CN1895296A - 一种检测灵芝产品口服制剂质量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属中药制药领域，涉及一种以灵芝植物特征物质为基础的系统、组合的质量检测方法，尤其涉及检测灵芝产品口服制剂双灵固本(商品名)质量的方法。本发明的定性鉴别方法及其检测步骤依次为显微鉴别、紫外灯、试液反应鉴别和薄层层析鉴别；所述含量测定方法及其检测步骤依次为灵芝多糖含量测定和灵芝总三萜含量测定。本方法能严格控制双灵固本口服制剂生产全过程和监控产品贮藏期质量。

Description

一种检测灵芝产品口服制剂质量的方法

技术领域

本发明属中药制药领域，涉及一种以灵芝植物特征物质为基础的系统、组合的质量检测方法，具体涉及一种检测灵芝产品口服制剂双灵固本(商品名)质量的方法。

背景技术

灵芝是中医药用药历史较长的中药之一，两千年前东汉时期的《神农本草经》中将灵芝列为上品，认为“久食，轻身不老，延年神仙”。明朝李时珍编著的《本草纲目》中记载：灵芝味苦、平，无毒，益心气，活血，入心充血，助心充脉，安神，益肺气，补肝气，补中，增智慧，好颜色，利关节，坚筋骨，祛痰，健胃。

现代医学证明：灵芝含有多种生理活性物质，能够调节、增强人体免疫力，对神经衰弱、风湿性关节炎、冠心病、高血压、肝炎、糖尿病、肿瘤等有良好的协同治疗作用。最新研究表明：灵芝还具有抗疲劳，美容养颜，延缓衰老，防治爱滋病等功效。

现代化学研究发现：灵芝内含化学结构为四环三萜和五环三萜的灵芝三萜、灵芝多糖、灵芝多糖肽三个大类的化学物质，除外还含有生物碱、酶类及微量元素等。由于灵芝化学成分的多样性，使灵芝具有较广泛的药理活性。

双灵固本(商品名)口服制剂是在中医药理论的基础指导下，研制成的含有灵芝活性成分的口服制剂。经临床观察证明具滋补强身，扶正固本的功效。对消化道肿瘤及术后，放、化疗引起的体弱，厌食，失眠等症有康复保健作用。为保持双灵固本口服制剂其临床恒定的有效性，需要一种能系统性、全过程控制双灵固本口服制剂质量的检测方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种能系统性、全过程控制双灵固本口服制剂质量的检测方法。

双灵固本口服制剂的组分为：灵芝∶灵芝孢子为12.5∶1。

双灵固本口服制剂的制备方法为：取灵芝孢子，经超音速喷雾负压低温干燥法破壁，备用。取灵芝粉碎成粗粉，加乙醇，加热回流提取3次，滤过(药渣备用)，合并滤液，减压回收乙醇，并浓缩成浸膏，备用；药渣加水煎煮3次，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩成浸膏，备用；合并上述两种浸膏，加水稀释成清膏，喷雾干燥，加入上述破壁的灵芝孢子，混匀，制成口服制剂。

本发明依据双灵固本口服制剂内容物的特征，采用定性鉴别和含量测定的组合方法，系统检测灵芝内含特征物质灵芝多糖和灵芝总三萜，制定了能系统性测试内在质量的检测方法。

本发明的技术是通过如下方案实现的：

本发明双灵固本口服制剂的检测方法以灵芝内含特征物质为基础，包括对双灵固本口服制剂的定性鉴别方法和含量测定方法二大部分。

其中所述的定性鉴别包括：显微鉴别、紫外灯、试剂显色反应鉴别和以国家标准药材为对照品的薄层层析定性鉴别。

显微鉴别：显微鉴别是主要针对灵芝孢子粉这一特征物质的检测，灵芝孢子粉是灵芝发育后期弹射释放出来的种子，生物学上称担孢子，集中后呈末状，其形态为一层无色透明的膜状物，内孢壁较厚含坚硬几丁质。孢子体内含有丰富的灵芝三萜、灵芝多糖、灵芝多糖肽等活性化学物质，所述化学物质只有破壁后才可能被人体吸收。目前破壁技术有物理法、化学法、生物酶解法，其中以物理破壁技术较佳。本发明通过显微鉴别法，首先鉴别产品中有、无灵芝孢子存在，确定孢子的形态，孢体的状态，如有孢子存在则进一步鉴别其破壁效果，测定孢子的大小为(6-10μm)×(11-14μm)，能有效地确保患者服用时对有效活性物质的吸收，

紫外灯鉴别：双灵固本口服制剂由灵芝所组成，而灵芝中的三萜类化合物含有多个共轭双键，其共轭双键化合物在UV254um紫外灯光下会产生发色光团，故本方法用上述反应特征鉴别灵芝的特征。检测结果表明本方法能有效地控制产品质量，具有复性强的特点。

试剂显色反应鉴别：本发明采用α-萘酚乙醇溶液反应法和茚三酮试液反应法进行试剂显色反应鉴别。

其中，α-萘酚乙醇溶液反应法依据灵芝内含大量多糖类物质，该多糖物质在强酸的作用与α-萘酚乙醇溶液发生反应，由糖先转变为糠醛或其衍生物，再与酚缩合并经氧化而生成有色物质。经对多批双灵固本口服制剂进行鉴别验证，结果均显示出上述特征性的反应。

茚三酮试液反应法依据灵芝内含有肽类物质的特征性反应进行设计，其原理是肽类物质与茚三酮试液在热的催化条件下，能形成有色的氨缩合物。此反应特征性较强。经对多批双灵固本口服制剂进行鉴别验证，均显示出特征性的反应。

薄层层析定性鉴别：以国家认定的标准灵芝药材进行点对点成分鉴别，方法的特点是将国家认定的标准药材与检验样品在同一供试液制备方法下，通过超声处理提取，各吸取两种溶液各5ul，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60-90℃)-醋酸乙酯(8∶2)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。检测结果显示，供试品色谱中，在与国家认定的标准药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

上述方法的优点在于能鉴别出产品中所用灵芝是否为国家认定的标准药材灵芝及产品提取方式是否合理。本方法最大程度能体现在相同RF值位子上，有四组以上的成分，显相同颜色的荧光斑点。所述方法具有鉴别性强、特征性明显、重复性好的特点。

含量测定方法：现代研究证实灵芝起药理作用的主要物质基础是灵芝多糖和灵芝总三萜，本发明对所述二个物质基础进行含量测定，有利于双灵固本口服制剂质量的调控及其疗效的发挥及对产品生产工艺、贮藏期质量的控制。

1)灵芝多糖含量测定方法：现有灵芝多糖的含量测定方法有许多种，一般分为直接水溶变色法、水解变色法、薄板吸附变色法和酶解变色法，前三种方法在测定时，被测液中多糖成分分子范围广，易受粗多糖等多糖结构物质的干扰，造成测定值不稳定。

本发明对多糖的测定根据灵芝多糖的特性，采用10％α-淀粉酶溶液对灵芝中的多糖进行充分酶解，使其水解后形成单糖，再经反应变色以无水葡萄糖为标准参比物进行紫外吸收的测定。包括下述步骤：

a.制备对照品溶液  精密称取105℃干燥至恒重的无水葡萄糖60mg，置100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀即得(每1ml含无水葡萄糖0.6mg)。

b.制备标准曲线  精密量取对照品溶液0.0ml、1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml、3.0ml分别置50ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，精密量取上述溶液各2ml，置具塞试管中，分别加4％苯酚溶液1ml，混匀，迅速加入硫酸7.0ml，摇匀，于40℃水浴中保温30分钟，取出，置冰浴中5分钟，取出，以第一份为空白，照分光光度法(中国药典2005年版一部附录VA)，在489nm的波长处测定吸收度，以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。

c.制备样品液  取经研细的内容物约1.5g，精密称定，置研钵中，加热水少量研匀，移置100ml量瓶中，研钵用热水洗涤数次，洗涤液并入量瓶中，水浴加热15分钟，冷却至60℃以下。加1.0mL 10％α-淀粉酶溶液，加0.5ml醋酸钠缓冲液(PH7.4)，密闭，于55-60℃保温1小时后，加热至沸。冷却后，加水稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液2ml于离心管中，置快速混匀器上，缓慢滴加乙醇8ml，离心，取沉淀加水溶解，置100ml量瓶中，并稀释至刻度备用。

d.含量测定  精密量取样品液2ml，照b标准曲线的制备的方法，自“加4％苯酚1ml”起，依法测定吸收度，从标准曲线上读出供试品溶液中灵芝多糖的重量(ug)，计算，即得。

本方法克服了粗多糖，小分子多糖对测定值的影响，经测得数值偏差幅度明显小，重现性强。

灵芝多糖含量测定的方法学考查：

a.最大吸收波长的选择

精密量取葡萄糖对照品溶液3.0ml，置50ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，作为对照品溶液的稀释液。精密量取对照品稀释液2ml及供试品溶液2ml，置具塞试管中，分别加4％苯酚溶液1ml，混匀，迅速加入硫酸7.0ml，摇匀，于40℃水浴中保温30分钟，取出，置冰浴中5分钟，取出，以蒸馏水2ml同上操作制做空白溶液，照分光光度法(中国药典2000年版附录VB)试验，在400～600nm波长范围内扫描。扫描结果显示：葡萄糖对照品和供试品的入max均为488.7nm。

b.显色稳定性的考察。

依照选择的最大吸收波长对供试品溶液及对照品溶液测定方法及在入max处对供试品及对照品的显色稳定性进行考察结果表明，样品在1-3小时内测定结果。表1是稳定性考察结果。

表1

样品	一小时吸收值(A)	二小时吸收值(A)	三小时吸收值(A)
				试品溶液	0.420	0.422	0.420
对照品溶液	0.341	0.340	0.343

c.标准曲线制备

精密量取对照品溶液0.0ml、1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml、3.0ml、3.5ml、4.0ml，分别置50ml量瓶中，加水至刻度，摇匀。精密量取上述各溶液2ml，置具塞试管中，分别加4％苯酚溶液1ml，混匀，加入硫酸7.0ml，摇匀，于40℃水浴中保温30分钟，取出，置冰浴中5分钟，取出，以第一份为空白，用分光光度法在489nm的波长处测定吸收度，结果表明，葡萄糖浓度在2.436～9.744ug/ml范围内，线性关系良好。表2是线性关系考察结果。

表2

编号	1	2	3	4	5	6	7
								对照品溶液浓度ug/ml	2.436	3.654	4.872	6.090	7.308	8.526	9.744
测得A值	0.100	0.161	0.203	0.300	0.357	0.447	0.516

y＝0.0579x-0.0548 r＝0.9963

d.精密度考察

精密量取对照品溶液3.0ml，取6份照标准曲线方法测定，结果表明，精密度良好。表3是测定结果，精密度考察结果。

表3

编号	1	2	3	4	5	6
							吸收值	0.376	0.378	0.370	0.372	0.368	0.365
平均吸收值	0.3715
							RSD(％)	1.32

e.重复性考察

以双灵固本口服制剂批号为050402供试品，照供试品溶液制备法制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液2ml，共6份，照标准曲线方法测定，表4是重复性考察结果。

表4

编号	1	2	3	4	5	6
							吸收值	0.335	0.334	0.344	0.338	0.330	0.342
平均吸收值	0.337
							RSD(％)	1.55

2)灵芝总三萜含量测定：

灵芝含有丰富的饱和和不饱和三萜类化合物，其代表性成分有灵芝酸A、B、C-----等约120多种，从其结构上分析该类物质在强酸的存在下，与香草醛形成显色反应，此颜色能在波长为560nm处有最大的吸收峰出现，本发明方法鉴于上述原理采用了本含量测定方法方法，其中参比物质为中国药品生物制品检定所提供的批号为(110709-200304)的齐墩果酸标准品。本方法包括如下步骤：

a.制备对照品溶液  精密称取105℃干燥至恒重的齐墩果酸对照品5.0mg，置25ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀即得，每1ml含齐墩果酸0.20mg。

b.制备标准曲线  精密量取对照品溶液0.0ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml分别置试管中，于水浴挥干溶剂，加5％香草醛冰醋酸溶液0.4ml及高氯酸1.6ml，混匀，置70℃水浴加热15分钟，放冷，加乙酸乙酯8ml，混匀，在560nm的波长处测定吸收度，以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。

c.制备样品液  取经研细的内容物约0.2g，精密称定，置25ml量瓶中，加甲醇20ml，超声处理30分钟，冷却，加甲醇至刻度，混匀，过滤，滤液备用。

d.含量测定  精密量取样品液1ml置试管中，于水浴挥干溶剂，加5％香草醛冰醋酸溶液0.4ml及高氯酸1.6ml，混匀，置70℃水浴加热15分钟，放冷，加乙酸乙酯8ml，混匀，在560nm的波长处测定吸收度，从标准曲线上读出供试品溶液中总三萜的重量(mg)，计算，即得。

灵芝总三萜含量测定的方法学考查

a.最大吸收波长的选择：

精密量取对照品溶液0.4ml分别置试管中，水浴挥干溶剂，加5％香草醛冰醋酸溶液0.4ml及高氯酸1.6ml，混匀，置70℃水浴加热15分钟，放冷，加乙酸乙酯8ml，混匀，照分光光度法在400-800nm范围内进行波长扫描，结果：最大吸收峰为560nm。故以560nm作为测定波长。

b.线性关系的考察

精密量取对照品溶液0.0ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml分别置试管中，水浴挥干溶剂，同上法制备对照品溶液，照分光光度法在560nm的波长处测定吸收度，以吸收度为纵坐标，含量(mg)为横坐标，绘制标准曲线。表5是线性关系考察结果。

表5

取样量(ml)	0	0.2	0.4	0.6	0.8	1.0
							含量(mg)吸收度	0.0000.000	0.03920.167	0.07840.355	0.11760.542	0.15680.730	0.19600.918

回归方程为：Y＝4.7128X-0.0099  R＝0.9997

结果表明：齐墩果酸含量在0.0392～0.196mg范围内，含量与吸收度呈良好线性关系。

c.精密度试验

精密量取对照品溶液0.6ml共6份分别置试管中，水浴挥干溶剂，同上法制备对照品溶液，测定吸收度。表6是精密度试验结果。

表6

测定次数	1	2	3	4	5	6	RSD(％)
								含量(mg)吸收度	0.11760.552	0.11760.549	0.11760.546	0.11760.544	0.11760.538	0.11760.543	0.89

结果表明：齐墩果酸精密度试验的RSD为0.89％.

d.稳定性试验

取同一批号样品制备供试品溶液，每间隔2小时测定吸收度。表7是稳定性试验结果。

表7

测定时间(h)	0	2	4	6	8	RSD(％)
							吸收度	0.349	0.350	0.348	0.344	0.340	1.10

结果表明：样品溶液在8小时内，样品吸收值相对稳定，RSD＝1.10％。

e.重现性试验

取同一批号样品制备供试品溶液5份，按上述条件，测定吸收度。

表8是重现性试验结果。

表8

编号	1	2	3	4	5
						称样量(g)	0.2042	0.2071	0.2027	0.2053	0.2019
吸收度	0.349	0.346	0.340	0.356	0.348
						总三萜含量mg/g	18.43	18.04	18.12	18.78	18.60
RSD％	1.19％

结果表明：重现性试验RSD为1.19％。

f.回收率试验

取已知含量的样品0.2g，精密称定，精密加入对照品3.5mg，置100ml量瓶中，加甲醇约80ml，超声处理30分钟，冷却，加甲醇至刻度，混匀，过滤，精密量取续滤液1ml置试管中，自“水浴挥干溶剂”起依法测定吸收度，从标准曲线上读出供试品溶液中总三萜的重量(mg)，计算，即得。表9是齐墩果酸回收率试验结果。

表9

称样量(g)	样品总萜含量(mg)	齐墩果酸加入量	吸收值	测得总量(mg)	回收率(％)	平均回收率	RSD(％)
								0.20380.20510.20170.20350.2042	3.74873.77263.71013.74323.7561	3.51423.50893.50633.51143.5008	0.3220.3370.3390.3300.329	7.10317.36897.39687.21837.1916	97.8101.2102.599.599.1	100.02	1.84

结果表明：齐墩果酸回收率达100.02％，RSD％为1.84％，方法准确性良好。

g.超声提取时间的考查

取已知含量的样品0.2g，精密称定，置25ml量瓶中，加甲醇20ml，超声处理10、20、30、40、50分钟，冷却，加甲醇至刻度，依法制备供试品溶液，测定吸收度。表10是超声提取时间的考察结果。

表10

提取时间(分钟)	10	20	30	40	50
						称样量(g)	0.2074	0.2061	0.2075	0.2005	0.2024
吸收度测出量(mg/g)样品含量(mg/粒)	0.27414.364.88	0.35018.356.24	0.35418.446.27	0.34518.626.33	0.34618.486.28

结果表明：样品用超声提取30分钟后，总三萜成分即可提取完全，故样品采用超声提取30分钟，制备供试品溶液。

检测结果显示，本发明以灵芝植物特征物质为基础的系统、组合的质量检测方法，能用于放、化疗康复治疗的双灵固本口服制剂的质量检测，本方法对双灵固本口服制剂生产及贮藏期产品质量的控制起到了监控的作用，为双灵固本口服制剂临床疗效的稳定奠定了较为有效的基础。

附图说明

图1是灵芝总三萜和齐墩果酸对照品最大吸收峰。

具体实施方式

实施例1：

采用系统、组合的检测方法对多剂型双灵固本口服制剂进行检测

1、显微鉴别

取经研细内容物1g，加水5ml，振摇，使灵芝浸膏粉溶解，静置，待灵芝孢子沉淀，取沉淀物置显微镜下观察：散在孢子卵形，顶端平截，双层壁，外壁透明平滑，内壁棕褐色或淡棕色，有明显的纹筛，孢子大小为(6-10μm)×(11-14μm)。

2、紫外灯鉴别

取显微鉴别项下的上层溶液，点于滤纸上，置紫外灯(254nm)下观察，呈蓝灰色荧光。

3、试剂显色反应鉴别

3.1α-萘酚显色反应

取经研细内容物0.5g，加水10ml，摇匀后静置5分钟，滤过，取滤液2ml，滴加新鲜配制的5％α-萘酚乙醇溶液10滴，摇匀，沿管壁缓缓滴加硫酸1ml，在两液界面显紫红色环。

3.2茚三酮显色反应

取鉴别3.1项下的溶液，滴于滤纸上，晾干，滴加茚三酮试液1-2滴，在105℃烘数分钟，显紫红色斑点。

4、薄层层析定性鉴别

取经研细内容物1.0g，加乙醇10ml，超声处理10分钟，滤过，滤液浓缩至1ml，作为供试品溶液。另取灵芝对照药材0.5g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5ul，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60-90℃)-醋酸乙酯(8∶2)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

5、灵芝多糖的含量测定

5.1对照品溶液的制备  精密称取105℃干燥至恒重的无水葡萄糖60mg，置100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀即得(每1ml含无水葡萄糖0.6mg)。

5.2标准曲线的制备  精密量取对照品溶液0.0ml、1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml、3.0ml分别置50ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，精密量取上述溶液各2ml，置具塞试管中，分别加4％苯酚溶液1ml，混匀，迅速加入硫酸7.0ml，摇匀，于40℃水浴中保温30分钟，取出，置冰浴中5分钟，取出，以第一份为空白，照分光光度法在489nm的波长处测定吸收度，以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。

5.3测定法  取本品10片，除包衣后研细，取约1.0g，精密称定，置研钵中，加热水少量研匀，移置100ml量瓶中，研钵用热水洗涤数次，洗涤液并入量瓶中，水浴加热15分钟，冷却至60℃以下。加1.0mL 10％α-淀粉酶溶液，密闭，于55-60℃保温1小时后，加热至沸。冷却后，加水稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液2ml于离心管中，置快速混匀器上，缓慢滴加乙醇8ml，离心，取沉淀加水溶解，置100ml量瓶中，并稀释至刻度，精密量取2ml，照标准曲线的制备项下的方法，自“加4％苯酚1ml”起，依法测定吸收度，从标准曲线上读出供试品溶液中灵芝多糖的重量(ug)，计算，即得。

6、灵芝总三萜的测定

6.1对照品溶液的制备  精密称取105℃干燥至恒重的齐墩果酸对照品5.0mg，置25ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀即得(每1ml含齐墩果酸0.20mg)。

6.2标准曲线的制备  精密量取对照品溶液0.0ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml分别置试管中，水浴挥干溶剂，加5％香草醛冰醋酸溶液0.4ml及高氯酸1.6ml，混匀，置70℃水浴加热15分钟，放冷，加乙酸乙酯8ml，混匀，照分光光度法在560nm的波长处测定吸收度，以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。

6.3测定法  取灵芝测定项下研细的粉末约0.2g，精密称定，置50ml量瓶中，加甲醇40ml，超声处理30分钟，冷却，加甲醇至刻度，混匀，过滤，精密量取续滤液1ml置试管中，自“水浴挥干溶剂”起依法测定吸收度，从标准曲线上读出供试品溶液中总三萜的重量(mg)，计算，即得。

本品每片含灵芝总三萜以齐墩果酸计，不得少于9.0mg。

本品每片含灵芝多糖以无水葡萄糖(C₆H₁₂O₆)计，不得少于32mg。

表11是本发明检测方法对各剂型双灵固本口服制剂检测结果。

表11

样品实例序号	样品剂型	显微鉴别	紫外灯鉴别	试剂显色反应鉴别		薄层层析定性鉴别	含量测定
									α-萘酚	茚三酮	多糖(mg/g)	总三萜(mg/g)
				1	散剂		符合规定	蓝灰色荧光					显紫红色环	显紫红色斑点	显相同颜色荧光斑点	79.6	18.59
2	散剂	符合规定	蓝灰色荧光			显紫红色环			显紫红色斑点	显相同颜色荧光斑点	79.2	18.65
				3	片剂		符合规定	蓝灰色荧光					显紫红色环	显紫红色斑点	显相同颜色荧光斑点	90.6	21.33
4	片剂	符合规定	蓝灰色荧光			显紫红色环			显紫红色斑点	显相同颜色荧光斑点	90.0	21.37
				5	胶囊剂		符合规定	蓝灰色荧光					显紫红色环	显紫红色斑点	显相同颜色荧光斑点	89.0	19.06
6	胶囊剂	符合规定	蓝灰色荧光			显紫红色环			显紫红色斑点	显相同颜色荧光斑点	89.2	19.00
				7	颗粒剂		符合规定	蓝灰色荧光					显紫红色环	显紫红色斑点	显相同颜色荧光斑点	80.6	21.76
8	颗粒剂	符合规定	蓝灰色荧光			显紫红色环			显紫红色斑点	显相同颜色荧光斑点	81.2	21.69
				9	软胶囊剂		符合规定	蓝灰色荧光					显紫红色环	显紫红色斑点	显相同颜色荧光斑点	94.4	21.28
10	软胶囊剂	符合规定	蓝灰色荧光			显紫红色环			显紫红色斑点	显相同颜色荧光斑点	94.4	21.11

Claims (9)

1、一种检测灵芝产品口服制剂质量的方法，其特征在于采用定性鉴别和含量测定的组合方法，系统检测灵芝内含特征物质灵芝多糖和灵芝总三萜，所述定性鉴别方法及其检测步骤依次为显微鉴别、紫外灯、试液反应鉴别和薄层层析鉴别；所述含量测定方法及其检测步骤依次为灵芝多糖含量测定和灵芝总三萜含量测定。

2、如权利要求1所述检测灵芝产品口服制剂质量的方法，其特征在于其中所述的显微鉴别方法包括下述步骤：取研细的待检样品内容物1g，加水5ml，振摇，使灵芝浸膏粉溶解，静置，待灵芝孢子沉淀，取沉淀物置显微镜下观察孢子形态。

3、如权利要求1所述检测灵芝产品口服制剂质量的方法，其特征在于其中所述的紫外灯鉴别包括下述步骤：取研细的待检样品内容物1g，加水5ml，振摇，使灵芝浸膏粉溶解，静置，待灵芝孢子沉淀后吸取上层溶液，点于滤纸上，置紫外灯(254nm)下观察荧光色。

4、如权利要求1所述检测灵芝产品口服制剂质量的方法，其特征在于其中所述的试液反应鉴别包括下述步骤：

(1)取待检样品0.5g，加水10ml，摇匀后静置5分钟，滤过，取滤液2ml，滴加新配制的5％α-萘酚乙醇溶液10滴，摇匀，沿管壁缓缓滴加硫酸1ml，在两液界面显紫红色环；

(2)取待检样品0.5g，加水10ml，摇匀后静置5分钟，滤过，取滤液滴于滤纸上，晾干，滴加茚三酮试液1-2滴，在105℃烘数分钟，显紫红色斑点。

5、权利要求1所述检测灵芝产品口服制剂质量的方法，其特征在于其中所述的薄层层析鉴别包括如下步骤，取取待检样品0.5g，加乙醇10ml，超声处理10分钟，滤过，滤液浓缩至1ml，作为供试品溶液，另取灵芝对照药材0.5g，同法制成对照药材溶液，照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5ul，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚，60-90℃，—醋酸乙酯，8∶2，为展开剂，展开，取出晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。

6、如权利要求1所述检测灵芝产品口服制剂质量的方法，其特征在于所述的灵芝多糖的含量测定方法通过如下步骤：

a.对照品溶液的制备    精密称取105℃干燥至恒重的无水葡萄糖60mg，置100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀即得，每1ml含无水葡萄糖0.6mg；

b.标准曲线的制备    精密量取对照品溶液0.0ml、1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml、3.0ml分别置50ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，精密量取上述溶液各2ml，置具塞试管中，分别加4％苯酚溶液1ml，混匀，迅速加入硫酸7.0ml，摇匀，于40℃水浴中保温30分钟，取出，置冰浴中5分钟，取出，以第一份为空白，照分光光度法，在489nm的波长处测定吸收度，以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线；

c.样品液制备    取经研细的内容物约1.5g，精密称定，置研钵中，加热水研匀，移置瓶中，研钵用热水洗涤，洗涤液并入量瓶中，水浴加热15分钟，冷却至60℃以下，加1.0mL 10％α-淀粉酶溶液，加0.5ml醋酸钠缓冲液，PH7.4，密闭，于55-60℃保温1小时，加热至沸，冷却后，加水稀释至刻度，摇匀，滤过，量取续滤液2ml于离心管中，置快速混匀器上，滴加乙醇8ml，离心，取沉淀加水溶解，置量瓶中，备用；

d.含量测定    量取样品液2ml，照b标准曲线的制备的方法，自“加4％苯酚1ml”起，依法测定吸收度，从标准曲线上读出供试品溶液中灵芝多糖的重量，计算，即得。

7、如权利要求1所述检测灵芝产品口服制剂质量的方法，其特征在于其中所述的灵芝总三萜的含量测定通过如下步骤：

a.对照品溶液的制备    精密称取105℃干燥至恒重的齐墩果酸对照品5.0mg，置25ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀即得，每1ml含齐墩果酸0.20mg；

b.标准曲线的制备    精密量取对照品溶液0.0ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml分别置试管中，于水浴挥干溶剂，加5％香草醛冰醋酸溶液0.4ml及高氯酸1.6ml，混匀，置70℃水浴加热15分钟，放冷，加乙酸乙酯8ml，混匀，在560nm的波长处测定吸收度，以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线；

c.样品液制备    取经研细的内容物约0.2g，精密称定，置25ml量瓶中，加甲醇20ml，超声处理30分钟，冷却，加甲醇至刻度，混匀，过滤，滤液备用；

d.含量测定    精密量取样品液1ml置试管中，于水浴挥干溶剂，加5％香草醛冰醋酸溶液0.4ml及高氯酸1.6ml，混匀，置70℃水浴加热15分钟，放冷，加乙酸乙酯8ml，混匀，在560nm的波长处测定吸收度，从标准曲线上读出供试品溶液中总三萜的重量(mg)，计算，即得。

8、权利要求1所述检测灵芝产品口服制剂质量的方法在检测灵芝产品双灵固本(商品名)口服制剂质量中的用途。

9、按权利要求9所述的用途，其中所述的双灵固本(商品名)口服制剂包括灵固本片剂、颗粒剂、散剂、胶囊剂和软胶囊剂。

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