CN107384873A - 重组腺病毒的纯化方法 - Google Patents

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    • C12N2710/10051—Methods of production or purification of viral material

Abstract

本发明提供了一种重组腺病毒的纯化方法，获得转染腺病毒基因的细胞，0℃～15℃超声处理，静置，离心过滤收集滤液，获得病毒液，经柱层析纯化。0℃～15℃低温状态下可以最大限度的保持病毒活性，超声处理提高细胞溶解效率减少溶解时间提高生产效率。试验结果表明，本发明提供的重组腺病毒的纯化方法获得的病毒纯度均达到99％。用时12h，成本大约1万。本发明提供的纯化方法需要的设备成本相应较低，耗时更短，更利于放大和工业化。

Description

重组腺病毒的纯化方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及重组腺病毒的纯化方法。
背景技术
CAR-T，全称是Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy，嵌合抗原受体T细胞免疫疗法。这是一个出现了很多年，但是近几年才被改良使用到临床上的新型细胞疗法。和其它免疫疗法类似，它的基本原理就是利用病人自身的免疫细胞来清除癌细胞。
临床上发现肿瘤时，一般已是中晚期，此时病人体内肿瘤细胞占优势，严重损害了机体的免疫功能，在这样的免疫系统微环境下，DC细胞功能受损，激活T细胞效率较低，攻击癌细胞能力不够，也不够精准；另外，肿瘤细胞通过低表达或不表达MHC分子的逃逸机制，逃脱免疫细胞的攻击。这就需要制造精密制导、精准打击的免疫细胞武器，克服MHC介导的杀瘤机制。于是，靶向性抗肿瘤细胞CAR-T技术应运而生。
2011年8月10日，美国《生物转化医学》和《新英格兰医学期刊》权威杂志报道，宾夕法尼亚大学基因治疗专家卡尔·朱恩利用患者改造后的自身T细胞治愈了两位晚期慢性淋巴细胞白血病(血癌)患者，开创了肿瘤生物治疗的新纪元。
嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)是将能识别某种肿瘤抗原的抗体的抗原结合部与CD3-ζ链或FcεRIγ的胞内部分在体外偶联为一个嵌合蛋白，通过基因转导的方法转染患者的T细胞，使其表达嵌合抗原受体(CAR)。患者的T细胞被“重编码”后，生成大量肿瘤特异性的CAR-T细胞。
CAR-T技术优势——1、治疗更精准：由于CAR-T细胞是应用基因修饰病人自体的T细胞，利用抗原抗体结合的机制，能克服肿瘤细胞通过下调MHC分子表达以及降低抗原递呈等免疫逃逸，让肿瘤细胞无所逃遁。2、多靶向更精准：CAR既可以利用肿瘤蛋白质抗原，又可利用糖脂类非蛋白质抗原，扩大了肿瘤抗原靶点范围，CAR-T细胞作用过程不受MHC的限制。3、杀瘤范围更广：鉴于很多肿瘤细胞表达相同的肿瘤抗原，针对某一种肿瘤抗原的CAR基因构建一旦完成，便可以被广泛利用。4、杀瘤效果更持久：新一代CAR结构中加入了促进T细胞增殖与活化的基因序列，能保证T细胞进入体内后还可以增殖，CAR-T细胞具有免疫记忆功能，可以长期在体内存活。
CAR-T的治疗主要包括5个步骤：第一，人工合成CAR；第二，从肿瘤患者体内分离获得淋巴T细胞；第三，利用基因工程的方法把设计好的CAR转入T细胞中，并且同时激活T细胞杀死肿瘤细胞的嵌合抗体，T细胞立马华丽变身为高大上的CAR-T细胞；第四，体外筛选，并大量扩增CAR-T细胞，一般一个病人需要几十亿，乃至上百亿个CAR-T细胞(体型越大，需要细胞越多)；第五，检测合格后输注到患者体内。在输入到患者体内后，需要严密监护病人，尤其是控制前几天身体的剧烈反应。
在CAR-T治疗中，重组腺病毒是将CAR转入到T细胞中的首选载体。但是，这种载体的规模化发展的生产和安全性依然是个挑战。另外，对于这种载体，任何环节都必须有充分的证据来确定其的免疫性和毒性。可供选择的在柱层析的基础上再用经典的CsCl梯度离心纯化的方法已经形成了，但是第一代的纯化过程在潜在的应用方面存在一定的缺陷，获得的腺病毒载体纯度较低，耗时较长且生产成本较高，不利于生产放大。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种重组腺病毒的纯化方法。本发明提供的纯化方法需要的设备成本相应较低，耗时更短，更利于放大和工业化。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
一种重组腺病毒的纯化方法，其特征在于，获得转染腺病毒基因的细胞，0℃～15℃超声处理，静置，离心过滤收集滤液，获得病毒液，经柱层析纯化。
在本发明的一些具体实施方案中，所述静置的温度为0℃～15℃，所述静置的时间为3～6h。
在本发明的一些具体实施方案中，所述超声的频率为20～25KHz，所述超声的时间为30min～60min。
在本发明的一些具体实施方案中，所述离心的温度为0℃～15℃，所述离心的转速为3000rpm～6000rpm，所述离心的时间为15～30min。
在本发明的一些具体实施方案中，所述柱层析包括依次经二乙氨乙基纤维素填料柱、羧甲基纤维素填料柱和SephadexG-25填料柱纯化。
在本发明的一些具体实施方案中，所述二乙氨乙基纤维素填料柱的参数为GE公司DEAE Sepharose FF填料，离子交换基团为O-CH2CH2-N+(C2H5)2H、粒径为45～165μm，自装柱为BXK生产性自装柱；纯化的条件为用缓冲液为10mM Tris+1mMCaCl pH7.8上样用10mMTris+1mMCaCl+1M NaCl pH8.0为洗脱液20倍柱体积梯度洗脱收集洗脱样品液。
在本发明的一些具体实施方案中，所述羧甲基纤维素填料柱的参数为GE公司CMSepharose FF填料，离子交换基团为-CH2COOH、粒径为45～165μm，自装柱为BXK生产性自装柱；纯化的条件为缓冲液10mM Tris+1mMCaClpH7.8平衡后上样收集穿透样品液。
在本发明的一些具体实施方案中，所述SephadexG-25填料柱的参数为为GE公司SephadexG-25填料，自装柱为BXK生产性自装柱；纯化的条件为缓冲液10mM Tris+1mMCaClpH8.0平衡后上样，收集电导率低于10μS/cm段洗脱样品液。
在本发明的一些具体实施方案中，所述柱层析通过AKTAPurifter系统实现。
本发明提供了一种重组腺病毒的纯化方法，获得转染腺病毒基因的细胞，0℃～15℃超声处理，静置，离心过滤收集滤液，获得病毒液，经柱层析纯化。0℃～15℃低温状态下可以最大限度的保持病毒活性，超声处理提高细胞溶解效率减少溶解时间提高生产效率。因为腺病毒具有酸性PI，通过DEAE弱阴离子柱吸附病毒进行纯化去除大部分杂质。CM柱可以吸附一些DEAE柱未能去除细胞蛋白，而流穿病毒颗粒，从而达到纯化病毒的目的。利用SephadexG-25柱对病毒液c脱盐及去除小分子量杂质如残留DNA、RNA等收集高纯度重组腺病毒。通过AKTAPurifter纯化系统可以实时调控整个纯化过程，将整个纯化流程数据化、系统化、流程化，整个工艺均可成比例放大规模化。且每一步纯化过程的纯化柱均可再生重复利用节约成本。
试验结果表明，本发明提供的重组腺病毒的纯化方法获得的病毒纯度均达到99％。用时12h，成本大约1万。本发明提供的纯化方法放大成本不会成比例增加。
综合上述试验结论，本发明提供的纯化方法需要的设备成本相应较低，耗时更短，更利于放大和工业化。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示对比例中传统方法纯化重组腺病毒的HPLC图谱；
图2示实施例1纯化重组腺病毒的HPLC图谱；
图3示实施例2纯化重组腺病毒的HPLC图谱；
图4示实施例3纯化重组腺病毒的HPLC图谱。
具体实施方式
本发明公开了一种重组腺病毒的纯化方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的重组腺病毒的纯化方法，关键技术包括：
1、0℃～15℃低温下超声处理转染腺病毒E1A基因的人肾上皮细胞系293细胞，然后待细胞自然溶解释放病毒颗粒。
2、运用AKTAPurifter纯化系统和二乙氨乙基纤维素填料柱进行纯化病毒液。
3、运用AKTAPurifter纯化系统和羧甲基纤维素填料柱进行纯化病毒液。
4、运用AKTAPurifter纯化系统和SephadexG-25填料柱纯化病毒液。
5、本方法可用于CAR-T重组腺病毒及其他重组腺病毒的纯化。
(1)0℃～15℃低温状态、20～25KHz下超声处理细胞30～60min，0℃-15℃低温状态下放置让细胞自然溶解释放病毒颗粒时间大约3-6h，0℃-15℃低温状态下3000-6000rpm低速离心15～30min去除大量细胞破片留，上清通过囊式滤器过滤后备用病毒液a；传统方法里大多用反复冻融法处理细胞花费时间较长一般需要24h以上且造成病毒收率低下，低温状态下可以最大限度的保持病毒活性，超声处理提高细胞溶解效率减少溶解时间提高生产效率。
(2)运用AKTAPurifter纯化系统，在AKTA层析系统上二乙氨乙基纤维素填料柱(DEAE弱阴离子柱)纯化，因为腺病毒具有酸性PI，通过DEAE弱阴离子柱吸附病毒进行纯化去除大部分杂质。将前一步处理的澄清病毒液a通过DEAE树脂进行层析纯化，去除的杂质。然后加洗脱液，收集纯化的病毒液b。
所述二乙氨乙基纤维素填料柱的参数为GE公司DEAE Sepharose FF填料，离子交换基团为O-CH2CH2-N+(C2H5)2H、粒径为45～165μm，自装柱为BXK生产性自装柱；纯化的条件为用缓冲液为10mM Tris+1mMCaCl pH7.8上样用10mM Tris+1mMCaCl+1M NaCl pH8.0为洗脱液20倍柱体积梯度洗脱收集洗脱样品液。
(3)在AKTA层析系统上甲基纤维素填料柱(CM弱阳离子柱)纯化，将第2步DEAE离子交换层析收集的病毒液b通过CM柱层析再次进行精纯化收集病毒液c。因为腺病毒具有酸性PI，这一步利用是CM柱可以吸附一些DEAE柱未能去除细胞蛋白，而流穿病毒颗粒，从而达到纯化病毒的目的。
所述羧甲基纤维素填料柱的参数为GE公司CM Sepharose FF填料，离子交换基团为-CH2COOH、粒径为45～165μm，自装柱为BXK生产性自装柱；纯化的条件为缓冲液10mMTris+1mMCaCl pH7.8平衡后上样收集穿透样品液。
(4)在AKTA层析系统上，利用SephadexG-25柱对病毒液c脱盐及去除小分子量杂质如残留DNA、RNA等收集高纯度重组腺病毒。SephadexG-25柱脱盐效率等效于传统的透析或超滤的方法，但是操作简便节约时间。
所述SephadexG-25填料柱的参数为为GE公司SephadexG-25填料，自装柱为BXK生产性自装柱；纯化的条件为缓冲液10mM Tris+1mMCaCl pH8.0平衡后上样，收集电导率低于10μS/cm段洗脱样品液。
在(2)到(4)步均利用到AKTA Purifter纯化系统，通过AKTAPurifter纯化系统可以实时调控整个纯化过程，将整个纯化流程数据化、系统化、流程化，整个工艺均可成比例放大规模化。且每一步纯化过程的纯化柱均可再生重复利用节约成本。
(5)通过SDS-PAGE(7.5％的SDS-PAGE凝胶，150V电压下电泳40分钟)、HPLC(Agilent 1260高效液相色谱仪TSK-GEL G4000SW 600×7.5色谱柱200mM PB 50min 100％梯度下色谱分析)、CE(Beckman PA800PLUS毛细管电泳仪,CE大分子蛋白电泳试剂盒标准方法)等方法检测病毒的纯度。
本发明提供的重组腺病毒的纯化方法中所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
转染腺病毒E1A基因的人肾上皮细胞系293细胞，获得成熟细胞培养液5.2L，在4℃、20KHz的条件下超声处理30min，8℃条件下让细胞自然溶解4h。4℃3000转每分钟离心15min，收取上清液。上清液通过囊式滤器过滤。将前两步处理的澄清病毒液通过AKTA系统DEAE柱和CM柱进行层析纯化，去除杂质，收集纯化的病毒液。再用G25柱对洗脱液进行脱盐处理，就可得到高纯度的腺病毒溶液，病毒纯度达到99％。
实施例2
转染腺病毒E1A基因的人肾上皮细胞系293细胞，获得成熟细胞培养液13.5L，在4℃、25KHz的条件下超声处理60min，0℃条件下让细胞自然溶解6h。8℃4000转每分钟离心15min，收取上清液。上清液通过囊式滤器过滤。将前两步处理的澄清病毒液通过AKTA系统DEAE柱和CM柱进行层析纯化，去除杂质，收集纯化的病毒液。再用G25柱对洗脱液进行脱盐处理，就可得到高纯度的腺病毒溶液，病毒纯度达到99％。
实施例3
收取成熟细胞培养液24.1L,在8℃超声处理40min，4℃条件下让细胞自然溶解5h。4℃、22KHz的条件下6000转每分钟离心15min，收取上清液。上清液通过囊式滤器过滤。将前两步处理的澄清病毒液通过AKTA系统DEAE柱和CM柱进行层析纯化，去除杂质，收集纯化的病毒液。再用G25柱对洗脱液进行脱盐处理，就可得到高纯度的腺病毒溶液，病毒纯度达到99％。
实施例4
转染腺病毒E1A基因的人肾上皮细胞系293细胞，获得成熟细胞培养液5.2L，在0℃、23KHz的条件下超声处理50min，15℃条件下让细胞自然溶解3h。0℃5000rpm离心30min，收取上清液。上清液通过囊式滤器过滤。将前两步处理的澄清病毒液通过AKTA系统DEAE柱和CM柱进行层析纯化，去除杂质，收集纯化的病毒液。再用G25柱对洗脱液进行脱盐处理，就可得到高纯度的腺病毒溶液，病毒纯度达到99％。
实施例5
转染腺病毒E1A基因的人肾上皮细胞系293细胞，获得成熟细胞培养液5.2L，在15℃、24KHz的条件下超声处理55min，0℃条件下让细胞自然溶解3h。15℃3000rpm离心15min，收取上清液。上清液通过囊式滤器过滤。将前两步处理的澄清病毒液通过AKTA系统DEAE柱和CM柱进行层析纯化，去除杂质，收集纯化的病毒液。再用G25柱对洗脱液进行脱盐处理，就可得到高纯度的腺病毒溶液，病毒纯度达到99％。
对比例运用CsCl传统超高速离心方法纯化
收取成熟细胞培养液11L，室温条件下(20～30℃)让细胞自然溶解24h。4℃6000转每分钟离心10min。加入CsCl溶液，4℃，36000转每分钟离心2h，离心后用移液枪穿刺取病毒带。对取出的病毒带加入CsCl溶液，4℃72300转每分钟离心3h，离心后用移液枪穿刺取病毒带。对取出的病毒液用透析袋脱盐，隔1小时换液一次，反复3次。收取最后一次脱盐液就是高纯度的病毒液，病毒纯度达到96％。
实施例7
对照组：对比例；
实验组：实施例1～实施例5。
对比结果见表1。
表1
注：*示与对照组相比具有显著差异(P＜0.05)；#示与对照组相比具有极显著差异(P＜0.01)。
综合上述试验结果，本发明提供的重组腺病毒的纯化方法需要的设备成本相应较低，耗时更短，具有极显著差异(P＜0.01)，更利于放大和工业化。获得的重组腺病毒的纯度和活性与对照组相比具有显著差异(P＜0.05)，在节约成本、节省能耗的基础上获得了纯度更好的重组腺病毒。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种重组腺病毒的纯化方法，其特征在于，获得转染腺病毒基因的细胞，0℃～15℃超声处理，静置，离心过滤收集滤液，获得病毒液，经柱层析纯化。
2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述静置的温度为0℃～15℃，所述静置的时间为3～6h。
3.根据权利要求1或2所述的纯化方法，其特征在于，所述超声的频率为20～25KHz，所述超声的时间为30min～60min。
4.根据权利要求1至3任一项所述的纯化方法，其特征在于，所述离心的温度为0℃～15℃，所述离心的转速为3000rpm～6000rpm，所述离心的时间为15～30min。
5.根据权利要求1至4任一项所述的纯化方法，其特征在于，所述柱层析包括依次经二乙氨乙基纤维素填料柱、羧甲基纤维素填料柱和SephadexG-25填料柱纯化。
6.根据权利要求5所述的纯化方法，其特征在于，所述二乙氨乙基纤维素填料柱的填料为DEAE Sepharose FF，离子交换基团为O-CH2CH2-N+(C2H5)2H、粒径为45～165μm；纯化的条件为用缓冲液为10mM Tris+1mMCaCl pH7.8上样用10mM Tris+1mMCaCl2+1M NaCl pH8.0为洗脱液20倍柱体积梯度洗脱收集洗脱样品液。
7.根据权利要求5所述的纯化方法，其特征在于，所述羧甲基纤维素填料柱的填料为CMSepharose FF，离子交换基团为-CH2COOH、粒径为45～165μm；纯化的条件为缓冲液10mMTris+1mMCaCl2 pH7.8平衡后上样收集穿透样品液。
8.根据权利要求5所述的纯化方法，其特征在于，所述SephadexG-25填料柱的填料为为SephadexG-25；纯化的条件为缓冲液10mM Tris+1mMCaCl2 pH8.0平衡后上样，收集电导率低于10μS/cm段洗脱样品液。
9.根据权利要求1至8任一项所述的纯化方法，其特征在于，所述柱层析通过AKTAPurifter系统实现。
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