CN1275038C - 药品、保健品和食品中枸橼酸西地那非掺杂的测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种药品、保健品和食品中枸橼酸西地那非掺杂的快速测定方法。该方法由以下步骤组成：(1)从固态的药品、保健品和食品中提取枸橼酸西地那非或将液态的药品、保健品和食品酸化；(2)氧化干扰物质；(3)加入检测剂。本发明为一分析成本低、专属性强、灵敏度高、抗共存物质干扰能力强、试验现象明显、检验结论正确率高、操作简便和不需要使用贵重分析仪器的快速检验方法，适用于现场检验药品、保健品和食品是否掺入了枸橼酸西地那非。根据本发明制成枸橼酸西地那非快速检验试剂盒，将能满足广大的农村地区和检验技术条件落后的中小城市开展药品、保健品和食品监督检验的需要。

Description

药品、保健品和食品中枸橼酸西地那非掺杂的测定方法

                         技术领域

本发明涉及一种枸橼酸西地那非成分的检测方法，具体是检测药品和保健品、食品，尤其是用于检测壮阳补肾、增强性功能类中药制剂和抗疲劳功能保健品、食品是否添加枸橼酸西地那非成分的方法。

                         背景技术

枸橼酸西地那非(英文名称为Sildenafil citrate)，商品名称为Viagra(译名：伟哥、威而钢)，通称“伟哥”，是美国辉瑞制药公司新开发的治疗男性勃起功能不良(erectile dysfunction，简称ED，俗称“阳痿”)的一种药物。枸橼酸西地那非，其化学名称为：1-{4-乙氧基-3-[5-(6，7-二氢-1-甲基-7-氧代-3-丙基-1H-吡唑并[4，3d]嘧啶)]苯磺酰}-4-甲基哌嗪枸橼酸盐。分子式：C₂₂H₃₀N₆O₄S·C₆H₈O₇。

枸橼酸西地那非片使用说明书描述：健康男性患者单剂口服西地那非100mg，导致卧位血压下降(平均最大幅度8.4/5.5mmHg)服药后1～2小时血压下降最明显，服药后8小时与安慰剂组无差别。同时服用硝酸酯类药物的患者降压作用更大。低血压(90/50mmHg)和硝酸酯类或提供硝酸根的药物是应用西地那非的严格禁忌症。西地那非对血压的最大作用发生在约给药后1小时，即与药物血浆峰值一致。因此，在西地那非的血浆药物峰值浓度时，性活动可能诱发心脏事件。

大多数阳痿患者，或由其他病引起，或因身体虚弱所致，阳痿是自我保护的一种反应。枸橼酸西地那非与硝酸甘油等药物有绝对的禁忌症，如果患冠心病、高血压、脑血栓和年纪偏大的人在缺乏医嘱的情况下擅自服用，很可能导致严重的药物不良反应，引起心肌梗塞甚至死亡。

枸橼酸西地那非，我国处方药名为万艾可，患者需要在医生的指导下方能服用，国家对其生产、经营及使用进行了严格的规定。

关于枸橼酸西地那非引起的药物不良反应已有不少报道。近年来，在补肾壮阳类中药制剂和保健食品中非法添加枸橼酸西地那非的情况甚为严重。为此国家药品监督管理局于二○○一年九月二十七日发出《关于开展在中药中擅自添加枸橼酸西地那非等其他物质违法行为专项打击活动的通知》(国药监市[2001]431号文)，该通知要求各省(区、市)药监局对检验中检出违法添加枸橼酸西地那非的企业，要按照《药品管理法》的规定依法严肃处理。对在经营企业中检查出违法添加枸橼酸西地那非需要核实生产企业的，该生产企业所在地的省(区、市)药监局有责任、有义务支持协助进行核实。该通知同时要求各省(区、市)药监局将抽查检验的结果和各地对违法添加枸橼酸西地那非企业依法查处的结果，于2002年1月30日前上报国家药品监督管理局。在此次专项打击活动，已查出了大量违法添加枸橼酸西地那非的药品。

查处在补肾壮阳类中药制剂和保健食品中擅自添加枸橼酸西地那非的违法行为，是一项长期的任务。它涉及范围广，需要进行大量的检验，在广大的农村地区和经济欠发达的中小城市开展这项检验活动有较大的难度。

非法添加枸橼酸西地那非的中药制剂和保健食品主要在广大的农村和经济欠发达的中小城市销售，主要原因是这些地区的技术监管能力薄弱，缺少必要的检验仪器。

检验中药制剂和保健食品中枸橼酸西地那非掺杂现有的方法主要有两种：

1、薄层色谱法

样品中的待测成分用混合溶剂[甲醇-水-氨水(75∶25∶1)]提取，所得的供试品溶液和对照品溶液点在同一块薄层色谱板上(薄层色谱板通常用硅胶制成)，用展开剂展开，晾干后，薄层色谱板在紫外灯下检示。不同的物质在薄层色谱板不同的位置上以斑点的形式出现(原因是不同的物质有不同迁移的速度，常以色谱迁移值表示展开后斑点到原点之间的距离)，根据待测样品是否在与对照品相应的位置上出现斑点这一实验所得的现象来判断待测样品是否含有目标成分。枸橼酸西地那非对照品溶液和样品提取所得的供试品溶液在同一块薄层色谱板上点样，展开剂展开，晾干后，薄层色谱板在紫外灯下检示，如果供试品溶液薄层色谱图在与枸橼酸西地那非对照品相应的位置上出现斑点，则提示样品中可能含有枸橼酸西地那非。

薄层色谱法的优点是不需要使用昂贵的分析仪器。该法缺点是：(1)色谱分辩率较低，中药制剂成分复杂，干扰因素多，易将某些共存成分误判为枸橼酸西地那非，某些共存成分如果量较大且色谱迁移值与枸橼酸西地那非接近则会干扰目标成分的检出。(2)色谱展开和晾干的时间长，不能满足快速测定的要求。(3)薄层色谱板需要自行铺制，烘干并干燥存放(预制的薄层色谱板需要干燥存放)，环境温度和湿度对分离效果的影响大。(4)要求实验人员有较好的经验。(5)需要有固定的实验场所，不适合作流动性大的现场检测。

2、高效液相色谱法

高效液相色谱法是常用的现代分析方法。在相同的色谱条件下，不同的物质有不同的色谱保留时间。在相同的色谱条件下枸橼酸西地那非对照品溶液和样品提取所得的供试品溶液分别进样，根据色谱保留时间可判断待测样品是否含有枸橼酸西地那非。

高效液相色谱法的优点是色谱分离效率高，灵敏度高。其缺点是：(1)仪器价格昂贵，样品前处理时间长，色谱柱易受污染，分析成本高；(2)当共存成分的色谱保留时间与枸橼酸西地那非的色谱保留时间接近时容易作出错误的判断；(3)仪器对使用环境要求高，需要固定摆放，不适合作流动性大的现场检测。

3、高效液相色谱液-质谱联用法

用质谱仪对物质进行定性分析，结果可靠性高。以高效液相色谱仪作为分离器、质谱仪作为分析器的高效液相色谱液-质谱联用法适合于成分复杂、背景干扰严重的样品分析，这种分析方法可提高检测结果的可靠性。

高效液相色谱液-质谱联用法是一种分析成本比高效液相色谱法更高、操作比高效液相色谱法更复杂的分析方法。仪器对使用环境要求更高，需要固定摆放，不适合作流动性大的现场检测。

在进行高效液相色谱液-质谱联用法分析前，一般用高效液相色谱法作为筛选方法，以达到降低分析成本的目的。这些检验只能在少数实验室中进行，不易推广使用。

                      发明内容

本发明的目的在于提供一种克服现有技术存在的缺点，分析成本低、不需要使用贵重分析仪器、专属性强、灵敏度高，适用于现场检验药品、保健品和食品是否掺入枸橼酸西地那非的快速检验方法。

本发明的另一目的在于提供上述方法在制备枸橼酸西地那非快速检验试剂盒的应用。

本发明的另一目的在于提供上述方法在检验药品、保健品和食品是否掺入枸橼酸西地那非的筛选检验中的应用。

本发明药品、保健品和食品中枸橼酸西地那非掺杂的快速测定方法，依次由以下步骤组成：

(1)从固态的药品、保健品和食品中提取枸橼酸西地那非或将液态的药品、保健品和食品酸化；

(2)氧化干扰物质；

(3)加入检测剂。

枸橼酸西地那非是由1-{4-乙氧基-3-[5-(6，7-二氢-1-甲基-7-氧代-3-丙基-1H-吡唑并[4，3d]嘧啶)]苯磺酰}-4-甲基哌嗪与枸橼酸结合形成的有机盐。1-{4-乙氧基-3-[5-(6，7-二氢-1-甲基-7-氧代-3-丙基-1H-吡唑并[4，3d]嘧啶)]苯磺酰}-4-甲基哌嗪有三个可接受质子的氮原子，在酸性溶液中，接受三个质子后生成带三个正电荷、呈游离态的阳离子(以R³⁺表示)。硫酸的存在可增强枸橼酸西地那非生成游离态阳离子(R³⁺)的能力，使溶液中游离态阳离子(R³⁺)有较高的浓度。

三硝基苯酚(俗称苦味酸)，由于受三个硝基的吸电子效应影响，其酚羟基容易进行酸式电离，生成游离态的阳离子H⁺和游离态的阴离子([(NO₂)₃C₆H₂O]^-)。三硝基苯酚有较强的酸性。

游离态的阳离子(R³⁺)正电荷密度高，能与游离态的附离子([(NO₂)₃C₆H₂O]^-)发生离子反应，生成在酸性不太强的水介质中不易溶解的有机盐(黄色不溶物产物)。离子反应式如下：

中药等天然成分多含还原基团，在酸性条件下被KMnO₄氧化，分解为无色的小分子，减少了与三硝基苯酚作用的机会，降低了背景颜色对现象观察的影响，达到了消除干扰的目的。

对于片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂或散剂等固态样品，采用稀硫酸溶液提取枸橼酸西地那非，然后经过滤或离心处理，滤液或离心后的上清液加入高锰酸钾水溶液使共存的干扰物质被氧化，溶液变为无色或几乎无色，再滴加三硝基苯酚的饱和水溶液，如果溶液出现黄色浑浊(有黄色不溶物析出；静置时间长，这些黄色不溶物会沉到试管底部，成为黄色沉淀物)，则表示样品含有枸橼酸西地那非，如果溶液没有出现黄色浑浊(没有黄色不溶物析出)则表示样品不含有枸橼酸西地那非。

对于口服液等液态样品，样品加入稀硫酸溶液酸化(如果溶液浑浊，则先经过滤或离心处理除去不溶物)，然后加入高锰酸钾水溶液，使共存的干扰物质被氧化，溶液变为无色或几乎无色，再滴加三硝基苯酚的饱和水溶液，如果溶液出现黄色浑浊(有黄色不溶物析出；静置时间长，这些黄色不溶物会沉到试管底部，成为黄色沉淀物)则表示样品含有枸橼酸西地那非，如果溶液没有出现黄色浑浊(没有黄色不溶物析出)则表示样品不含有枸橼酸西地那非。

具体的技术方案如下：

1、取固态的药品、保健品或食品，加入过量重量百分浓度为2％～3％的稀硫酸溶液，振摇使分散，静置片刻，过滤，收集滤液作为供试液；或取液态的药品、保健品或食品，加入过量重量百分浓度为2％～3％的稀硫酸溶液，使混合溶液呈酸性，作为供试液(溶液浑浊时过滤，收集滤液作为供试液)。

针对目前市场上的大多数药品、保健品或食品，一般的取样量为：片剂为0.5～1片，胶囊剂为0.5～1颗量内容物，丸剂、颗粒剂、散剂和其它固态制剂为0.6～0.8g；液态样品为2ml。对应的稀硫酸溶液加入体积为6～8ml。

2、往供试液中滴入摩尔浓度为0.02～0.04mol/L高锰酸钾溶液，滴入的同时振摇；滴至溶液出现的紫红色在15s内不褪色为止，稍停，待紫红色完全褪去，溶液变为无色或几乎无色。

供试液的颜色越深，消耗高锰酸钾溶液的量越多；取样量越大，消耗高锰酸钾溶液的量越多。

3、连续滴入三硝基苯酚的饱和水溶液，应注意三硝基苯酚的饱和水溶液滴入过程和滴完后都不能振摇试管。

如果3min之内溶液出现黄色浑浊(有黄色不溶物析出)，则可判断样品含有枸橼酸西地那非。

黄色不溶物析出的速度和析出量与溶液中枸橼酸西地那非的浓度有关。枸橼酸西地那非的浓度越大，析出量越多，析出速度越快。静置3min观察是为了使低含量的枸橼酸西地那非也能被检出。如果枸橼酸西地那非的含量较低，则静置3分钟后在试管中液体的上端即有黄色不溶物析出。

如果试管静置3min后仍未见到黄色不溶物析出，则可判断样品不含有枸橼酸西地那非。

试管中溶液呈黄色但未见到黄色不溶物析出，则不可误判样品含有枸橼酸西地那非，因为三硝基苯酚的饱和水溶液本身是黄色液体。

根据本发明可以制成枸橼酸西地那非快速检验试剂盒。

同现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

分析成本低、不需要专门设备、专属性强、灵敏度高，适用于现场检验药品、保健品和食品是否掺入枸橼酸西地那非的快速检验方法，克服了现有技术存在的缺点，满足药品、保健品和食品监督检验的需要，同时为检验药品、保健品和食品是否掺入枸橼酸西地那非的专门实验室的提供快速的筛选检验方法，以达到降低分析成本低，提高检验效率的目的。同时本发明还具有抗共存物质干扰能力强，试验现象明显，检验结论正确率高，操作简便快速，不需要使用贵重仪器等优点。

根据本发明制成枸橼酸西地那非快速检验试剂盒，将能满足广大的农村地区开展相关的食品监督检验的需要。

                   具体实施方式

  以下的实施例将有助于本领域的普通技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。

实施例1

力补金秋胶囊(胶囊剂，标示服用量为每次2颗，高效液相色谱法测定结果本品每颗含枸橼酸西地那非58mg)。

取0.5颗量内容物，置于10ml样品瓶中，加入重量百分浓度为2％的稀硫酸溶液8ml，旋紧瓶盖，用力振摇2min，静置4min，溶液呈深棕褐色，用注射器吸取上层液体4ml，接上滤头(0.45μm孔径，外径25mm)，压挤，前1～2ml滤液弃去，收集续滤液2ml，滴入浓度为0.02mol/L的高锰酸钾溶液，边滴边摇，至最后一滴滴入后，溶液出现的紫红色在15s内不褪色为止，稍停，待紫红色完全褪去，再滴入三硝基苯酚的饱和水溶液0.15ml(不要振摇试管)，溶液立即有黄色不溶物析出而浑浊，由此可判断样品中含有枸橼酸西地那非。

实施例2

藏鞭霸丸(大蜜丸，规格为每丸10g，标示服用量为每日1丸，高效液相色谱法测定结果本品每丸含枸橼酸西地那非176mg)。

样品剪碎成米粒大小，取样0.6g，置于10ml样品瓶中，加入重量百分浓度为3％的稀硫酸溶液8ml，旋紧瓶盖，用力振摇2min使溶散(必要时可用玻棒捣散)，静置4min，溶液呈深棕色，用注射器吸取上层液体4ml，接上滤头(0.45μm孔径，外径25mm)，压挤，前1～2ml滤液弃去，收集续滤液2ml，滴入浓度为0.03mol/L的高锰酸钾溶液，边滴边摇，至最后一滴高锰酸钾溶液滴入后，溶液出现的紫红色在15s内不褪色为止，稍停，待紫红色完全褪去，溶液几乎无色，再滴入三硝基苯酚的饱和水溶液0.2ml(不要振摇试管)，溶液立即有黄色不溶物析出而浑浊，由此可判断样品中含有枸橼酸西地那非。

以上操作，用离心处理代替过滤处理，效果相同，均可判断样品中含有枸橼酸西地那非。

实施例3

九鞭王(蓝色包衣片，片心白色；标示服用量为每次1片；高效液相色谱法测定结果本品每片含枸橼酸西地那非72mg)。

取样品0.5片，置于10ml样品瓶中，加入重量百分浓度为3％的稀硫酸溶液8ml，玻棒捣散，用力振摇2min，静置，过滤，收集续滤液2ml(滤液呈蓝色)，滴入浓度为0.04mol/L的高锰酸钾溶液0.04ml，溶液呈现紫红色，稍停，待紫红色完全褪去，再滴入三硝基苯酚的饱和水溶液0.2ml(不要振摇试管)，溶液立即有大量黄色不溶物析出而浑浊，由此可判断样品中含有枸橼酸西地那非。

实施例4

挺简单补肾强身片(片剂，红褐色包衣，标示服用量为每次5片，高效液相色谱方法检测证实不含枸橼酸西地那非)。

取样品1片，压碎后置于10ml样品瓶中，加入重量百分浓度为3％的稀硫酸溶液约8ml，用力振摇2min，静置，过滤，收集续滤液2ml(滤液呈浅棕色)，滴入浓度为0.03mol/L的高锰酸钾溶液0.04ml，溶液呈现紫红色，稍停，待紫红色完全褪去，溶液呈无色，再滴入三硝基苯酚的饱和水溶液0.2ml(不要振摇试管)，溶液没有黄色不溶物析出，静置3min仍然没有黄色不溶物析出，由此可判断样品中不含有枸橼酸西地那非。

实施例5

金牛丸(红色小蜜丸，每瓶6g，标示服用量为每次1瓶，高效液相色谱法测定结果本品每克含枸橼酸西地那非25mg)。

本品压碎，取样0.8g，置于10ml样品瓶中，加入重量百分浓度为3％的稀硫酸溶液约8ml，旋紧瓶盖，用力振摇2min，静置4min，过滤，收集续滤液2ml(滤液呈粉红色)，滴入浓度为0.04mol/L的高锰酸钾溶液，边滴边摇，至最后一滴高锰酸钾溶液滴入后，溶液出现的紫红色在15s内不褪色为止，稍停，待紫红色完全褪去，溶液呈无色，再滴入三硝基苯酚的饱和水溶液0.15ml(不要振摇试管)，溶液立即有黄色不溶物析出而浑浊(上端较中部明显，而底部几乎没有)，由此可判断样品中含有枸橼酸西地那非。

实施例6

南方板蓝根片(普通清热消炎中药，蓝绿色薄膜衣片，不含枸橼酸西地那非，作阴性对照试验用)

取本品1片，压碎后，置于10ml样品瓶中，加入重量百分浓度为3％的稀硫酸溶液约8ml，用力振摇2min，静置4min，过滤，收集续滤液2ml(滤液呈淡棕色)，滴入浓度为0.03mol/L的高锰酸钾溶液，至最后一滴高锰酸钾溶液滴入后，溶液出现的紫红色在15s内不褪色为止，稍停，待紫红色完全褪去，溶液呈无色，滴入三硝基苯酚的饱和水溶液0.15ml(不要振摇试管)，无固体析出，静置3min，溶液呈浅蓝色而微浑浊，但仍无黄色不溶物析出，由此可判断样品中不含有枸橼酸西地那非。

实施例7

君泰口服液(普通清热消炎中药，不含有枸橼酸西地那非，作阴性对照试验用)。

取本品2ml，加入重量百分浓度为3％的稀硫酸溶液6ml，混合后取出2ml置于试管中，溶液呈棕黄色，滴入浓度为0.03mol/L的高锰酸钾溶液，边滴边摇，至最后一滴高锰酸钾溶液滴入后，溶液出现的紫红色在15s内不褪色为止，稍停，待紫红色完全褪去，溶液呈无色，滴入三硝基苯酚的饱和水溶液0.15ml(不要振摇试管)，溶液为黄色澄清状，放置3min，仍无黄色不溶物析出，由此可判断样品中不含有枸橼酸西地那非。

实施例8

玉屏风颗粒冲剂(纯中药感冒药，不含枸橼酸西地那非，作为阴性对照试验)。

取本品0.8g，置于10ml样品瓶中，加入重量百分浓度为3％的稀硫酸溶液8ml，旋紧瓶盖，用力振摇2min，静置4min，过滤，收集续滤液2ml(滤液呈黄色)，加入浓度为0.03mol/L的高锰酸钾溶液，边滴边摇，至最后一滴高锰酸钾溶液滴入后，溶液出现的紫红色在15s内不褪色为止，稍停，待紫红色完全褪去，溶液呈无色，再滴入三硝基苯酚的饱和水溶液0.2ml(不要振摇试管)，溶液呈黄色，但未见黄色不溶物析，静置3min仍未见浑浊，由此可判断样品中不含有枸橼酸西地那非。

Claims (1)

1、一种药品、保健品和食品中枸橼酸西地那非掺杂的测定方法，依次由以下步骤组成：

(1)取固态的药品、保健品或食品，加入过量重量百分比浓度为2％～3％的稀硫酸溶液，振荡使分散，静置片刻，过滤，收集滤液作为供试液；或取液态的药品、保健品和食品药品、保健品或食品，加入过量重量百分比浓度为2％～3％的稀硫酸溶液，使混合溶液呈酸性，作为供试液，并且当溶液出现浑浊时过滤，收集滤液作为供试液；

(2)往供试液中滴入0.02～0.04mol/L的高锰酸钾水溶液，滴入的同时振荡，滴至溶液出现的紫红色在15秒内不褪色为止；

(3)连续滴入三硝基苯酚的饱和水溶液，并且在三硝基苯酚的饱和水溶液滴入过程中和滴完后都不能振荡试管，如果溶液出现黄色浑浊，则可判断样品含有枸橼酸西地那非。