CN101799459A - 一种测定多糖磷酸酯中磷含量的方法 - Google Patents

一种测定多糖磷酸酯中磷含量的方法 Download PDF

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张继
杨小舟
朱银荣
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Abstract

本发明公开了一种测定多糖磷酸酯中磷含量的方法。本发明用高效液相色谱检测处理后的样品溶液，通过配制梯度标准溶液、制作标准曲线并建立回归方程以计算所测多糖样品中的磷含量。本发明方法中所测多糖溶液与流动相混合液的相溶性很好、标准曲线线性范围较宽，克服了以往测定磷含量过程中操作烦琐，杂质干扰严重，精确性、灵敏度不理想，线性范围较窄等缺点；本发明方法检测结果准确可靠，简化检测步骤而节省了测定时间，测定费用低，易于推广实施。

Description

一种测定多糖磷酸酯中磷含量的方法
技术领域
本发明涉及一种测定磷含量的方法，具体涉及一种测定多糖磷酸酯中磷含量的方法。
背景技术
多糖磷酸酯是一类重要的多糖衍生物，其在糖基上引入磷酸根，使一些本无活性的糖类化合物具有了活性，并且能够提高某些多糖的生物学活性。多糖磷酸酯包括从自然界分离得到的各种多糖磷酸衍生物，如从粪产肠球菌中分离得到一种由葡萄糖、甘油及磷酸根组成的多糖磷酸酯，从毕赤酵母中分离得到甘露聚糖磷酸酯；以及人工合成、半合成的各种多糖磷酸酯，如魔芋葡甘聚糖磷酸酯、葡聚糖磷酸酯等。多糖磷酸酯具有广泛的生物学性质，包括抗病毒、抗肿瘤、抗菌、增强免疫系统功能等，因而受到极大关注。取代度的高低直接影响多糖的活性，羟基的磷酸酯化，不仅增加了多糖的溶解性，更重要的是改变了多糖的构象，因此，多糖磷酸酯中磷酸根含量的测定对研究多糖磷酸酯结构与功能的关系具有重要的意义。
现有磷含量的测定方法有：电感耦合等离子体-质谱法(ICP-MS)、原子发射光谱法(AES)、中子活化分析法(INAA)、原子吸收光谱法(AAS)、紫外分光光度法和荧光分光光度法、电化学分析法等。中国专利CN 1635366A于2005年7月6日公开了“一种利用低分辨率电感耦合等离子体质谱仪检测磷的方法”，此方法通过测定磷的氧化物的浓度来间接测量磷的浓度，但其测试成本太高而无法普及。中国专利CN 1296173A于2001年5月23日公开了“含磷抗静电剂中无机磷含量的测定方法”，将抗静电剂中的无机磷用饱和硝酸钠萃取，消解后用磷钼黄在420nm处进行比色测定，但此方法中，处理方法只是适合于所针对的样品，适用范围小，未明确测定的检出限和线性范围，从而导致其应用范围窄。文献“香菇多糖磷酸化修饰工艺条件的研究”(《食品与发酵工业》，2007，33(12)64～67)报道了香菇多糖磷酸酯中磷含量的测定方法，样品处理采用灰化法，处理时间长，过程繁琐，整个过程以主观判断为主从而导致测定结果不准确。因此，人们期望能够提供一种处理时间短、过程简单、准确度高、重复性好、成本低的测定多糖磷酸酯中磷含量的方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种准确地测定多糖磷酸酯中磷含量的方法。
为解决上述技术问题，本发明一种测定多糖磷酸酯中磷含量的方法，包括如下步骤：
(1)绘制标准曲线并建立回归方程：
取一定质量的KH2PO4定容于容量瓶中制备磷酸根(PO4 3-)浓度为100mg/ml的母液，然后，依次稀释成0.05、0.1、0.5、1、5、10mg/ml的磷酸根梯度标准溶液。取此梯度标准溶液注入高效液相色谱(HPLC)检测，每次进样量为20ul，每个样品测定三次，以峰面积平均值为纵坐标(Y)、磷酸根梯度标准溶液浓度为横坐标(X)绘制标准曲线并建立回归方程；
(2)样品的处理：
称取待测多糖磷酸酯干物质样品，加入浓度为1～2mol/L的盐酸，其中所述干物质样品与盐酸的比例为，重量∶体积＝1mg∶1～2ml，在100℃下氮气保护水解4～6小时，然后在40～60℃、0.07～0.08MPa下减压浓缩蒸干得到干物质A；
(3)样品磷含量的测定：
将干物质A用超纯水溶解定容，使其磷酸根浓度在0.05～10mg/ml范围内，取所定容的样品溶液注入高效液相色谱检测，每次进样量为20ul，每个样品测定三次，将峰面积平均值代入步骤(1)中所建立的回归方程算出定容后样品溶液的磷酸根浓度(mg/ml)，根据所定容样品溶液中磷酸根的质量和所用多糖磷酸酯干物质样品的质量算出该干物质样品的磷酸根含量，最后由磷在磷酸根中的质量百分比(32.63％)算出该干物质样品的磷含量(用“质量百分比”表示)。
高效液相色谱参数：
色谱柱：Sephadex G-10柱；
洗脱剂：超纯水；
洗脱速率：1ml/min；
柱温：30℃；
检测器：示差折光检测器，检测器温度35℃；
进样量：20ul；
标准曲线的线性范围：0.05～10mg/ml；
检出限：0.01mg/ml。
表1为实施例1～3的标准曲线数据，图1～3分别为实施例1～3中以梯度磷酸根标准溶液浓度(X)对峰面积(Y)绘制的标准曲线，在实施例1～3中所建立的对应的回归方程，其相关系数R2值均接近于1，说明其对应的回归方程都具有极显著的线性相关关系。
表1：实施例1～3中各梯度磷酸根标准溶液所对应的HPLC检测峰面积的平均值及各实施例中所建立回归方程的R2值
  磷酸根含量(mg/ml)   实施例1峰面积平均值   实施例2峰面积平均值   实施例3峰面积平均值
  0.05   0.1689   0.1711   0.1732
  0.1   0.2781   0.2721   0.2756
  0.5   1.2012   1.2102   1.2073
  1   2.1120   2.1089   2.1109
  5   11.7012   11.6078   11.7023
  磷酸根含量(mg/ml)   实施例1峰面积平均值   实施例2峰面积平均值   实施例3峰面积平均值
  10   22.1102   22.0967   22.0873
  R2   0.9992   0.9994   0.9991
表2给出了针对同样的多糖磷酸酯干物质样品，本发明实施例测定的磷含量与元素分析仪测定的磷含量及紫外法测定的磷含量的数据比较；此处紫外法测定的结果由于受杂质的干扰而使测定结果有所偏差，元素分析仪(ICP)测定是在其他测试机构测定的，该测定是目前精确度较高的测定方法。本发明实施例的测定结果与ICP测定的结果基本一致，说明本发明的测定结果是准确、可靠的。
表2：对于同样的多糖磷酸酯干物质样品，本发明实施例的HPLC测定与元素分析仪(ICP)测定及紫外法测定的磷含量(％)数据比较
  实施例样品   HPLC测定样品的磷含量(％)   ICP测定样品的磷含量(％)   紫外法测定样品的磷含量(％)
  实施例1样品 6.02 6.06 6.45
  实施例2样品 9.23 9.42 10.89
  实施例3样品 12.24 12.31 13.08
本发明的有益效果是：在本发明一种快速测定多糖磷酸酯中磷含量的方法中，多糖溶液与流动相混合液的相溶性很好、标准曲线线性范围较宽，克服了以往测定磷含量过程中操作烦琐，杂质干扰严重，精确性、灵敏度不理想，线性范围较窄等缺点；本发明方法检测结果准确可靠，重复性好，大大简化了检测步骤，不包括样品水解预处理的时间，样品一次测定的时间仅为20分钟左右，节省了测定时间，测定费用低，易于推广实施。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
图1为根据实施例1中数据制作的标准曲线；
图2为根据实施例2中数据制作的标准曲线；
图3为根据实施例3中数据制作的标准曲线；
图4为实施例3的测试样品溶液的液相色谱图，其中横坐标为保留时间(min)，纵坐标为响应值(MV)。
具体实施方式
下面的实施例可更详细地说明本发明，但不以任何形式限制本发明。
本发明的目的是提供一种测定多糖磷酸酯中磷含量的方法。在实际测定中，每测同一批样品要求重新制作标准曲线。
实施例1
本发明一种测定多糖磷酸酯中磷含量的方法，包括如下步骤：
(1)绘制标准曲线并建立回归方程：
称取14.32g KH2PO4定容于100ml容量瓶中制备磷酸根(PO4 3-)浓度为100mg/ml的母液，然后，依次稀释成0.05、0.1、0.5、1、5、10mg/ml的磷酸根梯度标准溶液。取此梯度标准溶液注入高效液相色谱检测，每次进样量为20ul，每个样品测定三次，以峰面积平均值为纵坐标(Y)、磷酸根梯度标准溶液浓度为横坐标(X)绘制标准曲线(图1)并建立回归方程Y＝2.2246X+0.0888，R2＝0.9992；
(2)样品的处理：
准确称取2mg待测多糖磷酸酯干物质样品，加入浓度为2mol/L盐酸4ml，在100℃下氮气保护水解6小时，然后在60℃、0.06MPa下减压浓缩蒸馏得到干物质A；
(3)样品磷含量的测定：
将干物质A用超纯水溶解定容至2ml，取所定容的样品溶液注入高效液相色谱检测，每次进样量为20ul，每个样品测定三次，将峰面积平均值(Y)0.4992代入步骤(1)中所建立的回归方程(Y＝2.2246X+0.0888)算出定容后样品溶液的酸根浓度(X)为0.1845mg/ml，根据所定容样品的体积2ml和所用干物质多糖磷酸酯样品的质量2mg算出该干物质样品的磷酸根含量18.45％，最后由磷在磷酸根中的质量百分比(32.63％)算出该干物质样品的磷含量6.02％。
实施例2
本发明一种测定多糖磷酸酯中磷含量的方法，包括如下步骤：
(1)绘制标准曲线并建立回归方程：
称取14.32g KH2PO4定容于100ml容量瓶中制备磷酸根(PO4 3-)浓度为100mg/ml的母液，然后，依次稀释成0.05、0.1、0.5、1、5、10mg/ml的磷酸根梯度标准溶液。取此梯度标准溶液注入高效液相色谱检测，每次进样量为20ul，每个样品测定三次，以峰面积平均值为纵坐标(Y)、磷酸根梯度标准溶液为横坐标(X)浓度绘制标准曲线(图2)并建立回归方程Y＝2.2207X+0.0821，R2＝0.9994；
(2)样品的处理：
准确称取2mg待测干物质样品，加入浓度为1mol/L盐酸2ml，在100℃下氮气保护水解4小时，然后在40℃、0.08MPa下减压浓缩蒸馏得到干物质A；
(3)样品磷含量的测定：
将干物质A用超纯水溶解定容至1ml，取所定容的样品溶液注入高效液相色谱检测，每次进样量为20ul，每个样品测定三次，将峰面积平均值(Y)1.3386代入步骤(1)中所建立的回归方程(Y＝2.2207X+0.0821)算出所定容样品溶液的磷酸根浓度(X)为0.5658mg/ml，根据所定容样品溶液体积1ml和所用干物质多糖硫酸酯样品的质量2mg算出该干物质样品的磷酸根含量为28.29％，最后由磷在磷酸根中的质量百分比(32.3％)算出该干物质样品的磷含量9.23％。
实施例3
本发明一种测定多糖磷酸酯中磷含量的方法，包括如下步骤：
(1)绘制标准曲线并建立回归方程：
称取14.32g KH2PO4定容于100ml容量瓶中制备磷酸根(PO4 3-)浓度为100mg/ml的母液，然后，依次稀释成0.05、0.1、0.5、1、5、10mg/ml的磷酸根梯度标准溶液。取此梯度标准溶液注入高效液相色谱检测，每次进样量为20ul，每个样品测定三次，以峰面积平均值为纵坐标(Y)、磷酸根梯度标准溶液浓度为横坐标(X)绘制标准曲线(图3)并建立回归方程Y＝2.2223X+0.0925，R2＝0.9991；
(2)样品的处理：
准确称取2mg待测干物质样品，加入浓度为4mol/L盐酸3ml，在100℃下氮气保护水解5小时，然后在50℃、0.07MPa下减压浓缩蒸馏得到干物质A；
(3)样品磷含量的测定：
将干物质A用超纯水溶解定容至1ml，取所定容的样品溶液注入高效液相色谱检测(液相色谱图如图4)，每次进样量为20ul，每个样品测定三次，将峰面积平均值(Y)1.7597代入步骤(1)中所建立的回归方程(Y＝2.2223X+0.0925)算出定容后样品溶液的磷酸根浓度(X)为0.7502mg/ml，再根据所定容样品溶液体积1ml和所用干物质多糖磷酸酯样品的质量2mg算出该干物质样品的磷酸根含量37.51％，最后由磷在磷酸根中的质量百分比(32.3％)算出该干物质样品的磷含量12.24％。

Claims (1)

1.一种测定多糖磷酸酯中磷含量的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)绘制标准曲线并建立回归方程：
取一定质量的KH2PO4定容于容量瓶中制备磷酸根浓度为100mg/ml的母液，然后，依次稀释成0.05、0.1、0.5、1、5、10mg/ml的磷酸根梯度标准溶液。取此梯度标准溶液注入高效液相色谱检测，每次进样量为20ul，每个样品测定三次，以峰面积平均值为纵坐标、磷酸根梯度标准溶液浓度为横坐标绘制标准曲线并建立回归方程；
(2)样品的处理：
称取待测多糖磷酸酯干物质样品，加入浓度为1～2mol/L的盐酸，其中所述干物质样品与盐酸的比例为，重量∶体积＝1mg∶1～2ml，在100℃下氮气保护水解4～6小时，然后在40～60℃、0.07～0.08MPa下减压浓缩蒸干得到干物质A；
(3)样品磷含量的测定：
将干物质A用超纯水溶解定容，使其磷酸根浓度在0.05～10mg/ml范围内，取所定容的样品溶液注入高效液相色谱检测，每次进样量为20ul，每个样品测定三次，将峰面积平均值代入步骤(1)中所建立的回归方程算出定容后样品溶液的磷酸根浓度，根据所定容样品溶液中磷酸根的质量和所用多糖磷酸酯干物质样品的质量算出该干物质样品的磷酸根含量，最后由磷在磷酸根中的质量百分比算出该干物质样品的磷含量。
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