CN103645151A - 一种快速测定大观霉素发酵液或成品中大观霉素含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种快速测定大观霉素发酵液或成品中大观霉素含量的方法，该含量测定方法是以紫外可见分光光度法进行测量，检测波长为255nm，并以磷钨酸为显色体系。本发明的方法工艺简单，测量误差较小，准确度较好，精密度较高，检测时间较短，不仅适用于大观霉素发酵液，同样适用于大观霉素成品的检测，可广泛应用于大观霉素含量的测定。

Description

一种快速测定大观霉素发酵液或成品中大观霉素含量的方法

技术领域

本发明涉及一种大观霉素的检测方法，特别是涉及一种快速测定大观霉素发酵液或成品中大观霉素含量的方法。

背景技术

大观霉素又名壮观霉素，是由壮观链霉菌产生的广谱抗生素，对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌有广谱活性，对肺炎杆菌、流感杆菌、支原体均有较好的抑制作用，主要作用于淋球菌，是治疗淋病的特效药。其盐酸盐为白色或类白色结晶粉末。易溶于水，不溶于乙醇、丙酮等有机溶剂。在酸性条件下稳定，中性、碱性条件下不稳定。

大观霉素极性较强，紫外最大吸收波长在190nm附近，属于末端吸收区，加之结构较不稳定，容易降解，故大观霉素的含量分析较为困难。目前盐酸大观霉素的检测方法有以下几种：管碟法（生物效价法）、萃取光度法、高效毛细管电泳法、高效液相法、高效液相色谱一蒸发光散射检测法，气相色谱法等。管碟法操作程序复杂繁琐、测定周期长、工作量大、需要熟练精确操作，无法实现实时控制生产过程；萃取光度法过程较为复杂，操作较为繁琐，生产中不易实现；高效毛细管电泳法设备成本较高；高效液相法需进行衍生化处理，衍生化反应操作复杂、耗时，且准确度受衍生物稳定性的影响大；高效液相色谱一蒸发光散射检测法操作简单，准确性、重现性好，但是该方法中需使用三氟醋酸水溶液作为流动相，会由于酸性过强，极大损伤并缩短色谱柱的使用寿命，成本较高，不适用于生产；气相色谱法是目前国际上通行的盐酸大观霉素含量检测方法，目前英国药典和美国药典盐酸大观霉素的测定均采用六甲基硅烷衍生化后用氢火焰离子检测器(FID)检测，但是该方法也需要进行衍生化处理，且不能检测大观霉素发酵液。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的缺陷，提供一种快速测定大观霉素发酵液或成品中大观霉素含量的方法，该方法工艺简单，测量误差较小，准确度较好，精密度较高。

本发明根据大观霉素的结构特性，通过试剂与检测条件筛选，所采用的技术方案如下：

一种快速测定大观霉素发酵液或成品中大观霉素含量的方法，其特征在于采用紫外可见分光光度法，检测波长为255nm，并以磷钨酸为显色体系。

所述采用紫外可见分光光度法测定的具体步骤为：

标准工作曲线的绘制：配置不同浓度的含有磷钨酸的盐酸大观霉素标准溶液，静置半小时后过滤，以蒸馏水为参比溶液，测定上述不同浓度标准溶液在255nm下的吸光度，然后以吸光度为纵坐标，对应标准溶液的浓度为横坐标，绘制标准曲线；

测定方法：取待测大观霉素发酵液或成品，加入磷钨酸溶液，静置半小时，稀释定容过滤后作为测试液；以同样处理的不加磷钨酸溶液的待测大观霉素成品为参比溶液，测定测试液在255nm下的吸光度；根据标准曲线，计算大观霉素的浓度。

本发明采用紫外分光光度法测定大观霉素发酵液或成品中大观霉素的浓度，与现有技术相比，具有以下技术优势：

（1）本发明的方法操作简单，检测方便，检测时间短，仅需要十几分钟。

（2）本发明的方法不仅能检测大观霉素发酵液，也能检测大观霉素纯品，其测定结果与高效液相色谱法测定的结果一致，可广泛应用于大观霉素含量的测定。

（3）本发明的方法不用进行衍生化处理即可实现，避免了衍生操作过程中的误差，准确度高。

（4）本发明的方法专一性较强，成本较低，易于实现生产在线检测。

附图说明

图1是用本发明方法所做的大观霉素标准曲线。

具体实施方式

下面用实例予以说明本发明，应该理解的是，实例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。本发明的范围与核心内容依据权利要求书加以确定。

实施例1：检测条件的选择和方法验证

1 试验仪器与材料

试验仪器：海能i8紫外可见分光光度计（济南海能仪器股份有限公司）

材料：盐酸大观霉素标准品：由中国兽药监察所提供，效价为638μ/mg；

大观霉素发酵滤液；

磷钨酸（天津凯通化学试剂有限公司）；

蒸馏水。

2 溶液的配制

磷钨酸标准溶液（0.01g/L）：精确称取1.0g磷钨酸，溶解定容至100ml。

盐酸大观霉素标准液（1000μ/ml）：准确称取0.1567g盐酸大观霉素标准品，溶解定容至100ml，置于冰箱保存。

大观霉素发酵液：来自不同菌株，不同发酵时间。

3 最大吸收波长测定

分别取磷钨酸水溶液与发酵滤液各1.5ml稀释定容至100ml，以蒸馏水为空白，在紫外分光光度计上测定其最大吸收波长。结果表明磷钨酸在210nm和255nm处各有一吸收峰，由于在210nm处发酵液也有吸收，会干扰测定，故选择255nm作为该方法的检测波长。

4 反应时间确定

取1ml大观霉素标准溶液与1.5ml磷钨酸溶液混合后，稀释定容至100ml，静置不同时间后检测滤液的吸光度。结果表明，反应前几分钟内，滤液的吸光度值不稳定，在十五分钟后趋于稳定，在半小时后保持不变。因此确定大观霉素与磷钨酸的反应时间为半小时。

5 专属性试验

分别取2份1.5ml发酵滤液，一份加1.5ml磷钨酸水溶液，一份不加磷钨酸水溶液，各稀释定容至100ml。以蒸馏水为空白，在紫外分光光度计上测定其最大吸收波长。结果表明：大观霉素发酵液在255nm处未见吸收，即大观霉素发酵液本品对测定并无影响，即本方法具有专属性。

6 线性与范围

梯度量取0.1～2.0ml之间的浓度为1000μ/ml的大观霉素标准溶液，分别置于100ml的容量瓶中，然后分别加入1.5ml的磷钨酸溶液，用蒸馏水稀释至刻度，静置半小时过滤配制成不同浓度的标准溶液，以蒸馏水为参比溶液，测定上述不同浓度标准溶液在255nm下的吸光度值A。由吸光度值可知，当大观霉素的浓度在10μ/ml～20μ/ml时，大观霉素的浓度与吸光度具有较好的线性关系，故绘制标准曲线，线性方程为y=-0.0947x+2.4781，其中x为大观霉素的浓度μ/ml，相关系数r=0.9993。

7 重复性试验

取发酵滤液1.5ml，置于100ml的容量瓶中，然后加入1.5ml的磷钨酸溶液，用蒸馏水稀释至刻度，静置半小时过滤，以发酵滤液为参比溶液，测定待测滤液的吸光度值A，连续测定6次。平均效价为1628.6，RSD为0.01%，说明本方法的精密度较好。

8 稳定性试验

取发酵滤液1.5ml，置于100ml的容量瓶中，然后加入1.5ml的磷钨酸溶液，用蒸馏水稀释至刻度，静置半小时过滤，以发酵滤液为参比溶液，测定待测滤液的吸光度值A，分别在0、1、2、4、6、8小时测样，进行稳定性实验，测定结果表明，在8小时内大观霉素的效价无明显变化，稳定性良好。

时间	0h	2h	4h	6h	8h
						效价μ/ml	2356	2360	2359	2361	2358

9 重现性试验

精密称取6份同一批次同一发酵时间的发酵滤液1.5ml，分别置于100ml的容量瓶中，然后分别加入1.5ml的磷钨酸溶液，用蒸馏水稀释至刻度，静置半小时过滤，以发酵滤液为参比溶液，测定待测滤液的吸光度值A。结果显示平行进行6次检测，RSD为0.78%，说明本方法的重现性好，方法稳定。

10 回收率实验

精密量取发酵滤液1.5ml，精密加入对照品1.0mg，按照测定方法检测，平均回收率为100.3%，RSD为1.43%，说明本方法准确度高。

11 结论

由以上的验证数据可以看出，本检测方法的线性关系良好，精密度、稳定性、准确度均达到了要求，重现性良好，可以作为快速检测大观霉素发酵液的一种方法。

实施例2：用于大观霉素成品检测

精密称取盐酸大观霉素标准品20mg，置于1000ml的容量瓶中，然后分别加入1.5ml的磷钨酸溶液，用蒸馏水稀释至刻度，静置半小时过滤，作为待测溶液，以大观霉素标准溶液，不加磷钨酸为参比溶液，测定其滤液的吸光度值A。由标准曲线计算可得大观霉素成品效价为710μ/mg。

实施例3：高效液相色谱法对比实施例

色谱条件：流动相由25%的蒸馏水，40%的乙睛，35%的四氢呋喃组成，流速为1.0ml/min，进样量为20μl，柱温为30℃，自动进样间隔为10min，检测波长为415nm。

样品处理：取实施例2中配置好的样品溶液0.5mL，同时快速加入2ml三氟乙酸-乙睛溶液（以乙睛为溶剂，三氟乙酸为溶质，浓度6%）和2mL2,4-二硝基苯肼-乙睛溶液（以乙睛为溶剂，2,4-二硝基苯肼为溶质，浓度0.5%），混匀后放入70℃恒温水浴锅中1h进行衍生化反应。然后取出置于冰上冷却，马上向反应体系中加入0.5mL丙酮用以终止反应。自反应体系中精密吸取1.0mL加入1.5mL离心管中，14000r/min，离心10min，取上清液备用。

由外标法计算大观霉素效价为708μ/ml，可见本发明的方法与高效液相法检测结果基本一致。

Claims (2)

1.一种快速测定大观霉素发酵液或成品中大观霉素含量的方法，其特征在于采用紫外可见分光光度法，检测波长为255nm，并以磷钨酸为显色体系。

2.按照权利要求1所述的快速测定大观霉素发酵液或成品中大观霉素含量的方法，其特征在于所述采用紫外可见分光光度法测定的具体步骤为：

标准工作曲线的绘制：配置不同浓度的含有磷钨酸的盐酸大观霉素标准溶液，静置半小时后过滤，以蒸馏水为参比溶液，测定上述不同浓度标准溶液在255nm下的吸光度，然后以吸光度为纵坐标，对应标准溶液的浓度为横坐标，绘制标准曲线；

测定方法：取待测大观霉素发酵液或成品，加入磷钨酸溶液，静置半小时，稀释定容过滤后作为测试液；以同样处理的不加磷钨酸溶液的待测大观霉素成品为参比溶液，测定测试液在255nm下的吸光度；根据标准曲线，计算大观霉素的浓度。

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