KR20060028388A - 아데노바이러스 벡터의 생산을 위한 방법과 조성물 - Google Patents

아데노바이러스 벡터의 생산을 위한 방법과 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 세포 배양 시스템에서 성장되는 아데노바이러스의 생산율을 개선하기 위하여 실시된다. 특히, 아데노바이러스의 경우에, 세포 배양 시스템에서 37℃ 미만의 감염 온도의 이용이 아데노바이러스의 생산율을 증가시키는 확인되었다. 이에 더하여, 숙주 세포를 바이오리엑터에서 성장시키는 경우에, 이들 숙주 세포를 새로운 배지와 아데노바이러스로 희석함으로써 아데노바이러스 감염을 시작하면 아데노바이러스의 생산율이 증가하는 것으로 확인되었다. 37℃ 미만의 감염 온도를 이용한 아데노바이러스 생산과 정제 방법을 개시한다. 숙주 세포가 바이오리엑터에서 성장되고 아데노바이러스 감염이 숙주 세포를 새로운 배지와 아데노바이러스로 희석함으로써 시작되는 아데노바이러스 생산과 정제 방법을 또한 개시한다.
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아데노바이러스 벡터

Description

아데노바이러스 벡터의 생산을 위한 방법과 조성물{METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE PRODUCTION OF ADENOVIRUS VECTORS}
본원은 2003년 5월 15일자 제출된 미국 특허 출원 10/439,278에 우선권을 주장한다.
본 발명은 세포 배양과 바이러스 생산 분야에 관한다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 포유류 세포의 배양, 아데노바이러스로 이들 세포의 감염, 이들 세포로부터 감염성 아데노바이러스의 생산과 정제를 위한 개선된 방법에 관한다.
다양한 암과 유전 질환이 유전자 요법에 의해 해결되고 있다. 바이러스는 특정 세포형으로의 핵산 전달에 매우 유효하며, 감염된 숙주 면역계에 의한 감지를 빈번하게 회피한다. 이들 특징으로 인하여, 특정 바이러스는 유전자 요법에 이용되는 유전자-전달 운반체로서 매력적인 후보이다(Robbins and Ghivizzani, 1998; Cristiano et al., 1998). 복제 불능이며 비-병원성인 변형된 아데노바이러스는 다수의 대사와 종양 질환에서 치료 유전자를 전달하는 운반제로서 이용되고 있다. 이들 아데노바이러스 벡터는 일시적인 치료 유전자 발현으로 가장 효과적으로 치료되는 질환, 예를 들면, 암에 특히 적합한데, 그 이유는 DNA가 숙주 게놈에 통합되지 않고, 외래도입유전자 발현이 제한되기 때문이다. 아데노바이러스 벡터는 유전자 대체 요법에서도 현저한 이점을 제공하는데, 여기서 유전적 또는 대사적 결함이나 결핍은 이런 결함이나 결핍을 치료하는 산물을 인코딩하는 대체 유전자의 발현을 제공함으로써 치료된다.
아데노바이러스는 다양한 세포형에 치료 또는 리포터 외래도입유전자를 효과적으로 전달하기 위하여 변형될 수 있다. 인간에서 호흡 질환을 유발하는 재조합 아데노바이러스 2형과 5형(각각, Ad2와 AdV5)은 유전자 치료를 위하여 현재 개발되고 있는 아데노바이러스중의 한가지이다. Ad2와 AdV5 모두 인간 악성 종양과 연관되지 않은 아데노바이러스 아강에 속한다. 최근에, 하이브리드 아데노바이러스 벡터 AdV5/F35가 개발되었는데, 이는 유전자 치료법 및 관련된 연구에서 많은 주목을 받았다(Yotnda et al., 2001).
재조합 아데노바이러스는 매우 높은 수준의 외래도입유전자 전달을 제공할 수 있다. 유전적 불균형을 보충하는 치료 외래도입유전자를 생체내에 전달하는 이런 시스템의 효능은 다양한 질환의 동물 모델에서 입증되었다(Watanabe, 1986; Tanzawa et al., 1980; Golasten et al., 1983; Ishibashi et al., 1993; and Ishibashi et al., 1994). 실제로, 낭포성 섬유증 막통과 조절인자(CFTR)에 대한 cDNA를 인코딩하는 재조합 복제 결함성 아데노바이러스가 적어도 2가지 인간 CF 임상 시험에 사용이 승인되었다(Wilson, 1993). Hurwitz 등(1999)은 암(망막모세포종)의 뮤린 모델에서 아데노바이러스 매개된 유전자 치료의 효능을 입증하였다.
임상 시험이 진행됨에 따라, 임상 등급 아데노바이러스 벡터에 대한 수요가 급증하고 있다. 300건의 환자 임상 시험을 위한 연간 예상되는 수요는 대략 6 x 1014 PFU에 육박할 수 있다.
전통적으로, 아데노바이러스는 시판되는 조직 배양 플라스크 또는 “세포공장(cellfactory)”에서 생산된다. 일반적으로, 아데노바이러스 벡터 생산은 HEK293 세포의 부착을 위한 배양 표면을 제공하는 배양 장치, 예를 들면, T-플라스크에서 수행된다. 바이러스 감염된 세포는 수득하고 냉동-해동시켜, 정제되지 않은 세포 용해물 형태로 세포로부터 바이러스를 방출시킨다. 이후, 생산된 정제되지 않은 세포 용해물(CCL)은 이중 CsCl 구배 한외원심분리를 이용하여 정제한다. 100 단일 트레이 세포공장(cellfactory)에서 전형적으로 수득되는 바이러스는 대략 6 ×1012 PFU이다. 분명한 점은 이와 같은 통상적인 공정을 이용하면 필요한 양의 바이러스를 만들 수 없다는 것이다. 증가하는 수요를 충족시키기 위해서는 생산 규모를 늘리고, 효과적인 새로운 생산 및 정제 공정을 개발해야 한다.
CsCl 구배 한외원심분리를 통한 정제는 지극히 제한적이어서, 유전자 치료에 필요한 아데노바이러스 벡터의 요구량을 충족시킬 수 없다. 따라서, 아데노바이러스 벡터를 대규모로 생산하기 위해서는 CsCl 구배 한외원심분리 방법이외의 다른 정제 방법을 개발해야 한다. 재조합 단백질을 정제하는데 크로마토그래피가 광범위하게 이용되고는 있지만, 바이러스를 크로마토그래피로 정제하는 것은 지극히 제한적이다. 레트로바이러스, 진드기-유래의 뇌염 바이러스, 식물 바이러스를 정제하는데 크기 배제, 이온 교환, 친화성 크로마토그래피가 이용된다는 보고가 있긴 하지만, 그 성공 여부는 각기 다르다(Crooks, et al., 1990; Aboud, et al., 1982; McGrath et al., 1978, Smith and Lee, 1978; O'Neil and Balkovic, 1993). 또한, 크로마토그래피를 이용한 아데노바이러스의 정제에 대한 연구는 극히 적다. 이와 같이 연구 활동이 부족한 이유는 아데노바이러스의 경우, 효과적이지만 규모 확대가 불가능한 CsCl 구배 한외원심분리 정제 방법이 존재하기 때문이다.
최근에, Huyghe 등(1996)은 금속 킬레이트 친화성 크로마토그래피와 이온 교환 크로마토그래피를 병용하여 아데노바이러스 벡터를 정제하였다고 보고하였다. CsCl 구배 한외원심분리를 통하여 수득한 것과 비슷한 수준의 바이러스 순도가 보고되었다. 불행하게도, 이중 칼럼 정제 과정이후 단지 23% 정도의 바이러스만 회수되었다. 이와 같이 바이러스 회수율이 낮은 원인은 세포와 이중 칼럼 정제 과정으로부터 바이러스를 방출시키기 위해 세포를 용해시키는데 냉동/해동 단계가 이용되었기 때문이다.
대부분의 E1 결실된 1세대 아데노바이러스 벡터에서, 생산은 아데노바이러스 벡터 E1 결실을 in trans에서 보충하는 HEK293 세포를 이용하여 수행된다. HEK293 세포의 고정 의존(anchorage dependency)으로 인하여, 아데노바이러스 벡터 생산은 일반적으로, HEK293 세포의 부착을 위한 배양 표면을 제공하는 배양 장치, 예를 들면, T-플라스크, 복수층 CellfactoriesTM, 대규모 CellCubeTM 바이오리엑터 시스템에서 수행되어 왔다. 최근에, HEK293 세포는 현탁 바이오리엑터에서 아데노바이러스 벡터의 생산을 가능하게 하는 다양한 혈청-없는 배지에서 현탁 배양에 순응되었다. 원심분리를 이용한 바이러스 감염 시점에서 완전 배지 교체는 대규모로 수행하기 어렵다. 이에 더하여, 외부 여과 장치에 요구되는 배지 재순환과 연관된 전단 응력(shear stress)은 단백질-없는 배지에서 숙주 세포에 유해한 효과를 유발할 가능성이 높다.
분명한 점은 이런 산물에 대한 더욱 증가하는 수요를 충족할 만큼 높은 생산율로 아데노바이러스 벡터를 생산하는 개선된 방법이 요구된다는 것이다. 아데노바이러스 벡터 생산을 위한 개선된 방법은 더욱 효과적인 생산을 결과하는 개선된 기술 및 아데노바이러스 벡터 생산을 증가시키기 위한 작동 조건의 최적화를 포함할 수 있다.
아데노바이러스 생산과 정제에서 작동 조건의 연구는 극히 미미하다. 한 연구(Jardon and Garnier, 2003)에서, E1과 E3 결실된 Ad5 생산에 대한 온도, pH, pCO2를 비롯한 특정 작동 조건의 효과를 기술하였다.
본 발명의 요약
본 발명은 배지에서 성장된 숙주 세포를 감염시킴으로써 아데노바이러스를 생산하는 경우에, 아데노바이러스 생산이 37℃보다 약간 낮은 감염 온도(infection temperature)에서 극대화된다는 발견에 기초한다. 아데노바이러스 감염을 위한 최적 감염 온도 범위의 확인은 유전자 요법용 아데노바이러스 벡터를 생산하는 기술에서 현저한 개선에 해당한다.
이에 더하여, 본 발명은 숙주 세포를 바이오리엑터에서 성장시키는 경우에, 새로운 배지가 교체되는 희석 단계와 아데노바이러스 감염 단계가 병합될 수 있다 는 발견에 기초한다. 더욱 구체적으로, 별도의 배지 교체 단계가 필요하지 않다. 따라서, 두 단계를 단일 단계로 병합함으로써 아데노바이러스의 대량 생산 기술을 더욱 효율적으로 수행할 수 있다. 감염에 앞서 원심분리와 완전 배지 교체의 표준 방법과 비교하여, 본 발명의 희석/감염 방법으로 대략 등가의 바이러스 생산율이 달성되었다.
이런 이유로, 본 발명은 아데노바이러스 생산과 정제에 관련된 개선된 기술을 제공함으로써 이들 새로운 개선을 활용되도록 설계된다. 따라서, 본 발명은 아데노바이러스의 생산과 정제에 관련된 방법 및 이들 새로운 개선에 따라 생산되고 정제된 아데노바이러스 조성물에 관한다.
본 발명의 방법은 아데노바이러스를 생산하는 방법을 포함하는데, 상기 방법은 a) 아래의 단계로 아데노바이러스 제조물을 제조하고:
(i) 배지에서 숙주 세포를 성장시키고;
(ii) 37℃ 미만의 성장 허용 온도(growth-permissive temperature)
에서 아데노바이러스로 숙주 세포를 감염시킨다;
b) 상기 아데노바이러스 제조물로부터 아데노바이러스를 분리하는 단계를 포함한다. 특정 구체예에서, 아데노바이러스로 숙주 세포의 감염은 31℃ 초과 내지 37℃ 미만의 온도에서 수행된다. 가령, 아데노바이러스로 숙주 세포의 감염은 32℃ 내지 36℃, 33℃ 내지 36℃, 34℃ 내지 36℃, 35℃ 내지 36℃의 온도 범위, 또는 이로부터 추론될 수 있는 임의의 온도 범위에서 수행된다. 다른 구체예에서, 아데노바이러스로 숙주 세포의 감염은 32℃ 내지 37℃ 미만, 33℃ 내지 37℃ 미만, 34 ℃ 내지 37℃ 미만, 35℃ 내지 37℃ 미만, 36℃ 내지 37℃ 미만의 온도 범위, 또는 이로부터 추론될 수 있는 임의의 온도 범위에서 수행된다. 다른 구체예에서, 아데노바이러스로 숙주 세포의 감염은 대략 36℃, 대략35℃, 대략 34℃, 대략 33℃, 대략 32℃의 온도, 또는 이로부터 추론될 수 있는 임의의 온도 범위에서 수행된다.
아데노바이러스를 생산하는 방법에 관한 본 발명의 개시된 구체예에서, 숙주 세포의 성장을 뒷받침할 수 있는 임의의 배지가 숙주 세포를 성장시키는데 고려된다. 본 발명의 특정 구체예에서, 배지는 DMEM + 2% FBS이다. 또한, 본 발명은 숙주 세포 성장을 뒷받침하기 위하여 다른 물질을 배지의 첨가를 고려한다. 당업자에게 공지된 범위의 물질과 첨가제를 이용하여 세포 성장을 촉진할 수 있다. 가령, 일부 구체예에서, 배지에서 글루코오스 농도는 대략 0.5 내지 대략 3.0 gm 글루코오스/ℓ로 유지된다.
본 발명의 다른 구체예는 아데노바이러스를 생산하는 방법에 관하는데, 상기 방법은 a) 아래의 단계로 아데노바이러스 제조물을 제조하고:
(i) 바이오리엑터에 담긴 배지에서 숙주 세포를 성장시키고;
(ii) 새로운 배지와 아데노바이러스로 숙주 세포를 희석함으로써
바이러스 감염을 시작한다;
b) 아데노바이러스 제조물로부터 아데노바이러스를 분리하는 단계를 포함한다. 숙주 세포 성장을 뒷받침할 수 있는 당업자에게 공지된 임의의 바이오리엑터가 본 발명의 이용될 수 있다. 다양한 유형의 바이오리엑터에 관한 상세는 아래에 제공한다.
바이오리엑터를 요하는 본 발명의 다양한 구체예에서, 바이오리엑터에서 세포 성장을 뒷받침할 수 있는 임의 유형의 배지가 바이오리엑터와 병용될 수 있다. 가령, 배지는 혈청-없는 배지이다. 다른 구체예에서, 배지는 단백질-없는 배지이다. 일부 구체예에서, 배지는 CD293 배지이다. 본 발명의 이들 구체예에서, 숙주 세포는 고정-의존성 배양 또는 비-고정-의존성(현탁) 배양으로 성장될 수 있다.
바이오리엑터를 요하는 아데노바이러스 생산 방법에 관한 본 발명의 구체예에서, 당업자에게 공지된 임의의 바이오리엑터가 본 발명에 이용될 수 있다. 특정 구체예에서, 바이오리엑터는 바이오리엑터 내에서 파동(wave motion)을 유도하는 평면 플랫폼의 축성 진동(axial rocking)을 이용하는 바이오리엑터를 포함한다. 일부 구체예에서, 파동은 폴리에틸렌 비닐 아세테이트와 에틸 비닐 알코올로 만들어진 무균 가방의 내부에 유도된다. 다른 구체예에서, 바이오리엑터는 1회용 바이오리엑터이다. 본 발명에는 임의 크기의 바이오리엑터가 이용될 수 있다. 가령, 바이오리엑터는 10 ℓ 바이오리엑터이다. 이에 더하여, 바이오리엑터는 상업용 바이오리엑터일 수 있다. 가령, 바이오리엑터는 Wave Bioreactor®(Wave Biotech, LLC, Bedminster, NJ)이다.
아데노바이러스 생산 방법에 관한 본 발명의 구체예에서, 세포 배양의 작동 조건은 당업자에게 공지된 임의의 기술로 조정되거나 측정될 수 있다. 조정되는 이런 조건의 실례는 배지의 pH 및 배지의 용존 산소 분압(dissolved oxygen tension)이 포함된다.
아데노바이러스 생산 방법에 관한 일부 구체예는 당업자에게 공지된 임의의 방법으로 배지의 가공과 처리에 관한다. 가령, 본 발명의 특정 구체예에서, 아데노바이러스 생산 방법은 필터를 통하여 배지를 살포시키는 단계를 수반한다. 필터는 바이오리엑터의 내부에 위치하거나, 또는 바이오리엑터의 외부에 위치한다. 특정 구체예에서, 필터는 유동 플랫 필터(floating flat filter)이다. 유동 플랫 필터는 바이오리엑터로부터 소모된 배지를 제거하는데 이용된다. 당업자에게 공지된 임의의 방법을 이용하여 배양 용적(culture volume)을 조정하고 유지할 수 있다. 일부 구체예에서, 배양 용적은 새로운 배지 첨가를 유인하는데 이용되는 로드 셀(load cell)에 의해 유지된다.
본 발명의 구체예에서, 배지는 숙주 세포의 배양액으로 살포되거나 살포되지 않는다. 본 발명의 일부 구체예에서, 배지는 숙주 세포 성장의 3일 시점부터 살포된다. 당업자에게 공지된 다양한 기술과 장치를 이용하여 배지를 세포 배양 시스템으로 살포할 수 있다.
아데노바이러스 생산 방법에 관한 본 발명의 구체예에서, 배지로 숙주 세포를 희석하는 단계는 아데노바이러스 감염 단계와 병합될 수 있다. 이는 이들 두 단계가 효율적으로 병합되면 아데노바이러스 벡터의 우수한 생산율을 제공할 수 있다는 본 발명자들의 발견에 기초한다. 본 발명에는 당업자에게 공지된 임의의 희석 방법이 이용될 수 있다. 특정 구체예에서, 숙주 세포는 새로운 배지와 아데노바이러스로 2-배 내지 50-배 희석된다. 다른 구체예에서, 숙주 세포는 새로운 배지와 아데노바이러스로 10-배 희석된다.
아데노바이러스 생산 방법에 관한 본 발명의 구체예에서, 숙주 세포의 바이 러스 감염의 시작은 당업자에게 공지된 임의의 방법으로 달성될 수 있다. 가령, 바이오리엑터의 이용을 수반하는 본 발명의 구체예에서, 바이러스 감염은 제 2 바이오리엑터에서 진행된다. 가령, 숙주 세포의 바이러스 감염은 20-100 vp/숙주 세포를 첨가함으로써 달성된다. 다른 특정 구체예에서, 바이러스 감염은 50 vp/숙주 세포를 첨가함으로써 달성된다. 바이러스 감염은 임의의 기간 동안 진행될 수 있다. 바이러스 감염의 진행을 모니터하는 기술은 당분야에 공지되어 있다. 본 발명의 특정 구체예에서, 바이러스 감염은 대략 4일 동안 진행된다. 본 발명의 다른 특정 구체예에서, 아데노바이러스 제조물로부터 아데노바이러스의 분리는 바이러스 감염이 완결된 이후 4일 시점에서 수행된다.
아데노바이러스 생산을 수반하는 본 발명의 이들 구체예에서, 숙주 세포가 이용될 수 있다. 아데노바이러스의 복제를 뒷받침할 수 있는 임의의 세포형이 숙주 세포로서 이용될 수 있다. 당업자에게 공지된 다양한 숙주 세포가 숙주 세포로부터 아데노바이러스의 생산에 이용될 수 있다. 가령, 본 발명의 일부 구체예에서, 숙주 세포는 복제-결함성 아데노바이러스의 성장을 보충한다. 복제-결함성 아데노바이러스는 E1-영역의 적어도 일부가 부재하는 아데노바이러스이거나, 또는 E1A 및/또는 E1B 영역의 적어도 일부가 부재하는 아데노바이러스이다. 숙주 세포는 예로써, 293, HEK293, PER.C6, 911, IT293SF 세포에서 선택된다. 본 발명의 특정 구체예에서, 숙주 세포는 HEK293 세포이다.
본 발명의 일부 구체예에서, 아데노바이러스는 재조합 아데노바이러스이다. 가령, 재조합 아데노바이러스는 프로모터에 작동가능하게 결합된 재조합 유전자를 인코딩한다. 프로모터로서 기능할 수 있는 당업자에게 공지된 임의의 프로모터가 이용될 수 있다. 가령, 특정 구체예에서, 프로모터는 SV40 EI, RSV LTR, β-액틴, CMV-IE, 아데노바이러스 주요 후기, 폴리오마 F9-1, 티로시나아제 프로모터, α-태아 단백질 프로모터, 또는 egr-1이다.
아데노바이러스가 재조합 유전자를 인코딩하는 아데노바이러스인 본 발명의 구체예에서, 임의의 재조합 유전자, 특히, 치료 유전자가 본 발명에 이용된다. 가령, 재조합 유전자는 재조합 유전자는 안티센스 ras, 안티센스 myc, 안티센스 raf, 안티센스 erb, 안티센스 src, 안티센스 fms, 안티센스 jun, 안티센스 trk, 안티센스 ret, 안티센스 gsp, 안티센스 hst, 안티센스 bcl, 안티센스 abl, Rb, CFTR, p16, p21, p27, p57, p73, C-CAM, APC, CTS-1, zac1, scFV ras, DCC, NF-1, NF-2, WT-1, MEN-I, MEN-II, BRCA1, VHL, MMAC1, FCC, MCC, BRCA2, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11 IL-12, GM-CSF, G-CSF, 티미딘 키나아제, mda7, fus, 인터페론 α, 인터페론 β, 인터페론 γ, ADP, p53에서 선택된다. 일부 구체예에서, 재조합 유전자는 p53 유전자이다. 다른 구체예에서, 재조합 유전자는 mda-7 유전자이다.
본 발명의 일부 구체예에서, 재조합 유전자는 안티센스 ras, 안티센스 myc, 안티센스 raf, 안티센스 erb, 안티센스 src, 안티센스 fms, 안티센스 jun, 안티센스 trk, 안티센스 ret, 안티센스 gsp, 안티센스 hst, 안티센스 bcl 안티센스 abl, Rb, CFTR, p16, p21, p27, p57, p73, C-CAM, APC, CTS-1, zac1, scFV ras, DCC, NF-1, NF-2, WT-1, MEN-I, MEN-II, BRCA1, VHL, MMAC1, FCC, MCC, BRCA2, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11 IL-12, GM-CSF, G-CSF, 티미딘 키나아제, mda7, fus, 인터페론 α, 인터페론 β, 인터페론 γ, ADP, p53, ABLI, BLC1, BLC6, CBFA1, CBL, CSFIR, ERBA, ERBB, EBRB2, ETS1, ETS2, ETV6, FGR, FOX, FYN, HCR, HRAS, JUN, KRAS, LCK, LYN, MDM2, MLL, MYB, MYC, MYCL1, MYCN, NRAS, PIM1, PML, RET, SRC, TAL1, TCL3, YES, MADH4, RB1, TP53, WT1, TNF, BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, ApoAI, ApoAIV, ApoE, Rap1A, 시토신 디아미나아제, Fab, ScFv, BRCA2, zac1, ATM, HIC-1, DPC-4, FHIT, PTEN, ING1, NOEY1, NOEY2, OVCA1, MADR2, 53BP2, IRF-1, Rb, zac1, DBCCR-1, rks-3, COX-1, TFPI, PGS, Dp, E2F, ras, myc, neu, raf, erb, fms, trk, ret, gsp, hst, abl, E1A, p300, VEGF, FGF, 트롬보스폰딘, BAI-1, GDAIF, 또는 MCC이다.
본 발명의 다른 구체예에서, 재조합 유전자는 ACP 디새츄라아제, ACP 하이드록실라아제, ADP-글루코오스 피로포릴라아제, ATPase, 알코올 디하이드로게나아제, 아밀라아제, 아밀로글루코시다아제, 카탈라아제, 셀룰라아제, 사이클로옥시게나아제, 디카르복실라아제, 덱스트리나아제, 에스테라아제, DNA 중합효소, RNA 중합효소, 히알루론 합성효소, 갈락토시다아제, 글루카나아제, 글루코오스 옥시다아제, GTPase, 헬리카아제, 헤미셀룰라아제, 히알루로니다아제, 인테그라아제, 인베르타아제, 아이소머라아제, 키나아제, 락토오스, 리파아제, 리폭시게나아제, 리아제, 리소자임, 펙틴스테라아제, 페록시다아제, 포스파타아제, 포스포리파아제, 포스포릴라아제, 폴리갈락투로나아제, 프로테이나아제, 펙티데아제, 풀라나아제, 리콤비 나아제, 역전사효소, 토포아이소머라아제, 자일라나아제, 리포터 유전자, 인터루킨, 또는 사이토킨을 인코딩하는 유전자이다.
본 발명의 다른 구체예에서, 재조합 유전자는 카바모일 합성효소 I, 오르니틴 트랜스카바밀라아제, 아르기노숙시네이트 합성효소, 아르기노숙시네이트 리아제, 아르기나아제, 푸마릴아세토아세테이트 하이드롤라아제, 페닐알라닌 하이드록실라아제, 알파-1 안티트립신, 글루코오스-6-포스파타아제, 저-밀도-지단백 수용체, 포르포빌리노겐 디아미나아제, 인자 VIII, 인자 IX, 시스타티원 β-합성효소, 분지쇄 케토산 디카르복실라아제, 알부민, 이소발레릴-CoA 디하이드로게나아제, 프로피오닐 CoA 카르복실라아제, 메틸 말로닐 CoA 뮤타아제, 글루타릴 CoA 디하이드로게나아제, 인슐린, 베타-글루코시다아제, 피루베이트 카르복실라아제, 헤파틱 포스포릴라아제, 포스포릴라아제 키나아제, 글리신 디카르복실라아제, H-단백질, T-단백질, 멘케스병(Menkes disease) 구리-전달 ATPase, 윌슨병(Wilson's disease) 구리-전달 ATPase, 시토신 디아미나아제, 하이폭산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라아제, 갈락토오스-1-포스페이트 우리딜트랜스퍼라아제, 페닐알리닌 하이드록실라아제, 글루코세르브로시다아제, 스핑고미엘리나아제, α-L-이두로니다아제, 글루코오스-6-포스페이트 디하이드로게나아제, HSV 티미딘 키나아제, 또는 인간 티미딘 키나아제를 인코딩하는 유전자이다. 대안으로, 재조합 유전자는 성장 호르몬, 프롤락틴, 태반 락토겐, 황체화 호르몬, 여포-자극 호르몬, 융모성 성선자극호르몬, 갑상선-자극 호르몬, 렙틴, 부신피질자극호르몬(adrenocorticotropin), 안지오텐신 I, 안지오텐신 II, β-엔도르핀, β-멜라닌세포 자극 호르몬, 콜레시스토키닌 (cholecystokinin), 엔도텔린 I, 갈라닌(galanin), 위 억제 펩티드, 글루카곤, 인슐린, 리포트로핀(lipotropin), 뉴우로피신(neurophysin), 소마토스타틴, 칼시토닌, 칼시토닌 유전자 관련된 펩티드, β-칼시토닌 유전자 관련된 펩티드, 악성 인자의 고칼슘혈증(hypercalcemia), 부갑상선 호르몬-관련된 단백질, 글루카곤-유사 펩티드, 판크레아스타틴(pancreastatin), 췌장 펩티드, 펩티드 YY, PHM, 세크레틴(secretin), 혈관작동성 장 펩티드, 옥시토신, 바소프레신, 바소톡신, 엔케팔린아마이드(enkephalinamide), 메토르핀아마이드(metorphinamide), 알파 멜라닌세포 자극 호르몬, 심방 나트륨배설 인자(atrial natriuretic factor), 아밀린(amylin), 아밀로이드 P 성분, 부신피질 자극호르몬 방출 호르몬(corticotropin releasing hormone), 성장 호르몬 방출 인자, 황체화 호르몬-방출 호르몬, 뉴로펩티드 Y, 물질 K, 물질 P, 또는 갑상선자극호르몬 분비촉진 호르몬(thyrotropin releasing hormone)을 인코딩한다.
본 발명의 특정 구체예는 아데노바이러스 제조물로부터 아데노바이러스의 분리를 수반하는 아데노바이러스 생산 방법에 관한다. 당업자에게 공지된 아데노바이러스 제조물로부터 아데노바이러스를 분리하는 임의의 방법이 본 발명에 이용될 수 있다. 본 발명의 특정 구체예에서, 숙주 세포는 아데노바이러스에 의한 감염이후, 용해에 앞서 수집되고, 숙주 세포의 용해는 냉동-해동, 자가용해(autolysis), 또는 계면활성제 용해로 달성된다. 본 발명의 다른 특정 구체예에서, 아데노바이러스 생산 방법은 아데노바이러스 제조물에서 핵산 오염물질의 농도를 감소시키는 단계를 수반한다.
본 발명의 일부 구체예에서, 분리된 아데노바이러스는 제약학적으로 수용가능한 조성물에 배치된다. 제약학적 조성물을 제조하는데 이용되는 다양한 방법과 기술은 당분야에 공지되어 있다. 아데노바이러스를 함유하는 임의의 제약학적 조성물이 본 발명에 이용될 수 있다. 가령, 본 발명의 특정 구체예는 경구 투여용, 국소 투여용, 또는 정맥 투여용 아데노바이러스의 제약학적 조성물에 관한다.
본 발명의 특정 구체예는 아데노바이러스 제조물로부터 분리된 아데노바이러스의 정제에 관한다. 아데노바이러스를 정제하는 다양한 기술은 당분야에 공지되어 있다. 가령, 아데노바이러스의 정제는 크로마토그래피 단계를 수반한다. 본 발명의 일부 구체예에서, 크로마토그래피 단계에는 아데노바이러스를 1회 이상의 크로마토그래피 분리에 적용하는 단계가 포함되고, 다른 구체예에서, 크로마토그래피 단계는 아데노바이러스를 1회 크로마토그래피 분리에 적용하는 단계를 수반한다. 다른 구체예에서, 크로마토그래피 분리는 이온 교환 크로마토그래피를 포함한다.
본 발명의 일부 구체예는 바이러스 생산을 분석하는 과정에 관한다. 가령, 바이러스 생산은 HPLC를 이용하여 분석된다. 당업자에게 공지된 바이러스 생산 분석 기술이 본 발명에 이용될 수 있다.
본 발명의 일부 구체예에서, 본 명세서에 기술된 아데노바이러스 생산 방법은 아래의 특성 중에서 한가지 이상을 보유하는 정제된 아데노바이러스 조성물을 수득하는 단계를 수반하는 아데노바이러스를 분리하는 정제하는 방법에 관한다:
(a) 대략 1 x 109 내지 대략 1 x 1013 pfu/㎖의 바이러스 역가;
(b) 대략 1 x 1010 내지 대략 2 x 1013 입자/㎖의 바이러스 입자 농도;
(c) 대략 10 내지 대략 60의 입자:pfu 비율;
(d) 1 x 10e12 바이러스 입자당 50 ng 미만의 BSA;
(e) 1 x 1012 바이러스 입자당 대략 50 pg 내지 대략 1 ng의 오염 인간 DNA;
(f) 피크 아래 영역(area under peak)의 97% 내지 99%로 구성되는 단일 HPLC 용출 피크. 특정 구체예에서, 상기한 단계에 따라 제조된 아데노바이러스 조성물은 5 x 1014 내지 1 x 1018 바이러스 입자를 함유한다. 다른 구체예에서, 조성물은 제약학적으로-수용가능한 조성물이다.
본 발명의 일부 구체예에서, 본 명세서에 기술된 아데노바이러스 생산 방법은 아데노바이러스 제조물로부터 아데노바이러스의 분리를 수반하고, 상기 분리에는 아래의 단계가 포함된다:
(a) 제 1 크로마토그래피 배지에서 아데노바이러스 제조물을 크로마토그래피에 적용하고, 여기서 아데노바이러스 입자는 제 1 크로마토그래피 칼럼에 유지되고;
(b) 제 1 크로마토그래피 배지로부터 아데노바이러스 입자를 용출하여 아데노바이러스 입자의 용출액을 생산하고;
(c) 제 2 크로마토그래피 배지에서 용출액으로부터 유래된 아데노바이러스 입자를 크로마토그래피에 적용하고, 여기서 제 2 크로마토그래피 배지는 용출액으로부터 한가지 이상의 오염물질을 보유하고, 제 2 크로마토그래피 배지는 크기 배 제 배지가 아니며;
(d) 용출액으로부터 아데노바이러스 입자를 수집한다. 특정 구체예에서, 제 1 크로마토그래피 배지는 음이온 교환 배지, 양이온 교환 배지, 고정된 금속 친화성 배지, 황산화된 친화성 배지, 면역친화성 배지, 헤파린 친화성 배지, 하이드록시아파티트(hydroxyapatite) 배지, 소수성 상호작용 배지에서 선택된다. 다른 구체예에서, 제 2 크로마토그래피 배지는 음이온 교환 배지, 양이온 교환 배지, 고정된 금속 친화성 배지, 황산화된 친화성 배지, 염료친화성 배지, 하이드록시아파티트(hydroxyapatite) 배지, 면역친화성 배지, 헤파린 친화성 배지, 소수성 상호작용 배지에서 선택된다.
본 발명의 다른 구체예에서, 본 명세서에 기술된 아데노바이러스 생산 방법은 아데노바이러스 제조물로부터 아데노바이러스의 분리를 수반하고, 상기 분리에는 아래의 단계가 포함된다:
(a) 제 1 크로마토그래피 배지에서 아데노바이러스 제조물을 크로마토그래피에 적용하고, 여기서 아데노바이러스 제조물로부터 오염물질은 제 1 크로마토그래피 칼럼에 유지되고;
(b) 제 2 크로마토그래피 배지에서 용출액에 남아있는 아데노바이러스 입자를 크로마토그래피에 적용하고, 여기서 용출액으로부터 유래된 아데노바이러스 입자는 제 2 크로마토그래피 배지에 유지되고, 제 2 크로마토그래피 배지는 음이온 교환 배지이고, 제 1 크로마토그래피 배지는 황산화된 폴리사카라이드 친화성 배지 이외의 배지이며;
(d) 제 2 크로마토그래피 배지로부터 아데노바이러스 입자를 용출한다. 특정 구체예에서, 제 1 크로마토그래피 배지는 음이온 교환 배지, 양이온 교환 배지, 고정된 금속 친화성 배지, 황산화된 친화성 배지, 면역친화성 배지, 헤파린 친화성 배지, 하이드록시아파티트(hydroxyapatite) 배지, 소수성 상호작용 배지에서 선택된다. 다른 구체예에서, 제 2 크로마토그래피 배지는 음이온 교환 배지, 양이온 교환 배지, 고정된 금속 친화성 배지, 황산화된 친화성 배지, 염료친화성 배지, 하이드록시아파티트(hydroxyapatite) 배지, 면역친화성 배지, 헤파린 친화성 배지, 소수성 상호작용 배지에서 선택된다. 당업자에게 공지된 임의의 크로마토그래피 배지가 본 발명에 이용될 수 있다. 당업자에게 공지된 다양한 배지를 이용하여 청구된 발명을 실행할 수 있다.
본 발명의 방법과 관하여 기술된 구체예는 본 발명의 다른 방법에도 수행될 수 있다.
특허청구범위 및/또는 명세서에서 용어 “포함하는”과 동시에 이용된 단수 표현은 “하나”뿐만 아니라 “하나이상”, “적어도 하나”, “하나 또는 그 이상”을 포괄한다.
본 발명의 다른 목적, 특징, 이점은 아래의 상세한 설명으로부터 명확하다. 하지만, 본 발명의 특정 구체예를 예시하는 상세한 설명과 특정 실시예는 설명으로 목적으로 제공되는데, 그 이유는 본 발명의 기술적 사상과 범위를 벗어나지 않는 다양한 개변이 아래의 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백하기 때문이다.
본 발명의 일부를 구성하는 아래의 도면은 본 발명의 특징을 더욱 예시하기 위하여 첨부된다. 당업자는 본 명세서에 제공된 특정 구체예의 상세한 설명과 함께 도면을 참고하면 본 발명을 더욱 명확하게 이해할 수 있다.
도 1A. Adp53 생산에 대한 온도의 효과를 입증하는 연구 결과(vp/플라스크).
도 1B. Admda7 생산에 대한 온도의 효과를 입증하는 연구 결과(vp/플라스크).
도 2. 바이오리엑터에서 세포 성장과 생존능.
도 3. 배지에서 글루코오스와 락테이트 농도(g/ℓ) vs. 배양 일자.
도 4. 살포 바이오리엑터 시스템의 도표.
도 5. 살포 배양에서 세포 성장과 생존능 vs. 배양 일자.
도 6. 살포 배양에서 글루코오스와 락테이트 농도(g/ℓ) vs. 배양 일자.
전형적인 구체예의 설명
아데노바이러스 벡터는 진핵세포 유전자 발현 및 백신 개발에 성공적으로 이용될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 여러 증거를 통하여, 아데노바이러스는 유전자 요법에 이용될 수 있는 것으로 입증되고 있다. 여러 다른 조직으로 재조합 아데노바이러스를 투여하는 성공적인 연구 결과를 통하여, 아데노바이러스 벡터는 유전자 치료에 유용한 것으로 입증되었다. 이와 같은 연구 성과를 통하여 인간의 임상 실험에 이들 벡터가 이용되었다. 현재 다양한 치료에 이용되는 아데노바이러스 벡터에 대한 수요가 증가되고 있다. 현재 이용할 수 있는 기술로는 이와 같은 수요를 충족시키지 못한다. 따라서, 본 발명은 이런 치료에 이용되는 다량의 아데노바이러스의 생산과 정제 방법을 제공한다.
본 발명자들은 아데노바이러스 생산이 37℃보다 약간 낮은 온도에서 극대화된다는 놀라운 사실을 발견하였다. 아데노바이러스 감염을 위한 최적 감염 온도 범위의 확인은 유전자 요법용 아데노바이러스 벡터를 생산하는 기술에서 현저한 개선에 해당한다.
이에 더하여, 본 발명자들은 숙주 세포를 바이오리엑터에서 성장시키는 경우에, 새로운 배지가 교체되는 희석 단계와 아데노바이러스 감염 단계가 바이러스 생산의 손실 없이 병합될 수 있다는 사실을 발견하였다. 더욱 구체적으로, 별도의 배지 교체 단계가 필요하지 않다. 따라서, 두 단계를 단일 단계로 병합함으로써 아데노바이러스의 대량 생산 기술을 더욱 효율적으로 수행할 수 있다.
이런 이유로, 본 발명은 아데노바이러스 벡터의 생산과 정제에 관련된 대규모 배양 시스템에서 이들 개선을 활용되도록 설계된다. 본 발명자들의 새로운 발견을 활용하여 아데노바이러스를 생산하고 정제하는 방법은 아래에 상세하게 제시한다.
A. 아데노바이러스
아데노바이러스는 선형 이중 가닥 DNA를 포함하고 30 내지 35 kb 크기의 게놈을 보유한다(Reddy et al., 1998; Morrison et al., 1997; Chillon et al., 1999). 50여 개의 인간 아데노바이러스 혈청형 및 80여 개의 관련된 형태가 존재하는데, 이들은 면역 기준, 분자 기준, 기능 기준에 기초하여 6가지 과(科)로 분류된다(Wadell et al., 1980). 물리적으로, 아데노바이러스는 이중-가닥 선형 DNA 게놈을 보유하는 중간-크기 다면체형(icosahedral) 바이러스인데, 아데노바이러스 5형의 경우에 35,935개의 염기쌍의 게놈을 보유한다(Chroboczek et al., 1992). 아데노바이러스는 세포 감염과 바이러스 복제를 위하여, 숙주 세포로의 진입 및 바이러스 게놈의 핵으로의 전달을 요한다. 아데노바이러스 게놈의 현저한 특징은 조기 영역(early region)(E1, E2, E3, E4 유전자), 중간 영역(pIX 유전자, Iva2 유전자), 후기 영역(L1, L2, L3, L4, L5 유전자), 주요 후기 프로모터(MLP), 말단 반복 염기서열(inverted-terminal-repeat)(ITR), ψ 서열(Zheng, et al., 1999; Robbins et al., 1998; Graham and Prevec, 1995)이다. 조기 유전자 E1, E2, E3, E4는 감염이후 바이러스로부터 발현되고, 바이러스 유전자 발현, 세포 유전자 발현, 바이러스 복제, 세포 아폽토시스의 저해를 조절하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 또한, 바이러스 감염동안, MLP가 활성화되어 아데노바이러스 엔캡시데이션(encapsidation)에 필요한 폴리펩티드를 인코딩하는 후기(L) 유전자의 발현을 유도한다. 중간 영역은 아데노바이러스 캡시드의 성분을 인코딩한다. 아데노바이러스 말단 반복 염기서열(ITR; 100-200 bp 길이)은 cis 요소이고 복제 기원으로 기능하며 바이러스 DNA 복제에 필요하다. ψ 서열은 아데노바이러스 게놈의 패키징(packaging)에 필요하다.
아데노바이러스, 특히, 아데노바이러스 혈청형 2와 5에 의한 감염 기전은 폭넓게 연구되었다. CAR(Coxsackie Adenoviral Receptor)로 명명된 숙주 세포 단백질이 이들 아데노바이러스에 대한 일차 결합 수용체로서 확인되었다. CAR의 내인성 세포 기능은 아직 밝혀지지 않았다. 섬유 knob와 CAR 사이의 상호작용은 세포 표면에 대한 아데노바이러스의 결합에 충분하다. 하지만, 펜톤 염기와 다른 세포 표면 단백질, αv 인테그린 계통의 구성원 사이의 후속 상호작용은 효율적인 바이러스 내재화에 필요하다. 아데노바이러스의 해체는 내재화 동안 시작된다; 섬유 단백질은 세포 표면에서 CAR에 결합된 상태로 유지된다. 나머지 아데노바이러스는 바이러스 입자가 세포질 통하여 핵막의 핵공 복합체(pore complex)로 전달되면서 단계적인 방식으로 해체된다. 바이러스 DNA는 핵막을 통하여 핵으로 돌출되는데, 여기서 바이러스 DNA가 복제되고, 바이러스 단백질이 발현되며, 새로운 바이러스 입자가 조합된다. 아데노바이러스 감염의 이런 기전에서 특정 단계는 바이러스 감염과 유전자 발현을 조절할 수 있는 잠재적 표적이 된다.
본 발명의 특정 구체예에서, 아데노바이러스 생산 방법에 이용되는 아데노바이러스는 복제-결함성 아데노바이러스이다. 가령, 아데노바이러스는 E1 영역의 적어도 일부가 부재하는 복제-결함성 아데노바이러스이다. 특정 구체예에서, 아데노바이러스는 E1A 및/또는 E1B 영역의 적어도 일부가 부재한다. 다른 구체예에서, 아데노바이러스는 재조합 아데노바이러스이다.
B. 숙주 세포
본 발명의 다양한 구체예는 아데노바이러스 생산 방법에 관한다. “숙주 세포”는 아데노바이러스의 복제를 뒷받침할 수 있는 세포로서 정의된다. 아데노바이러스의 복제를 뒷받침할 수 있는 임의의 세포형은 본 발명에서 숙주 세포로서 이용될 수 있다. 가령, 숙주 세포는 HEK293, PER.C6, 911, 또는 IT293SF 세포이다. 아데노바이러스 생산 방법에 이용될 수 있는 다양한 숙주 세포는 당분야에 공지되어 있다.
특정 구체예에서, 아데노바이러스 벡터의 발생 및 증식이 293으로 명명된 독특한 헬퍼 세포주에 좌우되는데, 상기 세포주는 아데노바이러스 혈청형 5(Ad5) DNA 단편에 의해 인간 배아 신장 세포로부터 형질전환되고 E1 단백질을 구조적으로 발현한다(Graham et al., 1977). E3 영역은 Ad 게놈에서 없어도 되는 부분이기 때문에(Jones and Shenk, 1978), 현재 Ad 벡터는 293 세포의 도움으로, E1, E3 또는 양 영역에 외부 DNA를 보유한다(Graham and Prevec, 1991; Bett et al., 1994).
본 발명의 다양한 구체예에 이용되는 숙주 세포는 예로써 인간 배아 신장 세포 또는 영장류 세포와 같은 포유동물 세포로부터 유래될 수 있다. 다른 세포형에는 Vero 세포, CHO 세포, 또는 조직 배양 기술이 확립되고 아데노바이러스 허용성인 임의의 진핵 세포가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. “아데노바이러스 허용성”은 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터가 세포 환경 내에서 전체 세포내 바이러스 생명 주기를 완결할 수 있다는 것을 의미한다.
숙주 세포는 예로써 293 세포와 같은 기존의 세포주에서 유래되거나, 또는 de novo에서 생성될 수도 있다. 이런 숙주 세포는 아데노바이러스 게놈에서 in trans 결손을 보완하는데 필수적인 아데노바이러스 유전자를 발현하거나, 또는 E1, E2, E4, E5 및 후기 기능과 같은 다른 결함 아데노바이러스 벡터의 복제를 지원한다. 아데노바이러스 게놈의 특정 부분, E1 영역은 상보적인 세포주를 만드는데 이미 이용되고 있다. 통합된 형태 또는 에피솜 형태인지에 상관없이, 복제를 위한 바이러스 기원이 부재하는 아데노바이러스 게놈의 일부분이 세포주에 도입되면, 세포가 야생형 아데노바이러스로 중복감염(superinfection)되더라도 복제가 진행되지 않는다. 이에 더하여, 주요 후기 단위(Major Late Unit) 전사가 바이러스 DNA 복제 이후에 일어나기 때문에, 아데노바이러스의 후기 기능은 세포주로부터 충분히 발현되지 못한다. 따라서, 후기 기능(L1-5)과 중복되는 E2 영역은 세포주가 아닌 헬퍼 바이러스에 의해 제공된다. 일반적으로 본 발명에 따른 세포주는 E1 및/또는 E4를 발현시킨다.
아데노바이러스 게놈의 일부를 발현하는 숙주 세포인 재조합 숙주 세포 역시 본 발명에서 숙주 세포로서 이용될 수 있다. 본 명세서에서, “재조합” 세포는 유전자, 예를 들면, 아데노바이러스 게놈 또는 다른 세포의 게놈으로부터 유래된 유전자가 도입시킨 세포를 의미한다. 이런 이유로, 재조합 세포는 재조합에 의해 도입된 유전자를 가지고 있지 않은 자연-발생 세포와는 구별된다. 따라서, 재조합 세포는 “인간의 손”을 통하여 도입된 유전자를 보유하는 세포를 의미한다.
재조합 숙주 세포주는 아데노바이러스 재조합 벡터의 복제를 뒷받침할 수 있고, 특정 아데노바이러스 유전자에 결함을 보유하는 헬퍼 바이러스는 이들 바이러스와 벡터의 성장에 “허용성”이다. 재조합 세포는 복제-불능성 아데노바이러스 벡터에서 결함을 보완하고 이들 벡터의 복제를 뒷받침하는 능력으로 인하여, 헬퍼 세포로도 지칭된다.
복제 콤피던트 바이러스와 함께 이용되거나, 또는 복제 결함 바이러스와 함께 이용되는 보완성 숙주 세포로 변환되는 다른 유용한 포유류 세포주의 실례는 Vero와 HeLa 세포, Chinese hamster ovary 세포주, W138, BHK, COS-7, HepG2, 3T3, RIN, MDCK 세포 등이다.
특정 구체예에서, 원치않는 세포의 성장을 미리 배제하는 선별 시스템을 이용하는 것이 유용하다. 이는 선별가능 마커로 세포주를 영구적으로 형질전환시키거나, 또는 선별가능 마커를 인코딩하는 바이러스 벡터로 세포를 형질도입하거나 감염시킴으로써 달성될 수 있다. 어떤 경우든, 적절한 약물 또는 선별가능 화합물로 형질전환된/형질도입된 세포의 배양은 마커를 보유하는 이들 세포의 세포 개체군에서 증가를 결과한다.
마커의 실례에는 각각 tk-, hgprt- 또는 aprt- 세포에서 HSV 티미딘 키나아제, 하이폭산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라아제, 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라아제 유전자가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 또한, 항-대사물질 저항성은 메토트렉세이트에 대한 저항성을 공여하는 dhfr; 미코페놀산에 대한 저항성을 공여하는 gpt; 아미노글리코시드 G418에 대한 저항성을 공여하는 neo; 히그로마이신에 대한 저항성을 공여하는 hygro에 대한 선별의 기초로서 이용될 수 있다.
혈청-없는 현탁 배양액으로 고정-의존성 세포의 혈청 중단 적응(serum weaning adaptation)은 재조합 단백질(Berg,1993)과 바이러스 백신(Perrin, 1995)의 생산에 이용되고 있다. 최근까지, 혈청-없는 현탁 배양액으로 293A 세포의 적응에 관한 보고서는 거의 없었다. Gilbert는 아데노바이러스와 재조합 단백질 생산을 위한 혈청-없는 현탁 배양액으로 293A 세포의 적응을 보고하였다(Gilbert, 1996). 유사한 적응 방법이 아데노바이러스 생산을 위한 혈청-없는 배양 현탁액으로 A549 세포의 적응에 이용되었다(Morris et al., 1996). 하지만, 적응된 현탁 세포에서 세포-특이적 바이러스 생산율은 부모 부착된 세포에서 달성된 것보다 대략 5-10-배 낮았다.
293 세포를 현탁 배양액에 적응시키는데 2가지 방법이 이용되고 있다. Graham은 누드 생쥐에서 3회 계대배양으로 293A 세포를 현탁 배양액에 적응시켰다(293N3S 세포)(Graham, 1987). 현탁 293N3S 세포는 El- 아데노바이러스 벡터를 뒷받침할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 하지만, Garnier 등(1994)은 293N35 세포가 현탁 중에 상대적으로 긴 초기 잠복기(lag phase), 낮은 성장률, 강한 응집 경향을 보인다는 것을 확인하였다.
이용된 두 번째 방법은 현탁 성장으로 293A 세포를 점진적으로 적응시키는 방법이다(Cold Spring Harbor Laboratories, 293S cells). Garnier 등(1994)은 아데노바이러스 벡터로부터 재조합 단백질을 생산하기 위한 293S 세포의 이용을 보고하였다. 이들 저자는 293S 세포가 칼슘이 없는 배지에서 응집되는 경향이 훨씬 덜하고, 바이러스 감염시점에 새로운 배지로 교체하면 단백질 생산이 현저하게 증가한다 것을 발견하였다. 배지 교체없는 배양에서는 글루코오스가 제한 인자(limiting factor)인 것으로 확인되었다.
C. 세포 배양 시스템
제약 산업, 특히 유전자 요법에서 감염성 바이러스 벡터를 생산하는 능력이 중요하게 부각되고 있다. 지난 10년간, 생명공학의 발전으로 인하여, 치료요법, 백신, 단백질 생산 기계로서 잠재적으로 이용될 수 있는 상당수의 중요한 바이러스 벡터가 생산되었다. 포유류 배양에 이들 바이러스 벡터를 이용하면, 박테리아 또는 다른 하등 생명체를 숙주로 하여 생산된 단백질에 비하여, 이황화-의존성 접힘 및 글리코실화반응과 같은 번역이후에 진행되는 복잡한 단백질 구조를 형성하는 능력에서 이점이 갖는다.
포유류 세포 배양액에 매우 효과적인 벡터 시스템의 설계와 작제를 위한 분자 생물학 기술의 발전, 유용한 선별 마커 배터리, 유전자 증폭 과정 및 도입된 벡터로부터 최종 생물학적 활성 분자를 확보하는데 관련된 생화학과 세포 기전의 더욱 포괄적인 이해에 힘입어, 바이러스 벡터를 생산하기 위한 세포 배양이 매우 발전하였다.
바이러스 생산 방법을 기술한 PCT 출원 WO 98/00524, U.S. 특허 6,194,191, U.S. 공개된 특허 출원 US-2002-0182723-A1, U.S. 예비 특허 출원 No. 60/406,591(August 28, 2002)은 재조합 바이러스 입자의 배양, 생산, 정제를 위한 기술의 참고문헌으로서 본원에 포함된다.
본 발명의 특정 구체예는 바이오리엑터의 이용을 요하는 아데노바이러스 생산 방법에 관한다. 본 명세서에서, “바이오리엑터”는 세포를 배양할 목적으로 이용될 수 있는 임의의 장치를 의미한다. 바이오리엑터에서 본 발명에 따른 세포를 성장시켜, 본 발명의 아데노바이러스 벡터에 의해 감염될 수 있는 생물학적으로 완전한 활성을 갖는 세포를 대규모로 만들 수 있다.
바이오리엑터는 현탁과 고정 의존성 세포 배양액으로부터 생물학적 산물을 생산하는데 널리 이용되고 있다. 아데노바이러스 벡터를 생산하는데 가장 널리 이용된 세포는 고정 의존성 인간 배아 신장 세포(293 세포)이다. 아데노바이러스 벡터 생산을 위해 개발된 바이오리엑터는 높은 용적-특이적 배양 표면적 특징으로 인하여, 높은 생산 세포 밀도 및 높은 바이러스 생산율을 달성할 수 있다. 교반 탱크 바이오리엑터에서 마이크로캐리어 세포 배양액은 매우 높은 용적-특이적 배양 표면적을 제공하여, 바이러스성 백신을 만드는데 이용되고 있다(Griffiths, 1986). 또한, 교반 탱크 바이오리엑터는 산업적인 생산 규모로 확대될 수 있는 것이 입증되었다. Corning-Costar에서 제작된 복수 플레이트 CellcubeTM 세포 배양 시스템 역시 매우 높은 용적-특이적 배양 표면적을 제공한다. 세포는 압착 입방체 모양으로 서로 밀봉된 배양 플레이트의 양면에서 성장한다. 교반 탱크 바이오리엑터와 달리, CellcubeTM 배양 단위는 1회용이다. 이는 임상 산물의 초기 단계 생산에 매우 바람직한데, 그 이유는 1회용 시스템과 연관된 비용 절감, 품질 제어, 품질 보장 비용이 줄어들기 때문이다. 다른 시스템에 의해 제공되는 장점을 고려하여, 아데노바이러스 생산에서 교반 탱크 바이오리엑터와 CellcubeTM 시스템을 평가하였다.
본 발명의 특정 구체예는 혈청-없는 현탁 배양액에서 아데노바이러스를 생성시키는 방법에서 Wave Bioreactor®의 이용을 필요로 한다. Wave Bioreactor®는 값비싼 CIP와 SIP 처리 시설 없이 다양한 무균실 환경에 쉽게 개장될 수 있는 미리-멸균된 1회용 바이오리엑터 시스템이다. Wave Bioreactor®는 Wave Biotech® 모델 20/50EH일 수 있다. 바이오리엑터는 임의 용적의 배지를 수용할 수 있긴 하지만, 특정 구체예에서 바이오리엑터는 10ℓ(5ℓ 작업 용적) 바이오리엑터이다. 특정 구체예에서, 바이오리엑터는 특정 속도와 각도에서 진동하도록 조정될 수 있다. 다른 특정 구체예에서, 바이오리엑터는 용존 산소 분압(DOT) 프로브와 같은 용조 산소 분압을 모니터하는 장치를 보유할 수 있다. 바이오리엑터는 또한, 배지에서 온도를 모니터하는 장치를 보유할 수 있다. 다른 구체예는 배양 pH를 측정하고 조절하는 장치, 예를 들면, 배지에 전달되는 CO2 가스 비율을 조절할 수 있는 가스 혼합기이다.
본 명세서에서, “배지”는 세포의 성장을 조장할 수 있는 임의의 물질을 의미한다. 세포 배양 시스템에 이용될 수 있는 다양한 유형의 배지는 당분야에 공지되어 있다. 본 발명의 특정 구체예에서, 숙주 세포는 혈청-없는 배지에서 성장된다. 본 발명의 다른 구체예에서, 숙주 세포는 단백질-없는 배지에서 성장된다. 단백질-없는 배지의 한가지 실례는 CD293이다. 본 발명의 특정 구체예에서 숙주 세포 성장을 뒷받침할 수 있는 배지의 다른 실례는 DMEM + 2% FBS이다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 세포 성장을 조장하고 조절하기 위하여 다양한 성분과 약품을 배지에 첨가할 수 있다. 가령, 배지의 글루코오스 농도는 일정 수준으로 유지될 수 있다. 본 발명의 아데노바이러스 생산 방법의 한 구체예에서, 글루코오스 농도는 대략 0.5 내지 대략 3.0 gm 글루코오스/ℓ로 유지된다.
1. 고정 의존성 배양 vs. 비-고정-의존성 배양
본 발명의 일부 구체예에서, 아데노바이러스 생산 방법은 고정-의존성 배양액에 숙주 세포를 성장시키는 단계를 필요로 하는 반면, 다른 구체예는 비-고정-의존성 배양액에서 아데노바이러스를 생산하는 방법에 관한다. 동물 및 인간 세포는 시험관내에서 2가지 방식으로 증식될 수 있다; 전체 배양액에서 현탁중에 자유롭게 성장하는 비-고정 의존성 세포로서; 또는 증식을 위하여 고형 서포트(단층 형태의 세포 성장)에 부착을 요하는 고정-의존성 세포로서.
세포 및 세포 생성물의 대량 생산의 가장 일반적으로 이용되는 수단은 연속 확립된 세포주에서 비-고정 의존성 또는 현탁 배양이다. 바이오리엑터는 현탁 배양 시스템에서 빈번하게 이용된다. 하지만, 본 발명에서 바이오리엑터는 고정-의존성 배양에도 이용될 수 있다. 대규모 현탁 배양은 바이러스 벡터 생산에서 이점을 제공할 수 있다. 가령, 이들 공정은 상대적으로 작동 및 규모 확대가 용이하다. 상기한 바와 같이, 용존 산소와 pH와 같은 배양 조건의 정확한 모니터링과 조절이 가능한 바이오리엑터에 균질한 조건이 제공될 수 있다.
2. 바이오리엑터 및 현탁 공정
본 발명의 선택된 구체예에 이용되는 바이오리엑터는 교반 탱크 바이오리엑터이다. 교반 탱크에서 포유류 배양액의 대규모 현탁 배양이 보고되고 있다. 바이오리엑터에 설치와 제어는 관련 미생물 분야에서 발효기 설계에 맞게 개조되었다. 하지만, 포유류 배양액을 서서히 배양시키는데 있어서, 오염 제어에 대한 요구가 증가하기 때문에, 개선된 멸균 설계를 신속하게 이행하여, 이들 반응기의 의존성을 개선시켰다. 설치와 제어 방법은 다른 발효기에서와 근본적으로 동일한데, 교반, 온도, 용존 산소 및 pH 조절 등을 포함한다. 온-라인 및 오프-라인에서 탁도(존재하는 입자에 대한 함수), 용량(존재하는 생존 세포에 대한 함수), 글루코오스/락테이트, 탄산염/중탄산염, 이산화탄소 등을 측정할 수 있는 더욱 개선된 프로브와 자동분석장치를 이용할 수 있다. 본 발명의 한 구체예에서, 자동분석장치는 YSI-2700 SELECTTM 분석기이다.
2가지 현탁 배양 반응기 설계, 교반 반응기 및 공수 반응기는 업계에서 가장 널리 이용되는데, 그 이유는 작동이 간단하고 튼튼하기 때문이다. 교반 반응기 설계는 인터페론 생산을 위한 8000ℓ 용량에서 성공적으로 이용되었다(Phillips et al., 1985; Mizrahi, 1983). 높이:직경 비율이 1:1 내지 3:1인 스테인리스 강 탱크에서 세포를 성장시킨다. 배양액은 일반적으로, 칼날 디스크 또는 수중 프로펠러 패턴에 기초한 한 개 이상의 교반기로 혼합한다. 칼날보다 적은 전단 응력을 제공하는 교반기가 보고되고 있다. 교반은 직접적으로 또는 자석 결합된 드라이브에 의해 간접적으로 이루어진다. 간접 드라이브는 교반기 손잡이에서 밀봉을 통하여 미생물 오염 위험을 줄인다.
본 발명의 특정 구체예에서, 바이오리엑터는 바이오리엑터 내에서 파동(wave motion)을 유도하는 평면 플랫폼의 축성 진동(axial rocking)을 보유한다. 다른 구체예에서, 파동은 폴리에틸렌 비닐 아세테이트와 에틸 비닐 알코올로 만들어진 무균 가방의 내부에 유도된다.
미생물 발효에서 앞서 기술되고 이후 포유류 배양을 위하여 개조된 공수 반응기는 배양액을 혼합하고 산소를 제공하는데 기류를 이용한다. 기류는 반응기의 수직 부분으로 들어가 순환을 유도한다. 기류는 배양 표면에서 해방되어, 기포가 없는 조밀 액체가 바이오리엑터 아래로 이동하도록 한다. 이런 설계의 주요 장점은 간단하고 기계적인 혼합이 필요하지 않다는 점이다. 일반적으로, 높이-직경 비율은 10:1이다. 공수 반응기는 규모 확대가 상대적으로 용이하고 기체의 대량 전달이 양호하며 전단 응력이 상대적으로 적게 발생한다.
대부분의 대규모 현탁 배양은 배치(batch) 또는 피드-배치(fed-batch) 공정으로 작동되는데, 그 이유는 이들이 작동 및 규모 확대에 가장 간단하기 때문이다. 하지만, 물질 환경 조절장치(chemostat) 또는 살포 원리에 기초한 연속 공정을 이용할 수 있다.
배치 공정은 전형적인 성장 프로필이 관찰되는 밀폐 시스템이다. 잠복기는 지수기, 정체기, 감소기로 이어진다. 이런 시스템에서는 영양분이 고갈되고 대사물질이 축적됨에 따라 환경이 지속적으로 변화된다. 이는 세포 성장과 생산성에 영향을 주는 인자를 분석할 수 있어 공정을 최적화시킨다. 주요 영양소의 공급을 조절하여 성장 과정을 연장시킴으로써, 배치 공정의 생산성을 증가시킬 수 있다. 이런 피드-배치(fed-batch) 공정은 세포, 생산물, 폐기물이 제거되지 않기 때문에, 여전히 밀폐 시스템이다.
밀폐 시스템의 경우에, 배양액을 통한 새로운 배지의 살포는 다양한 장치(미세한 메쉬 스핀 필터, 다공성 필터 또는 편평한 플레이트 막 필터, 침강 튜브)로 세포를 유지시켜 달성할 수 있다. 실제 개방 시스템 및 간단한 살포 공정은 배지가 유입되고 세포 및 생성물이 유출되는 물질 환경 조절장치이다. 배양 배지는 반응기로 공급되는데, 이때 공급은 세포의 최대 특정 생산 속도보다는 적은 값(반응기로부터 세포 물질의 유실을 방지하기 위하여)으로 배양액의 희석 비율을 유지시키는 미리 결정된 일정 속도로 수행된다. 세포, 세포 생성물, 부산물을 함유하는 배양 유체는 동일한 속도로 제거된다.
본 발명에 따른 아데노바이러스 생산 방법의 특정 구체예에서, 바이오리엑터 시스템은 배지 교체를 가능하게 하는 시스템을 보유하도록 설치된다. 가령, 배지 교체를 용이하게 하기 위하여 소모된 배지로부터 세포의 분리를 가능하게 하는 필터가 바이오리엑터 시스템에 통합될 수 있다. 본 발명에 따른 아데노바이러스 생산 방법의 일부 구체예에서, 배지 교체와 살포는 세포 성장의 특정일부터 수행된다. 가령, 배지 교체와 살포는 세포 성장의 3일 시점에 시작될 수 있다. 필터는 바이오리엑터의 외부 또는 내부에 위치할 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 필터는 바이오리엑터의 내부에 위치하는 유동 플랫 필터(floating flat filter)이다. 필터는 세포와 소모된 배지의 분리를 제공한다. 특정 구체예에서, 소모된 배양 배지는 유동 필터를 통하여 배출된다. 본 발명의 다양한 구체예에서, 배지의 재순환은 필요할 수도 있고 필요하지 않을 수도 있다. 한 구체예에서, 파동을 이용하여 배지 살포동안 필터의 막힘(clogging)을 최소화시킨다. 배양 용적(culture volume)은 새로운 배지 첨가를 유인하는데 이용되는 로드 셀(load cell)에 의해 유지된다. 배지의 살포에 이용될 수 있는 다양한 유형의 필터 및 필터를 바이오리엑터에 부착시키고 이를 세포 성장 공정에 통합하는데 이용될 수 있는 다양한 방법은 당분야에 공지되어 있다.
3. 비-살포된 부착 시스템
전통적으로, 고정-의존성 세포 배양액은 작은 유리 또는 플라스틱 용기의 바닥에서 증식시킨다. 실험실 규모에 적합한 전통적인 기술에 의해 제공되는 제한된 표면-용적 비율은 대량으로 세포 및 세포 생산물을 생산하는데 방해가 된다. 작은 배양 용적에서 세포 성장을 위한 넓은 표면적을 제공하는 시스템을 제공하기 위하여, 여러 가지 기술이 제안되었다; 롤러 병 시스템(roller bottle system), 적층 플레이트 증식기(stack plates propagator), 나선형 필름 병(spiral film bottles), 공동 섬유 시스템(hollow fiber system), 충전상(packed bed), 플레이트 교환 시스템(plate exchanger system), 막 튜빙 겔(membrane tubing gel). 이들 시스템은 특징상 비-균질성이고, 일부 경우에는 다단계 공정에 기초하기 때문에, 여러 단점이 존재한다 - 규모 확대의 한계, 세포 샘플 획득의 어려움, 주요 공정 모수의 측정과 제어 한계, 배양동안 균일한 환경 조건 유지의 어려움.
이와 같은 단점에도 불구하고, 대규모 고정-의존성 세포 생산에 일반적으로 이용되는 공정은 롤러 병 시스템이다. 상이한 형상의 대형 T-플라스크 형태인 이런 시스템은 단순함으로 인하여 매우 신뢰성있고 매력적이다. 완전 자동화된 로봇이 하루에 수천개의 롤러 병을 처리할 수 있기 때문에, 오염 위험이 줄어들고 집중된 인력이 요구되지 않는다. 배지를 자주 교환하면, 롤러 병 배양으로 0.5× 106 세포/㎠(대략 109 세포/병, 또는 배양 배지 ㎖당 거의 107 세포에 상응)에 근접하는 세포 밀도를 달성할 수 있다.
4. 마이크로캐리어에서 배양
전통적인 고정-의존성 배양 공정의 단점을 극복하려는 시도로, van Wezel(1967)은 마이크로캐리어 배양 시스템 개념을 도입하였다. 이런 시스템에서, 세포는 천천히 교반하여 성장 배지에 부유된 작은 고체 입자 표면에서 증식한다. 세포는 마이크로캐리어에 부착되고 마이크로캐리어 표면에서 합류 수준으로 점진적으로 성장한다. 실제로, 이와 같은 대규모 배양 시스템은 단일 디스크 공정에서 단위 공정으로 부착 의존성 배양을 개량한 것으로, 단위 공정에서는 단층 및 현탁 배양이 동시에 수행된다. 따라서, 세포가 성장하는데 필수적인 표면적을 균질한 현탁 배양의 장점과 복합하여 생산을 증가시킨다.
대부분의 다른 고정-의존성 대규모 배양 방법에 비해 마이크로캐리어 배양의 장점은 다양하다. 첫째, 마이크로캐리어 배양은 높은 표면-용적 비율(캐리어 농도를 변화시켜 다양하게 한다)을 제공하는데, 이는 고밀도 세포 생산율을 제공하고 상당히 농축된 세포 생산물을 얻을 수 있는 가능성을 제공한다. 세포 생산율은 살포된 반응기에서 배양액이 증식되는 경우에 최대 1-2× 107 세포/㎖이다. 둘째, 다수의 낮은-생산성 용기(가령, 플라스크 또는 접시)를 이용하는 대신에 일 단위 공정 용기에서 세포가 증식될 수 있다. 결과적으로, 영양소 이용 효율이 개선되고 배양 배지가 상당히 절감된다. 또한, 단일 반응기에서 증식함으로써 설비 공간, 세포당 요구되는 조작 단계의 수를 줄일 수 있고 노동비용 및 오염 가능성을 줄일 수 있다. 셋째, 잘 혼합된 균질한 마이크로캐리어 현탁 배양으로 환경 조건(pH, pO2 및 배지 성분 등의 농도)을 모니터하고 조절하는 것이 가능하여, 더욱 재현가능한 세포 증식과 생성물 회수를 유도할 수 있다. 넷째, 현미경 관찰, 화학물질 검사, 또는 계산을 위한 대표 샘플을 채취하는 것이 가능하다. 다섯째, 마이크로캐리어는 현탁액으로부터 신속하게 침전하기 때문에, 피드-배치 공정의 이용 또는 세포의 회수가 용이하게 수행될 수 있다. 여섯째, 마이크로캐리어에서 고정-의존성 배양 증식 방식은 단백질분해 효소를 이용하지 않는 세포 전달, 세포의 공배양, 동물로의 이식, 마이크로캐리어를 보유할 수 있는 유리병, 칼럼, 유동화된 침상 또는 동공 섬유를 이용한 배양액의 살포와 같은 다른 세포 조작에 상기 시스템을 이용할 수 있다. 일곱째, 현탁액에서 미생물과 동물 세포 배양에 이용되는 통상의 장비를 이용하여 마이크로캐리어 배양의 규모를 상대적으로 용이하게 증가시킬 수 있다.
5. 포유류 세포의 마이크로포집 반응
포유류 세포를 배양하는데 특히 유용한 한가지 방법은 마이크로포집 반응이다. 포유류 세포는 반투성 하이드로겔 막 내부에 유지된다. 다공성 막이 세포 주변에 형성되어, 영양소, 기체, 대사 생성물과 캡슐 주변의 벌크 배지의 교환이 이루어진다. 부드럽고 신속하며 독성이 없는 여러 방법이 개발되었는데, 생성된 막은 전체 배양 동안에 성장 세포 물질을 유지할 수 있을 만큼 충분히 강하고 다공성이다. 이들 방법은 칼슘-함유 용액과의 액적 접촉으로 겔화된 가용성 알기네이트에 기초한다. Lim(1982, US Patent 4,352,883)은 대략 1% 나트륨 알기네이트에서 농축된 세포를 기술하는데, 이들 세포는 작은 구멍을 통하여 가압되고 액적을 형성하며 대략 1% 염화칼슘 용액으로 자유 분해된다. 이후, 액적은 표면 알기네이트에 이온 결합된 폴리아미노산 층으로 투사된다. 최종적으로, 알기네이트는 칼슘 이온을 제거하는 킬레이트제에서 액적을 처리함으로써 다시 액화된다. 다른 방법은 알기네이트 용액에 한 방울씩 떨어지는 칼슘 용액에서 세포를 이용하여 동공 알기네이트 구를 만든다. 유사한 방법은 알기네이트로 한 방울씩 떨어지는 키토산 용액에서 세포를 이용하여 동공 구를 만드는 단계를 수반한다.
마이크로포집된 세포는 교반 탱크 반응기에서 용이하게 증식되고, 150-1500㎛ 직경의 비드에서, 미세한 메쉬 스크린을 이용한 살포 반응기에서 용이하게 유지된다. 총 배양 용적에 대한 캡슐 용적의 비율은 1:2 내지 1:10으로 유지시킨다. 최대 108의 캡슐내 세포 밀도에서, 배양액에 효과적인 세포 밀도는 1-5× 107이다.
다른 공정에 비해 마이크로포집의 장점은 살포와 교반에서 발생하는 전단 응력의 유해한 효과로부터 보호, 살포 시스템을 이용하기 위한 목적으로 비드를 용이하게 유지하는 능력, 규모 확대의 용이성, 이식용 비드의 이용 가능성 등이다.
본 발명의 일부 구체예는 자연에서 고정-의존성인 세포를 포함한다. 가령, 293 세포는 고정-의존성인데, 현탁 성장하는 경우에 이들 세포는 서로 부착되어 덩어리로 성장하고, 종국에는 배양 조건에 의해 핵 세포를 유지할 수 없을 정도의 크기에 도달하면 각 덩어리의 내부 코어에서 세포를 질식시킨다. 이런 이유로, 이들 세포를 효과적으로 이용하여 다량의 아데노바이러스를 생산하려면 고정-의존성 세포를 대규모로 배양하는 효과적인 수단이 필요하다.
6. 살포된 부착 시스템
본 발명의 특정 구체예는 살포된 부착 시스템을 이용한 아데노바이러스 생산 방법에 관한다. 살포는 세포 집단(물리적 영양 용액의)에서 일정한 속도로 지속적인 흐름을 의미한다. 이는 배양 단위 내에서 세포가 보유된다는 것을 의미하는 것으로, 회수된 배양 배지로 세포를 씻어내는 연속-흐름 배양(가령, 물질 환경 조절장치)과는 반대된다. 살포 개념은 20세기 초반에 도입되었고, 광범위한 현미경 관찰을 위하여 작은 조직 조각을 생존 상태로 유지하는데 이용되고 있다. 상기 기술은 세포에 지속적으로 혈액, 림프 또는 다른 체액 등이 공급되는 in vivo 세포 환경을 모방하도록 개시되었다. 살포를 하지 않으면, 배양액에 있는 세포는 공급과 기아의 반복 과정을 겪게, 되고 성장 및 대사 능력을 충분히 발휘하지 못한다.
현재 이용되는 살포 배양은 고밀도(0.1-5× 108 세포/㎖)로 성장하는 세포의 공격에 대한 반응이다. 2-4× 106 세포/㎖ 이상으로 밀도를 증가시키기 위해서는 영양 결핍을 보충하고 독성 생성물을 제거하기 위하여 배지가 지속적으로 새로운 배지를 교체되어야 한다. 살포는 배양 환경(pH, pO2, 영양 수준 등)을 더욱 효율적으로 조절할 수 있게 하고, 세포 부착을 위한 배양액내 표면적의 이용을 상당히 증가시킨다.
비-편직 침상 매트릭스를 이용한 살포 충전상 반응기의 개발은 침상 용적(bed volume)이 108 세포/㎖을 초과하는 밀도에서 살포 배양액을 유지하는 수단을 제공한다(CelliGenTM, New Brunswick Scientific, Edison, NJ; Wang et al., 1992; Wang et al., 1993; Wang et al., 1994). 간단하게 말하면, 이와 같은 반응기는 고정-의존성 세포 및 비-고정 의존성 세포를 모두 배양하도록 개선된 반응기로 구성된다. 반응기는 내부 재순환 수단을 보유한 충전상으로 설계된다. 적절하게는, 섬유 매트릭스 담체가 반응 용기 내에서 바스켓에 배치된다. 바스켓의 위와 아래 부분에 구멍을 내어, 배지가 바스켓을 통하여 흐를 수 있도록 한다. 특별히 설계된 임펠러는 영양분을 균질하게 공급하고 폐기물을 제거할 수 있도록 섬유 매트릭스에 의해 점유된 공간을 통하여 배지가 재순환되도록 한다. 이는 또한, 적은 양의 전체 세포 물질이 배지에 부유되도록 한다. 바스켓과 재순환 수단의 복합은 섬유 매트릭스를 통하여 산소화 배지의 기포 없는 흐름을 제공한다. 섬유 매트릭스는 10 ㎛ 내지 100 ㎛의 “구멍” 직경을 보유하는 비-편직 섬유로, 개별 세포 용적의 1 내지 20 배에 상응하는 구멍 용적을 보유하는 높은 내부 용적을 제공한다.
다른 배양 시스템에 비하여, 이와 같은 방법은 여러 중요한 이점을 제공한다. 섬유 매트릭스 담체의 경우에, 세포는 교반 및 기포 발생에 기인한 기계적인 스트레스로부터 보호된다. 바스켓을 통하여 자유로운 배지 흐름은 세포에 적절히 조절된 수준의 산소, pH, 영양소를 제공한다. 생성물은 배양액으로부터 지속적으로 제거될 수 있는데, 수득된 생성물은 세포가 없고, 후속의 정제 단계를 용이하게 하는 저-단백질 배지에서 생산될 수 있다. 또한 이와 같은 반응 시스템의 독특한 설계는 반응기 규모를 확대하는데 더욱 용이한 방법을 제공한다. 현재, 최대 30ℓ까지 이용할 수 있다. 100ℓ와 300ℓ반응기가 개발중에 있으며, 이론적으로 계산하면 1000ℓ 반응기까지 규모를 확대할 수 있다. 이런 기술은 WO 94/17178(August 4, 1994, Freedman et al.)에서 상세하게 설명한다.
CellcubeTM(Corning-Costar) 모듈은 기질 부착된 세포의 성장 및 고정을 위한 큰 스티렌 표면을 제공한다. 이는 일련의 병렬 배양 플레이트가 결합되어 인접한 플레이트사이에 얇게 봉해진 박막 흐름 공간이 만들어지는 일체형으로 포집된 멸균 1회용 장치이다.
CellcubeTM 모듈은 서로 대각선 방향으로 마주하고 배지 흐름을 조절하는데 도움을 주는 유입과 유출 포트를 가진다. 성장의 첫 수일동안, 배양액은 초기 접종이후 시스템 내에 유지된 배지에 의해 전반적으로 충족된다. 초기 접종과 배지 살포 시작 사이의 시간은 접종물에서 세포 밀도 및 세포 성장 속도에 좌우된다. 순환 배지에서 영양소 농도를 측정하면 배양 상태를 잘 알 수 있다. 과정을 정립할 때, 다양한 살포 속도에서 영양 조성물을 모니터하여 가장 경제적이고 생산성이 높은 작동 모수를 결정하는 것이 필요하다.
시스템 내에서 세포의 밀도는 통상적인 배양 시스템의 용액 밀도(세포/㎖)보다 높다. 가장 일반적으로 이용되는 기초 배지는 1-2× 106 세포/㎖/day를 지원하도록 설계된다. 85,000㎠ 표면적을 갖는 전형적인 CellcubeTM는 모듈 내에 대략 6ℓ배지를 포함한다. 세포 밀도는 배양 용기에서 107 세포/㎖을 종종 초과한다. 합류 시점에서, 하루에 2-4 반응기 용적의 배지가 필요하다.
배양액의 생산기의 시간 및 모수는 특정 세포주의 유형과 이용에 좌우된다. 많은 배양액은 배양액의 성장기에 요구되는 것과 상이한 배지를 생산기에 요구한다. 한 단계에서 다른 단계로 전이하는 경우에 통상적인 배양에서 복수의 세척 단계를 요구한다. 하지만, CellcubeTM 시스템은 살포 시스템을 이용한다. 이와 같은 살포 시스템의 장점 중의 하나는 다양한 작동 단계 간에 유연한 전이를 제공할 수 있는 능력이다. 살포 시스템은 성장 배지에서 혈청 성분을 제거하기 위한 통상적인 세척 단계를 필요로 하지 않는다.
7. 혈청-없는 현탁 배양
특정 구체예에서, 아데노바이러스 벡터는 숙주 세포(가령, HEK293 세포)로부터 생산된다. 아데노바이러스 벡터 생산의 규모 확대는 293A 세포의 고정-의존성으로 인하여 제한된다. 아데노바이러스 벡터의 생산 규모를 확대하고 추가 수요에 부응하기 위하여, 규모를 확대할 있는 대안적 생산 공정의 개발에 상당한 노력이 경주되고 있다. 이런 방법에는 바이오리엑터에서 H293 세포의 성장 및 숙주 세포의 현탁 배양액으로의 순응이 포함된다.
본 발명의 특정 구체예에서, 아데노바이러스 생산 방법에 이용되는 배지는 혈청-없는 배지이다. 본 발명의 다른 구체예에서, 배지는 단백질-없는 배지이다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 세포 성장을 가능하게 하는 임의의 배지가 본 발명에 이용될 수 있다. 상기한 바와 같이, 본 발명의 특정 구체예는 바이오리엑터의 이용에 관한다. 바이오리엑터는 세포의 혈청-없는 현탁 배양을 위하여 개조될 수 있다. 배지 교체에 의한 배지의 여과는 이런 시스템에 포함되거나 포함되지 않을 수 있다.
D. 바이러스 감염
본 발명은 아데노바이러스로 숙주 세포를 감염시키는 단계를 포함하는 아데노바이러스 생산 방법에 관한다. 전형적으로, 바이러스는 바이러스의 흡입이 가능한 생리학적 조건하에 적절한 숙주 세포에 노출된다. 바이러스 감염을 개시시키는데 이용되는 여러 기술은 당분야에 공지되어 있다.
본 발명의 특정 구체예에서, 숙주 세포의 감염이 수행되는 온도는 37℃이다. 하지만, 다른 구체예에서, 감염 온도는 37℃ 미만의 온도이다. 이는 37℃ 미만의 감염 온도가 아데노바이러스의 최적 생산을 제공한다는 새로운 발견에 기초한다. 따라서, 온도는 예로써 32.1℃, 32.2℃, 32.3℃, 32.4℃, 32.5℃, 32.6℃, 32.7℃, 32.8℃, 32.9℃, 33.0℃, 33.1℃, 33.2℃, 33.3℃, 33.4℃, 33.5℃, 33.6℃, 33.7℃, 33.8℃, 33.9℃, 34.0℃, 34.1℃, 34.2℃, 34.3℃, 34.4℃, 34.5℃, 34.6℃, 34.7℃, 34.8℃, 34.9℃, 35.0℃, 35.1℃, 35.2℃, 35.3℃, 35.4℃, 35.5℃, 35.6℃, 35.7℃, 35.8℃, 35.9℃, 36.0℃, 36.1℃, 36.2℃, 36.3℃, 36.4℃, 36.5℃, 36.6℃, 36.7℃, 36.8℃, 36.9℃, 이로부터 추론될 수 있는 임의의 온도 범위이다. 당분야에 공지된 임의의 방법을 이용하여 세포 배양 배지의 온도를 측정할 수 있다. 배양 배지의 온도를 측정하는데 이용되는 여러 방법은 당분야에 공지되어 있다.
가령, 온도를 간편하게 측정하는 측정할 수 있는 한가지 방법은 배양기 내에서 온도를 측정하는 실시간 디지털 장치를 이용하는 것이다. 이런 과정에 앞서, 디지털 장치는 디지털 장치의 정확도를 검증하는 온도 조정 장치를 이용하여 조정할 수 있다.
본 발명의 특정 구체예에서, 아데노바이러스 생산 방법은 새로운 배지와 새로운 배지와 아데노바이러스로 숙주 세포를 희석함으로써 바이러스 감염을 시작하는 단계를 수반한다. 이는 감염에 앞서 별도의 배체 교체 단계를 필요로 하지 않는다. 본 발명에서 숙주 세포는 임의의 양으로 희석된다. 특정 구체예에서, 숙주 세포는 새로운 배지로 10-배 희석된다. 또한, 본 발명에서 감염을 시작하기 위하여 임의의 양으로 바이러스가 첨가된다. 하지만, 본 발명의 특정 구체예에서, 바이러스 감염은 50 vp/숙주 세포를 첨가함으로써 시작된다.
본 발명의 구체예에서, 바이러스 감염은 임의의 기간동안 진행될 수 있다. 하지만, 특정 구체예에서, 바이러스 감염은 4일동안 진행된다. 본 발명의 다른 구체예에서, 숙주 세포 성장은 한 바이오리엑터에서 진행되고, 숙주 세포의 감염은 두 번째 바이오리엑터에서 진행된다.
본 명세서에서 “아데노바이러스 제조물”은 아데노바이러스로 감염의 시작이후의 반응 혼합물을 의미한다. 아데노바이러스 제조물은 용해된 숙주 세포, 세포 단편, 아데노바이러스, 배지, 감염동안 반응 혼합물에 존재하는 임의의 다른 성분을 포괄한다. 아데노바이러스 제조물은 감염이 얼마나 오랫동안 진행되는 지에 따라 완전한 숙주 세포를 포함할 수 있다. 숙주 세포의 일부 또는 전부가 세포 용해될 수 있는데, 바이러스 입자가 주변 배지로 방출된다. 본 발명에 따른 아데노바이러스 생산 방법의 구체예에서, 아데노바이러스 분리는 감염이후 임의의 시점에서 당업자에게 공지된 임의의 수단으로 수행될 수 있다. 가령, 본 발명의 한 구체예에서, 아데노바이러스 제조물로부터 아데노바이러스 분리는 바이러스 감염이 완결된 이후 4일 시점에 수행된다.
E. 바이러스 벡터의 가공
1. 바이러스 벡터
특정 구체예에서, 발현 구조체의 전달을 위하여 재조합 아데노바이러스가 고려된다. “재조합 아데노바이러스”, “아데노바이러스 벡터” 또는 “아데노바이러스 발현 벡터”는 (a) 구조체의 패키징(packaging)을 뒷받침하고 (b) 클론된 조직 또는 세포-특이적 구조체를 궁극적으로 발현할 만큼 충분한 아데노바이러스 서열을 보유하는 구조체를 의미한다. 재조합 아데노바이러스는 재조합 유전자를 인코딩한다. 따라서, 재조합 아데노바이러스는 아데노바이러스 서열을 포함하는 임의의 가공된 벡터를 보유한다.
본 발명에 따른 아데노바이러스 발현 벡터에는 아데노바이러스의 유전적으로 가공된 형태가 포함된다. 아데노바이러스 벡터의 특성은 본 발명의 성공적인 실시에 중요하지 않은 것으로 생각된다. 아데노바이러스는 임의의 공지된 혈청형 및/또는 소집단 A-F이다. 소집단 C의 아데노바이러스 5형은 본 발명에 이용되는 아데노바이러스 벡터를 획득하기 위한 출발 물질로서 선호된다. 이는 아데노바이러스 5형이 상당한 생화학적, 유전적 정보가 공개된 인간 아데노바이러스이고, 아데노바이러스를 벡터로서 이용하는 대부분의 작제에 역사적으로 사용되어 왔기 때문이다.
아데노바이러스 유전자 전달의 이점은 비-분화 세포를 비롯한 다양한 세포형을 감염시킬 수 있는 능력, 중간-크기 게놈, 조작의 용이성, 높은 감염도, 높은 역가로 성장 능력 등이다(Wilson, 1996). 더 나아가, 숙주 세포의 아데노바이러스 감염은 크로모좀 통합을 유도하지 않는다. 그 이유는 아데노바이러스 DNA가 다른 바이러스 벡터와 연관된 잠재적 유전독성(genetoxicity)없이 에피솜 방식으로 복제할 수 있기 때문이다. 아데노바이러스는 또한, 구조적으로 안정하고(Marienfeld et al., 1999), 광범위한 증폭이후에 게놈 재배치가 관찰되지 않는다(Parks et al., 1997; Bett et al., 1993).
아데노바이러스 성장과 조작은 당업자에게 공지되어 있으며, 시험관내와 생체내에서 넓은 숙주 범위를 보인다(U.S. 특허 5,670,488; 5,932,210; 5,824,544). 이런 바이러스 군은 높은 역가, 예를 들면, ㎖당 109 내지 1011 플라크-형성 단위(plaque-forming unit)로 수득될 수 있고, 고도 감염성이다. 아데노바이러스의 생명 주기는 숙주 세포 게놈으로의 통합을 요하지 않는다. 아데노바이러스에 의해 전달된 외부 유전자는 에피솜으로 존재하기 때문에, 숙주 세포에 낮은 유전독성을 나타낸다.
아데노바이러스 기초한 벡터가 다른 벡터 시스템에 비하여 여러 독특한 이점을 제공하긴 하지만, 이들 벡터는 벡터 면역원성, 재조합 유전자의 삽입에서 크기 제한, 낮은 복제 수준, 낮은 외래도입유전자 발현 수준에 의해 제한된다. 아데노바이러스 벡터를 이용할 때 주요한 문제점은 패키징 세포주에서 벡터 생산 동안 또는 개체의 유전자 요법 치료 동안 복제-콤피던트 바이러스의 발생이다. 복제-콤티던트 바이러스의 발생은 의도하지 않은 바이러스 감염의 심각한 위협 및 환자에 대한 병리학적 결과를 초래할 수 있다.
본 발명의 특정 구체예는 복제-결함성 아데노바이러스를 수반하는 아데노바이러스 생산 방법에 관한다. Armentano 등은 복제-결함성 아데노바이러스 벡터의 제조를 기술하고, 복제-콤피던트 아데노바이러스의 부주의한 발생 가능성을 제거하였다고 주장하였다(U.S. 특허 5,824,544). 상기 복제-결함성 아데노바이러스 방법은 결실된 E1 영역 및 이전된 단백질 IX 유전자를 포함하는데, 여기서 벡터는 이질성 포유동물 유전자를 발현한다.
유전자 전달 벡터로 이용되는 아데노바이러스를 발생시키는 일반적인 방식은 E1 유전자의 결실(E1-)인데, 상기 유전자는 E2, E3, E4 프로모터의 유도에 관여한다(Graham and Prevec, 1995). 후속으로, E1 유전자 대신에 치료 유전자를 재조합 방식으로 삽입할 수 있는데, 여기서 치료 유전자의 발현은 E1 프로모터 또는 이질성 프로모터에 의해 유도된다. 이후, E1-, 복제-결함성 바이러스는 in trans에서 E1 폴리펩티드를 제공하는 “헬퍼” 세포주(가령, 인간 배아 신장 세포주 293)에서 증식시킨다. 대안으로, E3 영역, E4 영역의 일부 또는 둘 모두가 결실되는데, 여기서 진핵 세포에서 작동되는 프로모터의 조절하에 이질성 핵산 서열은 유전자 전달에 이용되는 아데노바이러스 게놈으로 삽입된다(U.S. 특허 5,670,488; 5,932,210).
2. 치료 유전자를 인코딩하는 바이러스 벡터
특정 구체예에서, 본 발명은 아데노바이러스가 재조합 유전자를 인코딩하는 재조합 아데노바이러스인 아데노바이러스 생산 방법에 관한다. 재조합 유전자는 프로모터에 작동가능하게 결합된다. 다른 특정 구체예에서, 재조합 유전자는 치료 유전자이다. 본 발명에서, 질병 또는 유전 질환의 치료에서 치료 가치 또는 잠재적 치료 가치를 보유하는 임의 유전자가 이용될 수 있다. 확인된 넓은 범위의 이들 유전자는 당분야에 공지되어 있다.
일반적으로, 유전자 요법은 치료 유전자(외래도입유전자)의 세포로의 도입을 수반하는데, 외래도입유전자 발현은 질병 또는 유전 질환의 완화 또는 치료를 결과한다. 관련된 치료 유전자는 단백질, 구조 또는 효소 RNA, 안티센스 RNA 또는 DNA와 같은 저해 산물, 또는 임의의 다른 유전자 산물을 인코딩하는 유전자이다. 발현은 이런 유전자 산물의 발생 또는 이런 유전자 산물의 발생의 결과적 효과이다. 따라서, 강화된 발현은 임의의 치료 유전자의 더욱 증가된 생산, 또는 세포, 조직, 장기 또는 생물체의 상태를 결정하는데 있어 이런 산물의 역할 강화를 결과한다. 아데노바이러스 벡터에 의한 치료 유전자의 전달은 세포의 형질도입을 수반한다. 본 명세서에서, 형질도입은 아데노바이러스 또는 관련 벡터에 의한 치료 유전자, 외래도입유전자, 또는 외래도입유전자 구조체의 세포로의 도입으로 정의된다.
유전자 전달 벡터로서 아데노바이러스의 효용을 조사하기 위한 많은 실험, 기술 혁신, 전임상 연구, 임상 시험이 현재 진행되고 있다. 가령, 간 질환(Han et al.,1999), 정신 질환(Lesch, 1999), 신경 질환(Hermens and Verhaagen, 1998), 관상 질환(Feldman et al., 1996), 근육 질환(Petrof, 1998), 결장직장암과 같은 다양한 암(Dorai et al., 1999), 방광(Irie et al., 1999), 전립선(Mincheff et al., 2000), 두경부(Blackwell et al., 1999), 유방(Stewart et al., 1999), 폐(Batra et al., 1999), 난소(Vanderkwaak et al., 1999)에 대한 아데노바이러스 유전자 전달-기초한 유전자 치료법이 개발되었다.
아데노바이러스 벡터에 의해 인코딩되는 특정 치료 유전자는 제한이 없으며, 다양한 치료와 연구 목적에 유용한 유전자; 외래도입유전자의 발현 및 아데노바이러스 벡터 형질도입의 효율을 추적하는데 유용한 리포터 유전자, 리포터 유전자 시스템, 구조체를 포괄한다. 따라서, 예로써 아래의 유전자 부류가 본 발명의 조성물과 방법에 의해 발현이 강화될 수 있다: 발달 유전자(가령, 부착 분자, 사이클린 키나아제 저해물질, Wnt 계통 구성원, Pax 계통 구성원, Winged 나선 계통 구성원, Hox 계통 구성원, 사이토킨/림포카인 및 이들의 수용체, 성장이나 분화 인자 및 이들의 수용체, 신경전달물질 및 이들의 수용체), 종양 유전자(가령, ABLI, BLC1, BCL6, CBFA1, CBL, CSFIR, ERBA, ERBB, EBRB2, ETS1, ETS1, ETV6, FGR, FOX, FYN, HCR, HRAS, JUN, KRAS, LCK, LYN, MDM2, MLL, MYB, MYC, MYCL1, MYCN, NRAS, PIM1, PML, RET, SRC, TAL1, TCL3, YES), 종양 억제 유전자(가령, APC, BRCA1, BRCA2, MADH4, MCC, NF1, NF2, RB1, TP53, WT1), 효소(가령, ACP 디새츄라아제와 하이드록실라아제, ADP-글루코오스 피로포릴라아제, ATPases, 알코올 디하이드로게나아제, 아밀라아제, 아밀로글루코시다아제, 카탈라아제, 셀룰라아제, 사이클로옥시게나아제, 디카르복실라아제, 덱스트리나아제, 에스테라아제, DNA와 RNA 중합효소, 히알루론 합성효소, 갈락토시다아제, 글루카나아제, 글루코오스 옥시다아제, GTPases, 헬리카아제, 헤미셀룰라아제, 히알루로니다아제, 인테그라아제, 인베르타아제, 아이소머라아제, 키나아제, 락토오스, 리파아제, 리폭시게나아제, 리아제, 리소자임, 펙틴스테라아제, 페록시다아제, 포스파타아제, 포스포리파아제, 포스포릴라아제, 폴리갈락투로나아제, 프로테이나아제, 펙티데아제, 풀라나아제, 리콤비나아제, 역전사효소, 토포아이소머라아제, 자일라나아제), 리포터 유전자(가령, 녹색 형광 단백질 및 이의 색깔 변이체, 루시페라아제, CAT 리포터 시스템, 베타-갈락토시다아제 등), 혈액 유도체, 호르몬, 림포카인(사이토킨 포함), 인터페론, TNF, 성장 인자, 신경전달물질 또는 이의 전구물질 또는 합성 효소, 영양 인자(가령, BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, 등), 아포지단백(가령, ApoAI, ApoAIV, ApoE 등), 디스트로핀(dystrophin) 또는 미니디스트로픽(minidystrophic), 종양 억제 유전자(가령, p53, Rb, Rap1A, DCC, k-rev 등), 응고에 관여하는 인자(가령, 인자 VII, VIII, IX 등)를 코딩하는 유전자, 자살 유전자(가령, 티미딘 키나아제), 시토신 디아미나아제, 또는 자연이나 인공 면역글로불린의 전체 또는 일부(Fab, ScFv 등). 치료 유전자의 다른 실례는 fus, 인터페론 α, 인터페론 β, 인터페론 γ, ADP(아데노바이러스 사멸 단백질) 등이다.
치료 유전자는 표적 세포에서 발현이 세포 유전자의 발현 또는 세포 mRNA의 전사가 조절되도록 하는 안티센스 유전자 또는 서열, 예를 들면, 리보자임일 수도 있다. 이런 서열은 예로써 표적 세포에서, 세포 mRNA에 상보적인 RNA로 전사될 수 있다. 표적 유전자는 인간에서 면역 반응을 발생시킬 수 있는 항원성 펩티드를 코딩하는 유전자일 수도 있다. 이런 특정 구체예에서, 본 발명은 인간을 특히 미생물과 바이러스로부터 면역할 수 있는 백산의 생산을 가능하게 한다.
종양 억제 유전자는 과도한 세포 증식을 저해하는 기능을 한다. 이들 유전자의 불활화는 이들의 저해 활성을 파괴하여 무절제한 증식을 초래한다. 종양 억제 유전자 p53, p16, C-CAM은 아래에 기술한다.
p53은 종양 억제 유전자로 인정되고 있다. 화학적 종양발생, 자외선 조사, SV40을 비롯한 여러 바이러스에 의해 형질전환된 많은 세포에서 높은 수준의 돌연변이 p53이 발견되었다. p53 유전자는 다양한 인간 종양에서 돌연변이 불활화의 주요 표적으로, 인간에서 주로 발생하는 암에서 가장 빈번하게 돌연변이된 유전자로 알려져 있다. 이는 인간 NSCLC(Hollestein et al., 1991)의 50% 이상 및 다양한 범위의 다른 종양에서 돌연변이된다.
p53 유전자는 대형-T 항원 및 E1B와 같은 숙주 단백질과 복합체를 형성할 수 있는 393-아미노산 인산단백질을 인코딩한다. 상기 단백질은 정상 조직 및 세포에서도 발견되긴 하지만 형질전환된 세포 또는 종양 조직에서 발견되는 것에 비하여 그 농도가 낮다. 흥미롭게도, 야생형 p53은 세포 성장과 분열을 조절하는데 중요한 역할을 하는 것으로 보인다. 일부 경우에 야생형 p53은 과발현되어 인간 종양 세포주에서 항-증식성을 제공하기도 한다. 따라서, p53은 세포 성장의 음성 조절물질로 작용하고(Weinberg, 1991), 무절제한 세포 성장을 직접적으로 억제하거나 이와 같은 성장을 억제하는 유전자를 간접적으로 활성화시킨다. 따라서, 야생형 p53의 부재 또는 불활화는 형질전환의 원인이 될 수 있다. 하지만, 일부 연구에서는 유전자의 형질전환 잠재력을 완전하게 발현하는데 돌연변이 p53의 존재가 필수적임을 암시한다.
야생형 p53은 많은 세포형에서 중요한 성장 조절물질로서 인정되고 있다. p53 유전자에서 미스센스 돌연변이는 일반적이며, 종양유전자의 형질전환 능력에 필수적이다. 점 돌연변이에 의해 촉발된 단일 유전자 변이는 발암성 p53을 발생시킬 수 있다. 다른 종양유전자와 달리, p53 점 돌연변이는 적어도 30개의 별개 코돈에서 발생되는 것으로 알려져 있는데, 가끔은 동형접합성으로의 환원없이 세포 표현형을 변화시키는 우성 대립형질을 만든다. 또한, 이들 우성 네가티브 대립형질의 대부분은 생물체에서 관용되고 생식세포계열로 전달되는 것으로 보인다. 다양한 돌연변이 대립형질은 최소한 기능이상에서부터 강력한 침입성 우성 네가티브 대립유전자의 범위로 나타난다(Weinberg, 1991).
본 발명에 이용될 수 있는 다른 종양 유전자는 BRCA1, BRCA2, zac1, p73, MMAC-1, ATM, HIC-1, DPC-4, FHIT, NF2, APC, DCC, PTEN, ING1, NOEY1, NOEY2, PML, OVCA1, MADR2, WT1, 53BP2, IRF-1 등이다. 본 발명에 이용될 수 있는 다른 유전자는 Rb, APC, DCC, NF-1, NF-2, WT-1, MEN-I, MEN-II, zac1, p73, VHL, MMAC1 /PTEN, DBCCR-1, FCC, rsk-3, p27, p27/p16 융합, p21/p27 융합, 항-혈전증 유전자(가령, COX-1, TFPI), PGS, Dp, E2F, ras, myc, neu, raf, erb, fms, trk, ret, gsp, hst, abl, E1A, p300, 혈관형성에 관여하는 유전자(가령, VEGF, FGF, 트롬보스폰딘, BAI-1, GDAIF, 또는 이들의 수용체), MCC 등이다.
특정 구체예에서, 아데노바이러스에는 mda-7 유전자인 외인성 유전자 구조체가 포함된다. MDA-7은 p53-야생형, p53-무표지(null), p53-변이체인 암 세포의 성장을 억제할 수 있는 것으로 밝혀진 다른 추정 종양 억제자이다. 또한, p53 무표지 세포에서 아폽토시스-관련된 Bax 유전자의 관찰된 상향조절은 MDA-7이 암 세포의 파괴를 유도하기 위하여 p53-독립된 기전을 이용할 수 있음을 암시한다.
여러 연구에서, MDA-7의 상승된 발현이 암 세포 성장을 시험관내에서 억제하고 인간 유방암 세포에서 아폽토시스를 선택적으로 유도할 뿐만 아니라 누드 생쥐에서 종양 성장을 저해하는 것으로 밝혀졌다(Jiang et al., 1996; Su et al., 1998). Jiang 등(1996)은 MDA-7이 유방, 중추 신경계, 경부, 결장, 전립선, 연결 조직을 비롯한 다양한 기관의 암 세포에서 강력한 성장 억제 유전자라고 보고하였다. 콜로니 저해 검사에서, MDA-7의 상승된 발현은 인간 경부 암종(HeLa), 인간 유방 암종(MCF-7과 T47D), 결장 암종(LS174T와 SW480), 비강인두암(nasopharyngeal carcinoma)(HONE-1), 전립선 암종(DU-145), 흑색종(HO-1과 C8161), 다형성아교모세포종(glioblastoma multiforme)(GBM-18과 T98G), 골육종(osteosarcoma)(Saos-2)에서 성장 저해를 강화시킨다는 것으로 입증되었다. 정상 세포(HMECs, HBL-100, CREF-Trans6)에서 MDA-7 과다발현은 제한된 성장 저해를 보였는데, 이는 MDA-7 외래도입유전자가 정상 세포에서 드러나지 않는다는 것을 암시한다. 종합하면, 상기 데이터는 MDA-7의 상승된 발현에 의한 성장 저해가 정상 세포에서보다 암 세포에서 시험관내에서 더욱 유효하다는 것을 암시한다. Su 등(1998)은 MDA-7가 암 세포 성장을 억제하는 기전에 관한 조사 결과를 보고하였다. 여러 연구에서, 유방암 세포주 MCF-7과 T47D에서 MDA-7의 이소 발현은 정상 HBL-100 세포에 대한 효과없이, 세포 주기 분석과 TUNEL 검사에서 아폽토시스를 유도하는 것으로 보고되었다. 아데노바이러스 MDA-7(“Ad-MDA-7”)로 감염된 세포로부터 세포 용해질의 웨스턴 블랏 분석 결과는 아폽토시스 촉진 단백질 BAX의 상향 조절을 보였다. Ad-MDA-7 감염은 MCF-7과 T47D 세포에서만 BAX 단백질의 수준을 상승시키고 정상 HBL-100 또는 HMEC 세포에서는 이의 수준을 상승시키지 않았다. 이들 데이터에 기초하여, MCF-7 종양 세포의 이종이식편 종양 형성에 대한 ex vivo Ad-MDA-7 형질도입의 효과를 평가하였다. Ex vivo 형질도입은 종양 이종이식편 모델에서 종양 형성과 진행을 저해하였다. 이들 특징은 MDA-7이 PKR의 유도인자 및 유도된 면역 반응의 강화인자로서 폭넓은 치료, 전조, 진단 잠재력을 보유한다는 것을 암시한다.
다양한 효소 유전자 역시 치료 유전자로 고려된다. 발현에 특히 적합한 유전자는 개체 포유동물의 표적 세포에서 정상 수준 미만으로 발현되는 것으로 생각되는 유전자이다. 특히 유용한 유전자 산물의 실례는 카바모일 합성효소 I, 오르니틴 트랜스카바밀라아제, 아르기노숙시네이트 합성효소, 아르기노숙시네이트 리아제, 아르기나아제 등이다. 다른 바람직한 유전자 산물은 푸마릴아세토아세테이트 하이드롤라아제, 페닐알라닌 하이드록실라아제, 알파-1 안티트립신, 글루코오스-6-포스파타아제, 저-밀도-지단백 수용체, 포르포빌리노겐 디아미나아제, 인자 VIII, 인자 IX, 시스타티원 β-합성효소, 분지쇄 케토산 디카르복실라아제, 알부민, 이소발레릴-CoA 디하이드로게나아제, 프로피오닐 CoA 카르복실라아제, 메틸 말로닐 CoA 뮤타아제, 글루타릴 CoA 디하이드로게나아제, 인슐린, 베타-글루코시다아제, 피루베이트 카르복실라아제, 헤파틱 포스포릴라아제, 포스포릴라아제 키나아제, 글리신 디카르복실라아제(P-단백질), H-단백질, T-단백질, 멘케스병(Menkes disease) 구리-전달 ATPase, 윌슨병(Wilson's disease) 구리-전달 ATPase 등이다. 유전자 산물의 다른 실례는 시토신 디아미나아제, 하이폭산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라아제, 갈락토오스-1-포스페이트 우리딜트랜스퍼라아제, 페닐알리닌 하이드록실라아제, 글루코세르브로시다아제, 스핑고미엘리나아제, α-L-이두로니다아제, 글루코오스-6-포스페이트 디하이드로게나아제, HSV 티미딘 키나아제, 인간 티미딘 키나아제 등이다. 호르몬은 본원에 기술된 벡터에 이용될 수 있는 다른 유전자 군이다. 여기에는 성장 호르몬, 프롤락틴, 태반 락토겐, 황체화 호르몬, 여포-자극 호르몬, 융모성 성선자극호르몬, 갑상선-자극 호르몬, 렙틴, 부신피질자극호르몬(adrenocorticotropin, ACTH), 안지오텐신 I, 안지오텐신 II, β-엔도르핀, β-멜라닌세포 자극 호르몬(β-MSH), 콜레시스토키닌(cholecystokinin), 엔도텔린 I, 갈라닌(galanin), 위 억제 펩티드(GIP), 글루카곤, 인슐린, 리포트로핀(lipotropin), 뉴우로피신(neurophysin), 소마토스타틴, 칼시토닌, 칼시토닌 유전자 관련된 펩티드(CGRP), β-칼시토닌 유전자 관련된 펩티드, 악성 인자(1-40)의 고칼슘혈증(hypercalcemia), 부갑상선 호르몬-관련된 단백질(107-139)(PTH-rP), 부갑상선 호르몬-관련된 단백질(107-111)(PTH-rP), 글루카곤-유사 펩티드(GLP-1), 판크레아스타틴(pancreastatin), 췌장 펩티드, 펩티드 YY, PHM, 세크레틴(secretin), 혈관작동성 장 펩티드(VIP), 옥시토신, 바소프레신(AVP), 바소톡신, 엔케팔린아마이드(enkephalinamide), 메토르핀아마이드(metorphinamide), 알파 멜라닌세포 자극 호르몬(알파-MSH), 심방 나트륨배설 인자(atrial natriuretic factor)(5-28)(ANF), 아밀린(amylin), 아밀로이드 P 성분(SAP-1), 부신피질 자극호르몬 방출 호르몬(corticotropin releasing hormone, CRH), 성장 호르몬 방출 인자(GHRH), 황체화 호르몬-방출 호르몬(LHRH), 뉴로펩티드 Y, 물질 K(뉴로키닌 A), 물질 P, 또는 갑상선자극호르몬 분비촉진 호르몬(thyrotropin releasing hormone, TRH) 등이다. 본 발명의 벡터에 삽입될 수 있는 다른 종류의 유전자는 인터루킨 및 사이토킨을 포함한다. 인터루킨 1(IL-1), IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, GM-CSF, G-CSF.
현재 바이러스 벡터를 이용할 수 있는 질병의 실례에는 아데노신 디아미네이즈 결핍증, 혈우병 B에서 인간 혈액 응고 인자 IX 결핍증, 방광 섬유증(방광 섬유증 전도 조절 유전자의 치환과 관련됨) 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 본 발명에서 구현된 벡터는 혈관형성 저해물질 또는 세포 주기 저해물질을 인코딩하는 유전자의 전달로, 류마티스 관절염 및 재협착증과 같은 과증식성 질환을 치료하는데 이용될 수도 있다. HSV-TK 유전자와 같은 프로드럭(prodrug) 활성물질의 전달 역시 암을 비롯한 과증식성 질환을 치료하는데 이용될 수 있다.
3. 안티센스 구조체
ras, myc, neu, raf, erb, src, fms, jun, trk, ret, gsp, hst, bcl, abl과 같은 종양유전자 역시 적절한 표적이 된다. 하지만, 치료요법적 이점을 위하여, 이들 종양유전자은 안티센스 핵산으로 발현되어 종양유전자의 발현을 저해한다. “안티센스 핵산”은 종양유전자를 인코딩하는 DNA 및 RNA 염기서열에 상보적인 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 표적 세포로 도입된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산에 특이적으로 결합하여 전사, RNA 프로세싱, 수송 및/또는 번역을 방해한다. 올리고뉴클레오티드로 이중 가닥(ds) DNA를 표적하면 삼중 나선이 형성되고, RNA를 표적하면 이중 나선이 형성된다.
안티센스 구조체는 프로모터, 다른 조절 영역, 엑손, 인트론 또는 유전자의 엑손-인트론 경계에 결합되도록 설계된다. 안티센스 RNA 구조체 또는 이런 안티센스 RNA를 인코딩하는 DNA를 이용하면 in vitro 또는 in vivo에서 숙주 동물 세포내에서, 예를 들면, 인간을 비롯한 숙주 동물 내에서 유전자 전사 또는 번역 또는 둘 모두를 저해할 수 있다. “상보적인 뉴클레오티드”를 포함하는 핵산 서열은 표준 Watson-Crick 상보성 규칙에 따라 염기쌍을 이룰 수 있다. 즉, 큰 퓨린은 작은 피리미딘과 염기쌍을 형성하여 구아닌은 시토신과 염기쌍을 이루고(G:C), 아데닌은 DNA의 경우에 티민과 염기쌍을 이루고(A:T), RNA의 경우에 우라실과 염기쌍을 이룬다(A:U).
본 명세서에서, “상보적인” 또는 “안티센스 서열”은 전장을 통하여 실질적으로 상보적이고 염기 미스매치(mismatch)가 거의 존재하지 않는 핵산 서열을 의미한다. 가령, 15개 염기의 핵산 서열은 단일 또는 이중 미스매치가 존재하고 13개 또는 14개 위치에서 상보적인 뉴클레오티드가 존재하는 경우에 상보적이라고 한다. “완전히 상보적인” 핵산 서열은 전장을 통하여 완전하게 상보적이고 염기 미스매치가 존재하지 않는 핵산 서열이다.
유전자 서열의 전부 또는 일부를 안티센스 작제에 이용하면, 통계학적으로 17개 염기 길이의 임의 서열만이 인간 게놈에서 발생되는데, 이는 독특한 표적 서열을 특정할 만큼 충분하다. 더욱 짧은 올리고머가 만들기에 용이하고 in vivo에서 접근성이 좋지만, 혼성화반응의 특이성을 결정하는 데에는 수많은 다른 인자가 관련된다. 이의 상보적인 표적에 대한 올리고뉴클레오티드의 결합 친화성 및 서열 특이성은 길이가 증가함에 따라 증가된다. 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 그 이상의 염기쌍을 갖는 올리고뉴클레오티드가 이용될 수 있다. 내생 유전자의 기능이 영향을 받는지 또는 상보적인 서열을 갖는 관련 유전자의 발현이 영향을 받는지를 결정하기 위하여 in vitro에서 구조체를 검사함으로써, 일정한 안티센스 핵산이 상응하는 숙주 세포 유전자를 효과적으로 표적하는 지를 용이하게 결정할 수 있다.
특정 구체예에서, 다른 요소를 보유하는 안티센스 구조체, 예를 들면, C-5 프로핀 피리미딘을 보유하는 안티센스 구조체를 이용할 수 있다. 우리딘 및 시티딘의 C-5 프로핀 유사체를 보유하는 올리고뉴클레오티드는 높은 친화성으로 RNA에 결합하고 유전자 발현의 강력한 안티센스 저해물질인 것으로 밝혀졌다(Wagner et al., 1993).
표적화된 안티센스 전달의 대안으로서, 표적화된 리보자임이 이용될 수 있다. “리보자임”은 종양유전자 DNA 및 RNA에서 특정 염기 서열을 표적하고 절단할 수 있는 RNA계 효소를 의미한다. 리보자임은 리보자임 서열을 통합하는 RNA 올리고뉴클레오티드의 형태로 세포에 직접 표적되거나, 또는 원하는 리보자임 RNA를 인코딩하는 발현 구조로서 세포에 도입될 수 있다. 안티센스 핵산에서 설명한 바와 동일한 방식으로 리보자임을 이용하고 적용할 수 있다.
4. 백신에 대한 항원
다른 치료요법 유전자에는 바이러스 항원, 박테리아 항원, 곰팡이 항원 또는 기생충 항원과 같은 항원을 인코딩하는 유전자가 포함된다. 바이러스에는 피코르나바이러스(picornavirus), 코로나바이러스(coronavirus), 토가바이러스(togavirus), 플라비르비루(flaviviru), 라브도바이러스(rhabdovirus), 파라믹소바이러스(paramyxovirus), 오르소믹소바이러스(orthomyxovirus), 부니아바이러스(bunyavirus), 아렌바이러스(arenvirus), 레오바이러스(reovirus), 레트로바이러스(retrovirus), 파포바바이러스(papovavirus), 파르보바이러스(parvovirus), 허피스바이러스(herpesvirus), 폭스바이러스(poxvirus), 헵파드나바이러스(hepadnavirus), 스폰지폼바이러스(spongiform virus) 등이 포함된다. 적절한 바이러스 표적에는 인플루엔자, 허피스 심플렉스 바이러스 1과 2, 홍역, 천연두, 소아미비, HIV 등이 포함된다. 병인에는 파동편모충(trypanosome), 촌충, 회충, 기생충 등이 포함된다. 또한, 태아 항원 또는 전립선 특이 항원과 같은 종양 표식이 이와 같은 방식으로 표적될 수 있다. 바람직한 실례는 HIV env 단백질 및 B형 간염 표면 항원 등이 포함된다. 본 발명에 따른 백신용 벡터를 투여하기 위해서, 벡터-관련 항원은 강한 면역 반응이 용구되는 외래도입유전자의 장기 발현을 가능하게 할 만큼 충분히 비-면역원성이어야 한다. 적절하게는, 개체의 예방접종은 1년에 1회 또는 2년에 1회 정도면 충분하고, 감염성 물질에 대한 장기적인 면역학적 보호를 제공한다.
5. 조절 영역
바이러스 벡터가 치료 유전자를 인코딩하는 전사체를 효과적으로 발현시키도록 하기 위하여, 치료 유전자를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 프로모터와 폴리아데닐화 신호의 전사 조절하에 위치시킨다. 이런 이유로, 본 발명의 특정 구체예는 프로모터에 작동가능하게 결합된 외인성 유전자 구조체를 인코딩하는 아데노바이러스 벡터를 아데노바이러스가 포함하는 아데노바이러스 생산 방법에 관한다. “프로모터”는 유전자의 특정 전사를 개시하는데 필요한 숙주 세포의 합성 기작 또는 도입된 합성 기작에 의해 인지되는 DNA 서열을 의미한다. 폴리아데닐화 신호는 번역에서 전사체의 적절한 프로세싱 및 핵에서 세포질로의 트래픽킹(trafficking)을 위하여 mRNA 전사체의 말단에 일련의 뉴클레오티드를 첨가하는데 필요한 숙주 세포의 합성 기작 또는 도입된 합성 기작에 의해 인지되는 DNA 서열을 의미한다. “작동가능하게 결합된”, “조절하에”, “전사 조절하에”는 프로모터가 폴리뉴클레오티드에서 정확한 위치에 정위하여 RNA 중합효소 개시 및 폴리뉴클레오티드 발현을 조절한다는 것을 의미한다.
본 명세서에서, 프로모터는 RNA 중합효소 II의 개시 부위 주변에 모여 있는 일군의 전사 조절 모듈을 의미한다. 프로모터가 어떻게 조직화되는 지에 대한 대부분의 생각은 HSV 티미딘 카이나제(tk), SV40 초기 전사 단위에 대한 프로모터를 비롯한 여러 바이러스 프로모터의 분석 결과로부터 유래된다. 최근 연구에 의해 강화된 이들 연구 결과는 프로모터가 별개의 기능을 하는 모듈로 구성되고, 이들 각각이 약 7-20 bp DNA로 구성되고 전사 활성물질 또는 단백질 억제물질에 대한 한가지 이상의 인지 부위를 보유한다.
각 프로모터에서 적어도 하나의 모듈은 RNA 합성을 위한 시작 부위를 확인하는 기능을 한다. 이의 가장 잘 알려진 실례는 TATA 박스이지만, TATA가 없는 일부 프로모터, 예를 들면, 포유류 말단 디옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라아제 유전자와 SV40 후기 유전자의 프로모터에서는 시작 부위와 겹치는 별도의 요소가 개시 부위에 고정되는 것을 돕는다.
추가 프로모터 요소는 전사 개시 빈도를 조절한다. 일반적으로, 이들은 시작 부위에서 30-110bp 상류에 위치하지만, 상당수의 프로모터는 시작 부위 하류에 기능 요소를 보유하는 것으로 최근에 밝혀졌다. 프로모터 요소간의 공간은 유동적이기 때문에 요소가 서로 역으로 되었거나 이동할 수 있으면 프로모터의 기능은 보존된다. tk 프로모터에서, 프로모터 요소간의 공간은 50bp까지 증가시킬 수 있지만, 이를 벗어나면 활성이 감소된다. 프로모터에 따라, 개별 요소는 공조하거나 또는 독립적으로 전사를 활성화시키는 역할을 한다.
표적 세포에서 폴리뉴클레오티드를 발현시킬 수 있다면, 치료 유전자의 발현을 조절하는데 이용되는 특정 프로모터는 중요한 것으로 생각되지는 않는다. 프로모터는 조직-특이적 프로모터 또는 유도성 프로모터이다. 이용될 수 있는 프로모터의 실례는 SV40 EI, RSV LTR, β-액틴, CMV-IE, 아데노바이러스 주요 후기, 폴리오마 F9-1, α-태아 단백질 프로모터, egr-1, 또는 티로시나아제 프로모터이다. 치료 유전자의 발현을 조절하는데 이용될 수 있는 프로모터는 당분야에 공지되어 있다. 따라서, 인간 세포를 표적하는 경우에, 인간 세포에서 발현될 수 있는 프로모터의 조절하에 폴리뉴클레오티드 코딩 영역을 인접하게 위치시키는 것이 바람직하다. 일반적으로, 이런 프로모터에는 인간 또는 바이러스 프로모터가 포함된다. 프로모터 목록은 표 1에 기재한다.
Figure 112005065171975-PCT00001
프로모터는 구조성 프로모터, 유도성 프로모터, 또는 조직-특이적 프로모터이다. 유도성 프로모터로 유도성 물질이 존재하는 경우를 제외하고 불활성이거나 낮은 활성을 보이는 프로모터이다. 본 발명에 포함되는 프로모터의 일부 실례에는 MT II, MMTV, 콜라게나제, 스트로멜리신, SV40, 뮤린 MX 유전자, α-2-마크로글로블린, MHC 클래스 I 유전자 h-2kb, HSP70, 프로리페린, 종양 괴사 인자, 또는 흉선 자극 호르몬 α유전자 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 연관된 인듀서(inducer)는 표 2에 기재한다. 본 발명의 실시에 임의의 유도성 프로모터가 이용될 수 있는데, 이들 프로모터 모두 본 발명의 범위에 속한다. “내인성” 또는 “구조성” 프로모터는 코딩 분절 및/또는 엑손의 상류에 위치한 5' 비-코딩 서열을 분리함으로써 수득되는 유전자 또는 서열과 자연적으로 결합된 프로모터이다.
Figure 112005065171975-PCT00002
다양한 구체예에서, 인간 사이토메갈로바이러스(CMV) 극초기 유전자 프로모터, SV40 초기 프로모터 및 라우스 살코마 바이러스 긴 말단 반복부위를 이용하여 원하는 폴리뉴클레오티드를 높은 수준으로 발현시킬 수 있다. 폴리뉴클레오티드를 발현시키기 위하여 당분야에 공지된 다른 바이러스 프로모터, 포유류 세포 프로모터 또는 박테리아 파지 프로모터를 이용할 수 있는데, 발현 수준이 성장 저해 효과를 달성할 수 있을 만큼 충분해야 한다.
공지의 특성을 갖는 프로모터를 이용하여, 트랜스펙션이후에 폴리뉴클레오티드의 발현 수준과 패턴을 최적화시킬 수 있다. 가령, 특정 세포에서 활성을 갖는 프로모터, 예로 들면, 티로시나제(흑색종), 알파-피토단백질과 알부민(간 종양), CC10(폐 종양), 전립선-특이적 항원(전립선 종양)의 선별은 치료 유전자의 조직 특이적인 발현을 가능하게 한다.
초기에, 인헨서는 동일한 DNA 분자에서 별도의 위치에 존재하는 프로모터로부터 전사를 증가시키는 유전 요소로서 감지되었다. 상당한 거리에서 활동하는 이의 능력은 원핵세포 전사 조절의 연구에서는 거의 전례가 없었다. 후속 연구에서 인헨서 활성을 갖는 DNA 부분은 프로모터와 유사하게 조직화되는 것으로 밝혀졌다. 다시 말하면, 이들은 많은 개별 요소로 구성되고, 이들 각각은 하나이상의 전사 단백질에 결합된다.
인헨서와 프로모터의 근본적인 차이는 작동에 있다. 전체적으로 인헨서 영역은 일정 거리에서 전사를 자극할 수 있다; 프로모터 영역 또는 이의 구성 요소에서는 반드시 그렇지는 않다. 한편, 프로모터는 특정 부위에서 특정 방향으로 RNA 합성의 개시를 유도하는 하나 이상의 요소를 보유해야 하는 반면, 인헨서는 이와 같은 특이성이 없다. 프로모터와 인헨서는 종종 겹쳐지고 인접하며 매우 유사한 모듈 조직을 갖는 것으로 보인다.
또한, 임의의 프로모터/인헨서 조합(Eukaryotic Promoter Data Base(EPDB)) 역시 특정 구조체의 발현을 유도하는데 이용될 수 있다. T3, T7 또는 SP6 세포질 발현 시스템의 이용은 다른 가능한 구체예이다. 적절한 박테리오파지 중합효소가 전달 복합체의 일부로서 또는 추가의 유전가 발현 벡터로서 제공된다면, 특정 박테리오파지 프로모터로부터 세포질 전사를 지원할 수 있다.
cDNA 삽입체를 이용하는 경우에, 유전자 전사체의 적절한 폴리아데닐화를 수행하기 위하여 폴리아데닐화 신호를 포함하는 것이 바람직하다. 폴리아데닐화 신호의 특징은 본 발명의 성공적인 실시에 그다지 중요하지 않으며, 임의의 서열이 이용될 수 있다. SV40, 소 성장 호르몬, 허피스 심플렉스 바이러스 티미딘 카이나제 유전자로부터 유래된 것과 같은 폴리아데닐화 신호는 다수의 표적 세포에서 기능하는 것으로 밝혀졌다.
F. 아데노바이러스를 분리하는 방법
아데노바이러스가 감염되면, 감염된 세포는 용해된다. 아데노바이러스 감염의 용해 특징은 2가지 서로 다른 양식의 바이러스 분리와 생산을 가능하게 한다. 한가지 양식은 세포 용해에 앞서 감염 세포를 수집하는 것이다. 다른 양식은 생산된 바이러스에 의한 완전한 세포 용해이후 바이러스 상층액을 수집하는 것이다. 후자의 경우에, 세포를 완전하게 용해하기 위하여 더 많은 배양 시간을 요한다. 바이러스 감염이후 이런 연장된 배양 시간은 특히 현 1세대 아데노바이러스 벡터(E1-결손된 벡터)에 대한 복제 콤피던트 아데노바이러스(RCA)의 발생 가능성에 관한 심각한 우려를 초래한다. 이런 이유로, 본 발명의 특정 구체예에서, 아데노바이러스 생산 방법은 숙주 세포를 수집하고, 이후 숙주 세포를 용해시키는 단계를 수반한다. 표 3에는 세포 수집이후 세포를 용해하는데 이용되는 가장 일반적인 방법을 기재한다.
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1. 계면활성제
본 발명의 특정 구체예에서, 아데노바이러스 생산 방법은 계면활성제로 숙주 세포를 용해시킴으로써 아데노바이러스를 분리하는 단계를 수반한다. 세포는 막에 결합되어 있다. 세포 성분을 방출시키기 위해서는 세포를 개방해야 한다. 이를 달성할 수 있는 가장 유리한 방법은 계면활성제를 이용하여 막을 용해시키는 것이다. 계면활성제는 지방 또는 방향족 특성의 비극성 말단 및 전하를 띄거나 띄지 않는 극성 말단을 갖는 양쪽성 분자이다. 계면활성제는 지질보다 친수성이기 때문에 지질보다 높은 물 용해도를 보유한다. 이는 수성 배지에 불수용성 화합물의 분산을 가능하게 하고, 자연 형태로 단백질을 분리하고 정제하는데 이용된다.
숙주 세포를 용해시킬 수 있는 임의의 계면활성제가 본 발명에 이용될 수 있다. 세포를 용해시키는데 이용가능한 넓은 범위의 계면활성제는 당분야에 공지되어 있다.
계면활성제는 변성 또는 비-변성이다. 전자는 도데실 설페이트 나트륨과 같은 음이온이거나 에틸 트리메틸 암모늄 브로마이드와 같은 양이온성이 될 수 있다. 이들 계면활성제는 막을 완전하게 분해하고, 단백질-단백질 상호작용을 파괴하여 단백질을 변성시킨다. 비-변성 계면활성제는 TritonR X-100과 같은 비-음이온성 계면활성제, 콜레이트와 같은 담즙염, CHAPS와 같은 양쪽성 계면활성제로 세분할 수 있다. 양쪽성은 동일 분자에 양이온과 음이온 기를 모두 포함하며, 양성 전하는 동일 또는 인접 분자에 있는 음성 전하에 의해 중화된다.
SDS와 같은 변성 계면활성제는 단량체로서 단백질에 결합하는데, 포화될 때까지 반응은 평형화된다. 따라서, 단량체의 유리 농도를 알면 필요한 계면활성제 농도를 알 수 있다. SDS 결합은 공조 방식을 취한다, 다시 말하면, 단백질에 SDS 한 분자가 결합하게 되면 다른 분자가 단백질에 결합할 가능성이 증가하게 되고 단백질이 막대형으로 변형되어 길이가 분자량에 비례하게 된다.
TritonR X-100과 같은 비-변성 계면활성제는 고유 형태에 결합하지도 공조 결합 기전을 취하지도 않는다. 이들 계면활성제는 견고하고 큰 비극성 부분을 보유하기 때문에, 수용성 단백질에 침투할 수 없다. 이들은 단백질의 소수성 부분에 결합한다. TritonR X100 및 다른 폴리옥시에틸렌 비-음이온성 계면활성제는 단백질-단백질간의 상호작용을 파괴하는데 무효하고 단백질의 인위적인 응집을 유도할 수 있다. 이들 계면활성제는 단백질-지질 상호작용을 파괴하지만 훨씬 점진적이고 단백질의 고유 형태와 기능을 유지할 수 있다.
여러 방법으로 계면활성제를 제거할 수 있다. 단량체로 존재하는 계면활성제는 투석을 이용한다. 쉽게 응집되어 미셀을 형성하는 계면활성제에는 투석이 다소 무효한데, 그 이유는 미셀이 너무 커서 투석을 통과할 수 없기 때문이다. 이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 이런 문제를 우회할 수 있다. 파괴된 단백질 용액은 이온 크로마토그래피 칼럼에 적용하고, 칼럼은 계면활성제가 없는 완충액으로 세척한다. 계면활성제 용액과 완충액 간에 평형이 이루어지면 계면활성제가 제거된다. 대안으로, 단백질 용액을 밀도 구배에 통과시킬 수 있다. 단백질이 밀도 구배를 통하여 침전되면, 계면활성제는 화학적 전위로 인하여 빠져나오게 된다.
세포에서 발견되는 단백질 환경을 분석하고 단백질을 용해하는데 있어서 한 가지 계면활성제로는 불충분하다. 단백질을 한가지 계면활성제에 용해시키고 단백질 분석용으로 적절한 다른 계면활성제에 위치시킨다. 제 1 단계에서 형성된 단백질 계면활성제 미셀은 순수한 계면활성제 미셀로부터 분리되어야 한다. 이들을 과량의 분석용 계면활성제에 첨가하면, 단백질은 이들 두 계면활성제를 포함하는 미셀에서 발견된다. 계면활성제-단백질 미셀의 분리는 이온 교환 또는 겔 여과 크로마토그래피, 투석 또는 부유(buoyant) 밀도 분리를 이용하여 달성할 수 있다.
a. Triton R X-계면활성제: 이런 종류의 계면활성제(TritonR X-100, X114, NP-40)는 동일한 기본 특징을 갖지만 특이적인 소수성-친수성 특성에서 차별된다. 이들 이형 계면활성제 모두 방향족 고리에 부착된 분지형 8-탄소 사슬을 보유한다. 분자에서 상기 부분은 계면활성제의 소수성 특징에 가장 많이 기여한다. TritonR X 계면활성제를 이용하여 비-변성 조건하에 막 단백질을 용해시킨다. 단백질을 용해시키기 위한 계면활성제의 선택은 용해되는 단백질의 소수성 특징에 좌우된다. 소수성 단백질은 이들을 효과적으로 용해하기 위하여 소수성 계면활성제를 요구한다.
TritonR X-100 및 NP-40은 구조 및 소수성에 있어서 매우 유사하고, 세포 용해, 탈지질 단백질 분해, 막 단백질 및 지질 용해 등을 비롯한 대부분의 분야에 상호 교환될 수 있다. 일반적으로, 1 ㎎ 막 단백질을 용해시키는데 2 ㎎ 계면활성제가 이용되거나, 또는 지질 막 1 ㎎당 10 ㎎ 계면활성제가 이용된다. TritonR X-114는 친수성 단백질에서 소수성 부분을 분리하는데 이용된다.
b. Brij R 계면활성제: 이들은 TritonR X 계면활성제와 구조상으로 유사한데, 소수성 사슬에 부착된 폴리옥시에틸렌 길이가 다양하다. 하지만, TritonRX 계면활성제와 달리, BrijR 계면활성제는 방향족 고리를 보유하지 않으며 탄소쇄 길이가 변할 수 있다. 투석을 이용하여 용액으로부터 BrijR 계면활성제를 제거하는 것은 어렵지만 계면활성제 제거 겔에 의해 제거될 수 있다. BrijR58은 소수성/친수성 특성에서 TritonRX100에 가장 근접하다. BrijR-35는 HPLC 과정에 일반적으로 이용되는 계면활성제이다.
c. 투석가능 비이온성 계면활성제: η-옥틸-β-D-글루코시드(옥틸글루코피라노시드)와 η-옥틸-β-D-티오글루코시드(옥틸글루코피라노시드, OTG)는 용액으로부터 용이하게 투석되는 비변성 비이온성 계면활성제이다. 이들 계면활성제는 막 단백질을 용해하는데 이용되고 280㎚에서 낮은 UV 흡수도를 가진다. 옥틸글루코시드는 23-25 mM의 높은 CMC를 보유하고, 막 단백질을 용해하는 경우에 1.1-1.2% 농도로 이용된다.
옥틸글루코시드에 대안을 제공하기 위하여 옥틸티오글루코시드를 먼저 합성하였다. 옥틸글루코시드는 제조 단가가 비싸고, β-글루코시다제에 의해 가수분해될 수 있기 때문에 생물학적 시스템에서 일부 문제점이 내재한다.
d. Tween R 계면활성제: TweenR 계면활성제는 비변성 비이온성 계면활성제이다. 이들은 지방산 폴리옥시에틸렌 솔비탄 에스테르이다. TweenR 20 및 TweenR 80 계면활성제는 생화학 분야에서 차단제로 이용되고, 단백질 용액에 첨가되어 플라스틱 또는 니트로셀룰로오스와 같은 소수성 물질에 비특이적으로 결합하는 것을 방지한다. 이들은 ELISA 및 블랏팅에서 차단제로 이용된다. 일반적으로, 이들 계면활성제는 소수성 물질에 대한 비특이적인 결합을 방지하기 위하여 0.01-1.0% 농도로 이용된다.
TweenR 20 및 다른 비이온성 계면활성제는 니트로셀룰로오스 표면으로부터 일부 단백질을 제거하는 것으로 밝혀졌다. TweenR 80은 막 단백질을 용해시키고 다중웰 플라스틱 조직 배양 플레이트에 단백질의 비특이적인 결합을 제공하며 ELISA에서 폴리스테렌 플레이트에 대한 혈청 단백질과 비오틴화된 단백질 A의 비특이적인 결합을 감소시키는데 이용된다.
계면활성제간의 차이는 지방산 사슬 길이에 기인한다. TweenR 80은 C18 사슬의 올레산에서 유도되고, TweenR 20은 C12 사슬의 라우린산에서 유도된다. 지방산 사슬이 길어질수록 TweenR 20 계면활성제보다 친수성이 덜한 TweenR 80 계면활성제가 만들어진다. 이들 2가지 계면활성제 모두 물에 잘 용해된다.
TweenR 계면활성제는 투석을 이용하여 용액으로부터 제거하기가 어렵지만, TweenR 20은 계면활성제 제거 겔에 의해 제거될 수 있다. 이들 계면활성제에서 발견되는 폴리옥시에틸렌 사슬은 이들을 산화되도록 하는데(과산화물 형성), 이는 TritonRX 및 BrijR 계면활성제에도 적용된다.
c. 양쪽성 계면활성제: 양쪽성 계면활성제, CHAPS는 콜린산의 설포베탄 유도체이다. 이런 양쪽성 계면활성제는 단백질 활성이 중요한 경우에, 막 단백질을 용해시키는데 유용하다. 이와 같은 계면활성제는 광역의 pH 범위(2-12)에서 유용하고, 높은 CMCs(8-10mM)로 인하여 투석에 의해 용액으로부터 용이하게 제거된다. 이와 같은 계면활성제는 280㎚에서 흡수도가 낮기 때문에, 상기 파장에서 단백질 모니터링이 필요한 경우에 유용하다. CHAPS는 BCA 단백질 검사와 양립하고, 계면활성제 제거 겔에 의해 용액으로부터 제거될 수 있다. CHAPS 존재하에 단백질은 요오드화될 수 있다.
CHAPS를 이용하여 고유 막 단백질과 수용체를 용해시키고 단백질의 기능 성능을 유지시킬 수 있다. 사이토크롬 P-450을 TritonR X-100 또는 콜레이트 나트륨에서 용해시키면 응집체가 형성된다.
2. 비-계면활성제 방법
적절하지는 않지만, 다양한 비-계면활성제 방법이 본 발명의 다른 특징과 병용될 수 있다.
a. 냉동-해동: 이는 점진적이고 효과적인 방법으로 세포를 용해하는데 널리 이용되는 기술이다. 세포는 완전하게 동결될 때까지 드라이아이스/에탄올 용액조에서 일반적으로 급속하게 냉동되고, 이후 완전하게 해동될 때까지 37℃ 용액조로 옮겨진다. 이런 주기를 수회 반복하여 세포를 완전하게 용해시킨다.
b. 초음파분쇄: 세포를 파괴하는데 고진동수 초음파 진동기가 유용하다. 초음파가 세포를 파괴하는 방법은 완전하게 밝혀지지는 않았지만, 현탁액에 초음파 진동을 제공하면 높은 전이 압력(transient temperature)이 발생된다. 이런 기술의 주요 단점은 상당량의 열이 발생된다는 점이다. 열 효과를 최소한으로 줄이기 위하여, 특별히 설계된 유리 용기를 이용하여 세포 현탁액을 보유한다. 이와 같은 설계는 현탁액이 초음파 프로브에서 용기 외부로 순환하도록 하는데, 플라스크가 얼음에 부유됨에 따라 현탁액이 냉각된다.
c. 고압 압출: 미생물 세포를 파괴하는데 이 방법이 주로 이용된다. 프렌치 프레스 셀은 세포를 파괴하기 위해 10.4× 107 Pa(16,000 p.s.i) 압력을 이용한다. 이들 장치는 바늘 밸브에 의해 외부로 개방되는 스테인리스 강 챔버로 구성된다. 세포 현탁액은 바늘 밸브가 닫힌 상태에 있는 챔버에 넣는다. 챔버를 뒤집은 이후, 밸브를 열고 피스톤을 눌러 챔버내에 있는 공기를 빼낸다. 밸브가 닫힌 상태에서, 챔버는 원래 위치로 회복되고 고체 베이스 위에 놓이며, 유압 프레스를 이용하여 피스톤에 필요한 압력을 가한다. 일정 압력에 도달하면, 바늘 밸브는 부분적으로 개방하여 압력을 약간씩 방출하고, 이에 따라 세포가 확장되어 파열된다. 압력이 유지되는 동안 밸브를 열린 상태로 유지되고, 소량의 파열된 세포가 수집된다.
d. 고체 전단 방법: 500㎚ 직경의 유리 비드 존재하에 현탁액을 활발하게 진동시키는(300-3000 time/min) Mickle 교반기에서 연마제로 기계적 전단을 달성할 수 있다. 이와 같은 방법은 기관 손상을 유발할 수 있다. 더욱 조절된 방법은 Hughes 프레스를 이용하는 것인데, 여기서 피스톤은 압력 챔버에서 0.25 ㎜ 직경 슬롯을 통하여 연마제 또는 세포의 고냉동 페이스트와 함께 대부분의 세포를 압박한다. 세균 준비물을 용해시키는 데에는 최고 5.5× 107 Pa(8000p.s.i.)가 이용된다.
e. 액체 전단 방법: 이들 방법은 고속 왕복 또는 회전 날을 이용하는 배합기; 상하로 움직이는 플랜져와 볼을 이용하는 균질화기; 작은 직경 튜브를 통한 고속 통과 또는 2가지 유체 흐름의 고속 충돌을 이용하는 마이크로유동화기 또는 충돌 제트를 이용한다. 배합기의 날이 서로 다른 각도로 기울기어 있어 효과적인 혼합이 가능하다. 일반적으로, 균질화기는 열 발생을 최소화시키기 위하여 수초의 짧은 고속 집중으로 작동된다. 이들 기술은 미생물 세포에는 적합하지 않지만, 매우 점진적인 액체 전단도 동물 세포를 파괴시키는데 적합하다.
f. 저장성/고장성 용액 방법: 세포는 매우 낮은(저장성) 또는 매우 높은(고장성) 용질 농도를 갖는 용액에 노출시킨다. 용질 농도에서 차이는 삼투압 압력 구배를 발생시킨다. 저장성 환경에서 세포에 물이 유입되면 세포가 팽창되고 파열된다. 고장성 환경에서 세포 밖으로 물이 유출되면 세포가 위축되고, 결과적으로 파열된다.
G. 농축 및 여과 방법
본 발명은 아데노바이러스 분리를 수반하는 아데노바이러스 생산 방법에 관한다. 숙주로부터 아데노바이러스를 분리하는 방법은 당업자에게 공지된 임의의 방법을 포함한다. 가령, 이들 방법에는 정화, 농축, 정용여과(diafiltration) 등이 포함된다. 정제 과정의 1 단계에서는 세포 용해물을 정화하여 대형 미립자, 특히 세포 성분을 세포 용해물로부터 제거한다. 용해물의 정화는 심층 필터(depth filter)를 이용하거나 접선방향 이동 여과로 달성할 수 있다. 본 발명의 적절한 구체예에서, 세포 용해질은 농축된다. 가공되지 않은 세포 용해물의 농축은 당업자에게 공지된 임의의 단계를 수반한다. 가령, 가공되지 않은 세포 용해물은 상대적으로 비-흡수성 재료(가령, 폴리에스테르 수지, 모래, 규조토, 콜로이드, 겔 등)의 밀집된 칼럼으로 구성되는 심층 필터에 통과시킨다. 접선방향 흐름 여과(TFF)에서, 용해물 용액은 막 표면을 가로질러 흐르는데, 이는 막 표면으로부터 벌크 용액으로 용질의 역 확산을 조장한다. 일반적으로, 막은 개방 채널 플레이트와 프레임, 동공 섬유, 세관 등을 보유하는 다양한 유형의 필터 장치 내에 배열된다.
세포 용해물의 정화와 선여과이후, 생성된 바이러스 상층액은 농축시키고, 완충액은 정용여과에 의해 교환된다. 바이러스 상층액은 100-300K 분획 분자량((nominal molecular weight cut-off)의 한외여과 막을 통한 접선 이동 여과에 의해 농축될 수 있다. 한외여과는 분자 크기, 모양 및/또는 전하에 의해 종류를 구분할 수 있는 반투막을 이용하는 압력-변형된 대류 공정이다. 이는 용질 분자 크기와 상관없이, 다양한 크기의 용질로부터 용매를 분리한다. 한외여과는 점진적이고 효율적이며 용액을 동시에 농축하고 탈염시키는데 이용될 수 있다. 일반적으로, 한외여과 막은 2개의 별개 층을 보유한다: 10-400Å의 구멍 크기를 갖는 얇고(0.1-1.5 ㎛) 밀집된 외피 및 한외필터의 침투면에 거의 개방되는 점진적으로 확대되는 구멍의 개방 하부구조. 따라서, 외피의 구멍을 통과할 수 있는 임의의 화학종은 막을 자유롭게 통과할 수 있다. 용질을 최대로 유지하기 위하여, 유지하고자 하는 종류의 분획 분자량 미만의 분획 분자량을 보유하는 막이 선택된다. 거대분자를 농축하는 경우에, 막은 원하는 생물종을 다량 함유하고, 유지된 물질이 없는 여과물을 제공한다. 미세용질은 대류에 의해 용매와 함께 제거된다. 유지된 용질의 농도가 증가함에 따라, 한외여과 속도가 감소한다.
본 발명의 일부 구체예는 가공되지 않은 세포 용해물의 교환 완충액의 이용에 관한다. 완충액 교환, 또는 한외필터를 이용한 정용여과(diafiltration)는 염, 당의 제거와 교환, 결합된 화학종으로부터 유리 화학종의 비-수용성 용매 분리, 저분자량 물질 제거, 또는 이온과 pH 환경의 신속한 변화에 이상적인 방법이다. 미세용질은 한외여과 속도와 동등한 속도로 한외여과되는 용액에 용질을 첨가함으로써 가장 효과적으로 제거된다. 이는 일정한 용적에서 용액으로부터 미세종(microspecies)을 씻어내고, 유지된 종을 정제한다.
H. 핵산 오염물질의 제거
본 발명에 따른 아데노바이러스 생산 방법의 특정 구체예는 가공되지 않은 용해물에서 오염 핵산의 농도를 감소시키는 단계에 관한다. 본 발명은 오염 핵산을 제거하기 위하여 뉴클레아제를 이용한다. 전형적인 뉴클레아제는 Benzonaser, PulmozymeR, 또는 당분야에서 통상적으로 이용되는 임의의 다른 DNase 또는 RNase 등이다.
BenzonaseR와 같은 효소는 핵산을 분해하고 단백질 분해활성이 없다. 핵산을 신속하게 가수분해하는 BenzonaseR는 세포 용해물 점도를 줄이는데 이상적인 효소이다. 핵산은 바이러스와 같은 세포 유래된 입자에 부착되는 것으로 널리 알려져 있다. 응집, 입자 크기 변화 또는 입자 하전 변화로 인하여 흡착이 분리를 방해하면, 일정한 정제 과정으로 회수되는 생성물은 거의 없다. BenzonaseR은 정제 동안에 핵산 적하를 감소시키고, 따라서 간섭을 줄이고 수득율을 개선하는데 특히 적합하다.
모든 엔도뉴클레아제에서처럼, BenzonaseR는 특정 뉴클레오티드 사이에 내부 포스포디에스테르 결합을 가수분해한다. 완전히 분해된 이후, 용액에 존재하는 모든 유리 핵산은 2 내지 4개 염기 길이의 올리고뉴클레오티드로 축소된다.
I. 정제 기술
본 발명의 특정 구체예는 아데노바이러스를 정제하는 단계를 수반하는 아데노바이러스 생산 방법에 관한다. 본 발명에서 발생된 아데노바이러스는 당업자에게 공지된 임의의 방법으로 정제할 수 있다. 특정 구체예에서, 특이적인 정제 기술이 이용된다. 이들 기술은 아래에 기술한다.
1. 밀도 구배 원심분리
밀도 구배 원심분리에는 2가지 방법, 속도 구역 기술(rate zonal technique) 및 등밀도(isopycnic) 기술이 있는데, 이들 양 방법은 입자 혼합물에서 모든 성분의 정량적 분리가 요구되는 경우에 이용될 수 있다. 또한, 부유 밀도를 측정하거나 침강 상수를 측정할 경우에도 이용된다.
속도 구역 기술에 의한 입자 분리는 크기 또는 침강 속도에서 차이에 기초한다. 이 기술은 수행된 액체 밀도 구배의 상부에 샘플 용액을 조심스럽게 얹는 단계를 수반하는데, 이런 구배의 최대 밀도는 분리되는 최대 조밀 입자의 밀도를 초과한다. 이후, 샘플은 원하는 수준으로 분리될 때까지, 다시 말하면, 입자가 이런 구배를 통하여 이동하여 입자의 상대적인 속도에 따라 이격된 별도 구역 또는 밴드를 형성할 수 있을 만큼 충분한 시간동안 원심분리한다. 이런 기술은 시간 의존성이기 때문에, 원심분리는 임의 분리된 지역이 튜브의 바닥에 펠렛을 형성하기 이전에 종결되어야 한다. 이런 방법은 효소, 호르몬, RNA-DNA 하이브리드, 리보솜 아단위, 부세포 기관의 분리, 폴리솜 샘플의 크기 분포 분석, 리포프로테인 분획에 이용된다.
샘플은 분리될 입자 밀도의 전체 범위에 걸쳐있는 연속적인 밀도 구배의 상부에 얹는다. 따라서, 구배의 최대 밀도는 가장 조밀한 입자의 밀도보다 항상 커야 한다. 원심분리 동안, 입자의 부유 밀도 및 구배 밀도가 같아질 때까지(즉, 방정식 2.12에서 Pp = Pm) 입자는 침전된다. 원심분리를 얼마나 오랫동안 지속하는 지와 상관없이, 이 시점에서 더 이상의 침전은 발생하지 않는데, 그 이유는 이들 입자가 자체의 밀도보다 큰 밀도를 갖는 재료 완충물에 부유하기 때문이다.
속도 구역 기술과는 대조적으로, 등밀도 원심분리는 균형 방법으로, 입자는 응집하여 특징적인 부유 밀도에서 각각 구역을 형성한다. 입자 혼합물에서 모든 성분이 필요하지는 않는 경우에, 혼합물에서 원하지 않는 성분은 원심분리 튜브 바닥으로 침전되고, 반면에 원하는 입자는 각각의 등밀도 위치에 침전되도록 하는 구배 범위를 선택할 수 있다. 이와 같은 기술은 속도 구역과 등밀도 방법의 조합을 수반한다.
등밀도 원심분리는 입자의 크기와 모양이 아닌 입자의 부유 밀도에 좌우되고 시간과는 무관하다. 매우 유사한 밀도(가령, 수크로오스 용액에서 p = 1.3g ㎝-3)를 보유하는 가용성 단백질은 이와 같은 방법으로 분리할 수 없는 반면에, 부세포 기관(가령, 수크로오스 용액에서 골지체, p = 1.11g ㎝-3; 미토콘드리아, p = 1.19g ㎝-3; 페록시솜, p = 1.23g ㎝-3)은 효과적으로 분리할 수 있다.
분리할 입자 혼합물을 미리 형성된 구배에 올려놓는 대안으로서, 샘플은 먼저 균질한 밀도의 용액을 제공하는 구배 매체와 혼합하는데, 구배는 원심분리 동안 침강 균형에 의해 자체적으로 형성된다. 이와 같은 방법(평형 등밀도 방법)에서, 중금속(가령, 세슘 또는 루비듐), 수크로오스, 콜로이드성 실리카 또는 메트리자마이드 염이 일반적으로 이용된다.
샘플(DNA)은 예로써, 염화세슘 농축액과 균질하게 혼합한다. 농축된 염화세슘 용액을 원심분리하면, CsCl 분자가 침전되어 농도 구배 및 밀도 구배가 형성된다. 초기에 튜브 전체에 균질하게 분포된 샘플 분자(DNA)는 용액 밀도가 이들의 부유 밀도에 동등한 부위(즉, 이들이 합쳐져 구역을 형성하는 등밀도 부위)에 도달할 때까지 상승하거나 침전한다. 이와 같은 기술은 평형을 확립하기 위하여 매우 긴 원심분리 시간(가령, 36 내지 48시간)을 요구하는 단점이 있다. 하지만, 이는 입자의 부유 밀도를 측정하고 이중 가닥 DNA의 염기 조성을 결정하며 원형 DNA에서 선형 DNA를 분리하기 위한 분석용 원심분리에 통상적으로 이용된다. 대장균(E. coli)에서 DNA 복제 기작을 밝히기 위하여 Leselson과 Stahl이 이용한 기술인 생합성동안에 동위요소(가령, 15N)의 통합에 의해, 또는 중금속 이온 또는 브롬화 에티듐과 같은 염료의 결합에 의해, 상이한 형태의 DNA간의 밀도차를 증가시킴으로써 분리 방법을 개선할 수 있다. 등밀도 구배는 바이러스를 분리하고 정제하며 인간 혈장 리포프로테인을 분석하는 데에도 이용된다.
2. 크로마토그래피
본 발명의 특정 구체예에서, 크로마토그래피를 이용하여 아데노바이러스를 정제한다. 아데노바이러스는 1회 이상의 크로마토그래피 단계에 적용한다. 정제 기술은 정제 기술은 당분야에 공지되어 있다. 이들 기술은 혼합물의 다른 성분으로부터 아데노바이러스 입자를 분리하기 위한 세포 환경을 분획을 수반한다. 다른 성분으로부터 아데노바이러스 입자를 분리하면, 아데노바이러스는 크로마토그래피 및 전기영동 기술을 이용하여 완전한 정제를 달성한다. 본 발명의 순수한 아데노바이러스 입자를 준비하는데 특히 적합한 분석 방법은 이온-교환 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동이다. 본 발명에 이용될 수 있는 특히 효율적인 정제 방법은 HPLC이다.
본 발명의 한 특징은 아데노바이러스 입자의 정제, 특정 구체예에서 아데노바이러스 입자의 실질적인 정제에 관한다. 본 명세서에서, “정제”는 다른 성분으로부터 분리될 수 있는 조성물을 의미하는데, 여기서 아데노바이러스 입자는 자연 상태에서 수득되는 형태에 비하여 임의의 수준으로 정제된다. 따라서, 정제된 아데노바이러스 입자는 자연적으로 발생되는 환경에는 없는 아데노바이러스 성분을 의미한다.
일반적으로, “정제된”은 다양한 다른 성분을 제거하기 위하여 분획된 아데노바이러스 입자를 의미하는데, 이의 조성물은 발현된 생물학적 활성을 실질적으로 보유한다. “실질적으로 정제된”은 입자, 단백질 또는 펩티드가 조성물의 주요 성분을 형성하는, 예를 들면, 조성물 구성물질의 대략 50% 또는 그 이상을 구성하는 조성물을 의미한다.
단백질 또는 펩티드의 정제 정도를 정량화하는 다양한 방법은 본 발명의 설명에 기초하여 당업자에게 명백하다. 이들 방법에는 활성 분획물의 특이 활성을 결정하거나, 또는 SDS/PAGE 분석으로 분획물 내에서 폴리펩티드의 양을 측정하는 것이 포함된다. 분획물의 순도를 평가하는 적절한 방법은 분획물의 특이 활성을 계산하고 최초 추출물의 특이 활성과 계산된 활성을 비교하며 순도 정도(“-배 정제 횟수”)를 계산한다. 활성 양을 나타내는데 이용되는 실제 단위는 정제이후 선택된 특정 검사 기술 및 발현된 단백질 또는 펩티드가 감지가능한 활성을 보이는 지에 좌우된다.
아데노바이러스가 가장 순수한 형태로 제공되어야 한다는 일반적인 규정은 없다. 실제로, 특정 구체예에서 실질적으로 순도가 떨어지는 생성물이 이용된다. 더욱 적은 정제 단계를 조합으로 이용하거나 동일한 정제 과정의 다른 형태를 이용하여 부분적으로 정제할 수 있다. 가령, HPLC 장치를 이용하여 수행된 양이온-교환 칼럼 크로마토그래피는 저압 크로마토그래피 시스템을 이용한 동일한 기술보다 몇 배 높은 순도를 결과한다. 상대적으로 낮은 수준의 정제를 보이는 방법은 단백질 산물의 전체 회수 또는 발현된 단백질의 활성 유지에 유리하다.
물론, 본 발명의 아데노바이러스 벡터에 의해 발현되는 단백질을 정제하는데 당분야에 공지된 크로마토그래피 기술 및 다른 정제 방법 역시 이용될 수 있다. 아데노바이러스 입자를 정제하는데 이용되는 예시적인 정제 기술은 아래에 기술된 이온 교환 크로마토그래피 및 고성능 액체 크로마토그래피이다.
이온-교환 크로마토그래피: 이온-교환 크로마토그래피의 기본 원리는 교환기(exchanger)에 대한 물질의 친화성이 재료의 전기적인 성질 및 용매에서 다른 하전된 물질의 상대적인 친화성에 조우된다는 것이다. 결합된 물질은 pH를 변경하여 재료의 하전을 변경함으로써, 또는 예로써 염과 같은 경쟁 물질을 첨가하여 용출할 수 있다. 다른 물질은 다른 전기적인 성질을 갖기 때문에, 각 결합된 분자종(molecular species)에서 방출 조건이 다양하다. 일반적으로, 효과적인 분리를 위하여 선택될 수 있는 방법은 연속 이온 강도 구배 용출 또는 단계적 용출이다(pH 구배 단독은 별로 이용되지 않는데, 그 이유는 이온 강도를 동시에 증가시키지 않으면서 pH 구배를 설정하는 것이 어렵기 때문이다). 음이온 교환기의 경우에, pH와 이온 강도가 점진적으로 증가하거나 이온 강도만 증가한다. 양이온 교환기의 경우에, pH와 이온 강도 모두 증가한다. 용출 과정은 안정성을 고려하여 시행착오를 통하여 선택하는 것이 바람직하다. 가령, 불안정한 물질의 경우에는 pH를 항상 일정하게 유지하는 것이 바람직하다.
이온 교환기는 이온이 전기적으로 결합된 화학적으로 결합된 하전기를 보유하는 고체이다; 이는 수용액에 있는 이온과 이들 이온을 교환할 수 있다. 이온 교환기는 칼럼 크로마토그래피에 이용하여 전하에 따라 분자를 분리할 수 있다; 실제로, 분자의 다른 특징도 중요한데, 그 이유는 크로마토그래피 행동이 전하 밀도, 전하 분포 및 분자 크기에 민감하기 때문이다.
이온 교환 크로마토그래피의 원리는 하전된 분자가 이온 교환기에 가역적으로 흡수되어, 이온 환경을 변화시킴으로써 분자를 결합시키거나 용출시키는 것이다. 이온 교환기에서 분리는 일반적으로 2단계로 달성된다; 첫째, 분리할 물질을 안정적이고 견고한 결합을 제공하는 조건하에서 교환기에 결합시킨다; 이후, 상이한 pH, 이온 강도, 또는 조성의 완충액으로 칼럼을 용출하고, 완충액의 이들 성분을 결합 부위에 대하여 결합 재료와 경쟁시킨다.
이온 교환기는 일반적으로, 공유결합된 하전 기를 보유하는 3차원 매트릭스 또는 네트워크이다. 기(基)가 음전하를 갖는 경우에, 이는 양이온을 교환하는 양이온 교환기가 된다. 양이온 교환기에 이용되는 전형적인 기는 SO3 -이다. H+ 이온이 기(基)에 결합되는 경우에, 교환기는 산 형태라고 한다; 이는 예로써, 1개의 Na+에 대하여 1개의 H+, 또는 1개의 Ca2+에 대하여 2개의 H+를 교환할 수 있다. 설폰산 기는 강산 양이온 교환기라고 한다. 다른 통상적으로 이용되는 기는 하이드록시 페놀 및 카르복시 페놀인데, 이들은 모두 약산 양이온 교환기이다. 하전된 기가 양성, 예를 들면, 4가 아미노기인 경우에, 이는 강염기 음이온 교환기이다. 가장 일반적으로 이용되는 약염기 음이온 교환기는 방향족 또는 지방족 아미노기이다.
매트릭스는 다양한 재료로 만들어 질 수 있다. 가장 일반적으로 이용되는 재료는 덱스트란, 셀룰로오스, 아가로즈, 스티렌과 폴리비닐벤젠의 공중합체인데, 여기서 디비닐벤젠은 폴리스테렌 가닥을 모두 교차 결합시키고 하전 기를 보유한다. 표 4에서는 많은 이온 교환기의 조성을 제공한다.
이온 교환기의 총 용량은 건조 중량 ㎎당 교환가능 기를 수용하는 능력의 척도가 된다. 상기 수치는 제조업자에 의해 제공되며, 용량이 초과되면 이온이 결합 없이 칼럼을 통과한다는 점에서 상당히 중요하다.
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이용가능 용량은 특정 실험 조건(즉, pH, 이온 강도)하에 용량이다. 가령, 이온 교환기가 하전되는 정도는 pH에 좌우된다(pH의 효과는 강한 이온 교환기에서 축소된다). 다른 인자는 이온 강도인데, 그 이유는 하전된 기 주변에 작은 이온들이 이들 기에 대하여 동일 분자와 경쟁하기 때문이다. 이런 경쟁은 샘플이 거대 분자인 경우에 상당히 효과적인데, 그 이유는 작은 이온의 더욱 높은 확산 상수가 더욱 많은 수의 충동을 의미하기 때문이다. 분명한 점은 완충액의 농도가 증가할수록 경쟁이 더욱 심해진다는 점이다.
매트릭스의 다공성 역시 중요한 인자인데, 그 이유는 하전된 기가 매트릭스의 내외에 모두 위치하고, 매트릭스가 분자체로서 또한 기능하기 때문이다. 큰 분자는 구멍을 통과할 수 없다; 따라서, 분자 크기가 증가되면 용량이 감소한다. 폴리스테렌계 수지의 다공성은 디비닐벤젠에 의한 교차 결합의 양으로 결정된다(디비닐벤젠의 양이 증가되면 다공성이 감소된다). Dowex와 AG 시리즈에서, 디비닐벤젠 비율은 X 다음의 수치로 나타내는데, 예로써 Dowex 50-X8은 8% 디비닐벤젠이다.
이온 교환기는 입자 크기, 즉 메쉬 크기가 다양하다. 미세해진 메쉬는 증가된 표면적-용적 비율을 의미하고, 따라서 일정한 용적의 교환기에서 교환이 진행되는 증가된 용량과 감소된 시간을 의미한다. 한편, 미세한 메쉬는 느린 유동 속도를 의미하는데, 이는 확산 퍼짐(diffusional spreading)을 증가시킬 수 있다. 대략 10 ㎛ 직경의 매우 가는 입자 및 적절한 흐름을 유지하기 위한 고압의 이용은 고성능 또는 고압 액체 크로마토그래피(또는, 간단하게 HPLC)라고 한다. 이런 다른 성질 가령, 전하, 용량, 다공성, 메쉬를 보유하는 교환기의 이와 같은 수집은 특정 분리를 달성하는데 적합한 교환기의 선별을 어렵게 한다.
이온 교환 크로마토그래피를 이용하는 경우에 여러 가지 선택해야 한다. 우선, 교환기를 음이온 또는 양이온으로 할 것인지를 선택하는 것이다. 칼럼에 결합할 재료가 단일 전하(+ 또는 -)를 보유하는 경우에는 선택이 간단하다. 하지만, 대부분 물질(가령, 단백질, 바이러스)은 음전하와 양전하를 모두 갖고 있기 때문에, 순전하(net charge)는 pH에 좌우된다. 이런 경우에, 주요 인자는 다양한 pH 값에서 물질의 안정성이다. 대부분 단백질은 양으로 또는 음으로 하전될 때, 안정된(즉, 변성되지 않는) pH 범위를 보유한다. 따라서, 단백질이 등전점 초과의 pH 값에서 안정적이면 음이온 교환기를 이용하고, 등전점 미만의 수치에서 안정적이면 양이온 교환기를 이용한다.
전하와 안정성에 대한 pH의 효과를 고려하여, 강한 교환기 또는 약한 교환기를 선택한다. 가령, 이온화를 위해 매우 낮거나 높은 pH를 요구하는 약하게 이온화된 물질을 크로마토그래피하는 경우에는 강한 이온 교환기가 요구되는데, 그 이유는 강한 이온 교환기가 전체 pH 범위에서 기능하기 때문이다. 하지만, 물질이 불안정한 경우에는 약한 이온 교환기가 적합한데, 그 이유는 강한 이온 교환기가 빈번하게 분자를 변형시켜 변성시키기 때문이다. 물질이 안정하게 유지되는 pH는 특정 약한 교환기가 하전되는 좁은 pH 범위와 일치해야 한다. 또한, 적은 전하를 보유하는 분자로부터 많은 전하를 보유하는 분자를 분리하는 데에는 약한 이온 교환기가 적합한데, 그 이유는 약하게 하전된 이온이 결합하지 못하기 때문이다. 약한 교환기는 또한, 전하 차이가 매우 적을 때 더욱 높은 물질 분해능을 보인다. 거대분자가 매우 강한 전하를 띄는 경우에, 강한 교환기로부터 용출은 불가능하고, 약한 교환기가 적절하다. 일반적으로, 약한 교환기가 강한 교환기보다 더욱 유용하다.
Sephadex와 Bio-gel 교환기는 낮은 이온 강도에서 불안정한 거대분자에 특히 유익하다. 매트릭스가 고도 극성인 경우에도 이들 재료에서 교차-결합이 매트릭스의 불용성을 유지시키기 때문에, 이온가능 기의 밀도는 셀룰로오스 이온 교환기에서보다 수배 크게 할 수 있다. 전하 밀도가 증가되면 친화성이 증가되어 더욱 높은 이온 강도에서 흡착이 수행될 수 있다. 한편, 이들 교환기가 분자체 성질을 일부 가지고 있기 때문에, 분자량 차이는 전하 차이로 인한 분산을 무효화시킨다; 분자체 효과는 또한, 분리를 강화시킨다.
작은 분자는 작은 구멍(높은 교차 결합)을 갖는 매트릭스 상에서 이용가능 용량이 크기 때문에 잘 분리되는 반면, 거대 분자는 구멍 크기가 커야 한다. 하지만, Sephadex 형태를 제외하고, 대부분 이온 교환기는 분자량과 다공성을 일치시킬 수 있는 기회를 제공하지 않는다.
셀룰로오스 이온 교환기는 단백질 및 폴리뉴클레오티드와 같은 거대 분자를 정제하는데 가장 효과적인 것으로 입증되었다. 이는 매트릭스가 섬유성이고, 모든 기능기가 표면에 위치하고 최대 분자에도 이용가능하기 때문이다. 하지만, 대부분의 경우에, DEAE-Sephacel 및 DEAE-Biogel P와 같은 비드 형이 더욱 유용한데, 그 이유는 유동 속도가 더욱 우수하고 분자체 효과가 분리에 도움을 주기 때문이다.
메쉬 크기를 선택하는 것은 항상 어려운 문제이다. 작은 메쉬 크기는 분해능을 개선시키기는 하지만 흐름 속도를 감소시키고, 이는 구역 퍼짐을 증가시키고 분해능을 감소시킨다. 따라서, 적절한 메쉬 크기는 경험적으로 결정된다.
완충액 자체가 이온으로 구성되기 때문에, 이들 또한 교환될 수 있고 pH 평형이 영향을 받게 된다. 이들 문제점을 피하기 위하여, 완충액의 역할: 음이온 교환기와 양이온 완충액, 음이온 완충액과 양이온 교환기를 이용한다. 이온 강도가 결합에서 인자가 되기 때문에, 완충액은 이온 강도가 너무 커지지 않도록 높은 완충 능력을 보유하는 완충액으로 선택된다. 또한, 최상의 분해능을 얻기 위해서, 칼럼에 샘플을 제공하는데 이용되는 이온 조건(소위, 시작 조건)은 칼럼을 용출하는데 이용되는 조건에 근접해야 한다.
고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)는 피크의 현저한 분해능에 의한 신속하고 급속한 분리로 특성화된다. 이는 적절한 유동 속도를 유지하기 위한 매우 미세한 입자 및 고압의 이용으로 달성된다. 수분 또는 최대 1시간 내에 분리될 수 있다. 더 나아가, 매우 소량의 샘플이 요구되는데, 그 이유는 입자가 매우 작고 상당히 밀집되며, 빈 공간이 베드 용적(bed volume)의 극히 일부이기 때문이다. 또한, 샘플의 농도가 높지 않아도 되는데, 그 이유는 밴드가 매우 좁아 샘플이 거의 희석되지 않기 때문이다.
본 발명의 특정 구체예에서, 아데노바이러스 생산 방법은 바이러스 생산을 분석하는 단계를 수반한다. 당업자에게 공지된 임의의 방법을 이용하여 바이러스 생산을 분석할 수 있다. 특정 구체예에서, 바이러스 생산은 HPLC로 분석된다.
J. 제약학적 조성물
본 발명은 특정 구체예에서, 아데노바이러스를 제약학적으로 수용가능한 조성물에 배치하는 단계를 수반하는 아데노바이러스 생산 방법에 관한다. 본 발명은 또한, 본원에 개시된 공정으로 제조된 아데노바이러스 조성물에 관하는데, 상기 조성물은 제약학적으로 수용가능한 조성물이다.
“제약학적으로 수용가능한 조성물”은 동물, 바람직하게는 인간에게 투여되는 경우에 부작용, 알레르기 반응, 또는 원치않는 반응을 유발하지 않는 분자 실체 또는 조성물을 의미한다. 본 명세서에서, “제약학적으로 수용가능한 조성물”은 임의의 용매, 분산 매체, 코팅, 항생제와 항균제, 등장성제와 흡수 지연제 등을 함유한다. 제약학적 활성 물질에 이런 매체와 작용제의 이용은 당분야에 널리 공지되어 있다. 임의의 통상적인 매체 또는 작용제는 활성 성분과 양립하지 않는 경우를 제외하고, 치료 조성물에 이용될 수 있다. 보조 활성 성분 역시 조성물에 함입될 수 있다. 이에 더하여, 조성물은 보조 활성성분을 함유할 수 있다. 가령, 구강세척액으로 사용되는 조성물은 향미료를 함유하거나, 또는 조성물은 지효성(timed-released) 보조 성분을 함유할 수 있다.
본 발명의 수용성 조성물은 제약학적으로 수용가능한 담체 또는 수용성 매체에 용해되거나 분산된 발현 카세트의 효과량을 함유한다. 수용성 조성물의 실례는 정맥 투여용 조성물 또는 국소 투여용 조성물이다.
유리 염기 또는 약리학적으로 수용가능한 염으로서 활성 화합물 용액은 물에서 하이드록시프로필셀룰로오스와 같은 계면활성제와 적절하게 혼합하여 제조할 수 있다. 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜, 이의 혼합물 및 오일에서 분산액을 제조할 수도 있다. 저장과 이용을 위한 통상의 조건하에, 이들 조제물은 미생물 성장을 예방하는 보존제를 함유한다.
본 발명의 아데노바이러스 조제물은 전통적인 제약학적 조제물을 포함한다. 본 발명에 따른 치료 조성물은 이용된 투여 경로를 통하여 표적 세포에 전달될 수 있다면 임의의 통상적인 경로를 통하여 투여된다. 일반적으로, 이들 조성물은 생리학적으로 수용가능한 담체, 완충액 또는 다른 부형제를 함유하는 제약학적으로 수용가능한 조성물로서 투여된다.
본 발명의 치료와 예방 조성물은 액체 용액 또는 현탁액 형태로 투여하는 것이 바람직하다; 국소 이용에 앞서 용액, 현탁액 또는 액체로 만들 수 있는 고체 형태 역시 제조할 수 있다. 이런 목적의 전형적인 조성물은 제약학적으로 수용가능한 담체를 함유한다. 가령, 조성물은 인산염 완충액 ㎖당 10 ㎎, 25 ㎎, 50 ㎎, 또는 최대 100 ㎎ 인간 혈청 알부민을 함유한다. 다른 제약학적으로 수용가능한 담체는 수용액; 염, 보존제, 완충액 등을 비롯한 비-독성 부형제 등이다. 비-수용성 용매의 실례는 폴리프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사용 유기 에스테르 등이다. 수용성 담체는 물, 알코올성 용액/수용액, 염 용액, 염화나트륨과 같은 장관외 담체, 링거 덱스트로스 등이다. 보존제는 항균제, 항산화제, 킬레이트제, 비활성 기체 등이다. 제약학적 조성물에서 다양한 성분의 pH 및 정확한 농도는 공지된 모수에 따라 조절된다.
경구 조성물은 제약학적 등급의 만니톨, 락토오스, 전분, 스테아르산 마그네슘, 사카린 나트륨, 셀룰로오스, 탄산 마그네슘 등과 같은 통상적으로 이용되는 부형제를 포함한다. 이들 조성물은 구강세척액과 같은 용액, 현탁액, 정제, 알약, 캡슐, 서방형 조제물, 또는 분말과 같은 형태를 취한다. 특정 구체예에서, 경구 제약학적 조성물은 불활성 희석제 및/또는 동화가능 식용 담체를 함유하거나, 연성 및/또는 경성 쉘 젤라틴 캡슐에 넣어지거나, 정제로 압착되거나, 또는 식이 음식과 직접 혼합될 수 있다. 경구 치료 투여를 위하여, 활성 화합물은 부형제와 혼합되거나, 또는 섭취가능 정제, 협측 테이블(buccal table), 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 현탁액, 시럽, 와이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다. 이런 조성물 및/또는 조제물은 적어도 0.1%의 활성 화합물을 함유한다. 조성물 및/또는 조제물의 비율은 변화되거나, 또는 통상적으로 단위 중량의 대략 2 내지 75%, 바람직하게는 25-60%이다. 이런 치료 조성물에서 활성 화합물의 양은 적절한 용랑이 달성되도록 하는 양이다.
정제, 트로키, 알약, 캡슐 등은 아래의 성분을 추가로 함유할 수 있다: 트래거캔스, 아카시아, 옥수수 전분, 젤라틴과 같은 결합제; 이인산칼슘과 같은 부형제; 옥수수 전분, 감자 전분, 알긴산 등과 같은 붕해제; 스테아르산마그네슘과 같은 윤활제; 수크로오스, 락토오스, 사카린과 같은 감미료; 페퍼민트, 노루발풀 오일, 체리향과 같은 향미료. 투약 단위 형태(dosage unit form)가 캡슐이면, 상기한 재료 이외에 액체 담체를 함유한다. 코팅제로서 또는 투약 단위의 물리적 형태를 변형시키기 위하여 다양한 다른 재료가 존재할 수 있다. 가령, 정제, 알약 및/또는 캡슐은 셀락, 당 및/또는 둘 모두로 코팅될 수 있다. 엘릭시르 시럽은 활성 화합물; 감미료로서 수크로오스; 보존제로서 메틸 및/또는 프로필파라벤; 염료 및/또는 향료로서 체리 및/또는 오렌지 향을 함유할 수 있다.
경구 투여를 위하여, 본 발명의 발현 카세트는 부형제와 혼합되고 비-섭취가능 구강세척액과 치약 형태로 사용될 수 있다. 구강세척액은 적절한 용매, 예를 들면, 붕산나트륨 용액(Dobell 용액)에 필요한 양의 활성 성분을 혼합하여 제조할 수 있다. 대안으로, 활성 성분은 붕산나트륨, 글리세린, 중탄산칼륨을 함유하는 방부 세척액에 혼합될 수 있다. 또한, 활성 성분은 겔, 페이스트, 분말, 슬러리를 함유하는 치약에 분산될 수도 있다. 활성 성분은 물, 결합제, 연마제, 향미료, 발포제, 습윤제를 함유하는 페이스트 치약에 치료 효과량으로 첨가될 수 있다.
본 발명의 조성물은 중성 형태 또는 염 형태로 조제될 수 있다. 제약학적으로 수용가능한 염에는 무기산, 예를 들면, 염산 또는 인산으로 형성되거나, 또는 유기산, 예를 들면, 아세트산, 옥살산, 주석산, 만델산 등으로 형성되는 산 첨가염(단백질의 유리 아미노기로 형성됨)이 포함된다. 또한, 유리 카르복실기로 형성되는 염은 무기 염기, 예를 들면, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 철 산화물 및/또는 유기 염기, 예를 들면, 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유래될 수 있다.
본 발명에서 투여용으로 용액 또는 스프레이, 하이포스프레이, 에어로졸 및/또는 흡입제를 이용할 수도 있다. 한가지 실례는 소화관(aerodigestive tract) 투여용 스프레이이다. 스프레이는 등장성이거나 약간 완충하여 5.5 내지 6.5의 pH를 유지시킨다. 이에 더하여, 필요한 경우에, 안구 조제물에 사용되는 것과 유사한 항균 보존제 및/또는 적절한 약물 안정제가 조성물에 포함될 수 있다. 다른 투야 양식에 적합한 추가의 조제물은 질과 직장 좌약 및/또는 페서리이다. 다른 유형의 국소 투여를 위한 조제물은 예로써, 크림, 좌약, 연고 또는 고약이다.
아래의 실시예에는 본 발명의 적절한 구체예를 설명한다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 실시예에 개시된 기술은 본 발명자들에 의해 본 발명을 실시하는데 있어 최적으로 기능하는 것으로 확인된 바람직한 양식이다. 하지만, 본 발명의 개시에 비추어, 본 발명의 기술적 사상과 범위를 벗어나지 않으면서 유사한 결과를 얻을 수 있는 특정 구체예에서 다양한 변화는 당업자에게 명백하다.
실시예 1
실험 과정
아데노바이러스 생산에 대한 감염 온도의 효과를 평가하는 연구는 2가지 아 데노바이러스 벡터, Adp53과 Admda7을 이용하여 수행하였다.
4가지 온도를 평가하였다: 32℃, 35℃, 37℃, 39℃. 이용된 아데노바이러스 벡터는 Adp53과 Admda7이었다. 세포는 HEK293 세포(세포 계대배양 #54)이었다. 실험은 배양기(Forma Scientific, Inc., model # Steri-Cult 200)를 이용하여 T-150 플라스크(Corning)에서 성장된 293 세포에서 수행하였다. 감염 배지는 DMEM+2%FBS이었다. 감염 다중도(multiplicity of infection, MOI)는 150 vp/세포이었다.
9개의 T-150 플라스크는 10%FBS-DMEM 배지에서 5.8x104 세포/㎝2의 접종 밀도로 293 세포(세포 계대배양 #54)를 접종하였다. 모든 플라스크는 10%CO2, 95% 상대 습도를 보유하는 37℃ 배양기내에 위치시켰다. 접종 72시간후, 한 플라스크를 트립신처리하고 계산하였는데, 세포 밀도가 1.6x105 세포/㎝2이었다. 나머지 8개 플라스크로부터 소모된 배지를 흡출하고 새로운 2%FBS-DMEM을 첨가하였다. 이들 플라스크는 상기 트립신처리된 플라스크의 세포수에 기초하여 15 0vp/세포의 MOI에서 Adp53 또는 Admda7로 감염시켰다. 플라스크 중에서 2개는 각각 아래의 온도: 39℃, 37℃, 35℃, 32℃에서 배양기 내에 위치시켰다. 모든 배양기는 10%CO2와 95% 상대 습도 환경으로 설정되었다. 모든 배양기의 온도는 서로 다른 온도의 정확성을 담보하기 위하여 사용에 앞서, 온도 조정 장치(Kaye Instruments)를 이용하여 조정하였다. 감염 96시간후, 모든 플라스크를 회수하였다. Tween-20을 1%(v/v)의 최종 농도로 각 플라스크에 첨가하고, 플라스크를 37℃에서 30분동안 배양하였다. 이후, Benzonase(EMD Chemicals)를 100 μ/㎖로 37℃에서 1시간동안 첨가하였다. 바이러스 농도의 HPLC 분석을 위하여 각 플라스크로부터 샘플을 채집하였다.
Adp53과 Admda7에 대한 결과는 각각 도 1A와 FIG. 1B에 도시한다.
바이러스 생산은 37℃에 비하여 39℃에서 현저하게 감소하였다(도 1A와 도 1B). 37℃ 감염 온도에서, Admda7 바이러스 생산율은 2.6E10 vp/㎖ 또는 26,000 vp/세포이었다. 35℃ 감염 온도에서, Ad-mda7 바이러스 생산율은 4.1E10 vp/㎖ 또는 41,000 vp/세포이었다. 대략 등가의 바이러스 생산이 37℃와 35℃ 모두에서 달성되었다. 32℃에서 바이러스 생산은 37℃에서보다 훨씬 낮았다. Adp53과 Admda7 벡터 모두에 대하여 동일한 결론이 도출되었다.
아데노바이러스 생산을 위한 최적 감염 온도는 32℃ 초과 내지 37℃ 미만이다. 이들 결과는 또한, 아데노바이러스 생산에 대한 높은 감염 온도(39℃)의 유해 효과를 입증한다.
사용된 재료
바이오리엑터 모델: 20/50EH(Wave Biotech, LLC)
배양 배지: CD293 단백질-없는 배지(InvitrogenTM)
HEK293 현탁 세포: Introgen Therapeutics, Inc.에서 혈청-없는
현탁 배양에 순응됨
아데노바이러스 벡터: Introgen Therapeutics, Inc.에서 제공
YSI 생화학 분석장치: YSI-2700 SELECTTM
실시예 2
배지 살포 없는 세포 성장과 아데노바이러스 벡터 생산
아데노바이러스 벡터 생산은 10 ℓ(5 ℓ 작업 용적) Wave Bioreactor®에서 수행하였다. HEK293 현탁 세포는 단백질-없는 CD293 배지에 4.8E5 세포/㎖로 접종하고 1.2E6 세포/㎖로 성장시켰다. 진동 속도(rocking speed)는 10으로 설정하고, 진동 각도는 11로 설정하였다. 배양 pH는 가스 혼합기로 전달되는 CO2 가스 비율을 조정함으로써 유지시켰다. 배양 배지에서 용존 산소 분압(DOT)은 1회용 DOT 프로브(Wave BiotechTM)를 이용하여 모니터하였다.
세포 농도가 1.2E6 세포/㎖에 도달하면, 배양액은 바이오리엑터로부터 빼내고 원심분리하며, 생성된 세포 펠렛은 새로운 CD293 배지로 재부유시켰다. 세포 현탁액은 바이오리엑터로 환원하고, 세포는 50 vp/세포의 MOI에서 아데노바이러스 벡터로 감염시켰다. 감염은 4일동안 진행시켰다. 배양액은 감염 4일후에 회수하였다. 세포 성장 데이터는 도 2에 도시한다. 도 2에서는 세포 농도가 4일에 피크에 도달하고, 생존능이 안정적으로 유지되지만 5일이후 감소한다는 것을 보여준다. 도 3에서는 영양분/대사물질 데이터를 도시한다. 바이러스 감염이후, 글루코오스 농도는 시간의 추이에서 감소하였고, 락테이트 농도는 시간의 추이에서 증가하였다.
아데노바이러스 벡터 생산은 음이온 교환 HPLC 방법을 이용하여 측정하였다. 바이오리엑터에서 아데노바이러스 벡터 농도는 4.5E10 vp/㎖이었고, 세포-특이적 벡터 생산성은 37,000 vp/세포이었다. 벡터 생산성은 혈청-함유 배지에서 부모 고 정-의존성 HEK293 세포를 이용하는 경우에 관찰되는 생산성에 거의 근접하였다.
실시예 3
세포 성장기동안 살포되는 경우에 세포 성장과 아데노바이러스 벡터 생산
독특하게 설계된 살포 Wave 바이오리엑터는 도 4에 도시된 바와 같이 설정하였다. 도 4에 도시된 시스템은 세포와 소모된 배지 사이를 분리하기 위하여 내부 플랫 필터를 이용한다. 소모된 배양 배지는 유동 필터를 통하여 빼낸다. 배지 순환은 필요하지 않으며, 결과적으로 이런 양식의 배지 살포는 배양중인 세포에 매우 점진적이다. 파동은 살포동안 필터 막힘을 최소화시킨다. 살포동안 배양 용적은 새로운 배지 첨가를 유인하는 로드 셀로 유지시킨다.
1 ℓ(작업 용적) 살포 Wave 바이오리엑터를 이용하여 바이러스 감염에 앞서 성장기동안 세포 농도를 증가시켰다. 배양동안 세포 성장 및 영양분/대사물질 농도는 도 5와 도 6에 도시한다.
HEK293 현탁 세포는 5E5 세포/㎖의 세포 농도로 접종하였다. 배양 3일 시점에, 1.7E6 세포/㎖의 세포 농도로 배지 살포를 시작하였다. 6일에 세포 농도는 1E7 세포/㎖로 거의 지수적으로 증가하였고, 세포 생존능은 90% 이상으로 유지되었다. 배양액은 새로운 CD293 배지로 10-배 희석하여 영양분을 보충하고 잠재적 독성 대사물질을 희석하였다. 배양액은 살포 필터없는 대형 Wave BioreactorTM에서 50 vp/세포의 MOI로 아데노바이러스 벡터로 즉시 감염시켰다. 배지 살포는 바이러스 감염이후 재개하지 않았다. 감염은 4일동안 진행시켰다. 배양액은 감염 4일후에 회수하 였다.
아데노바이러스 벡터 생산은 음이온 교환 HPLC 방법으로 측정하였다. Wave Bioreactor®에서 아데노바이러스 벡터 농도는 3.5E10 vp/㎖이고, 세포-특이적 벡터 생산성은 35,000 vp/세포이었다.
이들 결과는 Wave 바이오리엑터에 담긴 단백질-없는 CD293 배지에서 성장된 HEK293 세포의 현탁액에서 만족스런 아데노바이러스 벡터 생산을 입증하였다. 이와 같은 효율적이고 확대가능한 살포-희석 방법은 현탁 배양을 위한 바이러스 감염의 시점에서 배지 교환과 연관된 어려움을 극복한다. 원심분리 완전 배지 교환 감염 방법과 비교하여 살포-희석 감염 방법으로 거의 등가의 바이러스 생산성이 달성되었다. 작업 용이성으로 인하여, 살포-희석 감염 방법은 대규모 혈청-없는 현탁 배양에서 선호된다.
본원에서 개시되고 청구된 모든 방법과 조성물은 상기한 개시에 비추어 과도한 실험없이 달성될 수 있다. 본 발명의 조성물과 방법이 바람직한 구체예의 관점에서 기술되긴 했지만, 본 발명의 개념, 기술적 사상, 범위를 벗어나지 않으면서 이들 방법과 조성물에 다양한 개변이 적용될 수 있음은 당업자에게 명백하다. 더욱 구체적으로, 화학적 생리학적으로 관련된 특정 물질은 동일하거나 유사한 결과를 달성하는 본원에 기술된 다른 물질로 대체될 수 있다. 당업자에게 명백한 이와 같은 모든 유사한 치환과 변경은 첨부된 특허청구범위에 의해 정의되는 본 발명의 범위에 속한다.
참고문헌
아래의 참고문헌은 예시적인 과정 또는 이를 보충하는 다른 상세를 제시한다.
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Claims (80)

  1. 아데노바이러스를 생산하는 방법에 있어서,
    a) 아래의 단계로 아데노바이러스 제조물을 제조하고:
    (i) 배지에서 숙주 세포를 성장시키고;
    (ii) 37℃ 미만의 성장 허용 온도(growth-permissive temperature)
    에서 아데노바이러스로 숙주 세포를 감염시킨다;
    b) 상기 아데노바이러스 제조물로부터 아데노바이러스를 분리하는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 아데노바이러스로 숙주 세포의 감염은 31℃ 초과 내지 37℃ 미만의 온도에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 아데노바이러스로 숙주 세포의 감염은 32℃ 내지 36℃의 온도에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 아데노바이러스로 숙주 세포의 감염은 33℃ 내지 36℃의 온도에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 아데노바이러스로 숙주 세포의 감염은 34℃ 내지 36℃의 온도에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 아데노바이러스로 숙주 세포의 감염은 35℃ 내지 36℃의 온도에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 아데노바이러스로 숙주 세포의 감염은 32℃ 내지 37℃ 미만의 온도에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1 항에 있어서, 아데노바이러스로 숙주 세포의 감염은 33℃ 내지 37℃ 미만의 온도에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1 항에 있어서, 아데노바이러스로 숙주 세포의 감염은 34℃ 내지 37℃ 미만의 온도에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 1 항에 있어서, 아데노바이러스로 숙주 세포의 감염은 35℃ 내지 37℃ 미만의 온도에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 1 항에 있어서, 아데노바이러스로 숙주 세포의 감염은 36℃ 내지 37℃ 미만의 온도에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 1 항에 있어서, 아데노바이러스로 숙주 세포의 감염은 36℃의 온도에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 1 항에 있어서, 아데노바이러스로 숙주 세포의 감염은 35℃의 온도에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 1 항에 있어서, 아데노바이러스로 숙주 세포의 감염은 34℃의 온도에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 1 항에 있어서, 아데노바이러스로 숙주 세포의 감염은 33℃의 온도에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 1 항에 있어서, 아데노바이러스로 숙주 세포의 감염은 32℃의 온도에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 1 항에 있어서, 배지는 DMEM + 2% FBS인 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 1 항에 있어서, 배지에서 글루코오스 농도는 0.5 내지 3.0 gm 글루코오스/ℓ로 유지되는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 아데노바이러스를 생산하는 방법에 있어서,
    a) 아래의 단계로 아데노바이러스 제조물을 제조하고:
    (i) 바이오리엑터에 담긴 배지에서 숙주 세포를 성장시키고;
    (ii) 새로운 배지와 아데노바이러스로 숙주 세포를 희석함으로써
    바이러스 감염을 시작한다;
    b) 아데노바이러스 제조물로부터 아데노바이러스를 분리하는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 19 항에 있어서, 배지는 혈청-없는 배지인 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 19 항에 있어서, 배지는 단백질-없는 배지인 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 19 항에 있어서, 단백질-없는 배지는 CD293인 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 19 항에 있어서, 바이오리엑터는 바이오리엑터 내에서 파동(wave motion)을 유도하는 평면 플랫폼의 축성 진동(axial rocking)을 이용하는 바이오리엑터를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 23 항에 있어서, 파동은 폴리에틸렌 비닐 아세테이트와 에틸 비닐 알코올로 만들어진 무균 가방의 내부에 유도되는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 19 항에 있어서, 바이오리엑터는 1회용 바이오리엑터인 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 19 항에 있어서, 바이오리엑터는 10 ℓ 바이오리엑터인 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 19 항에 있어서, 바이오리엑터는 상업용 바이오리엑터인 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 19 항에 있어서, 아데노바이러스 제조물의 제조에는 배지의 pH를 조절하는 단계가 추가로 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제 19 항에 있어서, 아데노바이러스 제조물의 제조에는 배지에서 용존 산소 분압(dissolved oxygen tension)을 모니터하는 단계가 추가로 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 19 항에 있어서, 아데노바이러스 제조물의 제조에는 배지의 온도를 조절하는 단계가 추가로 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제 19 항에 있어서, 아데노바이러스 제조물의 제조에는 필터를 통하여 배지를 살포시키는 단계가 추가로 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제 31 항에 있어서, 필터는 바이오리엑터의 내부에 위치하는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제 31 항에 있어서, 필터는 바이오리엑터의 외부에 위치하는 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제 31 항에 있어서, 필터는 유동 플랫 필터(floating flat filter)인 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제 19 항에 있어서, 아데노바이러스 제조물의 제조에는 필터를 통하여 바이오리엑터로부터 소모된 배지를 제거하는 단계가 추가로 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 제 19 항에 있어서, 아데노바이러스 제조물의 제조에는 새로운 배지 첨가를 유인하는데 이용되는 로드 셀(load cell)에 의한 배양 용적(culture volume)을 유지하는 단계가 추가로 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 제 19 항에 있어서, 아데노바이러스 제조물의 제조에는 숙주 세포 성장의 3일 시점부터 배지를 살포하는 단계가 추가로 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 제 19 항에 있어서, 배지로 숙주 세포의 희석은 새로운 배지와 아데노바이러스로 숙주 세포를 2-배 내지 50-배 희석함으로써 달성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 제 38 항에 있어서, 숙주 세포는 새로운 배지와 아데노바이러스로 10-배 희석되는 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 제 19 항에 있어서, 제 2 바이오리엑터에서 바이러스 감염을 시작하는 단계가 추가로 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
  41. 제 19 항에 있어서, 바이러스 감염의 시작에는 20-100 vp/숙주 세포를 첨가하는 단계가 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
  42. 제 41 항에 있어서, 바이러스 감염의 시작에는 50 vp/숙주 세포를 첨가하는 단계가 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  43. 제 19 항에 있어서, 아데노바이러스 제조물의 제조에는 바이러스 감염이 4일 동안 진행되도록 하는 단계가 추가로 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
  44. 제 19 항에 있어서, 아데노바이러스 제조물로부터 아데노바이러스의 분리는 바이러스 감염이 완결된 이후 4일 시점에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  45. 제 1 항 또는 19 항에 있어서, 숙주 세포는 복제-결함성 아데노바이러스의 성장을 보충하는 것을 특징으로 하는 방법.
  46. 제 1 항 또는 19 항에 있어서, 아데노바이러스는 복제-결함성 아데노바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.
  47. 제 46 항에 있어서, 아데노바이러스는 E1-영역의 적어도 일부가 부재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  48. 제 46 항에 있어서, 아데노바이러스는 E1A 또는 E1B 영역의 적어도 일부가 부재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  49. 제 1 항 또는 19 항에 있어서, 숙주 세포는 293, HEK293, PER.C6, 911, IT293SF 세포에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  50. 제 49 항에 있어서, 숙주 세포는 HEK293 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  51. 제 1 항 또는 19 항에 있어서, 아데노바이러스는 재조합 아데노바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.
  52. 제 51 항에 있어서, 재조합 아데노바이러스는 프로모터에 작동가능하게 결합된 재조합 유전자를 인코딩하는 것을 특징으로 하는 방법.
  53. 제 52 항에 있어서, 프로모터는 조직-특이적 프로모터 또는 유도성 프로모터인 것을 특징으로 하는 방법.
  54. 제 52 항에 있어서, 프로모터는 SV40 EI, RSV LTR, β-액틴, CMV-IE, 아데노바이러스 주요 후기, 폴리오마 F9-1, 티로시나아제 프로모터, α-태아 단백질 프로모터, 또는 egr-1인 것을 특징으로 하는 방법.
  55. 제 52 항에 있어서, 재조합 유전자는 안티센스 ras, 안티센스 myc, 안티센스 raf, 안티센스 erb, 안티센스 src, 안티센스 fms, 안티센스 jun, 안티센스 trk, 안티센스 ret, 안티센스 gsp, 안티센스 hst, 안티센스 bcl, 안티센스 abl, Rb, CFTR, p16, p21, p27, p57, p73, C-CAM, APC, CTS-1, zac1, scFV ras, DCC, NF-1, NF-2, WT-1, MEN-I, MEN-II, BRCA1, VHL, MMAC1, FCC, MCC, BRCA2, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11 IL-12, GM-CSF, G-CSF, 티미딘 키나아제, mda7, fus, 인터페론 α, 인터페론 β, 인터페론 γ, ADP, p53, ABLI, BLC1, BLC6, CBFA1, CBL, CSFIR, ERBA, ERBB, EBRB2, ETS1, ETS2, ETV6, FGR, FOX, FYN, HCR, HRAS, JUN, KRAS, LCK, LYN, MDM2, MLL, MYB, MYC, MYCL1, MYCN, NRAS, PIM1, PML, RET, SRC, TAL1, TCL3, YES, MADH4, RB1, TP53, WT1, TNF, BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, ApoAI, ApoAIV, ApoE, Rap1A, 시토신 디아미나아제, Fab, ScFv, BRCA2, zac1, ATM, HIC-1, DPC-4, FHIT, PTEN, ING1, NOEY1, NOEY2, OVCA1, MADR2, 53BP2, IRF-1, Rb, zac1, DBCCR-1, rks-3, COX-1, TFPI, PGS, Dp, E2F, ras, myc, neu, raf, erb, fms, trk, ret, gsp, hst, abl, E1A, p300, VEGF, FGF, 트롬보스폰딘, BAI-1, GDAIF, 또는 MCC인 것을 특징으로 하는 방법.
  56. 제 52 항에 있어서, 재조합 유전자는 ACP 디새츄라아제, ACP 하이드록실라아제, ADP-글루코오스 피로포릴라아제, ATPase, 알코올 디하이드로게나아제, 아밀라아제, 아밀로글루코시다아제, 카탈라아제, 셀룰라아제, 사이클로옥시게나아제, 디카르복실라아제, 덱스트리나아제, 에스테라아제, DNA 중합효소, RNA 중합효소, 히알루론 합성효소, 갈락토시다아제, 글루카나아제, 글루코오스 옥시다아제, GTPase, 헬리카아제, 헤미셀룰라아제, 히알루로니다아제, 인테그라아제, 인베르타아제, 아이소머라아제, 키나아제, 락토오스, 리파아제, 리폭시게나아제, 리아제, 리소자임, 펙틴스테라아제, 페록시다아제, 포스파타아제, 포스포리파아제, 포스포릴라아제, 폴리갈락투로나아제, 프로테이나아제, 펙티데아제, 풀라나아제, 리콤비나아제, 역전사효소, 토포아이소머라아제, 자일라나아제, 리포터 유전자, 인터루킨, 또는 사이토킨을 인코딩하는 유전자인 것을 특징으로 하는 방법.
  57. 제 52 항에 있어서, 재조합 유전자는 카바모일 합성효소 I, 오르니틴 트랜스카바밀라아제, 아르기노숙시네이트 합성효소, 아르기노숙시네이트 리아제, 아르기나아제, 푸마릴아세토아세테이트 하이드롤라아제, 페닐알라닌 하이드록실라아제, 알파-1 안티트립신, 글루코오스-6-포스파타아제, 저-밀도-지단백 수용체, 포르포빌리노겐 디아미나아제, 인자 VIII, 인자 IX, 시스타티원 β-합성효소, 분지쇄 케토산 디카르복실라아제, 알부민, 이소발레릴-CoA 디하이드로게나아제, 프로피오닐 CoA 카르복실라아제, 메틸 말로닐 CoA 뮤타아제, 글루타릴 CoA 디하이드로게나아제, 인슐린, 베타-글루코시다아제, 피루베이트 카르복실라아제, 헤파틱 포스포릴라아제, 포스포릴라아제 키나아제, 글리신 디카르복실라아제, H-단백질, T-단백질, 멘케스병(Menkes disease) 구리-전달 ATPase, 윌슨병(Wilson's disease) 구리-전달 ATPase, 시토신 디아미나아제, 하이폭산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라아제, 갈락토오스-1-포스페이트 우리딜트랜스퍼라아제, 페닐알리닌 하이드록실라아제, 글루코세르브로시다아제, 스핑고미엘리나아제, α-L-이두로니다아제, 글루코오스-6-포스페이트 디하이드로게나아제, HSV 티미딘 키나아제, 또는 인간 티미딘 키나아제를 인코딩하는 유전자인 것을 특징으로 하는 방법.
  58. 제 52 항에 있어서, 재조합 유전자는 성장 호르몬, 프롤락틴, 태반 락토겐, 황체화 호르몬, 여포-자극 호르몬, 융모성 성선자극호르몬, 갑상선-자극 호르몬, 렙틴, 부신피질자극호르몬(adrenocorticotropin), 안지오텐신 I, 안지오텐신 II, β-엔도르핀, β-멜라닌세포 자극 호르몬, 콜레시스토키닌(cholecystokinin), 엔도텔린 I, 갈라닌(galanin), 위 억제 펩티드, 글루카곤, 인슐린, 리포트로핀(lipotropin), 뉴우로피신(neurophysin), 소마토스타틴, 칼시토닌, 칼시토닌 유전자 관련된 펩티드, β-칼시토닌 유전자 관련된 펩티드, 악성 인자의 고칼슘혈증(hypercalcemia), 부갑상선 호르몬-관련된 단백질, 글루카곤-유사 펩티드, 판크레아스타틴(pancreastatin), 췌장 펩티드, 펩티드 YY, PHM, 세크레틴(secretin), 혈관작동성 장 펩티드, 옥시토신, 바소프레신, 바소톡신, 엔케팔린아마이드(enkephalinamide), 메토르핀아마이드(metorphinamide), 알파 멜라닌세포 자극 호르몬, 심방 나트륨배설 인자(atrial natriuretic factor), 아밀린(amylin), 아밀로이드 P 성분, 부신피질 자극호르몬 방출 호르몬(corticotropin releasing hormone), 성장 호르몬 방출 인자, 황체화 호르몬-방출 호르몬, 뉴로펩티드 Y, 물질 K, 물질 P, 또는 갑상선자극호르몬 분비촉진 호르몬(thyrotropin releasing hormone)을 인코딩하는 것을 특징으로 하는 방법.
  59. 제 52 항에 있어서, 재조합 유전자는 p53 유전자인 것을 특징으로 하는 방법.
  60. 제 52 항에 있어서, 재조합 유전자는 mda7 유전자인 것을 특징으로 하는 방법.
  61. 제 1 항 또는 19 항에 있어서, 아데노바이러스의 분리에는 숙주 세포를 용해시키는 단계가 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
  62. 제 61 항에 있어서, 숙주 세포의 용해는 냉동-해동, 자가용해(autolysis), 또는 계면활성제 용해로 달성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  63. 제 1 항 또는 19 항에 있어서, 아데노바이러스의 분리에는 아데노바이러스 제조물에서 핵산 오염물질의 농도를 감소시키는 단계가 추가로 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
  64. 제 1 항 또는 19 항에 있어서, 아데노바이러스의 분리에는 아데노바이러스를 제약학적으로 수용가능한 조성물에 배치하는 단계가 추가로 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
  65. 제 1 항 또는 19 항에 있어서, 아데노바이러스의 분리에는 아데노바이러스를 정제하는 단계가 추가로 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
  66. 제 65 항에 있어서, 아데노바이러스의 정제에는 크로마토그래피 단계가 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
  67. 제 66 항에 있어서, 크로마토그래피 단계에는 아데노바이러스를 1회 이상의 크로마토그래피 분리에 적용하는 단계가 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
  68. 제 66 항에 있어서, 크로마토그래피 단계는 아데노바이러스를 1회 크로마토그래피 분리에 적용하는 단계를 수반하는 것을 특징으로 하는 방법.
  69. 제 68 항에 있어서, 크로마토그래피 분리는 이온 교환 크로마토그래피를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  70. 제 1 항 또는 19 항에 있어서, 바이러스 생산을 분석하는 단계가 추가로 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
  71. 제 70 항에 있어서, 바이러스 생산은 HPLC를 이용하여 분석되는 것을 특징으로 하는 방법.
  72. 제 1 항 또는 19 항에 있어서, 아데노바이러스의 분리에는 아래의 특성 중에서 한가지 이상을 보유하는 정제된 아데노바이러스 조성물을 수득하는 단계가 추가 로 포함되는 것을 특징으로 하는 방법:
    (a) 1 x 109 내지 1 x 1013 pfu/㎖의 바이러스 역가;
    (b) 1 x 1010 내지 2 x 1013 입자/㎖의 바이러스 입자 농도;
    (c) 10 내지 60의 입자:pfu 비율;
    (d) 1 x 10e12 바이러스 입자당 50 ng 미만의 BSA;
    (e) 1 x 1012 바이러스 입자당 50 pg 내지 1 ng의 오염 인간 DNA;
    (f) 피크 아래 영역(area under peak)의 97% 내지 99%로 구성되는 단일 HPLC 용출 피크.
  73. 제 1 항 또는 19 항에 따른 공정으로 제조되고 5 x 1014 내지 1 x 1018 바이러스 입자를 함유하는 아데노바이러스 조성물.
  74. 제 73 항에 있어서, 제약학적으로 수용가능한 조성물인 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 조성물.
  75. 제 1 항 또는 19 항에 있어서, 아데노바이러스 제조물로부터 아데노바이러스의 분리에는 아래의 단계가 포함되는 것을 특징으로 하는 방법:
    (a) 제 1 크로마토그래피 배지에서 아데노바이러스 제조물을 크로마토그래피 에 적용하고, 여기서 아데노바이러스 입자는 제 1 크로마토그래피 칼럼에 유지되고;
    (b) 제 1 크로마토그래피 배지로부터 아데노바이러스 입자를 용출하여 아데노바이러스 입자의 용출액을 생산하고;
    (c) 제 2 크로마토그래피 배지에서 용출액으로부터 유래된 아데노바이러스 입자를 크로마토그래피에 적용하고, 여기서 제 2 크로마토그래피 배지는 용출액으로부터 한가지 이상의 오염물질을 보유하고, 제 2 크로마토그래피 배지는 크기 배제 배지가 아니며;
    (d) 용출액으로부터 아데노바이러스 입자를 수집한다.
  76. 제 75 항에 있어서, 제 1 크로마토그래피 배지는 음이온 교환 배지, 양이온 교환 배지, 고정된 금속 친화성 배지, 황산화된 친화성 배지, 면역친화성 배지, 헤파린 친화성 배지, 하이드록시아파티트(hydroxyapatite) 배지, 소수성 상호작용 배지에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  77. 제 75 항에 있어서, 제 2 크로마토그래피 배지는 음이온 교환 배지, 양이온 교환 배지, 고정된 금속 친화성 배지, 황산화된 친화성 배지, 염료친화성 배지, 하이드록시아파티트(hydroxyapatite) 배지, 면역친화성 배지, 헤파린 친화성 배지, 소수성 상호작용 배지에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  78. 제 1 항 또는 19 항에 있어서, 아데노바이러스 제조물로부터 아데노바이러스의 분리에는 아래의 단계가 포함되는 것을 특징으로 하는 방법:
    (a) 제 1 크로마토그래피 배지에서 아데노바이러스 제조물을 크로마토그래피에 적용하고, 여기서 아데노바이러스 제조물로부터 오염물질은 제 1 크로마토그래피 칼럼에 유지되고;
    (b) 제 2 크로마토그래피 배지에서 용출액에 남아있는 아데노바이러스 입자를 크로마토그래피에 적용하고, 여기서 용출액으로부터 유래된 아데노바이러스 입자는 제 2 크로마토그래피 배지에 유지되고, 제 2 크로마토그래피 배지는 음이온 교환 배지이고, 제 1 크로마토그래피 배지는 황산화된 폴리사카라이드 친화성 배지 이외의 배지이며;
    (d) 제 2 크로마토그래피 배지로부터 아데노바이러스 입자를 용출한다.
  79. 제 78 항에 있어서, 제 1 크로마토그래피 배지는 음이온 교환 배지, 양이온 교환 배지, 고정된 금속 친화성 배지, 황산화된 친화성 배지, 면역친화성 배지, 헤파린 친화성 배지, 하이드록시아파티트(hydroxyapatite) 배지, 소수성 상호작용 배지에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  80. 제 78 항에 있어서, 제 2 크로마토그래피 배지는 음이온 교환 배지, 양이온 교환 배지, 고정된 금속 친화성 배지, 황산화된 친화성 배지, 염료친화성 배지, 하이드록시아파티트(hydroxyapatite) 배지, 면역친화성 배지, 헤파린 친화성 배지, 소수성 상호작용 배지에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
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