JP2007500015A - アデノウイルスベクター産生のための方法および組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、一般に、細胞培養およびウイルス産生分野に関する。より詳細には、哺乳動物細胞の培養方法、これらの細胞のアデノウイルスでの感染、ならびにこれら由来の感染性アデノウイルス粒子の産生および精製に関する。なお、本出願は、2003年3月15日提出のU. S. Patent Application Serial No. 10/439, 278の出願日の恩典を主張する。上記引用の開示全体が、権利放棄することなく参照により本明細書に組み入れられる。
種々の癌および遺伝病は、現在、遺伝子治療によって取り組まれている。ウイルスはしばしば感染した宿主の免疫系による検出を回避するが、特定の細胞種への核酸伝達で非常に有効である。これらの特徴は、一定のウイルスを遺伝子治療で使用するための遺伝子送達媒体としての魅力的な候補にしている(Robbins and Ghivizzani, 1998; Cristiano et al., 1998)。複製能力がなく、それにより非病原性を示す修飾アデノウイルスは、多数の代謝障害および腫瘍障害のための治療遺伝子を送達するための媒体として使用される。これらのアデノウイルスベクターは、特に、DNAが宿主ゲノムに組み込まれず、且つ導入遺伝子発現が制限されるので、一過性治療遺伝子発現によって最良に治療される癌などの障害に適切であり得る。アデノウイルスベクターはまた、遺伝子置換療法で特に有益であり、遺伝子または代謝の欠陥または欠失を、欠陥または欠失を修復する産物をコードする置換遺伝子の発現の提供によって修復する。
本発明は、アデノウイルスを培地中で成長した宿主細胞の感染によって産生した場合、アデノウイルス産生は37℃をわずかに下回る感染温度で最大となるという発見に基づく。アデノウイルス感染のための最適な感染温度範囲の同定により、遺伝子治療のためのアデノウイルスベクターの産生技術が有意に改良される。
真核遺伝子発現およびワクチン開発においてアデノウイルスベクターを首尾よく使用することができることが示されている。アデノウイルスを遺伝子治療に使用することができるという証拠が増加している。組換えアデノウイルスの異なる組織への投与における研究の成功は、遺伝子治療におけるアデノウイルスベクターの有効性を証明している。この成功により、ヒト臨床試験においてこのようなベクターが使用されている。現在、種々の治療で使用すべきアデノウイルスベクターの産生の要求が増加している。現在利用可能な技術は、このような要求を満たすには不十分である。本発明は、このような治療で使用するための大量のアデノウイルスの産生および精製方法を提供する。
アデノウイルスは、30kb〜35kbのサイズ範囲のゲノムを有する線状二本鎖DNAを含む(Reddy et al., 1998; Morrison et al., 1997; Chillonet al., 1999)。ヒトアデノウイルスは50を超える血清型が存在し、免疫学的、分子的、および機能的基準に基づいて6つのファミリーに分類される80を超える関連形態が存在する(Wadell et al., 1980)。物理的には、アデノウイルスは、例えば、5型では35,935塩基対である二本鎖線状DNAゲノムを含む中型で20面体のウイルスである(Chroboczek et al., 1992)。アデノウイルスは、宿主細胞に侵入し、細胞の感染およびウイルスの複製のために核にウイルスゲノムを送達する。アデノウイルスゲノムの顕著な特徴は、初期領域(E1、E2、E3、およびE4遺伝子)、中期領域(pIX遺伝子、Iva2遺伝子)、後期領域(Ll、L2、L3、L4、およびL5遺伝子)、主要後期プロモーター(MLP)、逆方向末端反復(ITR)、およびΨ配列(Zheng, et al., 1999; Robbins et al., 1998; Graham and Prevec, 1995)である。感染後にウイルスから初期遺伝子E1、E2、E3、およびE4が発現し、これらは、ウイルス遺伝子発現、細胞遺伝子発現、ウイルス複製、および細胞アポトーシスの阻害を調節するポリペプチドをコードする。さらに、ウイルス感染時に、MLPが活性化されて、アデノウイルスキャプシド形成に必要なポリペプチドをコードする後期(L)遺伝子を発現する。中期領域は、アデノウイルスキャプシド成分をコードする。アデノウイルス逆方向末端反復(ITR;100〜200bp長)はcisエレメントであり、複製起点として機能し、ウイルスDNA複製に必要である。Ψ配列は、アデノウイルスゲノムのパッケージングに必要である。
本発明の種々の態様は、アデノウイルスの産生方法を含む。「宿主細胞」は、アデノウイルスの複製を補助することができる細胞と定義される。細胞がアデノウイルスの複製を補助することができる限り、宿主細胞として使用するための任意の細胞型が本発明で意図される。例えば、宿主細胞は、HEK293細胞、PER.C6細胞、911細胞、またはIT293SF細胞であり得る。当業者は、アデノウイルスの産生方法での使用で利用可能な広範な宿主細胞に精通している。
感染性ウイルスベクターを産生する能力は、製薬産業、特に遺伝子治療の状況において、ますます重要である。この十年にわたって、バイオテクノロジーにおける進歩は、治療法、ワクチン、およびタンパク質産生機として使用可能な多数の重要なウイルスベクターの産生をもたらした。哺乳動物培養におけるウイルスベクターの使用は、ジスルフィド依存性折り畳みおよびグリコシル化のような複雑なタンパク質構造を転写後プロセスするそれらの能力の点で、細菌または他の下等生命体宿主において産生されるタンパク質を越える利点を有する。
本発明のいくつかの態様では、アデノウイルスの産生方法は、足場依存性培養における宿主細胞の成長が必要である一方で、他の態様は非足場依存性培養におけるアデノウイルスの産生方法に関する。動物細胞およびヒト細胞を、以下の2つの様式:培養物全体の懸濁液中で自由に成長する非足場依存性細胞として;または増殖のために固体基質への付着が必要な足場依存性細胞(すなわち、単層型の細胞成長)として増殖させることができる。
本発明の選択された態様の状況で使用されるバイオリアクターは、撹拌タンクバイオリアクターであり得る。攪拌タンク中の哺乳動物培養の大量懸濁培養を¥が記載されている。バイオリアクターの計装制御設備を、発酵槽のデザインと共に、関連する微生物の適用から適合させた。しかし、成長がより遅い哺乳動物培養における夾雑物管理の要求の増加が認められたので、改良された無菌デザインを迅速に実施し、これらのリアクターの信頼性を改善した。計装制御設備は、他の発酵槽で見出されるものと基本的に同一であり、撹拌、温度、溶存酸素、およびpHの調節を含む。濁度(存在粒子の関数)、キャパシタンス(存在生細胞の関数)、グルコース/乳酸、炭酸/重炭酸、および二酸化炭素のオンラインおよびオフライン測定のためのより高度なプローブおよび自動分析装置を利用可能である。本発明の1つの態様では、自動分析装置は、YSI-2700 SELECT(商標)分析器である。
伝統的に、足場依存性細胞培養物は、小さなガラスまたはプラスチック容器の底部で増殖する。研究室規模に適切な、古典的で伝統的な技術によって提供される制限された表面-容量比は、大規模な細胞および細胞産物の産生において障害を生じる。小さな培養体積における細胞増殖のための大きな利用可能表面を提供する系を提供するために、多数の技術が報告されている:ローラーボトル系、積層プレート増殖器(stack plate propagator)、らせんフィルムボトル、中空繊維系、充填べッド(packed bed)、プレート交換系(plate exchanger system)、および膜チューブリール(membrane tubing reel)。これらの系は、性質が不均一であり、時々複数のプロセスに基づくので、以下の短所に悩まされる−スケールアップのための限定された能力、細胞サンプルを得ることにおける困難、鍵となるプロセスパラメーターを測定および制御するための限定された能力、および培養を通して均一な環境条件を維持することの困難。
伝統的な足場依存性培養プロセスの短所を克服するための努力の結果、van Wezel(1967)は、マイクロキャリア培養系の概念を開発した。この系において、細胞は、増殖培地に懸濁された小さな固体粒子の表面で、遅い撹拌によって増殖される。細胞はマイクロキャリアに付着し、そしてマイクロキャリアの表面でコンフルエンシーまで徐々に増殖する。実際、この大規模培養系は、付着依存性培養を、単一ディスクプロセスから、単層および懸濁培養の両方がともにもたらされたユニットプロセスにアップグレードする。従って、細胞の増殖に必要な表面と、均一な懸濁培養の利点との組み合わせにより、産生が増加する。
哺乳動物細胞を培養するのに特に有用であることが示されている1つの方法は、マイクロカプセル化である。哺乳動物細胞は、半透性ヒドロゲル膜内に保持される。多孔性膜は細胞を囲んで形成され、栄養素、気体、および代謝産物の、カプセルの周りの大量の培地との交換を許容する。穏和で、迅速な、そして非毒性のいくつかの方法が開発されており、ここで得られる膜は、培養の期間を通じて増殖する細胞塊を維持するのに、十分多孔性かつ強力である。これらの方法は全て、カルシウム含有溶液との液滴接触によってゲル化された可溶性アルギン酸に基づいている。Lim(1982,米国特許第4,352,883号、本明細書中に参照として組み入れられる)は、細胞を約1%アルギン酸ナトリウム溶液に濃縮し、小さな開口部を介して液滴を形成させ、約1%塩化カルシウム溶液に拡散させることを記載している。次いで、液滴はアルギン酸の表面にイオン結合するポリアミノ酸の層に注入される。最後にアルギン酸は、キレート試薬中で液滴を処理してカルシウムイオンを除去することによって、再液化される。他の方法は、アルギン酸溶液に滴下されることにより中空アルギン酸球を作製する、カルシウム溶液中の細胞を使用する。同様のアプローチは、アルギン酸に滴下され中空球を作製するキトサン溶液中の細胞を含む。
本発明のある態様は、灌流付着系の使用を伴うアデノウイルスの産生方法を伴う。灌流とは、(生理学的栄養溶液の)細胞集団中または細胞集団上の、一定速度で連続する流れを意味する。細胞を回収された培地で洗い流す連続フロー培養(例えば、ケモスタット)とは反対に、培養ユニット内の細胞の保持を意味する。灌流の考え方は、今世紀初め以来公知であり、そして長期の顕微鏡観察の間組織片を生存させておくために適用されている。この技術は、血液、リンパ、または他の体液が連続的に細胞に供給される、インビボでの細胞環境を模倣することを開始した。灌流なしでは、培養物中の細胞は、流加(fed)および飢餓の交互段階を受けるため、それらの増殖および代謝能力の完全な発現を制限する。
特定の態様では、宿主細胞(例えば、HEK293細胞)の足場依存性培養からアデノウイルスを産生する。アデノウイルスベクター産生のスケールアップは、293A細胞の足場依存性に制限される。スケールアップを容易にしてアデノウイルスベクターに対するさらなる要求を満たすために、スケールアップ可能な別の産生プロセスを開発するために非常に努力した。方法は、バイオリアクター中でのHEK293の成長および宿主細胞の懸濁培養への適合を含む。
本発明は、アデノウイルスでの宿主細胞の感染を含むアデノウイルスの産生方法に関する。典型的には、ウイルス取り込みを可能にする生理学的条件下で、ウイルスを適切な宿主細胞に簡単に曝露する。当業者は、ウイルス感染の開始に利用可能な技術範囲に精通している。
ならびに任意の温度範囲またはその誘導可能な温度増加であり得る。当業者に公知の任意の方法を使用して、細胞培養培地の温度を測定することができる。当業者は、培養培地の温度測定に利用可能な広範な方法に精通している。
1.ウイルスベクター
特定の態様では、発現構築物の送達のための組換えアデノウイルスを意図する。「組換えアデノウイルス」、「アデノウイルスベクター」、または「アデノウイルス発現ベクター」は、(a)構築物のパッケージングの補助、および(b)クローン化した組織または細胞特異的構築物の最終的な発現に十分なアデノウイルス配列を含む構築物を含むことを意味する。組換えアデノウイルスは、組換え遺伝子をコードすることができる。したがって、組換えアデノウイルスには、アデノウイルス配列を含む任意の操作ベクターが含まれ得る。
一定の態様では、本発明は、アデノウイルスが組換え遺伝子をコードする組換えアデノウイルスである、アデノウイルスの産生方法を含み得る。組換え遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結することができる。一定の他の態様では、組換え遺伝子は、治療遺伝子である。本発明は、疾患または遺伝子障害の治療における治療または潜在的治療価値のある任意の遺伝子の使用を意図する。当業者は、同定されているこのような広範囲の遺伝子に精通している。
ras、myc、neu、raf、erb、src、fms、jun、trk、ret、gsp、hst、bcl、およびablのような癌遺伝子もまた、適切な標的である。しかし、治療上の利点のため、これらの癌遺伝子は、アンチセンス核酸として発現され、その結果癌遺伝子の発現を阻害する。用語「アンチセンス核酸」は、癌遺伝子をコードするDNAおよびRNAの塩基配列に相補的なオリゴヌクレオチドを意味することが意図される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的細胞に導入された場合、それらの標的核酸に特異的に結合し、そして転写、RNAのプロセシング、輸送、および/または翻訳を妨害する。オリゴヌクレオチドでの二本鎖(ds)DNAの標的化は、三重ヘリックスの形成を導き;RNAの標的化は二本鎖ヘリックスの形成を導く。
他の治療用遺伝子は、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、または寄生虫抗原のような抗原をコードする遺伝子を含み得る。ウイルスは以下を含む:ピコルナウイルス、コロナウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、ラブドウイルス、パラミクソウイルス、オルトミクソウイルス、ブンヤウイルス、アレナウイルス、レオウイルス、レトロウイルス、パポバウイルス、パルボウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、ヘパドナウイルス、およびスポンジ型ウイルス。好ましいウイルス標的として、インフルエンザ、単純ヘルペスウイルス1および2、麻疹、小痘、ポリオ、またはHIVが挙げられる。病原体として、トリパノソーマ、サナダムシ、回虫、ぜん虫が挙げられる。胎児抗原または前立腺特異的抗原のような腫瘍マーカーもまた、この様式で標的化され得る。好ましい例として、HIVエンベロープタンパク質およびB型肝炎表面抗原が挙げられる。ワクチンのための本発明のベクターの投与は、ベクター関連抗原が、導入遺伝子の長期間の発現を可能にするために十分に非免疫原性であることを必要とする。このために、強力な免疫応答が所望される。好ましくは、個々のワクチン接種は、まれに(例えば、1年ごとまたは2年ごと)しか必要とされず、感染要因に対する長期間の免疫学的保護を提供する。
ウイルスベクターが治療用遺伝子をコードする転写の発現に影響を及ぼすために、治療用遺伝子をコードするポリヌクレオチドは、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルの転写制御下にある。したがって、本発明の特定の態様は、プロモーターに作動可能に連結された外来遺伝子構築物をコードするアデノウイルスベクターを含むアデノウイルスの産生方法を伴う。「プロモーター」は、宿主細胞の合成機構によって認識されるDNA配列、または遺伝子の特異的な転写を開始するために必要とされる導入された合成機構をいう。ポリアデニル化シグナルは、宿主細胞の合成機構によって認識されるDNA配列、または翻訳のための細胞質への細胞核の転写後の適切なプロセシングおよび輸送のために、mRNA転写物の末端への一連のヌクレオチドの付加を導入することに必要とされる、導入された合成機構をいう。「作動可能に連結された」、「制御下」、および「転写制御下」という語は、プロモーターがRNAポリメラーゼの開始およびポリヌクレオチドの発現を制御するためにポリヌクレオチドに関して適切な位置に存在することを意味する。
アデノウイルス感染により、感染された細胞が溶解する。アデノウイルス感染の溶解特性により、ウイルスの単離および産生には2つの異なる様式が可能である。一方は細胞溶解前にの感染細胞の回収である。他方の様式は、産生されたウイルスによる完全な細胞溶解後のウイルス上清の回収である。後者の様式のために、完全な細胞溶解を達成するために、より長いインキュベーション時間が必要である。ウイルス感染後のこの長いインキュベーション時間により、特に、現在の初代アデノウイルスベクター(E1欠失ベクター)についての複製コンピテントアデノウイルス(RCA)の生成可能性の増大が深刻に懸念される。したがって、本発明の一定の態様では、アデノウイルスの産生方法は、宿主細胞を回収し、その後宿主細胞を溶解する工程を含む。表3は、細胞回収後の細胞溶解に使用されている最も一般的な方法を列挙する。
本発明の一定の態様では、アデノウイルスの産生方法は、界面活性剤での宿主細胞の溶解によってアデノウイルスを単離する工程を含む。細胞は、膜によって結合している。細胞成分を放出させるために、細胞を破壊して開口する必要がある。本発明によれば、これを達成することができる最も有利な方法は、界面活性剤の使用で膜を可溶化することである。界面活性剤は、脂肪族または芳香族の性質を有する無極性末端および荷電していても荷電していなくてもよい極性末端を有する両親媒性分子である。界面活性剤は、脂質よりも親水性が高いので、脂質よりも水溶性が高い。これらは、水不溶性化合物を水媒体に分散させ、天然形態のタンパク質を単離および精製するために使用する。
この界面活性剤ファミリー(Triton(登録商標)X-100、X114、およびNP-40)は、同一の基本的特徴を有するが、その特定の疎水性−親水性が異なる。これらの全異種界面活性剤は、芳香環に結合した分岐8炭素鎖を有する。分子のこの部分は、界面活性剤の疎水性のほとんどに寄与する。Triton(登録商標)X界面活性剤を使用して、非変性条件下で膜タンパク質を可溶化する。タンパク質を可溶化するための界面活性剤の選択は、可溶化すべきタンパク質の疎水性に依存する。疎水性タンパク質は、これらを効率的に可溶化するための疎水性界面活性剤が必要である。
これらは、疎水性鎖に結合した種々の長さのポリオキシエチレン鎖を有するという点で、Triton(登録商標)界面活性剤の構造と類似している。しかし、Triton(登録商標)界面活性剤と異なり、Brij(登録商標)界面活性剤は芳香環を持たず、炭素鎖の長さも変化し得る。Brij(登録商標)界面活性剤は、透析を使用して溶液から除去することが困難であるが、界面活性剤除去ゲルによって除去することができる。Brij(登録商標)58は、その疎水性/親水性特性がTriton(登録商標)X100と最も類似している。Brij(登録商標)-35は、一般に使用されているHPLC適用における界面活性剤である。
η-オクチル-β-グルコシド(オクチルグルコピラノシド)およびη-オクチル-β-D-チオグルコシド(オクチルチオグルコピラノシド、OTG)は、溶液から容易に透析される非変性非イオン性界面活性剤である。これらの界面活性剤は、膜タンパク質の可溶化に有用であり、280nmでのUV吸収は低い。オクチルグルコシドは、23〜25mMの高CMCを有し、膜タンパク質を可溶化するために1.1〜1.2%の濃度で使用されている。
Tween(登録商標)界面活性剤は、非変性非イオン性界面活性剤である。これらは、脂肪酸のポリオキシエチレンソルビタンエステルである。Tween(登録商標)20およびTween(登録商標)80界面活性剤は生化学的適用におけるブロッキング剤として使用され、通常、プラスチックまたはニトロセルロースなどの疎水性材料への非特異的結合を防止するためにタンパク質溶液に添加する。これらを、ELISAおよびブロッティングへの適用におけるブロッキング剤として使用されている。一般に、これらの界面活性剤を、疎水性材料への非特異的結合を防止するために0.01〜1.0%の濃度で使用する。
双性イオン界面活性剤(CHAPS)は、コール酸のスルホベタイン誘導体である。この双性イオン界面活性剤は、タンパク質活性が重要である場合、膜タンパク質可溶化に有用である。この界面活性剤は、広いpH範囲(pH2〜12)にわたって有用であり、高CMC(8〜10mM)のために、透析によって溶液から容易に除去される。この界面活性剤は280nmでの吸光度が低く、この波長でのタンパク質モニタリングが必要である場合に有用になる。CHAPSは、BCAタンパク質アッセイに適合し、界面活性剤除去ゲルによって溶液から除去することができる。タンパク質は、CHAPSの存在下でヨウ素化される。
本発明の他の有利な局面と組み合わせて、好ましくはないが、種々の非界面活性剤法を使用することができる。
これは、穏やか且つ有効な様式での細胞溶解のために広範に使用されている技術である。一般に、細胞を、例えば、ドライアイス/エタノール浴中で完全に凍結するまで急速凍結し、その後完全に解凍するまで37℃浴に移す。完全な細胞溶解を達成するために、このサイクルを何回も繰り返す。
高周波数の超音波振動は、細胞破壊に有用であることが見出されている。超音波が細胞を破壊する方法は、完全に理解されていないが、懸濁液が超音波振動に供されると、高過渡圧力が生成することが公知である。この技術の主な欠点は、大量の熱を発生することである。熱の影響をを最小にするために、特別にデザインしたガラス容器を使用して細胞懸濁液を保持する。このようなデザインにより懸濁液を超音波プローブからフラスコが氷中で懸濁されるように冷却した容器の外側へ循環させる。
これは、頻繁に使用されている微生物細胞の破壊方法である。フレンチプレスは、細胞を破壊するために10.4×107Pa(16,000p.s.i)の圧力を使用する。これらの装置は、ニードル弁によって外側に開くステンレススチール室からなる。細胞懸濁液を、ニードル弁が閉じた状態で室中にいれる。室の反転後、弁を開き、ピストンを押し下げて室中の任意の空気を強制的に押し出す。弁を閉じた位置にし、室を元の位置に戻し、固い基台上におき、ピストンで水圧によって必要な圧力をかける。圧力が到達した場合、ニードル弁を少し開けて圧力をわずかに放出させ、細胞が拡大するにつれて細胞が破壊される。回収されうる破裂細胞の滴が存在するように、圧力を維持しながら弁を開けたままにする。
直径500nmのガラスビーズの存在下で懸濁液を強く(300〜3000回/分)振動させるMickleシェーカー中で研磨剤を使用した機械的剪断を行うことができる。この方法により、オルガネラが損傷し得る。より制御された方法は、研磨剤と共に多くの細胞を、または細胞の冷凍ペーストを圧力室中の直径0.25mmのスロットを通過するようにピストンで押し進めるHughesプレスを使用することである。5.5×107Pa(8000p.s.i.)までの圧力を使用して、細菌調製物を溶解することができる。
これらの方法は、高速往復または回転ブレードを使用するブレンダー、プランジャおよびボールの上下動およびマイクロフルイダイザーを使用するホモジナイザー、または小直径チューブの高速通過もしくは2つの流動物の流れの高速衝突を使用する衝突噴流を使用する。効率よく混合するために、ブレンダーのブレードを異なる角度に傾ける。ホモジナイザーは、通常、局所発熱を最小にするために、数秒間の短時間高速破裂で操作する。これらの技術は、一般に、微生物細胞で適切ではないが、非常に穏やかな液体剪断は、通常、動物細胞の破壊に適切である。
細胞を、はるかに低い(低張)または高い(高張)溶質濃度の溶液に曝露する。溶質濃度の相違によって、浸透圧勾配が得られる。低張環境における細胞内への得られた水流により、細胞が膨張して破裂する。高張環境における細胞外への水流により、細胞が縮んでその後破裂する。
本発明は、アデノウイルスを単離する工程を含むアデノウイルスの産生方法を含む。宿主細胞からのアデノウイルスの単離方法は、当業者に公知の任意の方法を含む。例えば、これらの方法には、清澄化、濃縮、およびダイアフィルトレーションが含まれ得る。精製プロセス中の1つの工程には、細胞溶解物から巨大な粒子(特に、細胞成分)を除去するための細胞溶解物の清澄化が含まれ得る。デプスフィルターを使用するかクロスフロー濾過によって、溶解物を清澄化することができる。本発明の1つの態様では、細胞溶解物を濃縮する。粗細胞溶解物の濃縮は、当業者に公知の任意の工程を含み得る。例えば、粗細胞溶解物を、比較的非吸着性の材料(例えば、ポリエステル樹脂、砂、珪藻土、コロイド、およびゲルなど)のパックカラムからなるデプスフィルターを通過させることができる。クロスフロー濾過(TFF)では、溶解物溶液は、膜表面を通過して流れ、膜表面から大量の溶液への溶質の逆拡散を容易にする。膜は、一般に、種々のフィルター装置型(オープンチャネルプレートおよびフレーム、中空糸、ならびに細管が含まれる)内で配置する。
アデノウイルス産生方法の一定の態様は、粗細胞溶解物中の核酸の夾雑濃度の減少を含む。本発明は、夾雑核酸を除去するためにヌクレアーゼを使用する。例示的ヌクレアーゼには、当技術分野内で一般的に使用されているBenzonase(登録商標)、Pulmozyme(登録商標)、または任意の他のDNアーゼもしくはRNアーゼが含まれる。
本発明の一定の態様は、アデノウイルスの精製を含むアデノウイルスの産生方法を含む。特許請求の範囲に記載の方法で作製されたアデノウイルスを、当業者に公知の任意の方法によって精製することができる。一定の態様では、特定の精製技術を使用する。これらの技術を、以下に示す。
密度勾配遠心分離の2つの方法(速度帯技術(rate zonal technique)および等密度(等しい密度)技術)があり、両方とも粒子の混合物のすべての成分の定量的分離が必要とされる場合に使用され得る。これらは、浮遊密度の決定のためおよび沈降係数の評価のためにも使用される。
本発明のある実施態様では、アデノウイルスをクロマトグラフィーを用いて精製する。アデノウイルスを一つまたは複数のクロマトグラフィー工程に供してもよい。精製技術は、当技術分野で周知である。これらの技術は、混合物の他の成分からアデノウイルス粒子を分離するための細胞環境の分画化を包含する傾向がある。他の成分からアデノウイルス粒子が分離されると、アデノウイルスは、完全な精製を達成するために、クロマトグラフィーおよび電気泳動技術を使用して精製され得る。本発明の純粋なアデノウイルス粒子の調製に特に適切な分析方法は、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー;およびポリアクリルアミドゲル電気泳動である。本発明に関連して用いられるべき特に効率的な精製方法は、HPLCである。
イオン交換クロマトグラフィーの基本原理は、交換体に対する物質の親和性が、材料の電気的特性および溶媒中の他の荷電物質の相対親和性の両方に依存する。したがって、結合した材料は、pHを変化させること、そのため材料の電荷を変化させることによって、あるいは競合する材料(その塩は1例にすぎない)を添加することによって、溶出され得る。異なる物質は異なる電気的特性を有するので、遊離についての条件は、各結合した分子種で変化する。一般的に、良好な分離を得るために、選択方法は、連続的イオン強度勾配溶出または段階的溶出のいずれかである。(イオン強度を同時に増加させることなくpH勾配を設定することは困難であるので、pHのみの勾配は使用されないことが多い。)陰イオン交換体については、pHおよびイオン強度が徐々に増加するか、またはイオン強度のみが増加するかのいずれかである。陽イオン交換体については、pHおよびイオン強度の両方とも増加する。溶出手順の実際の選択は、通常、試行錯誤、および安定性の考慮の結果である。例えば、不安定な材料については、かなり一定のpHを維持することが最良である。
一定の態様では、本発明は、アデノウイルスを薬学的に許容される組成物中に配置する工程を含む、アデノウイルスの産生方法を含む。本発明はまた、薬学的に許容される組成物である、本明細書に開示の方法の1つによって調製したアデノウイルスの組成物を含む。
以下の実施例は、本発明の好ましい態様を証明するために含まれる。本発明の実施で十分に機能させるために本発明者らによって発見された本技術に従った実施例に技術を開示し、それにより、その実施のための好ましい様式を構成すると考えることができることが当業者に認識されるはずである。しかし、当業者は、本開示に照らして、開示した特定の態様を多数の変更形態を得ることができ、依然として本発明の精神および範囲から逸脱することなく同等または類似の結果を得ることができることを認識するはずである。
例示的手順
アデノウイルス産生に対する感染温度の効果を評価するための研究を、2つのアデノウイルスベクター(Adp53およびAdmda7)を使用して行った。
バイオリアクターのモデル:20/50EH (Wave Biotech, LLC)
培養培地: CD293無タンパク質培地(Invitrogen(商標))
HEK293懸濁細胞:Introgen Therapeutics, Inc.で無血清懸濁培養に適合させる
アデノウイルスベクター: Introgen Therapeutics, Inc. 製
YSI生化学分析器: YSI-2700 SELECT(商標)
培地灌流を使用しない細胞成長およびアデノウイルスベクターの産生
アデノウイルスベクターの産生を、10L(作業体積は5L)Waveバイオリアクター(登録商標)で行った。HEK293懸濁細胞を、4.8E5細胞/mlで播種し、無タンパク質CD293培地中で1.2E6細胞/mlまで成長させた。ロッキング速度を10に設定し、ロッキング角度を11に設定した。ガスミキサーによって送達されたCO2ガス比率の調整によって培地pHを維持した。Wave Biotech(商標)から供給されている使い捨てのDOTプローブを使用して、培養培地中の溶存酸素圧(DOT)をモニタリングした。
細胞成長期に灌流を使用した細胞成長およびアデノウイルスベクター産生
固有にデザインした灌流Waveバイオリアクターを、図4に記載のように設定した。図4に示すシステムは、細胞と使用済み培地とを分離するための内部平面フィルターを使用する。使用済み培養培地を、浮遊フィルターを介して回収する。培地の再循環が必要ないので、この培地灌流様式は培養細胞に非常に穏やかである。波動は、灌流中のフィルターの目詰りを最小にする。灌流時の培養体積を、新鮮な培地の添加を開始するために使用したロードセルによって維持する。
以下の参考文献は、これらが例示的手順または他の詳細を補助的に本明細書に提供する範囲で、参照により本明細書に組み入れられる。
Claims (80)
- a)(i)培地中で宿主細胞を成長させる工程;および
(ii)37℃未満の成長許容温度で宿主細胞をアデノウイルスに感染させる工程;
を含む、アデノウイルス調製物を調製する工程;ならびに
b)該アデノウイルス調製物からアデノウイルスを単離する工程;
を含む、アデノウイルスの産生方法。 - 宿主細胞をアデノウイルスに感染させる工程が、31℃を超えるが37℃未満の温度で行われる、請求項1記載の方法。
- 宿主細胞をアデノウイルスに感染させる工程が、32℃〜36℃の範囲内の温度で行われる、請求項1記載の方法。
- 宿主細胞をアデノウイルスに感染させる工程が、33℃〜36℃の範囲内の温度で行われる、請求項1記載の方法。
- 宿主細胞をアデノウイルスに感染させる工程が、34℃〜36℃の範囲内の温度で行われる、請求項1記載の方法。
- 宿主細胞をアデノウイルスに感染させる工程が、35℃〜36℃の範囲内の温度で行われる、請求項1記載の方法。
- 宿主細胞をアデノウイルスに感染させる工程が、32℃〜37℃未満の範囲内の温度で行われる、請求項1記載の方法。
- 宿主細胞をアデノウイルスに感染させる工程が、33℃〜37℃未満の範囲内の温度で行われる、請求項1記載の方法。
- 宿主細胞をアデノウイルスに感染させる工程が、34℃〜37℃未満の範囲内の温度で行われる、請求項1記載の方法。
- 宿主細胞をアデノウイルスに感染させる工程が、35℃〜37℃未満の範囲内の温度で行われる、請求項1記載の方法。
- 宿主細胞をアデノウイルスに感染させる工程が、36℃〜37℃未満の範囲内の温度で行われる、請求項1記載の方法。
- 宿主細胞をアデノウイルスに感染させる工程が、約36℃の温度で行われる、請求項1記載の方法。
- 宿主細胞をアデノウイルスに感染させる工程が、約35℃の温度で行われる、請求項1記載の方法。
- 宿主細胞をアデノウイルスに感染させる工程が、約34℃の温度で行われる、請求項1記載の方法。
- 宿主細胞をアデノウイルスに感染させる工程が、約33℃の温度で行われる、請求項1記載の方法。
- 宿主細胞をアデノウイルスに感染させる工程が、約32℃の温度で行われる、請求項1記載の方法。
- 培地がDMEM+2% FBSである、請求項1記載の方法。
- 培地中のグルコース濃度を約0.5g〜約3.0gグルコース/リットルに維持する、請求項1記載の方法。
- a)(i)バイオリアクター中の培地中で宿主細胞を成長させる工程;
(ii)宿主細胞を新鮮な培地およびアデノウイルスで希釈することによってウイルス感染を開始する工程;
を含む、アデノウイルス調製物を調製する工程;ならびに
b)アデノウイルス調製物からアデノウイルスを単離する工程;
を含む、アデノウイルスの産生方法。 - 培地が無血清培地である、請求項19記載の方法。
- 培地が無タンパク質培地である、請求項19記載の方法。
- 無タンパク質培地がCD293である、請求項19記載の方法。
- バイオリアクターが、平面プラットフォームの軸揺動(axial rocking)を使用してバイオリアクターの内側で波動を誘導するバイオリアクターを含む、請求項19記載の方法。
- ポリエチレンビニルアセテートおよびエチルビニルアルコールの層から作製された滅菌バッグの内側で波動を誘導する、請求項23記載の方法。
- バイオリアクターが使い捨てのバイオリアクターである、請求項19記載の方法。
- バイオリアクターが10Lのバイオリアクターである、請求項19記載の方法。
- バイオリアクターが市販のバイオリアクターである、請求項19記載の方法。
- アデノウイルス調製物を調製する工程が培地のpHをモニタリングする工程をさらに含む、請求項19記載の方法。
- アデノウイルス調製物の調製が培地中の溶存酸素圧をモニタリングする工程をさらに含む、請求項19記載の方法。
- アデノウイルス調製物を調製する工程が培地の温度をモニタリングする工程をさらに含む、請求項19記載の方法。
- アデノウイルス調製物を調製する工程がフィルターを介して培地を灌流する工程をさらに含む、請求項19記載の方法。
- フィルターがバイオリアクターの内部に存在する、請求項31記載の方法。
- フィルターがバイオリアクターの外部に存在する、請求項31記載の方法。
- フィルターが浮遊平面フィルター(floating flat filter)である、請求項31記載の方法。
- アデノウイルス調製物を調製する工程がフィルターを介してバイオリアクターから使用済み培地を除去する工程をさらに含む、請求項19記載の方法。
- アデノウイルス調製物を調製する工程が、新鮮な培地の添加を引き起こすために使用したロードセルによって培養物体積を維持する工程をさらに含む、請求項19記載の方法。
- アデノウイルス調製物を調製する工程が宿主細胞成長の3日目から開始される培地の灌流工程をさらに含む、請求項19記載の方法。
- 培地で宿主細胞を希釈する工程が、新鮮な培地およびアデノウイルスで宿主細胞を2倍〜50倍に希釈することによって行われる、請求項19記載の方法。
- 宿主細胞を新鮮な培地およびアデノウイルスで10倍に希釈する、請求項38記載の方法。
- 第2のバイオリアクター中でウイルス感染を開始する工程をさらに含む、請求項19記載の方法。
- ウイルス感染の開始が、20〜100vp/宿主細胞を添加する工程を含む、請求項19記載の方法。
- ウイルス感染の開始が、約50vp/宿主細胞を添加する工程を含む、請求項41記載の方法。
- アデノウイルス調製物を調製する工程が、ウイルス感染を約4日間続行する工程をさらに含む、請求項19記載の方法。
- アデノウイルス調製物からアデノウイルスを単離する工程を、ウイルス感染完了から約4日後に行う、請求項19記載の方法。
- 宿主細胞が複製欠損アデノウイルスの成長を補完する、請求項1または19記載の方法。
- アデノウイルスが複製欠損アデノウイルスである、請求項1または19記載の方法。
- アデノウイルスがE1領域の少なくとも一部を欠く、請求項46記載の方法。
- アデノウイルスがE1Aおよび/またはE1B領域の少なくとも一部を欠く、請求項46記載の方法。
- 宿主細胞が、293細胞、HEK293細胞、PER.C6細胞、911細胞、およびIT293SF細胞からなる群より選択される、請求項1または19記載の方法。
- 宿主細胞がHEK293細胞である、請求項49記載の方法。
- アデノウイルスが組換えアデノウイルスである、請求項1または19記載の方法。
- 組換えアデノウイルスがプロモーターに作動可能に連結された組換え遺伝子をコードする、請求項51記載の方法。
- プロモーターが組織特異的プロモーターまたは誘導性プロモーターである、請求項52記載の方法。
- プロモーターがSV40 EI、RSV LTR、β-アクチン、CMV-IE、アデノウイルス主要後期、ポリオーマF9-1、チロシナーゼプロモーター、α-胎児性タンパク質プロモーター、またはegr-1である、請求項52記載の方法。
- 組換え遺伝子が、アンチセンスras、アンチセンスmyc、アンチセンスraf、アンチセンスerb、アンチセンスsrc、アンチセンスfms、アンチセンスjun、アンチセンスtrk、アンチセンスret、アンチセンスgsp、アンチセンスhst、アンチセンスbcl、アンチセンスabl、Rb、CFTR、p16、p21、p27、p57、p73、C-CAM、APC、CTS-1、zac1、scFV ras、DCC、NF-1、NF-2、WT-1、MEN-I、MEN-II、BRCA1、VHL、MMAC1、FCC、MCC、BRCA2、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、GM-CSF、G-CSF、チミジンキナーゼ、mda7、fus、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、ADP、p53、ABLI、BLC1、BLC6、CBFA1、CBL、CSFIR、ERBA、ERBB、EBRB2、ETS1、ETS2、ETV6、FGR、FOX、FYN、HCR、HRAS、JUN、KRAS、LCK、LYN、MDM2、MLL、MYB、MYC、MYCL1、MYCN、NRAS、PIM1、PML、RET、SRC、TAL1、TCL3、YES、MADH4、RB1、TP53、WT1、TNF、BDNF、CNTF、NGF、IGF、GMF、aFGF、bFGF、NT3、NT5、ApoAI、ApoAIV、ApoE、Rap1A、シトシンデアミナーゼ、Fab、ScFv、BRCA2、zac1、ATM、HIC-1、DPC-4、FHIT、PTEN、ING1、NOEY1、NOEY2、OVCA1、MADR2、53BP2、IRF-1、Rb、zac1、DBCCR-1、rks-3、COX-1、TFPI、PGS、Dp、E2F、ras、myc、neu、raf、erb、fms、trk、ret、gsp、hst、abl、E1A、p300、VEGF、FGF、トロンボスポンジン、BAI-1、GDAIF、またはMCCである、請求項52記載の方法。
- 組換え遺伝子が、ACP デサチュラーゼ、ACPヒドロキシラーゼ、ADP-グルコースピロホリラーゼ、ATPアーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アミラーゼ、アミログルコシダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、シクロオキシゲナーゼ、デカルボキシラーゼ、デキストリナーゼ、エステラーゼ、DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、ヒアルロンシンターゼ、ガラクトシダーゼ、グルカナーゼ、グルコースオキシダーゼ、GTPアーゼ、ヘリカーゼ、ヘミセルラーゼ、ヒアルロニダーゼ、インテグラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、キナーゼ、ラクターゼ、リパーゼ、リポキシゲナーゼ、リアーゼ、リゾチーム、ペクチンエステラーゼ、ペルオキシダーゼ、ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、ホスホリラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテイナーゼ、ペプチデアーゼ(peptidease)、プルラナーゼ、リコンビナーゼ、逆転写酵素、トポイソメラーゼ、キシラナーゼ、レポーター遺伝子、インターロイキン、またはサイトカインをコードする遺伝子である、請求項52記載の方法。
- 組換え遺伝子が、カルバモイルシンテターゼI、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギノスクシネートシンテターゼ、アルギノスクシネートリアーゼ、アルギナーゼ、フマリルアセトアセテートヒドロラーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、α-1 アンチトリプシン、グルコース-6-ホスファターゼ、低密度リポタンパク質受容体、ポルホビリノゲンデアミナーゼ、第VIII因子、第IX因子、シスタチオンβ-シンターゼ、分岐鎖ケト酸デカルボキシラーゼ、アルブミン、イソバレリル-CoAデヒドロゲナーゼ、プロピオニルCoAカルボキシラーゼ、メチルマロニルCoAムターゼ、グルタリルCoA デヒドロゲナーゼ、インスリン、β-グルコシダーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、肝臓ホスホリラーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ、グリシンデカルボキシラーゼ、H-タンパク質、T-タンパク質、メンケス病銅輸送ATPアーゼ、ウィルソン病銅輸送ATPアーゼ、シトシンデアミナーゼ、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ガラクトース-1-リン酸ウリジルトランスフェラーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、グルコセレブロシダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、α-L-イズロニダーゼ、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、HSVチミジンキナーゼ、またはヒトチミジンキナーゼをコードする遺伝子である、請求項52記載の方法。
- 組換え遺伝子が、成長ホルモン、プロラクチン、胎盤性ラクトゲン、黄体形成ホルモン、卵胞刺激ホルモン、絨毛性ゴナドトロピン、甲状腺刺激ホルモン、レプチン、アドレノコルチコトロピン、アンギオテンシンI、アンギオテンシンII、β-エンドルフィン、β-メラニン細胞刺激ホルモン、コレシストキニン、エンドセリンI、ガラニン、胃抑制ペプチド、グルカゴン、インスリン、リポトロピン、ニューロフィシン、ソマトスタチン、カルシトニン、カルシトニン遺伝子関連ペプチド、β-カルシトニン遺伝子関連ペプチド、悪性腫瘍因子の高カルシウム血症、副甲状腺ホルモン関連タンパク質、副甲状腺ホルモン関連タンパク質、グルカゴン様ペプチド、パンクレアスタチン、膵臓ペプチド、ペプチドYY、PHM、セクレチン、血管活性腸管ペプチド、オキシトシン、バソプレシン、バソトシン、エンケファリンアミド、メトロフィンアミド、αメラニン細胞刺激ホルモン、心房性ナトリウム利尿因子、アミリン、アミロイドP成分、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン放出因子、黄体形成ホルモン放出ホルモン、神経ペプチドY、サブスタンスK、サブスタンスP、または甲状腺刺激ホルモン放出ホルモンをコードする、請求項52記載の方法。
- 組換え遺伝子がp53遺伝子である、請求項52記載の方法。
- 組換え遺伝子がmda7遺伝子である、請求項52記載の方法。
- アデノウイルスを単離する工程が、宿主細胞を溶解する工程を含む、請求項1または請求項19記載の方法。
- 宿主細胞を溶解する工程が、凍結融解、自己溶解、または界面活性剤溶解によるものである、請求項61記載の方法。
- アデノウイルスを単離する工程が、アデノウイルス調製物中の夾雑核酸の濃度を減少させる工程をさらに含む、請求項1または19記載の方法。
- アデノウイルスを単離する工程が、アデノウイルスを薬学的に許容される組成物中に配置する工程をさらに含む、請求項1または19記載の方法。
- アデノウイルスを単離する工程が、アデノウイルスを精製する工程をさらに含む、請求項1または19記載の方法。
- アデノウイルスの精製がクロマトグラフィ工程を含む、請求項65記載の方法。
- クロマトグラフィ工程が、アデノウイルスを複数のクロマトグラフィ分離に供する工程を含む、請求項66記載の方法。
- クロマトグラフィ工程が、アデノウイルスをただ1つのクロマトグラフィ分離に供する工程を含む、請求項66記載の方法。
- クロマトグラフィ分離が、イオン交換クロマトグラフィを含む、請求項68記載の方法。
- ウイルス産生を分析する工程をさらに含む、請求項1または19記載の方法。
- ウイルス産生をHPLCを使用して分析する、請求項70記載の方法。
- アデノウイルスを単離する工程が、一つまたは複数の以下の性質:
(a)ウイルス力価が1×109pfu/ml〜約1×1013pfu/ml;
(b)ウイルス粒子濃度が約1×1010粒子/ml〜約2×1013粒子/ml;
(c)粒子:pfu比が約10〜約60;
(d)1×1012ウイルス粒子あたりのBSAが50ng未満;
(e)1×1012ウイルス粒子あたりの夾雑ヒトDNAが約50pg〜1ng;
(f)本質的にピーク下面積の97%〜99%からなる単一のHPLC溶離ピーク;
を有する精製アデノウイルス組成物を得る工程をさらに含む、請求項1または19記載の方法。 - 請求項1または19記載の方法によって調製された5×1014〜1×1018個のウイルス粒子を含むアデノウイルス組成物。
- 薬学的に許容される組成物である、請求項73記載のアデノウイルス組成物。
- アデノウイルス調製物からアデノウイルスを単離する工程が、
(a)アデノウイルス調製物を第1のクロマトグラフィ媒体上のクロマトグラフィに供し、それによりアデノウイルス粒子が該第1のクロマトグラフィ媒体上に保持される工程;
(b)第1のクロマトグラフィ媒体からアデノウイルス粒子を溶離して、アデノウイルス粒子の溶離物を産生する工程;
(c)溶離物由来のアデノウイルス粒子を第2のクロマトグラフィ媒体上のクロマトグラフィに供し、第2のクロマトグラフィ媒体が溶離物由来の一つまたは複数の夾雑物を保持する工程であって、第2のクロマトグラフィ媒体が単にサイズ排除担体ではない、工程;および
(d)溶離物からアデノウイルス粒子を回収する工程;
を含む、請求項1または19記載の方法。 - 第1のクロマトグラフィ媒体が、陰イオン交換媒体、陽イオン交換媒体、固定化金属アフィニティ媒体、硫酸化アフィニティ媒体、免疫アフィニティ媒体、ヘパリンアフィニティ媒体、ヒドロキシアパタイト媒体、およびハイドロフォビン相互作用担体からなる群より選択される、請求項75記載の方法。
- 第2のクロマトグラフィ媒体が、陽イオン交換媒体、陰イオン交換媒体、固定化金属アフィニティ媒体、硫酸化アフィニティ媒体、色素アフィニティ媒体、ヒドロキシアパタイト媒体、免疫アフィニティ媒体、ヘパリンアフィニティ媒体、および疎水性相互作用媒体からなる群より選択される、請求項75記載の方法。
- アデノウイルス調製物からアデノウイルスを単離する工程が、
(a)アデノウイルス調製物を第1のクロマトグラフィ媒体上のクロマトグラフィに供し、それによりアデノウイルス調製物由来の夾雑物が第1のクロマトグラフィ媒体上に保持される工程;
(b)溶離物中に残存するアデノウイルス粒子を第2のクロマトグラフィ媒体上のクロマトグラフィに供し、それにより溶離物由来のアデノウイルス粒子が第2のクロマトグラフィ媒体上に保持される工程であって、第2のクロマトグラフィ媒体が陰イオン交換媒体である場合、第1のクロマトグラフィ媒体がスルホン化ポリサッカリドアフィニティ媒体以外の媒体である、工程;および
(c)該第2のクロマトグラフィ媒体からアデノウイルス粒子を溶離する工程
を含む、請求項1または19記載の方法。 - 第1のクロマトグラフィ媒体が、陰イオン交換媒体、陽イオン交換媒体、固定化金属アフィニティ媒体、硫酸化アフィニティ媒体、免疫アフィニティ媒体、ヘパリンアフィニティ媒体、ヒドロキシアパタイト媒体、およびハイドロフォビン相互作用担体からなる群より選択される、請求項78記載の方法。
- 第2のクロマトグラフィ媒体が、陽イオン交換媒体、陰イオン交換媒体、固定化金属アフィニティ媒体、硫酸化アフィニティ媒体、色素アフィニティ媒体、ヒドロキシアパタイト媒体、免疫アフィニティ媒体、ヘパリンアフィニティ媒体、および疎水性相互作用媒体からなる群より選択される、請求項78記載の方法。
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