CN114166771B - 一种测定灵芝中β-葡聚糖含量的方法 - Google Patents
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Abstract
一种测定灵芝中β‑葡聚糖含量的方法，其特征在于：制作测定样品，以无水葡萄糖为对照品，使用蒽酮‑硫酸法测定样品中β‑葡聚糖含量，所述的测定样品的制作方法为：使用高温高压提取‑加压过滤‑复合酶解‑超滤离心净化而得到。本发明制作测定样品的方法速度快，能不间断连续地完成检测：使用高温高压加速提取；提取后使用压力逼出残渣吸附的提取液；通过复合酶解将α‑葡聚糖完全分解成单糖和寡糖；通过木瓜蛋白酶将水溶性蛋白和复合酶大部分分解成氨基酸和寡肽；单糖和寡糖，氨基酸和寡肽通过超滤离心除去；消除α‑葡聚糖对检测结果的干扰，测定结果更准确。
Description
技术领域
本发明属于天然产物提取和分析化学领域，具体涉及一种测定灵芝中β-葡聚糖成分含量的方法。
背景技术
灵芝(GanodermaLucidum(Leyss ex Fr.)Karst.)为担子菌门多孔菌科灵芝属真菌赤芝的干燥子实体，灵芝孢子粉(GanodermaLucidumspore)为赤芝的生殖细胞，二者都含有以灵芝三萜、灵芝多糖、灵芝核苷类和灵芝甾醇类为主的活性成分，具有调节免疫、抗肿瘤和保肝等活性。目前已从赤芝和孢子粉中分离到超过200种的灵芝多糖，大部分是以葡萄糖、半乳糖和甘露糖等单糖组成的杂多糖，其中主要的活性多糖是β-葡聚糖，它在调节免疫和抗肿瘤方面发挥着重要作用；而它的异构体α-葡聚糖不具备药理活性。
目前，灵芝多糖的测定方法常用的有中国药典2020版的蒽酮-硫酸法、NYT 1676食用菌中粗多糖含量的测定的苯酚-硫酸法和白鸿的《保健食品功效成分检测方法》的多糖检测方法，前两者都不能排除的α-葡聚糖的干扰，白鸿虽然强调用酶解排除对α-葡聚糖的干扰，但对酶的活性和使用条件上的描述较为模糊，也未对α-葡聚糖的干扰进行定量分析。β-葡聚糖的测定方法主要有酶法试剂盒的酶解检测法、蛋白特异性识别方法和化学检测法、苯胺蓝荧光检测法和刚果红法。酶法试剂盒步骤繁琐，虽然扣除了α-葡聚糖及其单糖寡糖，但不能排除膳食纤维的干扰；蛋白特异性识别法易受葡聚糖分子量和分支度等结构特征的影响，也易受水溶性蛋白质干扰；荧光法由于受到需要荧光检测器的仪器条件限制，不能广泛应用。刚果红法反应条件苛刻，易受到待测液中杂质干扰，对真菌类β-D-(1→3)和β-D-(1→6)葡聚糖特异性不强。
蒽酮-硫酸法是测定多糖含量的较为常用的方法，其原理为多糖类在浓硫酸作用下先水解为单糖分子，并迅速脱水生成糠醛衍生物，糠醛衍生物再与蒽酮结合成带紫外吸收的络合物，其络合物较苯酚-硫酸法稳定，反应体系对操作人员友好，无需在通风橱操作，对环境要求低，无需水浴加热，适用于大部分配备有紫外可见光分光光度计的试验室，易于推广，灵芝β-葡聚糖经水解后产生的单糖有90％为葡萄糖。以无水葡萄糖为对照品可较为准确对灵芝β-葡聚糖进行定量。
目前主流的灵芝多糖检测方法为中国药典2020版的蒽酮-硫酸法，其中测定样品制作为：将2g灵芝或灵芝孢子粉加水60mL，静置1h，100℃加热回流4h，趁热过滤，用少量热水洗涤滤器和滤渣，将滤渣及滤纸置烧瓶中，加水60mL，100℃加热回流3h，趁热滤过，需过滤0.5-1h，合并滤液，置水浴锅上蒸干，约需4h，残渣用水溶解，醇沉，在4℃放置12h，离心，弃去上清液，沉淀物用热水溶解并转移至容量瓶定容50mL，取3mL定容25mL，即得供试品溶液。该法总共耗时1+4+3+0.5+4+12＝23.5工时，共计3天完成检测，操作繁琐，耗时耗力；并且该法将灵芝多糖中没有药理活性的α-葡聚糖也计入结果。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能较为准确测定灵芝中β-葡聚糖含量的方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种测定灵芝中β-葡聚糖含量的方法，其特征在于：制作测定样品，以无水葡萄糖为对照品，使用蒽酮-硫酸法测定样品中β-葡聚糖含量，所述的测定样品的制作方法为：使用高温高压提取-加压过滤-复合酶解-超滤离心净化而得到。
本发明制作测定样品的方法中，将样品加水，置于高温高压环境，提高水的温度和压力，加快分子热运动，使大分子物质加速溶出，通过高温高压提取来缩短提取的时间；灵芝子实体和灵芝孢子粉在提取后，残渣形成空洞，吸取大量提取液，使用滤纸依靠重力过滤，只能滤出部分提取液，并且耗时偏长，需等待0.5-1h才能过滤完全，即使使用离心0.5h，也不能将残渣和提取液完全分离，残渣与其吸附的提取液重量比为1:2-5，被吸附的提取液中所含的β-葡聚糖含量无法被检测到，导致检测结果偏低；因而药典法选择提取两次以减少误差，无疑增加了检测时间。本发明采用加压过滤，使用压力逼出残渣吸附的提取液，得到药典法不能滤出的部分，过滤速度快，耗时≤1min，同时测定结果更准确。本发明通过复合酶解将α-葡聚糖完全分解成单糖和寡糖，通过木瓜蛋白酶将水溶性蛋白和复合酶大部分分解成氨基酸和寡肽，单糖和寡糖，氨基酸和寡肽被超滤离心除去，超滤离心耗时≤10min，同时测定结果更准确。本发明的检测过程速度快，能不间断连续地完成检测，受干扰小。
所述的高温高压提取：将0.1g样品加水30mL，置于高压灭菌器提取，提取温度为135℃，提取压力为0.3MPa，提取时间为60min。灵芝和灵芝孢子粉具有坚韧的纤维素细胞壁，多糖在100℃下需要3-4h才能溶出，在提取液中达到溶出平衡；本发明采用高温高压加速提取，135℃提取60min即可达到溶出平衡，节省时间和提高效率。
所述的加压过滤：将高温高压提取后的样品残渣和提取液混合物，倒入加压过滤器中，加压滤出提取液。灵芝子实体和灵芝孢子粉在提取后，残渣形成空洞，吸取大量提取液，使用滤纸依靠重力过滤，只能滤出部分提取液，或使用离心，也不能将残渣和提取液完全分离；残渣与其吸附的提取液重量比为1:2-5，被吸附的提取液无法被检测到，导致检测结果偏低，因而药典法选择提取两次以减少误差。本发明采用加压过滤，过滤速度快，使用压力逼出残渣吸附的提取液，得到目前药典法不能滤出的部分，使测定结果更准确。
配制复合酶液：重量比：中温α-淀粉酶:糖化酶:普鲁兰酶＝5:2:1，首先将三种酶混合，加入少量纯化水混悬，将混悬后的溶液转移到的容量瓶中，再用水洗烧杯1-2次，将洗液也转移到容量瓶中，加水至刻度，使用前摇匀，配置后的中温α-淀粉酶的浓度为5mg/mL，糖化酶的浓度为2mg/mL，普鲁兰酶的浓度为1mg/mL；配制木瓜蛋白酶液：将木瓜蛋白酶加入少量纯化水混悬，将混悬后的溶液转移到的容量瓶中，再用水洗烧杯1-2次，将洗液也转移到容量瓶中，加水至刻度，使用前摇匀，配置后的木瓜蛋白酶的浓度为5mg/mL；所述的复合酶解：取前一步骤所得的提取液，加入1mL复合酶液，55℃酶解60min，再加入1mL的木瓜蛋白酶液，55℃酶解60min，4000r/min离心10min，离心得到上清液。
本发明通过自制的复合酶液来实现将α-葡聚糖完全分解成单糖和寡糖；从而被超滤离心除去，使测定结果更准确的目的，中温α-淀粉酶能够将淀粉水解成长短不一的糊精及少量的低分子糖类、葡萄糖和麦芽糖内切酶；糖化酶能把淀粉从非还原性未端水解α-(1→4)葡萄糖苷键产生葡萄糖，也能缓慢水解α-(1→6)葡萄糖苷键，转化为葡萄糖。同时也能水解糊精，糖原的非还原末端释放葡萄糖；普鲁兰酶能够专一性切开支链淀粉分支点中的α-(1→6)糖苷键，切下整个分支结构，形成直链淀粉；木瓜蛋白酶具有较宽的底物特异性，作用于蛋白质中L-精氨酸、L-赖氨酸、甘氨酸和L-瓜氨酸残基羧基参与形成的肽键，能切开蛋白质分子内部肽链-CO-NH-生成分子量较小的多肽类。本发明在反复试验后，发现在约31mL反应体系中，加入5mg的中温α-淀粉酶，2mg的糖化酶和1mg的普鲁兰酶这一最佳配比，55℃酶解60min，即可将α-葡聚糖完全分解成单糖和寡糖；从而被超滤离心除去，使测定结果更准确。本发明在反复试验后，发现在约32mL反应体系中，加入5mg的木瓜蛋白酶，55℃酶解60min，即可将提取液中的大部分灵芝水溶性蛋白，中温α-淀粉酶，糖化酶和普鲁兰酶分解成寡肽和氨基酸；从而被超滤离心除去，使测定结果更准确；另外经耐用性试验发现木瓜蛋白酶的残留不影响后续检测结果。
所述的超滤离心净化：取复合酶解后得到的上清液，加入截留分子量为3kD的超滤离心管的内管中，4000r/min离心10min，得到截留在内管的浓缩液。超滤离心管具有快速超滤功能，能够达到较高的浓缩倍数，轻松实现从稀释和复杂的混和样品中浓缩回收大分子物质。本发明通过反复试验，发现先将α-葡聚糖分解成的单糖和寡糖，再使用截留分子量为3kD的超滤离心管，4000r/min离心10min即可满足分离要求，将β-葡聚糖截留在超滤离心管的内管，单糖和寡糖，氨基酸和寡肽，色素和无机盐等杂质被滤除。本发明的超滤离心步骤全程耗时10min，与药典法醇沉4℃静置12h相比，节省时间和提高效率。
所述的蒽酮-硫酸法：取浓缩液定容25mL，即为供试品溶液；供试品溶液与蒽酮-硫酸反应，形成带有紫外吸收的络合物，以无水葡萄糖为对照品，测定供试品溶液中β-葡聚糖含量；根据样品重量即可算出样品中的灵芝中β-葡聚糖含量。
使用本发明制作测定样品总共耗时1+1+1+0.16＝3.16工时，1天即可完成检测，本发明制作测定样品的方法速度快，能不间断连续地完成检测，干扰小。药典中需将2g灵芝加水60mL，提取2次，提取料液比为2/60＝30，而后再醇沉，定容50mL，取3mL定容25mL。即稀释25/3＝8.3倍，样品/测定液浓度＝2/(50×8.3)＝0.48％，本发明一步到位，将0.1g样品加水30mL，提取料液比为0.1/30＝300，之后经超滤离心的浓缩液定容25mL，样品/测定液浓度＝0.1/25＝0.4％，在保持测定液浓度的同时，提高了提取料液比，提取更充分，同时减少了稀释倍数，使测定结果更准确。本发明采用加压过滤，使用压力逼出残渣吸附的提取液，得到药典法不能滤出的部分，同时通过复合酶解将α-葡聚糖完全分解成单糖和寡糖，通过木瓜蛋白酶将水溶性蛋白和复合酶大部分分解成氨基酸和寡肽，单糖和寡糖，氨基酸和寡肽被超滤离心除去，消除α-葡聚糖对检测结果的干扰，测定结果更准确。
附图说明
图1为本发明的原理步骤方框图
图2为灵芝β-葡聚糖标准曲线
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制，在不背离本发明的精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所做的修改或替换，均属于本发明的范围。
如图1所示，一种测定灵芝中β-葡聚糖含量的方法：制作测定样品，以无水葡萄糖为对照品，使用蒽酮-硫酸法测定样品中β-葡聚糖含量，所述的测定样品的制作方法为：使用高温高压提取-加压过滤-复合酶解-超滤离心净化而得到。
制作测定样品具体步骤：将0.1g样品加水30mL，置于高压灭菌器提取，提取温度为135℃，提取压力为0.3MPa，提取时间为60min；将高温高压提取后的样品残渣和提取液混合物，倒入加压过滤器中，加压滤出提取液。
由于目前市面上的加压过滤器容积较大，不能满足小剂量的检测使用，加压过滤器可以通过方法1，注射器自制：50mL注射器在出口处接入针孔式过滤器，滤膜孔径100μm；拔出注射器活塞，取高温高压加速提取后的样品残渣和提取液混合物从注射器活塞口加入注射器，插入活塞，手工加压滤出提取液，压力约0.12-0.2Mpa。
加压过滤器也可以通过方法2，定制100mL容量的加压过滤器：加压过滤器在下部出口处带有滤膜，滤膜孔径1.2μm；取高温高压加速提取后的样品残渣和提取液混合物从上部入口加入，盖好入口盖子，从空气入口，手动或机械加压打入空气，加压滤出提取液，压力约0.12-0.2MPa。
挤压的方式比目前使用滤纸依靠重力过滤，在相同的样品量下所提出的提取液体积多9％，即最终检测结果比药典法高9％；挤压的方式比目前使用离心法分离，在相同的样品量下所提出的提取液体积多5％，即最终检测结果比离心法高5％；本发明采用加压过滤，使用压力逼出残渣吸附的提取液，得到药典法不能滤出的部分，使测定结果更准确。
配制复合酶液：重量比：中温α-淀粉酶:糖化酶:普鲁兰酶＝5:2:1，首先将三种酶混合，加入少量纯化水混悬，将混悬后的溶液转移到的容量瓶中，再用水洗烧杯1-2次，将洗液也转移到容量瓶中，加水至刻度，使用前摇匀，配置后的中温α-淀粉酶的浓度为5mg/mL，糖化酶的浓度为2mg/mL，普鲁兰酶的浓度为1mg/mL；配制木瓜蛋白酶液：将木瓜蛋白酶加入少量纯化水混悬，将混悬后的溶液转移到的容量瓶中，再用水洗烧杯1-2次，将洗液也转移到容量瓶中，加水至刻度，使用前摇匀，配置后的木瓜蛋白酶的浓度为5mg/mL；所述的复合酶解：取前一步骤所得的提取液，加入1mL复合酶液，55℃酶解60min，再加入1mL的木瓜蛋白酶液，55℃酶解60min，4000r/min离心10min，离心得到上清液。
取复合酶解后得到的上清液，加入截留分子量为3kD的超滤离心管的内管中，4000r/min离心10min，得到截留在内管的浓缩液。
进行蒽酮-硫酸法试验：取浓缩液定容25mL，即为供试品溶液；供试品溶液与蒽酮-硫酸反应，形成带有紫外吸收的络合物，以无水葡萄糖为对照品，测定供试品溶液中β-葡聚糖含量；根据样品重量即可算出样品中的灵芝中β-葡聚糖含量。
实施例
1.1试剂和仪器
无水葡萄糖对照品(中国食品药品检定研究院)，β-D-葡聚糖对照品(燕麦来源，纯度≥95％，Sigma)，中温α-淀粉酶(4000U/g)，糖化酶(10000U/g)，普鲁兰酶(10000U/g)，木瓜蛋白酶(10000U/g)，蒽酮(AR，麦克林)，硫酸(AR，西陇科学)，盐酸(AR，西陇科学)，纯化水(RO，自制)，超滤离心管(Millipore)，分析天平(Mettler Toledo)，GMA-UN2超纯水机(普析通用)，UV-2450紫外可见分光光度计(岛津)，TD-5台式离心机(卢湘仪)，HH-6数显恒温水浴锅(常州易晨)，LDZF-75L-1立式高压灭菌器(上海申安，温度上限为137℃，压力上限0.33Mpa)。
材料和试液
灵芝子实体和灵芝孢子粉由福建仙芝楼生物科技股份有限公司提供。
硫酸-蒽酮溶液：精密称取蒽酮0.1g，加98％的硫酸溶液100mL使溶解，摇匀。
复合酶液配制：精密称取500mg中温α-淀粉酶，200mg糖化酶和100mg普鲁兰酶，加入到烧杯中，加少量纯化水混悬，将混悬后的溶液转移到100mL的容量瓶中，再用水洗烧杯1-2次，将洗液也转移到容量瓶中，加水至100mL，使用前摇匀。
木瓜蛋白酶液：精密称取500mg木瓜蛋白酶，加入到烧杯中，加少量纯化水溶解，将溶解后的溶液转移到100mL的容量瓶中，再用水洗烧杯1-2次，将洗液也转移到容量瓶中，加水至刻度，使用前摇匀。
对照品溶液的制备
取无水葡萄糖对照品12mg，准确称取，加水制成每1mL含0.12mg的溶液，即得。
标准曲线绘制
精密量取对照品溶液0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL，分别置10mL的具塞试管中，各加水至2.0mL，迅速精密加入硫酸蒽酮溶液6mL，立即摇匀，放置15min后，立即置冰浴中冷却15min，取出，以相应的试剂为空白，在625nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，以葡萄糖质量为横坐标，绘制标准曲线。
供试品溶液的制备
重复性：将灵芝子实体粉碎至20目以上的颗粒，精密称取6份0.1g(M)灵芝子实体颗粒加水30mL，置于高压灭菌器提取，提取温度135℃，提取压力0.3MPa，提取时间60min。取高温高压加速提取后的样品残渣和提取液混合物，转移至50mL注射器中，50mL注射器在出口处接入针孔式过滤器，滤膜孔径100μm；拔出注射器活塞，取高温高压加速提取后的子实体残渣和提取液混合物从注射器活塞口加入注射器，插入活塞，手工加压滤出提取液，压力约0.12-0.2MPa；提取液加入1mL的中温α-淀粉酶(4000U/g，浓度0.5％)，糖化酶(10000U/g，浓度0.2％)和普鲁兰酶(10000U/g，浓度0.1％)的复合酶液，55℃酶解60min，再加入1mL的木瓜蛋白酶(10000U/g，浓度0.5％)，55℃酶解60min，4000r/min离心10min，离心得到上清液；取上清液，加入截留分子量为3kD的超滤离心管的内管中，4000r/min离心10min，得到截留在内管的浓缩液；取浓缩液定容25mL(V1)，即为供试品溶液1。
破壁灵芝孢子粉：精密称取6份0.1g(M)孢子粉加水30mL，置于高压灭菌器提取，提取温度135℃，提取压力0.3MPa，提取时间60min。加压过滤器在下部出口处带有滤膜，滤膜孔径1.2μm；取高温高压加速提取后的孢子粉残渣和提取液混合物从上部入口加入，盖好入口盖子，从空气入口，手动或机械加压打入空气，加压滤出提取液，压力约0.12-0.2MPa；提取液加入1mL的中温α-淀粉酶(4000U/g，浓度0.5％)，糖化酶(10000U/g，浓度0.2％)和普鲁兰酶(10000U/g，浓度0.1％)的复合酶液，55℃酶解60min，再加入1mL的木瓜蛋白酶(10000U/g，浓度0.5％)，55℃酶解60min，4000r/min离心10min，离心得到上清液；取上清液，加入截留分子量为3kD的超滤离心管的内管中，4000r/min离心10min，得到截留在内管的浓缩液；取浓缩液定容25mL(V1)，即为供试品溶液2。
准确度：将灵芝子实体粉碎至20目以上的颗粒，“精密称取6份0.05g(M)灵芝子实体颗粒加水29mL，精密加入1mL的1.3mg/mLβ-葡聚糖对照品溶液，置于高压灭菌器提取，提取温度135℃，提取压力0.3MPa，提取时间60min。取高温高压加速提取后的样品残渣和提取液混合物，转移至50mL注射器中，50mL注射器在出口处接入针孔式过滤器，滤膜孔径100μm；拔出注射器活塞，取高温高压加速提取后的子实体残渣和提取液混合物从注射器活塞口加入注射器，插入活塞，手工加压滤出提取液，压力约0.12-0.2MPa；提取液加入1mL的中温α-淀粉酶(4000U/g，浓度0.5％)，糖化酶(10000U/g，浓度0.2％)和普鲁兰酶(10000U/g，浓度0.1％)的复合酶液，55℃酶解60min，再加入1mL的木瓜蛋白酶(10000U/g，浓度0.5％)，55℃酶解60min，4000r/min离心10min，离心得到上清液；取上清液，加入截留分子量为3kD的超滤离心管的内管中，4000r/min离心10min，得到截留在内管的浓缩液；取浓缩液定容25mL(V1)，即为供试品溶液3。
测定
精密量取供试品溶液2mL(V2)，置10mL具塞试管中，迅速精密加入硫酸蒽酮溶液6mL，立即摇匀，放置15min后，立即置冰浴中冷却15min，取出，以相应的试剂为空白，在625nm波长处测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液1，2，3中无水葡萄糖的质量(C)，计算即得。
式中：
W-β-葡聚糖的含量，％；
C-从标准曲线上查得样品的无水葡萄糖质量，mg；
M-样品质量，g；
V1-供试品溶液定容体积，V1＝25，mL；
V2-测定体积，V2＝2，mL；
线性范围
灵芝β-葡聚糖标准曲线，见附图2，该法在0.024-0.144mg范围内线性关系良好，可准确测定范围内的灵芝β-葡聚糖含量。
重复性
表1灵芝子实体β-葡聚糖重复性试验结果
灵芝子实体β-葡聚糖平均值为2.87％，RSD＝1.28％，符合2020版中国药典四部9101分析方法验证指导原则对含量测定中的重复性RSD＜2％的要求。
表2灵芝孢子粉β-葡聚糖重复性试验结果
灵芝孢子粉β-葡聚糖平均值为2.50％，RSD＝1.1％，符合2020版中国药典四部9101分析方法验证指导原则对含量测定中的重复性RSD＜2％的要求。
准确度
表3灵芝β-葡聚糖回收率试验结果
*加入β-葡聚糖量以无水葡萄糖计，加入β-葡聚糖量＝β-葡聚糖称重量×纯度/0.9。
灵芝β-葡聚糖回收率为104.4％，RSD＝1.96％，符合2020版中国药典四部9101分析方法验证指导原则对含量测定中的回收率限度为92～105％的要求。
不同方法对灵芝子实体的多糖/β-葡聚糖检测结果对比
精密称取样品，按照《保健食品功效成分检测方法》的多糖检测方法、中国药典2020版的蒽酮-硫酸法、NYT 1676-2008食用菌中粗多糖含量的测定的苯酚-硫酸法，酶法试剂盒和刚果红法进行检测。
表4不同方法对灵芝子实体的多糖/β-葡聚糖检测结果
表4不同方法对灵芝子实体的多糖/β-葡聚糖检测结果
| 方法 | 多糖含量％ | β-葡聚糖含量％ | 耗时h |
| 药典法 | 2.07 | 23.5 | |
| NYT 1676 | 1.45 | 3.16 | |
| 保健食品功效成分检测方法 | 1.01 | 7.5 | |
| 灵芝β-葡聚糖检测方法 | 2.87 | 3.16 | |
| 酶法试剂盒 | 50.5 | 5.5 | |
| 刚果红法 | 0.13 | 7.5 |
本发明所述的灵芝β-葡聚糖检测方法，由于使用高温高压加速提取等技术，可将灵芝中的β-葡聚糖成分完全提取和分离纯化出来，该方法重复性好(RSD＝1.1％)、准确度高(平均回收率＝104.4％)。但是，保健食品功效成分检测方法、药典法和NYT 1676提取温度仅为100℃：导致提取时间长或提取效率低下，提取不完全，结果偏低，并且后两种方法检测结果是α-葡聚糖和β-葡聚糖的总和，即多糖的含量，一方面未能排除不具备药理活性的灵芝α-葡聚糖的干扰，另一方面未能准确测定出具有药理活性的β-葡聚糖含量。酶法试剂盒虽然能排除灵芝α-葡聚糖，但是将灵芝子实体中不可溶和不具备药理活性的的纤维素等膳食纤维纳入β-葡聚糖含量，结果偏高。刚果红对灵芝β-葡聚糖不具备特异性或受到其他杂质的严重干扰，结果偏低。
Claims (5)
1.一种测定灵芝中β-葡聚糖含量的方法，其特征在于：制作测定样品，以无水葡萄糖为对照品，使用蒽酮-硫酸法测定样品中β-葡聚糖含量，所述的测定样品的制作方法为：使用高温高压提取-加压过滤-复合酶解-超滤离心净化而得到；在提取液加入 1mL 由4000U/g，浓度为0.5％的中温α-淀粉酶、10000U/g，浓度为0.2％糖化酶和10000U/g，浓度为0.1％普鲁兰酶组成的复合酶液，55℃酶解60min，再加入 1mL 10000U/g，浓度为0.5％的木瓜蛋白酶，55℃酶解 60min，4000r/min 离心 10min，离心得到上清液；取上清液，加入截留分子量为 3kD 的超滤离心管的内管中，4000r/min 离心 10min，得到截留在内管的浓缩液。
2.根据权利要求1中所述的一种测定灵芝中β-葡聚糖含量的方法，其特征在于：所述的高温高压提取：将0.1g样品加水30mL，置于高压灭菌器提取，提取温度为135℃，提取压力为0.3MPa，提取时间为60min。
3.根据权利要求1中所述的一种测定灵芝中β-葡聚糖含量的方法，其特征在于：所述的加压过滤：将高温高压提取后的样品残渣和提取液混合物，倒入加压过滤器中，加压滤出提取液。
4.根据权利要求1中所述的一种测定灵芝中β-葡聚糖含量的方法，其特征在于：配制复合酶液：重量比：中温α-淀粉酶:糖化酶:普鲁兰酶=5:2:1，首先将三种酶混合，加入少量纯化水混悬，将混悬后的溶液转移到的容量瓶中，再用水洗烧杯1-2次，将洗液也转移到容量瓶中，加水至刻度，使用前摇匀，配置后的中温α-淀粉酶的浓度为5mg/mL，糖化酶的浓度为2mg/mL，普鲁兰酶的浓度为1mg/mL；配制木瓜蛋白酶液：将木瓜蛋白酶加入少量纯化水混悬，将混悬后的溶液转移到的容量瓶中，再用水洗烧杯1-2次，将洗液也转移到容量瓶中，加水至刻度，使用前摇匀，配置后的木瓜蛋白酶的浓度为5mg/mL；所述的复合酶解：取前一步骤所得的提取液，加入1mL复合酶液，55℃酶解60min，再加入1mL的木瓜蛋白酶液，55℃酶解60min，4000r/min离心10min，离心得到上清液。
5.根据权利要求1中所述的一种测定灵芝中β-葡聚糖含量的方法，其特征在于：所述的蒽酮-硫酸法：取浓缩液定容25mL，即为供试品溶液；供试品溶液与蒽酮-硫酸反应，形成带有紫外吸收的络合物，以无水葡萄糖为对照品，测定供试品溶液中β-葡聚糖含量；根据样品重量即可算出样品中的灵芝中β-葡聚糖含量。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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