CN110715997A - 一种多糖测定分析方法及其应用 - Google Patents

一种多糖测定分析方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种多糖测定分析方法，包括以下步骤：(1)多糖酶解，使用内切酶对多糖样品进行酶解，获得酶解产物；(2)衍生化，使用衍生化试剂对所述酶解产物进行衍生化处理；(3)测定分析，采用UPLC‑MS或/和UPLC‑FLR对衍生化处理后的酶解产物进行分离、得到色谱图，随后对色谱峰特征信息进行分析，获得多糖信息。本发明提供的多糖的测定方法可以克服现有技术中对水解得到的特征寡糖片段分离度差、易受共流出组分影响等不足。

Description

一种多糖测定分析方法及其应用
技术领域
本发明涉及糖类测定技术领域，尤其涉及一种多糖测定分析方法及其在菌类中的应用。
背景技术
多糖是由10个以上的单糖以糖苷键连接而成的高分子多聚物。1969年，日本的千原从香菇中分离出抗肿瘤活性的多糖掀起了一股从食用菌中寻找抗肿瘤成分的高潮。实际上，真菌多糖因其显著的生物活性如免疫调节、降血糖、抗氧化和抗炎抗病毒等确已引起了人们广泛的关注[陈忠杰，等.广西轻工业，2007，6：5-6；李慧芬，等.陕西农业科学，2006，5：77-80]。目前，已报道的主要活性菌物多糖有香菇、猴头菇、灵芝、银耳、黑木耳、冬虫夏草、灵芝多糖、灰树花等。然而，由于多糖复杂的结构与组成，其质量控制一直是其应用开发的瓶颈。多糖的分子量、组成单糖、构象及糖苷键链接等与其活性密切相关，如何快速准确地鉴别及定量分析多糖是多糖产业化过程中的关键问题。为此，我们先后建立了基于多糖特异酶解反应及其产物特征的多糖“糖谱法”[中国专利ZL200910031276.5]和基于多糖dn/dc值的多糖定量方法[中国专利ZL201410172342.1]。由于分离鉴定技术对糖谱法准确鉴定不同来源多糖至关重要，而dn/dc存在无法克服共流出多糖组份对定量准确性的影响。为此，本发明采用针对活性多糖结构特征的定性鉴别及定量分析方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于酶解特征寡糖片段的高分离度的多糖测定分析方法。
为实现上述目的，本发明提供一种多糖测定分析方法，包括以下步骤：
(1)多糖酶解，使用内切酶对多糖样品进行酶解，获得酶解产物；
(2)衍生化，使用衍生化试剂对所述酶解产物进行衍生化处理；
(3)测定分析，采用UPLC-MS或/和UPLC-FLR对衍生化处理后的酶解产物进行分离、得到色谱图，随后对色谱峰特征信息进行分析，获得多糖信息。
具体地，步骤(1)中所述内切酶选自β-1,3(4)-葡聚糖内切酶、β-1,3-葡聚糖内切酶、β-1,4-半乳聚糖内切酶、右旋糖酐酶、阿拉伯聚糖酶、纤维素酶、果胶酶、α-淀粉酶和异淀粉酶中的一种或多种。每1mg多糖所使用的酶的用量范围为1～650U。内切酶的类型可根据所测多糖样品中结构特征进行选择，如香菇多糖中糖苷键主要含β-1,3-葡聚糖苷键，就选择β-1,3-葡聚糖内切酶水解香菇多糖。
具体地，步骤(2)中所述衍生化试剂选自2-AB(2-氨基苯甲酰胺)、2-AA(2-氨基苯甲酸)、ABBE(对氨基苯甲酸酯)、AMAC(2-氨基吖啶酮)、ANTS(8-氨基萘-1,2,6-三磺酸)、APTS(8-氨基芘-1,3,6-三磺酸盐)、3-AQ(3-氨基喹啉)或2-AP(2-氨基吡啶)。衍生化是指采用还原胺化、与吡唑啉酮类、肼类试剂反应、氨基衍生化、羟基衍生化、羧基衍生化，衍生化试剂具体根据所测多糖样品需进行的衍生化操作进行选择。
具体地，步骤(2)包括以下步骤：
a)将衍生化试剂溶于DMSO/乙酸溶液中，获得的衍生化试剂浓度为0.01-0.2M；
b)用步骤a)中获得的衍生化试剂溶液配制硼氢化钠溶液，使得硼氢化钠的最终浓度为0.1-1M，配制完成后获得所述衍生化试剂溶液；
c)取步骤b)中获得的衍生化试剂溶液加入酶解后的酶解产物中，水浴反应，反应完成后，采用离心处理，取上清液与乙腈混合，混合后采用Glycoworks HILIC固相萃取柱去除其中过量的衍生化试剂，得到衍生化试剂衍生化后的酶解产物。
进一步地，步骤(2)具体包括：
a)将2-AB溶于DMSO/乙酸溶液中，获得的2-AB浓度为0.01-0.2M；
b)用步骤a)中获得的2-AB溶液配制硼氢化钠溶液，使得硼氢化钠的最终浓度为0.1-1M，配制完成后获得所述衍生化试剂；
c)取50μL步骤b)中获得的衍生化试剂加入酶解后的酶解产物中，60℃水浴反应3h，反应完成后，采用6000g离心10min，取上清5μL与95μL乙腈混合，混合后采用GlycoworksHILIC固相萃取柱去除其中过量的衍生化试剂，得到2-AB衍生化后的酶解产物。
具体地，步骤(3)中采用所述UPLC-MS对衍生化处理后的酶解产物进行定性分析，根据色谱峰和保留时间，或以质谱色谱峰质荷比及二级质谱碎片特征，通过数据库比对进行色谱峰的识别与鉴定。
具体地，步骤(3)中采用所述UPLC-FLR对衍生化处理后的酶解产物进行定量分析，选择标准低聚糖或纯化的酶解特征片段寡糖为对照品，根据色谱峰峰面积及保留时间，对多糖进行定量分析。
具体地，步骤(3)中UPLC-MS色谱条件如下：
a)色谱柱，Waters UPLC BEH Glycan(2.1×150mm id,1.7μm)，柱温60℃，流动相为0.5％甲酸-水溶液(A)和乙腈(B)，梯度洗脱，程序为80％-56％B，0-30min，56％-0％B，30–34min，0％-0％B，34–37min，0％-80％B，37–40min，80％B平衡5min，流速0.5mL/min，进样量1μL；
b)质谱条件，电喷雾离子化(ESI)，正离子模式，电压:+4kV,氮气干燥气流速10L/min,干燥温度:250℃。
具体地，步骤(3)中UPLC-FLR色谱条件如下：
a)色谱柱为Waters UPLC BEH Glycan(2.1×150mm id,1.7μm)，柱温60℃，流动相为100mM甲酸铵，pH 4.5(A)和乙腈(B)，梯度洗脱，程序为25％-50％A，0–46.5min，50％-100％A，46.5–48min，100％A，48–49min，100％-25％A，49–50min，25％A平衡10min，流速0.5mL/min，进样量1μL；
b)荧光检测器，激发波长330nm，检测波长420nm。
本发明该提供上述多糖测定分析方法在菌类中的应用。将上述多糖测定方法应用于菌类多糖测定中，可以建立菌类多糖酶解片段的结构信息糖谱，实现菌类多糖的快速、准确鉴别。
具体地，所述菌类多糖样品的制备方法包括以下步骤：
(1)菌类多糖提取，将所述菌类干燥、打粉后加入水使得料液比1:20，水热平行提取，获得菌类初样；
(2)水提液浓缩，取步骤(1)中获得的菌类初样，加入乙醇沉淀，静置，离心，保留沉淀，加水复溶，冷冻干燥得到粗多糖；
(3)将步骤(2)中的粗多糖加去离子水配成溶液，转入超滤离心管，离心，弃滤液，采用苯酚-硫酸法跟踪检测滤液中糖含量，将截留液冷冻干燥，得到所述菌类多糖样品。
进一步地，所述菌类多糖样品的制备方法具体包括：
(1)菌类多糖提取，将所述菌类干燥、打粉后取1g加入水使得料液比1:20，100℃水热平行提取2h，获得菌类初样；
(2)水提液浓缩，取步骤(1)中获得的菌类初样，加入4倍体积95％乙醇沉淀，静置30min，4000g离心10min，保留沉淀，加水复溶，冷冻干燥得到粗多糖；
(3)将步骤(2)中的粗多糖加去离子水配成浓度为5-10mg/mL的溶液，转入超滤离心管，2000g离心25min，弃滤液，采用苯酚-硫酸法跟踪检测滤液中糖含量，将截留液冷冻干燥，得到所述菌类多糖样品。
本发明提供的多糖的测定方法，采用内切酶水解多糖样品并结合UPLC-MS或/和UPLC-FLR方法，其中，UPLC-MS、UPLC-FLR与基于TLC、PACE及HPLC-UV/ELSD/CAD的糖谱分析方法相比，具有分离度高、分析速度快、定量灵敏度高等特点，使得本发明提供的多糖的测定方法可以克服现有技术中对水解得到的特征寡糖片段分离度差、易受共流出组分影响等不足。
附图说明
图1是香菇多糖β-1,3-葡萄糖苷酶水解特征片段UPLC-Q-TOF-MS图谱及其特征片段(峰1-4)MS/MS结构分析；
图2是四批香菇多糖(LE1-4,e-f)β-1,3-葡萄糖苷酶水解产物UPLC-FLR图谱，β-1,3-葡萄糖苷酶(a)及未酶解香菇多糖(b)作为空白对照，以酶解后的β-1,3-D-Glucan(c)作为阳性对照；
图3是不同菌物多糖β-1,3-葡萄糖苷酶水解产物UPLC-FLR图谱；A，香菇多糖；B，猴头菇多糖；C，赤芝多糖；D，虎乳灵芝多糖；E，桦褐菌多糖；F，紫芝多糖；G，蛹虫草多糖；H，人工虫草多糖；I，天然虫草多糖；J，长座虫草多糖。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和有益效果，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。需说明的是，下述实施所述方法是对本发明做的进一步解释说明，不应当作为对本发明的限制。本发明的实施例中所用的材料、试剂若无特殊说明皆可从商业途径获得。
本发明提供的多糖的测定方法可以用于多种物质的测定，在本实施例中，选用香菇或其他菌类作为测试样品。由于菌类多糖中糖苷键大多主要含β-1,3-葡聚糖苷键，因此，采用β-1,3-葡聚糖内切酶水解香菇等菌类多糖，得到不同菌类多糖的水解特征图谱。
实施例1香菇多糖定性定量分析
(1)香菇多糖提取：四批香菇样品干燥，打粉，分别取1g药材加入水使得料液比1:20，100℃水热平行提取2h。
(2)水提液浓缩，加入4倍体积95％乙醇沉淀，静置30min，4000g离心10min，保留沉淀，加水复溶，冷冻干燥得到粗多糖。
(3)将上述粗多糖加去离子水配成浓度为5-10mg/mL的溶液，转入超滤离心管(截留分子量:>3kDa,Millipore,Billerica,MA,USA)，2000g离心25min，弃滤液，采用苯酚-硫酸法跟踪检测滤液中糖含量，截留液冷冻干燥，得到香菇多糖样品。
(4)香菇多糖的酶解：分别称取5mg样品加入2mL去离子水溶解，取300μL样品加入1,3-β-葡聚糖苷酶(终浓度约为2.0U/mL)水解，水解液以80℃加热20min终止酶解。离心后取上清，冷冻干燥后采用2-AB衍生化处理；以β-葡聚糖(1mg/mL)样品做同样处理作为阳性对照；不加酶的多糖样品同样处理作为空白对照。
(5)酶解样品2-AB衍生：
a)将2-AB溶于DMSO/乙酸溶液(7/3,v/v)中，2-AB浓度为0.01-0.2M，在本实施例中2-AB的浓度为0.1M；b)取上述2-AB溶液配制硼氢化钠溶液，获得的硼氢化钠的终浓度为0.1-1M，在本实施例中为0.5M，得到衍生化试剂；c)取50μL衍生化试剂加入酶解产物中，60℃水浴反应3h；反应完成后，采用6000g离心10min，取上清5μL与95μL乙腈混合，采用Glycoworks HILIC固相萃取柱去除过量的衍生化试剂，得到2-AB衍生化的香菇多糖及酶解产物；衍生后待测液采用0.45μm滤膜过滤，进行液相和质谱分析。
(6)定性分析：特征碎片结构鉴定，将上述衍生后的样品采用UPLC-MS进行分析，具体液质分析仪器及方法可根据实际需求进行选择，在本实施例中选择方法为UPLC-Q-TOF-MS并按如下条件进行分析：
液相色谱条件：色谱柱为Waters UPLC BEH Glycan(2.1×150mm id,1.7μm)，柱温60℃；流动相为0.5％甲酸-水溶液(A)和乙腈(B)，梯度洗脱，程序为80％-56％B，0-30min，56％-0％B，30–34min，0％-0％B，34–37min，0％-80％B，37–40min，80％B平衡5min。流速0.5mL/min，进样量1μL。
质谱条件：电喷雾离子化(ESI)，正离子模式，电压:+4kV,氮气干燥气流速10L/min，干燥温度:250℃。
结果见图1，通过保留时间及各组分MS碎片特征峰进行定性，数据采用DataAnalysis 4.0软件处理(布鲁克公司，德国)，特征峰结构采用GlycomeBD数据库检索比对。香菇多糖1,3-β-葡聚糖苷酶酶解特征片段主要为二糖至四糖，编号峰1和2为二糖、峰3为三糖、峰4为四糖，更高聚合度寡糖含量很低。
(7)定量分析：将上述2-AB衍生化的标准葡三糖溶液及衍生化处理的酶解样品溶液采用UPLC-FLR进行测定。制作标准曲线：以2-AB衍生化的标准葡三糖溶液的峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，作线性回归得标准曲线方程：y＝172839x+49407，r＝0.9993。检测限和定量限分别为21.7ng/mL和61.5ng/mL。以香菇多糖酶解样品为对象，考察方法精密度、重复性及稳定性，均以RSD(％)表示。结果：峰面积及保留时间日内精密度分别为1.96-3.32％和0.25-0.41％，日间精密度分别为3.58-5.24％和0.35-0.49％；峰面积及保留时间重复性分别为1.11-4.83％和0.25-0.33％；峰面积及保留时间稳定性分别为2.66-4.84％和0.33-0.50％；回收率为100.1％±0.2％。
UPLC-FLR色谱条件如下：采用Waters ACQUITY UPLC系统连接荧光检测器。色谱柱为Waters UPLC BEH Glycan(2.1×150mm id,1.7μm)，柱温60℃；流动相为100mM甲酸铵，pH4.5(A)和乙腈(B)，梯度洗脱，程序为25％-50％A，0–46.5min，50％-100％A，46.5–48min，100％A，48–49min，100％-25％A，49–50min，25％A平衡10min。流速0.5mL/min，进样量1μL。激发波长：330nm，检测波长：420nm。
四批香菇多糖β-1,3-葡萄糖苷酶水解产物UPLC-FLR图谱见图2，图中，d-g分别代表不同批次的香菇样品，a代表β-1,3-葡聚糖苷酶，b代表空白对照：未酶解香菇多糖，表明糖苷酶及未酶解的空白多糖样品中无单糖及寡糖干扰；c代表阳性对照：酶解后的β-1,3-D-Glucan(β-葡聚糖)，表明所使用的β-1,3-葡聚糖苷酶具有β-1,3-D-葡萄糖苷键水解特异性及活性。
定量分析结果，参照图3A之香菇多糖，以峰1,2,3,4为指标，以标准葡三糖为对照，计算香菇多糖β-1,3-葡聚糖苷酶水解产物特征寡糖在原香菇药材中含量分别为237±20μg/g，218±19μg/g，368±31μg/g，252±19μg/g(n＝4)。
实施例2菌类多糖定性鉴别分析
(1)菌类药材猴头菇(B)、赤芝(C)、虎乳灵芝(D)、桦褐菌(E)、紫芝(F)、蛹虫草(G)、人工虫草(H)、天然虫草(I)、长座虫草(J)，冷冻干燥，打粉，取1g药材加入水使得料液比1:20，100℃水热平行提取2h。
(2)水提液浓缩，加入4倍体积95％乙醇沉淀，静置30min，4000g离心10min，保留沉淀，加水复溶，冷冻干燥得到粗多糖。
(3)将上述粗多糖加去离子水配成浓度为5-10mg/mL的溶液，转入超滤离心管(截留分子量:>3kDa,Millipore,Billerica,MA,USA)，2000g离心25min，弃滤液，采用苯酚-硫酸法跟踪检测滤液中糖含量，截留液冷冻干燥，得到各菌物多糖样品。
(4)菌物多糖的酶解：
分别称取5mg样品加入2mL去离子水溶解，取300μL样品加入1,3-β-葡聚糖苷酶(终浓度约为2.0U/mL)水解，水解液以80℃加热20min终止酶解。离心后取上清，冷冻干燥后采用2-AB衍生化处理；不加酶的多糖样品同样处理作为空白对照。
(5)酶解样品2-AB衍生：
a)将2-AB溶于DMSO/乙酸溶液(7/3,v/v)中，2-AB浓度为0.01-0.2M；b)取上述2-AB溶液配制硼氢化钠溶液，终浓度为0.1-1M，得到衍生化试剂；c)取50μL衍生试剂加入酶解产物中，60℃水浴反应3h；反应完成后，采用6000g离心10min，取上清5μL与95μL乙腈混合，采用Glycoworks HILIC固相萃取柱去除过量的衍生化试剂；得到2-AB衍生化的菌物多糖及酶解产物，衍生后待测液采用0.45μm滤膜过滤，进行液相和质谱分析。
(6)定性分析：特征碎片结构鉴定，将上述衍生后的样品采用UPLC-Q-TOF-MS按如下条件进行分析：
液相色谱条件：色谱柱为Waters UPLC BEH Glycan(2.1×150mm id,1.7μm)，柱温60℃；流动相为0.5％甲酸-水溶液(A)和乙腈(B)，梯度洗脱，程序为80％-56％B，0-30min，56％-0％B，30–34min，0％-0％B，34–37min，0％-80％B，37–40min，80％B平衡5min。流速0.5mL/min，进样量1μL。
质谱条件：电喷雾离子化(ESI)，正离子模式，电压:+4kV,氮气干燥气流速10L/min，干燥温度:250℃。
(7)定量分析：将上述2-AB衍生化的标准葡三糖溶液及衍生化处理的酶解样品溶液采用UPLC进行测定。制作标准曲线：以2-AB衍生化的标准葡三糖溶液的峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，作线性回归得标准曲线方程：y＝172839x+49407，r＝0.9993。检测限和定量限分别为21.7ng/mL和61.5ng/mL。以香菇多糖酶解样品为对象，考察方法精密度、重复性及稳定性，均以RSD(％)表示。结果：峰面积及保留时间日内精密度分别为1.96-3.32％和0.25-0.41％，日间精密度分别为3.58-5.24％和0.35-0.49％；峰面积及保留时间重复性分别为1.11-4.83％和0.25-0.33％；峰面积及保留时间稳定性分别为2.66-4.84％和0.33-0.50％；回收率为100.1％±0.2％。
UPLC-FLR色谱条件如下：采用Waters ACQUITY UPLC系统连接荧光检测器。色谱柱为Waters UPLC BEH Glycan(2.1×150mm id,1.7μm)，柱温60℃；流动相为100mM甲酸铵，pH4.5(A)和乙腈(B)，梯度洗脱，程序为25％-50％A，0–46.5min，50％-100％A，46.5–48min，100％A，48–49min，100％-25％A，49–50min，25％A平衡10min。流速0.5mL/min，进样量1μL。激发波长：330nm，检测波长：420nm。
结果如图3，通过保留时间及个组分碎片特征峰进行定性，数据采用DataAnalysis 4.0软件处理(布鲁克公司，德国)，特征峰结构采用GlycomeBD数据库检索比对。根据各多糖酶解样品UPLC图谱及MS鉴定结果可知，不同菌类多糖酶解片段具有一定差异；其中香菇多糖、赤芝多糖、桦褐菌多糖酶解片段寡糖主要为二糖、三糖和四糖，但各寡糖片段含量具有明显的差异，见表1。结果表明：灵芝多糖酶解产物中三糖含量最高，而桦褐菌中稍低；紫芝中二糖至六糖总含量最高、三糖含量约为24％；猴头菇多糖、虎乳灵芝多糖、蛹虫草和天然虫草多糖含有五糖，比例为4.6％～23.4％；猴头菇多糖酶解片段含明显的六糖；而人工虫草、蛹虫草和长座虫草多糖酶解得到的寡糖片段主要为二糖，占总含量80％以上，其他寡糖比例较低；以此可区分香菇多糖及不同种类的菌类多糖。
表1几种菌物多糖酶解产物中代表性寡糖含量(μg/g)及其比例(％)
Figure BDA0001729260960000091
Figure BDA0001729260960000101
注：a含量；b比例
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种多糖测定分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)多糖酶解，使用内切酶对多糖样品进行酶解，获得酶解产物；
(2)衍生化，使用衍生化试剂对所述酶解产物进行衍生化处理；
(3)测定分析，采用UPLC-MS或/和UPLC-FLR对衍生化处理后的酶解产物进行分离、得到色谱图，随后对色谱峰特征信息进行分析，获得多糖信息。
2.如权利要求1所述的多糖测定分析方法，其中，步骤(1)中所述内切酶选自β-1,3(4)-葡聚糖内切酶、β-1,3-葡聚糖内切酶、β-1,4-半乳聚糖内切酶、右旋糖酐酶、阿拉伯聚糖酶、纤维素酶、果胶酶、α-淀粉酶和异淀粉酶中的一种或多种。
3.如权利要求1所述的多糖测定分析方法，其中，步骤(2)中所述衍生化试剂选自2-AB(2-氨基苯甲酰胺)、2-AA(2-氨基苯甲酸)、ABBE(对氨基苯甲酸酯)、AMAC(2-氨基吖啶酮)、ANTS(8-氨基萘-1,2,6-三磺酸)、APTS(8-氨基芘-1,3,6-三磺酸盐)、3-AQ(3-氨基喹啉)或2-AP(2-氨基吡啶)。
4.如权利要求1所述的多糖测定分析方法，其中，步骤(2)包括以下步骤：
a)将衍生化试剂溶于DMSO/乙酸溶液中，获得的衍生化试剂浓度为0.01-0.2M；
b)用步骤a)中获得的衍生化试剂溶液配制硼氢化钠溶液，使得硼氢化钠的最终浓度为0.1-1M，配制完成后获得所述衍生化试剂溶液；
c)取步骤b)中获得的衍生化试剂溶液加入酶解后的酶解产物中，水浴反应，反应完成后，采用离心处理，取上清液与乙腈混合，混合后采用Glycoworks HILIC固相萃取柱去除其中过量的衍生化试剂，得到衍生化试剂衍生化后的酶解产物。
5.如权利要求1所述的多糖测定分析方法，其中，步骤(3)中采用所述UPLC-MS对衍生化处理后的酶解产物进行定性分析，根据色谱峰和保留时间，或以质谱色谱峰质荷比及二级质谱碎片特征，通过数据库比对进行色谱峰的识别与鉴定。
6.如权利要求1所述的多糖测定分析方法，其中，步骤(3)中采用所述UPLC-FLR对衍生化处理后的酶解产物进行定量分析，选择标准低聚糖或纯化的酶解特征片段寡糖为对照品，根据色谱峰峰面积及保留时间，对多糖进行定量分析。
7.如权利要求1所述的多糖测定分析方法，其中，步骤(3)中UPLC-MS色谱条件如下：
a)色谱柱，Waters UPLC BEH Glycan(2.1×150mm id,1.7μm)，柱温60℃，流动相为0.5％甲酸-水溶液(A)和乙腈(B)，梯度洗脱，程序为80％-56％B，0-30min，56％-0％B，30–34min，0％-0％B，34–37min，0％-80％B，37–40min，80％B平衡5min，流速0.5mL/min，进样量1μL；
b)质谱条件，电喷雾离子化(ESI)，正离子模式，电压+4kV,氮气干燥气流速10L/min,干燥温度250℃。
8.如权利要求1所述的多糖测定分析方法，其中，步骤(3)中UPLC-FLR色谱条件如下：
a)色谱柱为Waters UPLC BEH Glycan(2.1×150mm id,1.7μm)，柱温60℃，流动相为100mM甲酸铵，pH 4.5(A)和乙腈(B)，梯度洗脱，程序为25％-50％A，0–46.5min，50％-100％A，46.5–48min，100％A，48–49min，100％-25％A，49–50min，25％A平衡10min，流速0.5mL/min，进样量1μL；
b)荧光检测器，激发波长330nm，检测波长420nm。
9.如权利要求1至8任一项所述的多糖测定分析方法在菌类中的应用。
10.如权利要求9所述的多糖测定分析方法在菌类中的应用，其中，所述菌类多糖样品的制备方法包括以下步骤：
(1)菌类多糖提取，将所述菌类干燥、打粉后加入水使得料液比1:20，水热平行提取，获得菌类初样；
(2)水提液浓缩，取步骤(1)中获得的菌类初样，加入乙醇沉淀，静置，离心，保留沉淀，加水复溶，冷冻干燥得到粗多糖；
(3)将步骤(2)中的粗多糖加去离子水配成溶液，转入超滤离心管，离心，弃滤液，采用苯酚-硫酸法跟踪检测滤液中糖含量，将截留液冷冻干燥，得到所述菌类多糖样品。
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