovírico pJM17 (que se puede obtener en Microbix Biosystems,
Toronto, Canadá) usando el procedimiento estándar del fosfato de
calcio descrito por McGrory W. J. y col., Virology vol. 163,
páginas 614-617 (1988). Véase también la
descripción técnica de Microbix Biosystems "Gene Transfer with
Adenovirus Vectors". Se cogieron las placas que correspondían a
\DeltaKmTNF y se cribó el gen de mTNF usando PCR estándar y
digestiones con enzimas de restricción.
\vskip1.000000\baselineskip
Las células A549 se cultivaron en placas de 6
cm, de modo que podían estar a aproximadamente 80% de confluencia
para la infección. La infección con DKmTNF se hizo como se ha
descrito con una MDI de 10. En varios puntos de tiempo se separó el
medio y se sustituyó por 3 ml de DME/FBS al 2% de nueva aportación.
Este se incubó a 37ºC durante 1 hora. Después de este intervalo, se
separó una parte alícuota de 1 ml del medio y se congeló a -80ºC
hasta que se habían recogido todas las muestras. El medio se
sustituyó en cada placa de modo que el volumen final era 4 ml hasta
el siguiente punto de tiempo. El mTNF secretado al medio se ensayó
usando un kit de ensayo ELISA comercial de Biosource, nº KMC3012.
El ensayo se llevó a cabo de acuerdo con las instrucciones del
fabricante. Cada muestra se determinó por duplicado y cada punto de
tiempo se recogió de 4 placas diferentes de células infectadas. La
Figura 9 muestra los resultados para 4 placas de 6 cm en diferentes
tiempos. Es evidente que la producción de mTNF se produjo en las 4
placas y que la producción más alta era en el punto de tiempo más
temprano, 24 horas, y posteriormente disminuía a lo largo de 60
horas.
La Figura 10 muestra un diagrama de la
construcción de los vectores lanzadera de E1B de la presente
invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de referencias citadas por el
solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no
forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto
el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u
omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad en este
respecto.
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Claims (13)
1. Procedimiento para crear un vector
adenovírico, comprendiendo dicho procedimiento las siguientes
etapas:
(i) introducir sitios de clonación únicos en la
región E1b adenovírica que permitan la deleción selectiva del o de
los genes de la región E1b;
(ii) suprimir uno o más genes de la región E1b
seleccionados del grupo formado por 55k; 19k y 55k; 19k, 55k y
pIX; y pIX; y
(iii) sustituir dicho o dichos genes de E1b por
un gen heterólogo de modo que dicho gen heterólogo esté bajo el
control del promotor E1b endógeno, y de modo que el gen heterólogo
presente sustancialmente el patrón de expresión temporal del o de
los genes de la región E1b suprimidos.
2. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que dicha supresión de dichos genes de la
región E1b comprende p19, 55K y pIX.
3. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que dicha supresión de dichos genes de la
región E1b comprende p19 y 55K.
4. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que dicha supresión de dichos genes de la
región E1b comprende pIX.
5. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que dicha supresión de dichos genes de la
región E1b comprende 55K.
6. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que la etapa (i) produce un vector
adenovírico que tiene sitios de clonación únicos seleccionados del
grupo formado por pD55K, pDE1B y pDE1B/pIX como se muestra en las
Figuras 1 a 3, para usar en la etapa (ii).
7. Procedimiento de la reivindicación 1, en el
que dicho gen heterólogo codifica una proteína seleccionada del
grupo formado por el factor alfa de necrosis tumoral, interferón
gamma, una interleuquina, una proteína de suicidio celular,
citosina desaminasa, timidina quinasa y mip-3.
8. Vector adenovírico que se puede obtener por
el procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6 o la
reivindicación 7.
9. Vector adenovírico de acuerdo con la
reivindicación 8, seleccionado del grupo formado por p\DeltaKmTNF,
p\DeltaE1B/
CD, p\Delta55K/CD, \DeltaKmTNF, \DeltaE1B/CD y \Delta55K/CD como se muestra en las Figuras 4, 5 y 8.
CD, p\Delta55K/CD, \DeltaKmTNF, \DeltaE1B/CD y \Delta55K/CD como se muestra en las Figuras 4, 5 y 8.
10. Uso de un vector adenovírico de la
reivindicación 8 o la reivindicación 9, para fabricar un medicamento
para el tratamiento de un mamífero que tiene una afección
neoplásica, comprendiendo dicho tratamiento la administración a
dicho mamífero de una dosis terapéuticamente eficaz de dicho vector
adenovírico.
11. Uso de la reivindicación 10, en el que el
tratamiento además comprende administrar con dicho vector
adenovírico un producto quimioterapéutico o un inmunosupresor.
12. Vector adenovírico seleccionado del grupo
formado por p\Delta55K, p\DeltaE1B, p\DeltaE1B/pIX,
p\DeltaE1B/CD, p\Delta55K/CD, \Delta55K/CD y p\Delta55kmTNF
como se muestra en las Figuras 1 a 5 y 8.
13. Célula que comprende un vector adenovírico
de acuerdo con la reivindicación 12.
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