CN103616339B - 一种含有灵芝多糖制剂的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种含有灵芝多糖制剂的检测方法，其特征是通过对制剂的粗多糖进行醇沉提取，再用碱性硫酸铜纯化后以苯酚硫酸显色，照紫外‑可见分光光度法的比色法测定制剂的灵芝多糖。本发明的优点是：采用特定的试剂，对制剂中的灵芝多糖进行选择性的沉淀，从而将其与糊精中所含多糖进行分离，排除辅料干扰，达到对灵芝多糖的含量进行准确检测的目的。该方法简单、准确、试剂易得，并且检测成本低，可用于含有灵芝多糖制剂的检测。
Description
技术领域
本发明属于中药制剂领域，涉及一种含有灵芝多糖制剂的检测方法。
背景技术
灵芝为多孔菌科赤芝Ganoderma lucidum ( Leyss.ex Fr.) Karst. 或紫芝G．sinense Zhao，Xu et Zhang的干燥子实体，具有补气安神、止咳平喘的功效。灵芝多糖是药用真菌灵芝中的主要药效成分之一，现代药理研究表明，灵芝多糖具有显著的提高免疫力和抗肿瘤、清除自由基、抗衰老等活性。目前已分离得到的灵芝多糖有200多种，其中大部分为β-葡聚糖，少数为α –葡聚糖，多糖链由三股单糖链构成，是一种螺旋状立体构形物。灵芝多糖大多为杂多糖，即除含有葡萄糖外，大多还含有少量阿拉伯糖、木糖、岩藻糖、鼠李糖、半乳糖等其他单糖。含有灵芝多糖的药物制剂在制备工艺中，加入了糊精等药用辅料，而糊精的主要成分为由葡萄糖组成的多糖，与灵芝多糖的组成单元相似。目前常使用的硫酸苯酚法或者硫酸蒽醌法检测含灵芝多糖制剂中灵芝多糖的含量，由于受辅料糊精的干扰，这些方法都会在检测灵芝多糖的同时，将糊精中所含多糖一并检测出，从而导致含量检测数据比实际高，检测结果不准确。目前，国内总多糖含量测定主要采取紫外分光光度法进行，经典的显色体系有苯酚-硫酸法（λmax=490nm）和蒽酮-硫酸法（λmax= 630nm），均选择无水葡萄糖为对照品。也有采用滴定法测定总多糖含量的，常用有斐林氏滴定法和间接碘量滴定法。在国外对多糖的质量控制多采用高效凝胶色谱法测定多糖分子量及其分布，这也是对多糖产品质控手段之一，其对纯度较高的多糖产品质量控制较好，能有效的评价该产品的真伪，但对于主要含多糖类成分的灵芝多糖制剂的质量控制方法较少，由于它们所含的有效多糖是一大类，很难对其多糖含量、分子量分布范围来评价药材及其制剂质量的真伪和优劣，该评价方式不能反映它们整体的内在质量变化，存在一定的不合理性和不科学性，且专属性也较差。
因此，如何采用低成本的显色法检测灵芝多糖，而排除糊精等含有葡萄糖结构单元的物质的干扰，建立准确、稳定的含灵芝多糖制剂的检测方法显得尤为重要。
发明内容
本发明提供了一种含有灵芝多糖制剂灵芝多糖含量的准确测定方法，本发明的检测方法能够排除糊精等含有葡萄糖结构单元物质产生的干扰，检测出的灵芝多糖含量准确、稳定，并且容易操作，检测成本低。
本发明的方法是对显色法的一种改进，其原理是首先对药物制剂中的粗多糖进行醇沉提取，把糊精等低分子量的含有葡萄糖结构单元物质与高分子量的灵芝多糖分离，再用碱性硫酸铜纯化后以苯酚硫酸显色，照紫外-可见分光光度法中的比色法测定制剂中的灵芝多糖。
含有灵芝多糖制剂的检测方法，包括如下步骤：
（1）称取样品2.5±0.5g，置于锥形瓶中，加水100ml，加热回流提取35分钟，静置冷却，离心，精密吸取10ml滤液置于离心管中，缓慢加入4倍体积的无水乙醇，混匀，在5000r/min下离心25分钟，弃去上清液，残渣加水溶解，移至25ml量瓶中，加水定容至刻度，即得粗多糖溶液；
（2）精密吸取上述粗多糖溶液10ml，置于50ml离心管中，加入10%氢氧化钠和铜试剂溶液混合溶液40ml，离心管置于90℃水浴40分钟，取出放置10～15分钟，在5000r/min转速下离心30分钟，弃去上清液，残渣用10%硫酸转移至50ml量瓶中，加水稀释至刻度，混匀，即样品测试液；
所述的10%氢氧化钠和铜试剂溶液混合溶液是将10%的氢氧化钠20ml加入铜试剂溶液20ml中，混匀；
（3）准确吸取样品测试液2.0ml，置于25ml比色管中，加入5%苯酚试液1ml，混匀，加入浓硫酸5ml，比色管置于90℃水浴中15分钟，取出，放置15分钟，分光光度计490nm处以空白试剂为参比，1cm比色皿测定其吸光度为A，以标准曲线计算灵芝多糖含量；
计算公式为：
式中，A为吸光度；B为截距；K为斜率；M为取样量g；n为稀释倍数。
所述的铜试剂溶液的配制方法为：称取1.5g五水合硫酸铜，10g枸橼酸钠，加水溶解至330ml，混匀，制得铜试剂储备液；取铜试剂储备液100ml，混匀后加入固体无水硫酸钠12g使其溶解，即得铜试剂溶液。
所述的标准曲线绘制方法是：精确吸取0、0.2、0.4、0.8、1.0、1.5ml 葡聚糖标准品溶液0.25mg/ml，分别置于25ml比色管中，精确补充水至2.0ml，加入5%苯酚溶液1ml，混匀，加入浓硫酸5ml，混匀，比色管置于90℃水浴中15分钟，取出于室温下冷却15分钟，用分光光度计于490nm处以空白试剂为参比，1cm比色皿测定吸光度值；以葡聚糖浓度单位C，mg/ml为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线C=KA+B。
所述的空白试剂配制方法为：准确吸取2.0ml水，加入5%的苯酚溶液1ml，混匀，加入浓硫酸5ml，混匀，比色管置于90℃水浴中15分钟，取出于室温下冷却15分钟，即得。
本发明的具体操作方案的考察：
1.提取方式的考察：
取本品适量，分别称取样品3份，每份约2.5g，精密称定，置于锥形瓶中，分别精密加入80℃水100ml搅拌溶解、加水100ml加热回流15分钟、加水100ml超声15分钟，按照供试品溶液的制备方法，测定吸光度A，计算含量，结果见表1。
表1 提取方式的考察
| 提取方式 | 取样量 g | 吸光度 Abs | 含量 mg/g |
| 加热水溶解 | 2.7113 | 0.517 | 19.8 |
| 加水加热回流 | 2.5604 | 0.596 | 24.1 |
| 加水超声 | 2.5921 | 0.398 | 16.1 |
结果表明，采用加热回流，测得含量最高，故本发明选择加水加热回流方式提取。
溶媒体积的考察：
取本品适量，分别称取样品3份，每份约2.5g，精密称定，置于锥形瓶中，分别精密加入125ml、100ml、75ml水，加热回流提取15分钟，按照供试品溶液的制备方法制备，测定吸光度A，计算含量，结果见表2。
表2 溶媒体积的考察
结果表明，采用100ml加热回流，测得含量与125ml提取无大差异，故本发明选择加水100ml加热回流方式对待测产品进行提取。
提取时间的考察：
取本品适量，分别称取样品4份，每份约2.5g，精密称定，置于锥形瓶中，精密加入100ml水，分别加热回流提取15分钟、25分钟、35分钟和45分钟，按照供试品溶液的制备方法制备，测定吸光度A，计算含量，结果见表3。
表3 提取时间考察
| 提取方式 | 取样量 g | 吸光度 Abs | 含量 mg/g |
| 回流提取15分钟 | 2.5706 | 0.641 | 25.2 |
| 回流提取25分钟 | 2.3220 | 0.597 | 26.1 |
| 回流提取35分钟 | 2.3847 | 0.656 | 27.7 |
| 回流提取45分钟 | 2.5112 | 0.757 | 27.9 |
结果表明，采用100ml加热回流35分钟，测得含量与提取45分钟无差异，故本发明选择加水100ml加热回流提取35分钟。
由以上实验结果得到供试品的提取方法：取本品，研细，取约2.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加水100ml，称定重量，加热回流提取35分钟，放冷，称重，用水补足失重，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
线性范围的考察
取葡聚糖标准品溶液（0.2610mg/ml），准确吸取0、0.2、0.4、0.8、1.0、1.5ml葡聚糖标准品溶液分别置于25ml比色管中，准确补充水至2.0ml，加入5%的苯酚溶液1ml，混匀，加入98%的浓硫酸5ml，混匀，比色管置于90℃水浴（烧杯中温度计显示90℃）中15分钟（严格要求15分钟），取出于室温下冷却15分钟，用分光光度计于490nm处以空白试剂为参比，1cm比色皿测定吸光度值。以葡聚糖浓度（mg/ml）为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线。（空白试剂配制：准确吸取2.0ml水，加入5%的苯酚溶液1ml，混匀，加入浓硫酸5ml，混匀，比色管置于90℃水浴（烧杯中温度计显示90℃）中15分钟（严格要求15分钟），取出于室温下冷却15分钟，即得）。所得回归方程：Y=12.34X-0.014，R2=0.999，n=6。结果表明，葡聚糖浓度在0—0.1958mg/ml范围内，浓度值与吸光度A呈良好的线性关系。上述试验结果见表4，标准曲线见图1。
表4 葡聚糖线性范围考察
5.精密度试验：
精密称取供试品2.5701g，置于具塞锥形瓶中，加水100ml称定重量，加热回流提取35分钟，放冷，称重，用水补足失重，摇匀，滤过，取续滤液，按照【供试品溶液的制备】方法制备，测定吸光度A，计算RSD%。结果见表5。
表5 精密度试验
| 序号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 平均值 | RSD% |
| Abs | 0.684 | 0.0.684 | 0.685 | 0.685 | 0.684 | 0.684 | 0.684 | 0.08 |
吸光度A值的RSD%小于3.0%，说明仪器精密度良好。
稳定性试验
精密称取供试品2.5701g，置于具塞锥形瓶中，加水100ml称定重量，加热回流提取35分钟，放冷，称重，用水补足失重，摇匀，滤过，取续滤液，按照【供试品溶液的制备】方法制备，分别于0、2、4、6、8小时，取样进行检测，测定吸光度A，计算RSD%。结果见表6。
表6 稳定性试验
| 小时 | 0 | 2 | 4 | 6 | 8 |
| Abs | 0.684 | 0.681 | 0.689 | 0.672 | 0.685 |
| 含量mg/g | 29.18 | 29.07 | 29.41 | 28.69 | 29.24 |
| RSD% | 0.92 |
吸光度A值的RSD%小于3.0%，说明供试品的稳定性良好。
重复性试验：
取同一批样品，取6份，每份约2.5g，精密称定，加水100ml称定重量，加热回流提取35分钟，放冷，称重，用水补足失重，摇匀，滤过，取续滤液，按照【供试品溶液的制备】方法制备，取样进行检测，测定吸光度A，计算含量和RSD%。结果见表7。
表7 重复性试验
含量的RSD%小于3.0%，说明供试品检测方法的重复性良好。
回收率试验：
取同一批已知含量的样品（含量为203.5mg/g），取6份，每份约0.5g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加入含0.214mg/ml葡聚糖标准品100ml，回流提取35分钟，放冷，称重，用水补足失重，摇匀，滤过，取续滤液，按照【供试品溶液的制备】方法，制备供试品溶液，按照【测定法】，进行检测，计算含量和回收率。结果见表8。
表8 回收率试验
通过以上的实验，确定本发明含灵芝多糖制剂中灵芝多糖含量的检测方法步骤为上述描述的技术方案是可行的。达到了以下的优点：采用特定的试剂，对制剂中的灵芝多糖进行选择性的沉淀，从而将其与糊精中所含多糖进行分离，排除辅料干扰，达到对灵芝多糖的含量进行准确检测的目的。该方法简单、准确、试剂易得，并且检测成本低，可用于含灵芝多糖制剂的检测。
附图说明
图1是标准曲线图。
图中，横坐标是葡聚糖浓度C（mg/ml），纵坐标是吸光度A。
具体实施方式
实施例1
含灵芝多糖的药物制剂，精密葡聚糖（MW=2.98×105g/mol）标准品25mg，加水溶解至100ml，为每1ml溶液含0.25mg葡聚糖，精确吸取0、0.2、0.4、0.8、1.0、1.5ml 葡聚糖标准品溶液分别置于25ml比色管中，精确补充水至2.0ml，加入5%的苯酚溶液1ml，混匀，加入浓硫酸5ml，混匀，比色管置于90℃水浴（盛装比色管的烧杯中温度计显示90℃）中15分钟（严格要求15分钟），取出于室温下冷却15分钟，用分光光度计于490nm处以空白试剂为参比，1cm比色皿测定吸光度值。以葡聚糖浓度（mg/ml）为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线。标准曲线图如图1所述。
空白试剂配制：准确吸取2.0ml水，加入5%的苯酚溶液1ml，混匀，加入浓硫酸5ml，混匀，比色管置于90℃水浴（盛装比色管的烧杯中温度计显示90℃）中15分钟（严格要求15分钟），取出于室温下冷却15分钟，即得。
按照本发明的方法测定制剂中灵芝多糖的含量：
表9本发明的方法测定得到灵芝多糖的含量
按照常规的硫酸苯酚法，即：取样品约2.5g，置于锥形瓶中，加水100ml，加热回流提取35分钟，静置冷却，离心，精密吸取10ml滤液置于50ml离心管中，加入10%氢氧化钠和铜试剂溶液混合溶液40ml（10%氢氧化钠20ml加入铜试剂溶液20ml，混匀），离心管置于90℃水浴40分钟，取出放置10～15分钟，在5000r/min转速下离心30分钟，弃去上清液，残渣用10%硫酸转移至50ml量瓶中，加水稀释至刻度，混匀，即样品测试液；
所述的10%氢氧化钠和铜试剂溶液混合溶液是将10%的氢氧化钠20ml加入铜试剂溶液20ml中，混匀；
准确吸取样品测试液2.0ml，置于25ml比色管中，加入5%的苯酚试液1ml，混匀，加入98%的浓硫酸5ml，比色管置于90℃水浴中15分钟，取出，放置15分钟，分光光度计490nm处以空白试剂为参比，1cm比色皿测定其吸光度为A，以标准曲线计算灵芝多糖含量如下：
表10 常规硫酸苯酚法测定得到灵芝多糖的含量
| 序号 | 1 | 2 | 3 |
| 取样量 g | 2.4821 | 2.5196 | 2.5835 |
| 吸光度 Abs | 0.684 | 0.676 | 0.698 |
| 含量mg/g | 39.62 | 40.12 | 39.41 |
从表9和表10可以看出，采用常规的硫酸苯酚法测定含有糊精的含灵芝多糖制剂中灵芝多糖的含量比实际的含量偏高，采用常规的硫酸苯酚法测定出的灵芝多糖含量不可靠。
Claims (1)
1.一种含有灵芝多糖制剂的检测方法，其特征在于，灵芝多糖的检测方法由以下步骤组成：
（1）称取样品2.5±0.5g，置于锥形瓶中，加水100ml，加热回流提取35分钟，静置冷却，离心，精密吸取10ml滤液置于离心管中，缓慢加入4倍体积的无水乙醇，混匀，在5000r/min下离心25分钟，弃去上清液，残渣加水溶解，移至25ml量瓶中，加水定容至刻度，即得粗多糖溶液；
（2）精密吸取上述粗多糖溶液10ml，置于50ml离心管中，加入10%的氢氧化钠和铜试剂溶液混合溶液40ml，离心管置于90℃水浴40分钟，取出放置10～15分钟，在5000r/min转速下离心30分钟，弃去上清液，残渣用10%硫酸转移至50ml量瓶中，加水稀释至刻度，混匀，即样品测试液；
所述的10%氢氧化钠和铜试剂溶液混合溶液是将10%的氢氧化钠20ml加入铜试剂溶液20ml中，混匀；
（3）准确吸取样品测试液2.0ml，置于25ml比色管中，加入5%苯酚试液1ml，混匀，加入浓硫酸5ml，比色管置于90℃水浴中15分钟，取出，放置15分钟，分光光度计490nm处以空白试剂为参比，1cm比色皿测定其吸光度为A，以标准曲线计算灵芝多糖含量；
计算公式为：
含量%=
式中，A为吸光度；B为截距；K为斜率；M为取样量g；n为稀释倍数；
所述的铜试剂溶液的配制方法为：称取1.5g五水合硫酸铜，10g枸橼酸钠，加水溶解至330ml，混匀，制得铜试剂储备液；取铜试剂储备液100ml，加入固体无水硫酸钠12g使其溶解，混匀，即得铜试剂溶液；
所述的标准曲线绘制方法是：精确吸取0、0.2、0.4、0.8、1.0、1.5ml 葡聚糖标准品溶液，重量含量为0.25mg/ml，分别置于25ml比色管中，精确补充水至2.0ml， 5%苯酚溶液1ml，混匀，加入浓硫酸5ml，混匀，比色管置于90℃水浴中15分钟，取出于室温下冷却15分钟，用分光光度计于490nm处以空白试剂为参比，1cm比色皿测定吸光度值；以葡聚糖浓度单位C，mg/ml为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线C=KA+B；
所述的空白试剂配制方法为：准确吸取2.0ml水，加入5%的苯酚溶液1ml，混匀，加入浓硫酸5ml，混匀，比色管置于90℃水浴中15分钟，取出于室温下冷却15分钟，即得；
所述的浓硫酸的重量含量为90-98%；
（4）取同一批含量为203.5mg/g的样品，取6份，每份0.5g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加入含0.214mg/ml葡聚糖标准品100ml，回流提取35分钟，放冷，称重，用水补足失重，摇匀，滤过，取续滤液，按照样品测试液的制备方法，制备供试品溶液，进行检测，计算含量和回收率；
计算公式为：
回收率%=。
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