JP2023517361A - 機能性エクソソーム調製のためのクロスフロー濾過装置の新たな用途 - Google Patents
機能性エクソソーム調製のためのクロスフロー濾過装置の新たな用途 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2023517361A JP2023517361A JP2022555153A JP2022555153A JP2023517361A JP 2023517361 A JP2023517361 A JP 2023517361A JP 2022555153 A JP2022555153 A JP 2022555153A JP 2022555153 A JP2022555153 A JP 2022555153A JP 2023517361 A JP2023517361 A JP 2023517361A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- exosomes
- functional
- tff
- concentration
- preparing
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 210000001808 exosome Anatomy 0.000 title claims abstract description 225
- 238000009295 crossflow filtration Methods 0.000 title claims abstract description 104
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 17
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 97
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 51
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 38
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 28
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 27
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 24
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 23
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 20
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 18
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 17
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 15
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 15
- 239000002994 raw material Substances 0.000 claims description 11
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims description 8
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 7
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 6
- 229920000249 biocompatible polymer Polymers 0.000 claims description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 3
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 40
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 35
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 23
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 18
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 13
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 12
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 12
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 10
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 8
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 8
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 7
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 7
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 7
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 7
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Chemical compound CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 description 6
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 5
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 5
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 5
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 5
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 5
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 4
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 4
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 4
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- -1 Carboxymethylchitin Proteins 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 3
- 229960004679 doxorubicin Drugs 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 3
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 3
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 3
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 2
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 2
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 2
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 229920000663 Hydroxyethyl cellulose Polymers 0.000 description 2
- 239000004354 Hydroxyethyl cellulose Substances 0.000 description 2
- 229920002153 Hydroxypropyl cellulose Polymers 0.000 description 2
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 2
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 2
- 230000000340 anti-metabolite Effects 0.000 description 2
- 229940100197 antimetabolite Drugs 0.000 description 2
- 239000002256 antimetabolite Substances 0.000 description 2
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 2
- AFYNADDZULBEJA-UHFFFAOYSA-N bicinchoninic acid Chemical compound C1=CC=CC2=NC(C=3C=C(C4=CC=CC=C4N=3)C(=O)O)=CC(C(O)=O)=C21 AFYNADDZULBEJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 2
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 2
- 229960002086 dextran Drugs 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 238000000703 high-speed centrifugation Methods 0.000 description 2
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 2
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 2
- 235000019447 hydroxyethyl cellulose Nutrition 0.000 description 2
- 239000001863 hydroxypropyl cellulose Substances 0.000 description 2
- 235000010977 hydroxypropyl cellulose Nutrition 0.000 description 2
- 239000001866 hydroxypropyl methyl cellulose Substances 0.000 description 2
- 229920003088 hydroxypropyl methyl cellulose Polymers 0.000 description 2
- 235000010979 hydroxypropyl methyl cellulose Nutrition 0.000 description 2
- UFVKGYZPFZQRLF-UHFFFAOYSA-N hydroxypropyl methyl cellulose Chemical compound OC1C(O)C(OC)OC(CO)C1OC1C(O)C(O)C(OC2C(C(O)C(OC3C(C(O)C(O)C(CO)O3)O)C(CO)O2)O)C(CO)O1 UFVKGYZPFZQRLF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N isomaltotriose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O)O1 FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N 0.000 description 2
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 2
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 2
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 2
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 2
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 2
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 2
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 2
- 238000011027 product recovery Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 2
- 239000003656 tris buffered saline Substances 0.000 description 2
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FDKXTQMXEQVLRF-ZHACJKMWSA-N (E)-dacarbazine Chemical compound CN(C)\N=N\c1[nH]cnc1C(N)=O FDKXTQMXEQVLRF-ZHACJKMWSA-N 0.000 description 1
- SERLAGPUMNYUCK-DCUALPFSSA-N 1-O-alpha-D-glucopyranosyl-D-mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO[C@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O SERLAGPUMNYUCK-DCUALPFSSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AOJJSUZBOXZQNB-VTZDEGQISA-N 4'-epidoxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-VTZDEGQISA-N 0.000 description 1
- SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-2-(trifluoromethoxy)pyridine Chemical compound FC(F)(F)OC1=CC=C(Br)C=N1 SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 6-{[2-carboxy-4,5-dihydroxy-6-(phosphanyloxy)oxan-3-yl]oxy}-4,5-dihydroxy-3-phosphanyloxane-2-carboxylic acid Chemical compound O1C(C(O)=O)C(P)C(O)C(O)C1OC1C(C(O)=O)OC(OP)C(O)C1O FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000215068 Acacia senegal Species 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 108010006654 Bleomycin Proteins 0.000 description 1
- 206010005949 Bone cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000018084 Bone neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 1
- 229920002567 Chondroitin Polymers 0.000 description 1
- 229920001287 Chondroitin sulfate Polymers 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 229920000858 Cyclodextrin Polymers 0.000 description 1
- CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N Cyclophosphamide Chemical compound ClCCN(CCCl)P1(=O)NCCCO1 CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- QWIZNVHXZXRPDR-UHFFFAOYSA-N D-melezitose Natural products O1C(CO)C(O)C(O)C(O)C1OC1C(O)C(CO)OC1(CO)OC1OC(CO)C(O)C(O)C1O QWIZNVHXZXRPDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 1
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 1
- SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N Digoxigenin Natural products C1CC(C2C(C3(C)CCC(O)CC3CC2)CC2O)(O)C2(C)C1C1=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 206010014733 Endometrial cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010014759 Endometrial neoplasm Diseases 0.000 description 1
- HTIJFSOGRVMCQR-UHFFFAOYSA-N Epirubicin Natural products COc1cccc2C(=O)c3c(O)c4CC(O)(CC(OC5CC(N)C(=O)C(C)O5)c4c(O)c3C(=O)c12)C(=O)CO HTIJFSOGRVMCQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000000461 Esophageal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 1
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 1
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000008808 Fibrosarcoma Diseases 0.000 description 1
- GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N Fluorouracil Chemical compound FC1=CNC(=O)NC1=O GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 229920000084 Gum arabic Polymers 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000003445 Mouth Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- ZDZOTLJHXYCWBA-VCVYQWHSSA-N N-debenzoyl-N-(tert-butoxycarbonyl)-10-deacetyltaxol Chemical compound O([C@H]1[C@H]2[C@@](C([C@H](O)C3=C(C)[C@@H](OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)OC(C)(C)C)C=4C=CC=CC=4)C[C@]1(O)C3(C)C)=O)(C)[C@@H](O)C[C@H]1OC[C@]12OC(=O)C)C(=O)C1=CC=CC=C1 ZDZOTLJHXYCWBA-VCVYQWHSSA-N 0.000 description 1
- 206010030155 Oesophageal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 1
- 229920002845 Poly(methacrylic acid) Polymers 0.000 description 1
- 229920000954 Polyglycolide Polymers 0.000 description 1
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 239000004373 Pullulan Substances 0.000 description 1
- 229920001218 Pullulan Polymers 0.000 description 1
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000453 Skin Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920002125 Sokalan® Polymers 0.000 description 1
- 208000000277 Splenic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 208000024313 Testicular Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010057644 Testis cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000024770 Thyroid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- DRQXUCVJDCRJDB-UHFFFAOYSA-N Turanose Natural products OC1C(CO)OC(O)(CO)C1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 DRQXUCVJDCRJDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000002495 Uterine Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- JXLYSJRDGCGARV-WWYNWVTFSA-N Vinblastine Natural products O=C(O[C@H]1[C@](O)(C(=O)OC)[C@@H]2N(C)c3c(cc(c(OC)c3)[C@]3(C(=O)OC)c4[nH]c5c(c4CCN4C[C@](O)(CC)C[C@H](C3)C4)cccc5)[C@@]32[C@H]2[C@@]1(CC)C=CCN2CC3)C JXLYSJRDGCGARV-WWYNWVTFSA-N 0.000 description 1
- TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N Xylitol Natural products OCCC(O)C(O)C(O)CCO TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000010489 acacia gum Nutrition 0.000 description 1
- 239000000205 acacia gum Substances 0.000 description 1
- DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal;sodium Chemical compound [Na].CC(O)=O.OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004504 adult stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 description 1
- 239000000783 alginic acid Substances 0.000 description 1
- 229960001126 alginic acid Drugs 0.000 description 1
- 150000004781 alginic acids Chemical class 0.000 description 1
- 229930013930 alkaloid Natural products 0.000 description 1
- 229940100198 alkylating agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002168 alkylating agent Substances 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- 229940045799 anthracyclines and related substance Drugs 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 238000010420 art technique Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 229960001561 bleomycin Drugs 0.000 description 1
- OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O bleomycin A2 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC=C(N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCC[S+](C)C)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O 0.000 description 1
- 229960000182 blood factors Drugs 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010418 carrageenan Nutrition 0.000 description 1
- 239000000679 carrageenan Substances 0.000 description 1
- 229920001525 carrageenan Polymers 0.000 description 1
- 229940113118 carrageenan Drugs 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 1
- DLGJWSVWTWEWBJ-HGGSSLSASA-N chondroitin Chemical compound CC(O)=N[C@@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1OC1[C@H](O)[C@H](O)C=C(C(O)=O)O1 DLGJWSVWTWEWBJ-HGGSSLSASA-N 0.000 description 1
- 229940059329 chondroitin sulfate Drugs 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000001218 confocal laser scanning microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000010924 continuous production Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 229960004397 cyclophosphamide Drugs 0.000 description 1
- 229960003901 dacarbazine Drugs 0.000 description 1
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 1
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 1
- QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N digitoxigenin Natural products CC12CCC(C3(CCC(O)CC3CC3)C)C3C11OC1CC2C1=CC(=O)OC1 QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N digoxigenin Chemical compound C1([C@@H]2[C@@]3([C@@](CC2)(O)[C@H]2[C@@H]([C@@]4(C)CC[C@H](O)C[C@H]4CC2)C[C@H]3O)C)=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000003534 dna topoisomerase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229960003668 docetaxel Drugs 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960001904 epirubicin Drugs 0.000 description 1
- 201000004101 esophageal cancer Diseases 0.000 description 1
- VJJPUSNTGOMMGY-MRVIYFEKSA-N etoposide Chemical compound COC1=C(O)C(OC)=CC([C@@H]2C3=CC=4OCOC=4C=C3[C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@@H]4O[C@H](C)OC[C@H]4O3)O)[C@@H]3[C@@H]2C(OC3)=O)=C1 VJJPUSNTGOMMGY-MRVIYFEKSA-N 0.000 description 1
- 229960005420 etoposide Drugs 0.000 description 1
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002949 fluorouracil Drugs 0.000 description 1
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920000591 gum Polymers 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 201000005787 hematologic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000024200 hematopoietic and lymphoid system neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 239000007972 injectable composition Substances 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- JCQLYHFGKNRPGE-FCVZTGTOSA-N lactulose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 JCQLYHFGKNRPGE-FCVZTGTOSA-N 0.000 description 1
- 229960000511 lactulose Drugs 0.000 description 1
- PFCRQPBOOFTZGQ-UHFFFAOYSA-N lactulose keto form Natural products OCC(=O)C(O)C(C(O)CO)OC1OC(CO)C(O)C(O)C1O PFCRQPBOOFTZGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 208000012987 lip and oral cavity carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 1
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- QWIZNVHXZXRPDR-WSCXOGSTSA-N melezitose Chemical compound O([C@@]1(O[C@@H]([C@H]([C@@H]1O[C@@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)O)CO)CO)[C@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O QWIZNVHXZXRPDR-WSCXOGSTSA-N 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N meso ribitol Natural products OCC(O)C(O)C(O)CO HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000000441 neoplastic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 235000010987 pectin Nutrition 0.000 description 1
- 229920001277 pectin Polymers 0.000 description 1
- 239000001814 pectin Substances 0.000 description 1
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 239000004584 polyacrylic acid Substances 0.000 description 1
- 239000004633 polyglycolic acid Substances 0.000 description 1
- 239000004626 polylactic acid Substances 0.000 description 1
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 1
- 229920001444 polymaleic acid Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- OIGNJSKKLXVSLS-VWUMJDOOSA-N prednisolone Chemical compound O=C1C=C[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 OIGNJSKKLXVSLS-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 1
- 229960005205 prednisolone Drugs 0.000 description 1
- CPTBDICYNRMXFX-UHFFFAOYSA-N procarbazine Chemical compound CNNCC1=CC=C(C(=O)NC(C)C)C=C1 CPTBDICYNRMXFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000624 procarbazine Drugs 0.000 description 1
- 238000011112 process operation Methods 0.000 description 1
- 235000019423 pullulan Nutrition 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 239000002464 receptor antagonist Substances 0.000 description 1
- 229940044551 receptor antagonist Drugs 0.000 description 1
- 230000003134 recirculating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001223 reverse osmosis Methods 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HFHDHCJBZVLPGP-UHFFFAOYSA-N schardinger α-dextrin Chemical compound O1C(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(O)C2O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC2C(O)C(O)C1OC2CO HFHDHCJBZVLPGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 201000000849 skin cancer Diseases 0.000 description 1
- 235000019812 sodium carboxymethyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229920001027 sodium carboxymethylcellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 229960002920 sorbitol Drugs 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 201000002471 spleen cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Polymers 0.000 description 1
- 201000003120 testicular cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 201000002510 thyroid cancer Diseases 0.000 description 1
- 229940044693 topoisomerase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- RULSWEULPANCDV-PIXUTMIVSA-N turanose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](C(=O)CO)O[C@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O RULSWEULPANCDV-PIXUTMIVSA-N 0.000 description 1
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010046766 uterine cancer Diseases 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229960003048 vinblastine Drugs 0.000 description 1
- JXLYSJRDGCGARV-XQKSVPLYSA-N vincaleukoblastine Chemical compound C([C@@H](C[C@]1(C(=O)OC)C=2C(=CC3=C([C@]45[C@H]([C@@]([C@H](OC(C)=O)[C@]6(CC)C=CCN([C@H]56)CC4)(O)C(=O)OC)N3C)C=2)OC)C[C@@](C2)(O)CC)N2CCC2=C1NC1=CC=CC=C21 JXLYSJRDGCGARV-XQKSVPLYSA-N 0.000 description 1
- 229960004528 vincristine Drugs 0.000 description 1
- OGWKCGZFUXNPDA-XQKSVPLYSA-N vincristine Chemical compound C([N@]1C[C@@H](C[C@]2(C(=O)OC)C=3C(=CC4=C([C@]56[C@H]([C@@]([C@H](OC(C)=O)[C@]7(CC)C=CCN([C@H]67)CC5)(O)C(=O)OC)N4C=O)C=3)OC)C[C@@](C1)(O)CC)CC1=C2NC2=CC=CC=C12 OGWKCGZFUXNPDA-XQKSVPLYSA-N 0.000 description 1
- OGWKCGZFUXNPDA-UHFFFAOYSA-N vincristine Natural products C1C(CC)(O)CC(CC2(C(=O)OC)C=3C(=CC4=C(C56C(C(C(OC(C)=O)C7(CC)C=CCN(C67)CC5)(O)C(=O)OC)N4C=O)C=3)OC)CN1CCC1=C2NC2=CC=CC=C12 OGWKCGZFUXNPDA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GBABOYUKABKIAF-GHYRFKGUSA-N vinorelbine Chemical compound C1N(CC=2C3=CC=CC=C3NC=22)CC(CC)=C[C@H]1C[C@]2(C(=O)OC)C1=CC([C@]23[C@H]([C@]([C@H](OC(C)=O)[C@]4(CC)C=CCN([C@H]34)CC2)(O)C(=O)OC)N2C)=C2C=C1OC GBABOYUKABKIAF-GHYRFKGUSA-N 0.000 description 1
- 229960002066 vinorelbine Drugs 0.000 description 1
- 239000000811 xylitol Substances 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N xylitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N 0.000 description 1
- 229960002675 xylitol Drugs 0.000 description 1
- 235000010447 xylitol Nutrition 0.000 description 1
- UHVMMEOXYDMDKI-JKYCWFKZSA-L zinc;1-(5-cyanopyridin-2-yl)-3-[(1s,2s)-2-(6-fluoro-2-hydroxy-3-propanoylphenyl)cyclopropyl]urea;diacetate Chemical compound [Zn+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O.CCC(=O)C1=CC=C(F)C([C@H]2[C@H](C2)NC(=O)NC=2N=CC(=CC=2)C#N)=C1O UHVMMEOXYDMDKI-JKYCWFKZSA-L 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D61/00—Processes of separation using semi-permeable membranes, e.g. dialysis, osmosis or ultrafiltration; Apparatus, accessories or auxiliary operations specially adapted therefor
- B01D61/14—Ultrafiltration; Microfiltration
- B01D61/145—Ultrafiltration
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0662—Stem cells
- C12N5/0667—Adipose-derived stem cells [ADSC]; Adipose stromal stem cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D63/00—Apparatus in general for separation processes using semi-permeable membranes
- B01D63/02—Hollow fibre modules
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
- C12M29/04—Filters; Permeable or porous membranes or plates, e.g. dialysis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M47/00—Means for after-treatment of the produced biomass or of the fermentation or metabolic products, e.g. storage of biomass
- C12M47/10—Separation or concentration of fermentation products
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D2315/00—Details relating to the membrane module operation
- B01D2315/10—Cross-flow filtration
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M35/00—Means for application of stress for stimulating the growth of microorganisms or the generation of fermentation or metabolic products; Means for electroporation or cell fusion
- C12M35/04—Mechanical means, e.g. sonic waves, stretching forces, pressure or shear stimuli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
- C12N2502/13—Coculture with; Conditioned medium produced by connective tissue cells; generic mesenchyme cells, e.g. so-called "embryonic fibroblasts"
- C12N2502/1352—Mesenchymal stem cells
- C12N2502/1382—Adipose-derived stem cells [ADSC], adipose stromal stem cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Water Supply & Treatment (AREA)
- Sustainable Development (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Hematology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本発明は、機能性エクソソーム調製のためのクロスフロー濾過装置の新たな用途及び超高濃度エクソソーム溶液の調製のための連続濃縮システムに関する。
Description
本発明は、クロスフロー濾過装置の新たな用途及び超高濃度医療用エクソソーム溶液の調製のための連続濃縮システムに関する。
ヒトを含む多細胞生物内に存在する様々な細胞では、「エクソソーム」というナノサイズの小胞体を分泌することが知られている。エクソソームは細胞膜と同じ膜構造を持つ小嚢体で、膜成分、タンパク質、ＲＮＡなどを他の細胞や組織に伝達する役割を担っていることが知られている。特に、幹細胞から分泌されるエクソソームは、幹細胞が分泌する多様な成長因子やサイトカインを含有しており、細胞の接着、増殖、分化などの挙動を制御すると知られている。また、エクソソームは、分離過程で細胞培養液中の細胞老廃物、抗生物質、血清などの不純物が除去されるため、細胞培養液と同等の効果で安全に使用できる。
エクソソームは約１００ｎｍのサイズを有し、細胞と細胞間のシグナル伝達を行う。特に細胞間のタンパク質や遺伝物質など交換の移動媒介手段としての役割が明らかになり、エクソソームを用いて細胞を含む組織の挙動を制御するための研究が脚光を浴びている。
エクソソームは、親細胞に由来するタンパク質と遺伝物質を特定の細胞に伝達する能力を最大限に発揮させる物質として知られている。このようなエクソソーム治療剤は、病変組織周囲の細胞に治療効能を有するタンパク質や遺伝物質を伝達して組織を治療する効能においては、従来の細胞治療剤が有する「サイトカイン効果（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｅｆｆｅｃｔ）」を上回る治療効能を有すると判断される。エクソソームの特性を制御あるいは分析するために、エクソソームの脂質二重膜もしくは内部に特定の物質を反応させて機能性を持たせる研究が行われて射る。
本明細書全体にわたって多数の文献が参照され、その引用が示されている。引用された文献の開示内容はその全体が参照として本明細書に組み込まれ、本発明の属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。
本発明の目的は、濃縮、精製及びバッファー交換方法に限られていた従来のクロスフロー濾過装置の新たな用途を提供することであり、クロスフロー濾過装置のみを用いて機能性エクソソームを調製する方法を提供するところにある。
また、本発明の目的は、エクソソームを含む溶液（例えば、幹細胞培養液）からエクソソーム成分を超高濃度に濃縮する多重ＴＦＦ連続濃縮装置及びそれを用いた超高濃度エクソソーム溶液の調製方法を提供するところにある。
さらに詳しくは、本発明の目的は、以下の具現例を提供するところにある。
具現例１．クロスフロー濾過（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ ｆｌｏｗ ｆｌｉｆｉｔｉｏｎ；ＴＦＦ）装置を用いてエクソソームを機能性物質で改質することを特徴とする、機能性エクソソームの調製方法。
具現例２．具現例１において、前記機能性物質は、生体適合性高分子、タンパク質薬物、化学薬物及び標識分子からなる群から選ばれる少なくとも１つであることを特徴とする、機能性エクソソームの調製方法。
具現例３．先行する具現例のいずれか一つにおいて、前記方法は、エクソソームと機能性物質とを混合する反応ステップ；未反応機能性物質を除去する濾過及び濃縮ステップ；及びエクソソーム溶液の溶媒を置換する洗浄ステップ；を含み、前記反応ステップ、濾過及び濃縮ステップ、及び洗浄ステップは、１つのクロスフロー濾過装置（第１ＴＦＦ装置）を用いて行われることを特徴とする、機能性エクソソームの調製方法。
具現例４．先行する具現例のいずれか一つにおいて、前記反応ステップは、エクソソームと機能性物質との混合液をＴＦＦ装置のポンプにより循環させる過程で行われることを特徴とする、機能性エクソソームの調製方法。
具現例５．先行する具現例のいずれか一つにおいて、前記方法は、エクソソームと機能性物質とを反応させるための別途のバッチリアクター（Ｂａｔｃｈ ｒｅａｃｔｏｒ）
を使用しないことを特徴とする、機能性エクソソームの調製方法
具現例６．先行する具現例のいずれか一つにおいて、前記方法は、ＴＦＦ装置以外の別途の攪拌設備及び洗浄設備を使用しないことを特徴とする、機能性エクソソームの調製方法。
を使用しないことを特徴とする、機能性エクソソームの調製方法
具現例６．先行する具現例のいずれか一つにおいて、前記方法は、ＴＦＦ装置以外の別途の攪拌設備及び洗浄設備を使用しないことを特徴とする、機能性エクソソームの調製方法。
具現例７．先行する具現例のいずれか一つにおいて、前記方法は、ＴＦＦ装置を用いて前記反応ステップ、濾過及び濃縮ステップ、及び洗浄ステップを同時に行うことを特徴とする、機能性エクソソームの調製方法。
具現例８．先行する具現例のいずれか一つにおいて、前記方法は、機能性エクソソームの大量生産のためのものである、機能性エクソソームの調製方法。
具現例９．先行する具現例のいずれか一つにおいて、前記方法は、前記第１のＴＦＦ装置から得られたエクソソームを多重ＴＦＦ連続濃縮装置に注入してエクソソームを濃縮するステップをさらに含み、前記多重ＴＦＦ連続濃縮装置はｎ個のＴＦＦ装置を含み、ｎ個のＴＦＦ装置が外部から隔離された１つのシステムとして接続され、ｎ個の濃縮工程を１つの閉鎖系内で連続的に行うことを特徴とする、機能性エクソソームの調製方法（ここで、前記ｎは１～１０の整数である）。
具現例１０．先行する具現例のいずれか一つにおいて、エクソソームを含む原料溶液を、ｎ個のＴＦＦ装置が外部から隔離された１つのシステムとして接続された多重ＴＦＦ連続濃縮装置に注入するステップ；及び前記多重ＴＦＦ連続濃縮装置を用いてｎ個の濃縮工程を１つの閉鎖系内で連続的に行うステップ；を含む、超高濃度エクソソーム溶液の調製方法（ここで、前記ｎは１～１０の整数である）。
具現例１１．先行する具現例のいずれか一つにおいて、前記ｎ個の連続濃縮工程後に得られた最終エクソソームの濃度は、原料溶液中のエクソソームの濃度の２５～５０ｎ倍であることを特徴とする。とする、超高濃度エクソソーム溶液の調製方法。
具現例１２．先行する具現例のいずれか一つにおいて、前記ｎ個の連続濃縮工程後に得られた最終エクソソームの濃度は、１０７～１０１３粒子／ｍＬであることを特徴とする、超高濃度エクソソーム溶液の調製方法。
本発明の他の目的及び利点は、以下の発明の詳細な説明、特許請求の範囲及び図面によってより明確になる。
機能性エクソソーム調製のためのクロスフロー濾過装置の新たな用途
本発明の１つの態様は、クロスフロー濾過（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ ｆｌｏｗ ｆｉｌｌｉｔｉｏｎ；ＴＦＦ）装置を用いてエクソソームを機能性物質で改質することを特徴とする、機能性エクソソームの調製方法を提供することである。
本発明の１つの態様は、クロスフロー濾過（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ ｆｌｏｗ ｆｉｌｌｉｔｉｏｎ；ＴＦＦ）装置を用いてエクソソームを機能性物質で改質することを特徴とする、機能性エクソソームの調製方法を提供することである。
「機能性エクソソーム」とは、エクソソームの脂質二重膜の内外部またはエクソソームの内部に生化学的分子などの機能性物質を担持したり架橋させたりして生化学的機能を持たせるエクソソームをいい、機能性物質の種類や機能によってエクソソーム標識技術、エクソソーム薬物担持技術、エクソソーム治療技術などの１種以上の技術を選択的に適用することができる。
従来の機能性エクソソーム調製技術は、１．エクソソームと機能性物質との反応工程、２．機能性エクソソーム分離及び精製工程、３．更なる濃縮又は希釈による完成品調製工程を含む段階的な工程を経る。
前記反応工程では、エクソソームと機能性物質とを反応器又は容器に入れた後、攪拌環境下で機能性物質とエクソソームとを反応させる。このとき、移し替える過程で外部物質が混入する可能性がある。また、撹拌環境を形成するためには、マグネティックスターラーまたはプロペラ撹拌システムなどの追加の装置が必要である。
前記分離及び精製工程では、超遠心分離法又は透析法（Ｄｉａｌｙｓｉｓ）を用いて未反応残留物を除去する。超遠心分離法の場合、未反応物質を除去するために多量のバッファーを反応物に希釈し、超遠心分離して純粋な特性改質エクソソームを得る方法をいう。残留反応物は、１回の工程で完全に除去することはできず、３回以上の洗浄を繰り返すことで残留反応物を完全に除去することができる。超遠心分離を繰り返す必要があるため、エクソソームの収率は非常に低くなる可能性がある。さらに、１５０，０００ｘｇ以上の高い回転速度と、１回あたり１時間以上の工程時間を必要とする。透析法の場合、エクソソームよりも小さく、反応物よりも濾過機能が大きい透析膜により残留反応物を除去する方法を指す。透析チューブに入られたエクソソーム反応物を大量のバッファー溶液に浸漬し、透析チューブの外に残留反応物を除去する方式であり、純粋なエクソソームを得るためには長い洗浄時間が必要である。
このように、従来のエクソソーム特性改質技術では、共通的に、１）反応過程、分離及び精製過程、及び洗浄過程を同時に行うことができず、２）残留反応物を除去するために反復的で時間のかかる洗浄過程を必要としている。
また、従来の機能性エクソソーム調製技術では、一度に１００ｍＬ未満のエクソソームを改質するのに適しているだけであり、商業化レベルにスケールアップすると、工程時間及びコストが大幅に増加するだけでなく、エクソソームの損失が発生する可能性もある。
このような状況下で本発明は、クロスフロー濾過装置を用いて機能性エクソソームの反応過程、分離及び精製過程、及び洗浄過程を同時に行うだけでなく、機能性エクソソームを短期間で大量に生産し、商用化レベルにスケールアップされたエクソソームの調製方法を提供する。
一般に、クロスフロー濾過方法は、１）生物学的溶液を循環させる過程、２）濾過フィルターよりも小さいサイズのタンパク質及び不純物を除去する過程、及び３）溶液の溶媒を置換する過程などを含む。
本発明の一具現例によれば、前記１）の過程でエクソソームと機能性物質とを混合して反応させながらエクソソーム表面改質を行う。このとき、エクソソームと機能性物質との混合液はポンプにより循環するため、別途の攪拌過程を追加する必要はない。
前記２）過程で反応に参加していないタンパク質、染料、高分子などの未反応の機能性物質を濾過により除去し、反応したエクソソームを含む溶液を得ることができる。前記反応したエクソソームを含む溶液を再循環させて所望の濃度まで濃縮する過程を含み得る。
前記３）工程では、残留反応不純物を除去するために、バッファー溶液または注射用水への溶媒置換を行うことができ、例えば、前記溶媒は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝生理食塩水（ＨＢＳ）生理食塩水、蒸留水、培養培地及び注射用水から選ばれる少なくとも１つであり得る。
したがって、本発明は、エクソソームと機能性物質とを混合する反応ステップ；未反応の機能性物質を除去する濾過及び濃縮ステップ；およびエクソソーム溶液の溶媒を置換する洗浄ステップ；を含み、前記反応ステップ、濾過及び濃縮ステップ、及び洗浄ステップを一つのクロスフロー濾過装置を用いて行うことを特徴とする、機能性エクソソームの調製方法を提供する。
前記一連の過程を通じて表面改質したエクソソームを生産する際に、別途のバッチリアクター（Ｂａｔｃｈ ｒｅａｃｔｏｒ）、攪拌設備、及び洗浄設備が不要であり、反応時間を除く追加の濃縮及び洗浄を短時間で行うことができる。
このように、本発明は、従来の分離及び濾過、濃縮を含む限定的な用途に利用されるクロスフロー濾過方法を使用して機能性エクソソームを調製する新たな方法を提供し、別途の洗浄及び撹拌工程を必要としない反応ステップ（エクソソームの生化学的改質）、濾過及び濃縮ステップ、及び洗浄ステップを同時に行うので、従来技術よりも高い生産性及び収率を得ることができる。
本発明の一具現例で使用されるクロスフロー濾過装置は限外濾過システムであり、ＴＦＦ装置を用いて前記反応ステップ、濾過及び濃縮ステップ、及び洗浄ステップを行った結果、エクソソーム溶液が１／１０～１／１００の容積まで効率よく濃縮できる。
限外濾過とは、精密濾過（ｍｉｃｒｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）と逆浸透膜の中間領域に位置するもので、膜の細孔と溶質との大きさの違いによって特定の物質を分離する方法を指す。限外濾過膜は、膜により９０％以上の排除度を示す溶質の最小分子量で定義される分画分子量（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｃｕｔｏｆｆ：ＭＷＣＯ）によりその分離性能を示すことができる。
本発明に用いられる前記接線流濾過は、限外濾過を行うことができる中空繊維（Ｈｏｌｌｏｗ ｆｉｂｅｒ）ＴＦＦ及び膜（ｍｅｍｂｒａｎｅ）ＴＦＦからなる群から選ばれる少なくとも１つであってもよいし、好ましくは、分画分子量（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｃｕｔｆｏｆｆ：ＭＷＣＯ）が１００，０００Ｄａ～５００，０００ＤａであるＴＦＦフィルターを使用するものであり得る。
本発明における用語「改質」とは、エクソソームの脂質二重膜表面または脂質二重膜の内部あるいはエクソソームの内部に機能性物質（例えば、生化学的物質）を担持または架橋させることを意味する。
一具現例において、前記機能性物質は、生体適合性高分子、タンパク質薬物、化学薬物及び標識分子からなる群から選ばれる少なくとも１つであり得る。
前記生体適合性高分子は、ヒアルロン酸（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ：ＨＡ）、ゼラチン（ｇｅｌａｔｉｎ）、キトサン（ｃｈｉｔｏｓａｎ）、コラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ）、アルギン酸、ペクチン、カラギーナン、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、デキストラン、デキストラン硫酸、ポリリジン、カルボキシメチルキチン、フィブリン、アガロース、プルラン、セルロース、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアルコール、ガム、アラビアガム、アルギネート、シクロデキストリン、デキストリン、ブドウ糖、果糖、でん粉、トレハロース、グルコース、マルトース、ラクトース、ラクツロース、フルクトース、ツラノース、メリトース、メレジトース、デキストラン、ソルビトール、キシリトール、パラチニット、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリエチレンオキサイド、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、ポリメタクリル酸、及びポリマレイン酸からなる群から選ばれる少なくとも１つであり得る。
前記タンパク質薬物は、ホルモン、サイトカイン、酵素、抗体、成長因子、転写調節因子、血液因子、ワクチン、構造タンパク質、リガンドタンパク質及び受容体、細胞表面抗原、受容体拮抗物質、及び毒素からなる群から選ばれる少なくとも１つであり得る。
前記化学薬物は、アルキル化剤、代謝拮抗剤（抗代謝剤）、アントラサイクリン、植物アルカロイド、トポイソメラーゼ阻害剤、及び抗がん剤（シクロホスファミド、メトトレキサート、５－フルオロウラシル、ビノレルビン、ドキソルビシン、ドセタキセル、ブレオマイシン、ビンブラスチン、ダカルバジン、マスタング、ビンクリスチン、プロカルバジン、プレドニゾロン、エトポシド、エピルビシンなど）からなる群から選ばれる少なくとも1つであり得る。
前記標識分子は、蛍光団（フルオレセイン、フィコエリスリン、ローダミン、リサミン、及びＣｙ３とＣｙ５（ファルマシア）等）、発色団、化学発光団、磁性粒子、放射性同位元素（Ｃ１４、Ｉ１２５、Ｐ３２及びＳ３５など）、質量標識、電子密集粒子、酵素（アルカリンホスファターゼ及び西洋ワサビペルオキシダーゼ等）、助因子、酵素に対する基質、重金属（例えば、金）、そして抗体、ストレプトアビジン、ビオチン、ジゴキシゲニンとキレート基などの特定結合パートナーを有するハプテンからなる群から選ばれる少なくとも１つであり得る。
本発明の一具現例では、機能性物質で改質されるエクソソームは、幹細胞、がん細胞、組織細胞などの初代細胞（ｐｒｉｍａｒｙ ｃｅｌｌｓ）、幹細胞株、がん細胞株などの細胞株が培養中に分泌されるエクソソームであり得る。
前記幹細胞株は、胚性幹細胞株、成体幹細胞株及び誘導万能幹細胞（ｉＰＳＣ）株からなる群から選ばれる少なくとも１つであり得、前記癌細胞株は、膀胱癌細胞株、血液癌（白血病、骨髄腫）細胞株、骨癌細胞株、脳腫瘍細胞株、乳癌細胞株、子宮頸癌細胞株、結腸直腸癌細胞株、子宮内膜癌細胞株、食道癌細胞株、線維肉腫癌細胞株、腎臓癌細胞株、肝臓癌細胞株、肺癌細胞株、リンパ腫細胞株、神経癌細胞株、口腔癌細胞株、卵巣癌細胞株、膵臓癌細胞株、前立腺癌細胞株、皮膚癌細胞株、脾臓癌細胞株、胃癌細胞株、精巣癌細胞株、甲状腺癌細胞株、及び子宮癌細胞株からなる群から選ばれる少なくとも１つであり得る。
このような本発明の調製方法により改質された機能性エクソソームは、大量生産されて医療用途または化粧品用途に有用に使用することができる。
超高濃度医療用エクソソーム溶液の調製のための連続濃縮システム
本発明の他の態様は、超高濃度医療用エクソソーム溶液を調製するための連続濃縮システムを提供することである。
本発明の他の態様は、超高濃度医療用エクソソーム溶液を調製するための連続濃縮システムを提供することである。
エクソソームを濃縮するための従来技術には、現在の細胞培養過程中に得られた培養液から細胞から分泌されたエクソソームの超遠心分離（ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）、限外濾過（ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）、クロマトグラフィー（ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）、沈殿（ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）方法などがある。
しかしながら、現在報告されているエクソソーム生産の従来技術は、初期容量と比較して２５～１００倍の濃縮しか達成できず、最大２．０×１０１０粒子／ｍＬの濃度でエクソソームを生産することが可能である。これは、低濃度でも効果を発揮する化粧品などの用途には適しているが、高濃度や低用量の臨床適用（容積が非常に小さい関節腔への局部注射など）では更なる濃縮作業が必要となる場合がある。具体的には、例えば、１．０×１０１２個のエクソソームが治療に有効な用量である場合、効果を得るには現在は５０ｍＬを投与する必要があり、このような大きな容積を投与可能な方法は静脈注射でのみ可能である。また、エクソソーム治療剤の濃度が低いと、局所注射時に適用部位から外れる可能性が非常に高く、エクソソーム治療効果が低下するというデメリットが生じる可能性がある。
現在、高濃度のエクソソーム溶液を調製するためには更なる濃縮過程が必要であり、これに伴う工程数や工程時間が長くなってしまう。工程数や工程時間は、生産人員及び生産コストに絶対的な影響を与える工程要因であり、すなわち、工程の追加は生産性の低下につながる。また、工程追加による中間製品の移動や外部暴露により、外的要因によるサンプル汚染など治療剤の安定性を低下させる要因が発生する可能性がある。
本発明は、このような従来の問題を解決し、エクソソームを含む溶液（例えば、幹細胞培養液）を原料物質として連続式濃縮システムに投入することにより、連続工程として超高濃度エクソソーム溶液を調製する方法を提供する。
具体的には、本発明は、エクソソームを含む原料溶液を、ｎ個のＴＦＦ装置が外部から隔離された１つのシステムとして接続された多重ＴＦＦ連続濃縮装置に注入するステップ；及び前記多重ＴＦＦ連続濃縮装置を用いてｎ個の濃縮工程を１つの閉鎖系内で連続的に行うステップ；を含む、超高濃度エクソソーム溶液の調製方法を提供する（ここで、前記ｎは１～１０の整数である）。
「連続濃縮システム」とは、図１２から図１４に示すように、２つまたは多数のＴＦＦ濃縮工程において、中間製品回収及び原料注入過程を省略し、多数の濃縮工程を１つの閉鎖系（ｃｌｏｓｅｄ ｓｙｓｔｅｍ）内で連続的に行うことを意味する。
詳細には、二重及び多重ＴＦＦ連続濃縮システムは外部から隔離された単一のシステムとして構築され、初期注入された原料培養液は、一次濃縮後の製品回収なしに二次または多回次濃縮過程を同時に経て最終原料を生産する。
前記システムは、中間製品の移動などにより引き起こされる外部要因による汚染を最小限に抑えることで、エクソソーム溶液の安定性及び品質改善を図る。
従来のエクソソーム抽出技術においても、高濃度エクソソームを抽出するために二次ＴＦＦ濃縮を追加する実施形態があるが、本発明では、二重または多重の濃縮工程を同時に行うことにより工程時間を短縮できるだけでなく最終製品の濃度を多くは２５倍以上高めることができる。そのため、従来の濃縮過程を単純に加えるのとは異なると言える。
また、本発明は、システムのスケールアップが可能であり、濃縮工程中に培養液が全く外部に露出されず、医薬品の安定性を確保することができ、医薬用ＧＭＰの適用に適している。特に、本システムは、ＧＭＰ適用時に生物学的安全キャビネット（ＢＳＣ）内の工程運転を強制する必要がなく、これは作業性や作業難易度を下げる要因となる。ただし、本システムは、ＡＰＶ認証取得後、ＢＳＣ外部の作業が可能である。
前記本発明は、１つの濃縮パーツ当たり、１つのＴＦＦフィルター、１つ以上の原料投入容器、１つの回収容器、及びマニホールドで構成されている。
前記本発明は、二重または多重の濃縮パーツが連続的に行われる。
１）１次ＴＦＦフィルターパーツでは、スケールに合わせてフィルター容量が選択される。
２）２次ＴＦＦフィルターパーツは、１次フィルターパーツの１／１０～１／５０倍のスケールを有し、スケールに合わせてフィルター容量が選択される。
３）（ｎ）次ＴＦＦフィルターパーツは、（ｎ－１）次フィルターパーツの１／１０～１／５０倍のスケールを有し、スケールに合わせてフィルター容量が選択される。
前記フィルターパーツは、用途やスケールに合わせて２～５個適用可能であるが、好ましくは２～３個適用する。しかし、本発明はこれに限定されない。
前記単一フィルターパーツは、初期重量に対して５～５０倍に濃縮されるが、好ましくは１０～３０倍の濃縮を行う。しかし、本発明はこれに限定されない。
前記ＴＦＦフィルターは、シート（ｓｈｅｅｔ）状及び中空繊維（ｈｏｌｌｏｗ ｆｉｂｅｒ）状の両方とも使用可能であるが、好ましくはホ中空繊維状ＴＦＦフィルターを使用する。
前記ＴＦＦフィルターは容量に合わせて選択可能であるが、運転時のせん断速度（ｓｈｅａｒ ｒａｔｅ）が１０００～６，０００ｓ－１のフィルターを選択しなければならず、好ましくは３，０００～５，０００ｓ－１のフィルターを選択しなければならない。
前記本発明において、（ｎ）次連続濃縮時に最終的に得られるエクソソームの濃度は、理論上、初期原料重量に対して２５～５０ｎ倍の濃縮となるが、好ましくは２５～２５００倍の濃縮となり、より好ましくは５０～１００倍の濃縮となる。
具体的には、本発明で得られる最終エクソソーム製品は、１０７～１０１３分子／ｍＬのエクソソーム濃度、好ましくは２．０×１０１０～５．０×１０１０分子／ｍＬのエクソソーム濃度で産生される。しかし、本発明はこれに限定されない。
一方、本発明で得られる最終エクソソーム製品のタンパク質濃度は、１～１０００μｇ／ｍＬであり、好ましくは１００～５００μｇ／ｍＬ、より好ましくは３００～４００μｇ／ｍＬである。しかし、本発明はこれに限定されない。
本発明の具現例では、前記システムは、高濃度の幹細胞エクソソームを含む局所注入用注射剤を提供する。
前記注射剤は、１．０×１０７～１．０×１０１３分子／ｍＬのエクソソーム濃度を有し、０．１～１００ｍＬの用量を有することができる。
以下、本発明を下記の実施例においてより詳細に記述する。ただし、下記の実施例は、本発明の内容を例示するものに過ぎず、本発明の権利範囲を制限または限定するものではない。本発明の詳細な説明及び実施例から、本発明が属する技術分野の通常の技術者が容易に類推できることは、本発明の権利範囲に属するものと解釈される。
１．ヒト脂肪由来幹細胞培養
ヒト脂肪由来幹細胞からエクソソームを抽出するために、３～７継代まで継代培養したヒト脂肪由来幹細胞を６時間～３日間培養しながら細胞培養液を回収した。前記回収した細胞培養上清から、０．２μｍフィルターを用いて細胞残渣（ｃｅｌｌ ｄｅｂｒｉｓ）及び不純物を除去した。
ヒト脂肪由来幹細胞からエクソソームを抽出するために、３～７継代まで継代培養したヒト脂肪由来幹細胞を６時間～３日間培養しながら細胞培養液を回収した。前記回収した細胞培養上清から、０．２μｍフィルターを用いて細胞残渣（ｃｅｌｌ ｄｅｂｒｉｓ）及び不純物を除去した。
２．ヒト脂肪由来幹細胞エクソソームの抽出
前記１で得られたヒト脂肪由来幹細胞培養液から、クロスフロー濾過方式（Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ Ｆｌｏｗ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）を用いてエクソソームを抽出及び精製した。クロスフロー濾過方式には１００または５００ＫＤａの濾過能を有するフィルターを使用し、細胞培養液を１０倍または１００倍に濃縮してエクソソームを回収した。エクソソームの純度を高めるために、回収したエクソソームを１０倍～１００倍容積のダルベッコリン酸緩衝液（ＤＰＢＳ）で希釈し、再び１００または５００ＫＤａの濾過能を有するフィルターを用いて濃縮した。抽出工程を図３及び図４に示した。
前記１で得られたヒト脂肪由来幹細胞培養液から、クロスフロー濾過方式（Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ Ｆｌｏｗ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）を用いてエクソソームを抽出及び精製した。クロスフロー濾過方式には１００または５００ＫＤａの濾過能を有するフィルターを使用し、細胞培養液を１０倍または１００倍に濃縮してエクソソームを回収した。エクソソームの純度を高めるために、回収したエクソソームを１０倍～１００倍容積のダルベッコリン酸緩衝液（ＤＰＢＳ）で希釈し、再び１００または５００ＫＤａの濾過能を有するフィルターを用いて濃縮した。抽出工程を図３及び図４に示した。
３．ヒト脂肪由来幹細胞エクソソームの特性分析
前記２により、ヒト脂肪由来幹細胞から抽出されたエクソソームの物理的及び生化学的特性を、ナノ粒子トラッキング解析（Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｔｒａｃｋｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ：ＮＴＡ）及びビシンコニン酸（Ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ ａｃｉｄ：ＢＣＡ）アッセイ法を用いたタンパク質定量により確認した。前記２で抽出したエクソソーム粒子の大きさは５０～２００ｎｍであることが確認された。
前記２により、ヒト脂肪由来幹細胞から抽出されたエクソソームの物理的及び生化学的特性を、ナノ粒子トラッキング解析（Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｔｒａｃｋｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ：ＮＴＡ）及びビシンコニン酸（Ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ ａｃｉｄ：ＢＣＡ）アッセイ法を用いたタンパク質定量により確認した。前記２で抽出したエクソソーム粒子の大きさは５０～２００ｎｍであることが確認された。
４．蛍光標識機能性エクソソームの調製
（１）クロスフロー濾過方式を用いた蛍光標識機能性エクソソームの調製（実施例）
蛍光標識機能性エクソソームを調製するためのＴＦＦ装置を図３及び図４に示した。濃度５．０×１０９粒子／ｍＬのエクソソーム１ｍＬと１００ｕＬの蛍光標識物質（Ｖｙｂｒａｎｔ（商標）ＤｉＤ Ｃｅｌｌ－Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｖ２２８８７）とを、１．５ｍＬチューブに移した。混合物を１０倍～１００倍容積のＤＰＢＳで希釈し、ＴＦＦ装置内のリザーバーにそれぞれ注ぎ、混合した。
（１）クロスフロー濾過方式を用いた蛍光標識機能性エクソソームの調製（実施例）
蛍光標識機能性エクソソームを調製するためのＴＦＦ装置を図３及び図４に示した。濃度５．０×１０９粒子／ｍＬのエクソソーム１ｍＬと１００ｕＬの蛍光標識物質（Ｖｙｂｒａｎｔ（商標）ＤｉＤ Ｃｅｌｌ－Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｖ２２８８７）とを、１．５ｍＬチューブに移した。混合物を１０倍～１００倍容積のＤＰＢＳで希釈し、ＴＦＦ装置内のリザーバーにそれぞれ注ぎ、混合した。
図３に示すＴＦＦ装置を用いてエクソソームと蛍光標識物質を循環させて反応する過程を施した。ＴＦＦフィルターのＰ（パーミエイト）方向に接続されたチューブ及び洗浄用ＰＢＳが、リザーバーに流入するチューブをクランプで塞ぎ、反応物が外部に漏れたり、外部バッファーが混入したりすることを防止した。ポンプ１を１０～１００ｃｃ／分の速度で１０秒～１時間作動させ、リザーバー内のエクソソームと蛍光標識物質との混合溶液がＴＦＦフィルター内部を循環するようにした。前記過程でエクソソーム膜に蛍光標識物質が担持され、エクソソーム表面が蛍光標識された。
前記工程の後、残留蛍光標識物質を除去するために洗浄工程を行った。図４に示すように、すべてのクランプを取り外した。ポンプ１を１０～２５０ｃｃ／分の速度で１分～１０分間作動させ、ポンプ２を５～１０～５０ｃｃ／分の速度で１分～１０分間作動させた。ポンプ１は、混合溶液がＴＦＦとリザーバーを循環させる用途に使用され、ポンプ２は、それぞれ洗浄（ウォッシング）用のＰＢＳをリザーバーに送達する用途、及び残留蛍光標識物質を含む廃棄溶液を回収する用途に使用された。前記工程中に、ＴＦＦフィルターのメンブレン孔よりも大きなエクソソームはフィルターに濾過されないが、メンブレン孔よりも小さな蛍光標識物質は濾過されて、エクソソームと反応しない未反応蛍光標識物質は除去され、蛍光標識されたエクソソームのみが得られた。洗浄効果を確認するために、リザーバーから１分毎に１ｍＬずつサンプルを採取し、ＵＶ可視分光光度計を用いて４５０ｎｍでの吸光度を測定した。最終的に分離されたエクソソーム、廃棄物、ＰＢＳの各単位容積を採取し、同様に４５０ｎｍでの吸光度を測定した（図５）。
（２）超高速遠心分離方式を用いた蛍光標識機能性エクソソームの調製（比較例１）
前記（１）と同様の方法でエクソソームと蛍光標識物質との混合物を調製した。具体的には、濃度５．０×１０９粒子／ｍＬのエクソソーム１ｍＬと１０ｕＬの蛍光標識物質（Ｖｙｂｒａｎｔ（商標）ＤｉＤ Ｃｅｌｌ－Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｖ２２８８７）とを、１．５ｍＬチューブに移した。混合物を１０倍～１００倍容積のＤＰＢＳで希釈し、ＴＦＦ装置内のリザーバーにそれぞれ注ぎ、混合した。
前記（１）と同様の方法でエクソソームと蛍光標識物質との混合物を調製した。具体的には、濃度５．０×１０９粒子／ｍＬのエクソソーム１ｍＬと１０ｕＬの蛍光標識物質（Ｖｙｂｒａｎｔ（商標）ＤｉＤ Ｃｅｌｌ－Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｖ２２８８７）とを、１．５ｍＬチューブに移した。混合物を１０倍～１００倍容積のＤＰＢＳで希釈し、ＴＦＦ装置内のリザーバーにそれぞれ注ぎ、混合した。
次に、混合物を８０，０００～１５０，０００Хｇの速度で遠心分離して、蛍光標識エクソソームをスピンダウンした。蛍光標識エクソソームを１ｍＬのＤＰＢＳに分散させ、蛍光標識エクソソーム溶液を得た（図６及び図７）。
（３）メンブレンフィルター濾過法を用いた蛍光標識機能性エクソソームの調製（比較例２）
前記（１）と同様の方法でエクソソームと蛍光標識物質との混合物を調製した。具体的には、濃度５．０×１０９粒子／ｍＬのエクソソーム１ｍＬと１００ｕＬの蛍光標識物質（Ｖｙｂｒａｎｔ（商標）ＤｉＤ Ｃｅｌｌ－Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｖ２２８８７）を、１．５ｍＬチューブに移した。混合物を１０倍～１００倍容積のＤＰＢＳで希釈し、ＴＦＦ装置内のリザーバーにそれぞれ注ぎ、混合した。
前記（１）と同様の方法でエクソソームと蛍光標識物質との混合物を調製した。具体的には、濃度５．０×１０９粒子／ｍＬのエクソソーム１ｍＬと１００ｕＬの蛍光標識物質（Ｖｙｂｒａｎｔ（商標）ＤｉＤ Ｃｅｌｌ－Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｖ２２８８７）を、１．５ｍＬチューブに移した。混合物を１０倍～１００倍容積のＤＰＢＳで希釈し、ＴＦＦ装置内のリザーバーにそれぞれ注ぎ、混合した。
次に、混合物を、３～５０ＫＤａの濾過能を有するメンブレンフィルター（Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ－１５ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒ Ｕｎｉｔｓ，Ｍｅｒｃｋ）を用いて３０分間、１，０００×ｇ～４，０００×ｇの速度で遠心分離し、蛍光標識エクソソームを濃縮精製した。蛍光標識エクソソームを１．５ｍＬチューブで回収し、蛍光標識エクソソーム溶液を得た（図６及び図７）。
５．蛍光標識機能性エクソソームの特性分析
前記４（１）で調製した蛍光標識機能性エクソソームの蛍光標識能を確認するために、１０８～１０１０個のエクソソームが分散したＤＰＢＳ１ｍＬと細胞培養液９ｍＬとを混合し、ヒト角質形成細胞（ＨａＣａＴ ｃｅｌｌ）に１時間処理した。エクソソーム処理されたヒト角質形成細胞において、共焦点蛍光顕微鏡を用いて蛍光標識エクソソームの細胞内浸透を確認した（図８）。
前記４（１）で調製した蛍光標識機能性エクソソームの蛍光標識能を確認するために、１０８～１０１０個のエクソソームが分散したＤＰＢＳ１ｍＬと細胞培養液９ｍＬとを混合し、ヒト角質形成細胞（ＨａＣａＴ ｃｅｌｌ）に１時間処理した。エクソソーム処理されたヒト角質形成細胞において、共焦点蛍光顕微鏡を用いて蛍光標識エクソソームの細胞内浸透を確認した（図８）。
６．クロスフロー濾過方式を用いたＰＥＧ化機能性エクソソームの調製
前記４（１）と類似する方法でＰＥＧ化エクソソームを調製した。濃度５．０×１０９粒子／ｍＬのエクソソーム１ｍＬと１０μＬの１～１，０００ｍｇ／ｍＬのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とを、１．５ｍＬチューブに移した。混合物を１０倍～１００倍容積のＤＰＢＳで希釈し、ＴＦＦ装置内のリザーバーにそれぞれ注ぎ、混合した。エクソソームとＰＥＧとの化学的結合を誘導するために、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）／Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）架橋過程を行った。１～１００ｍＭのＥＤＣ５００μＬと同じ濃度のＮＨＳ５００μＬとをエクソソーム／ＰＥＧ混合物に添加し、約１～３０分間リザーバーで反応させた。
前記４（１）と類似する方法でＰＥＧ化エクソソームを調製した。濃度５．０×１０９粒子／ｍＬのエクソソーム１ｍＬと１０μＬの１～１，０００ｍｇ／ｍＬのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とを、１．５ｍＬチューブに移した。混合物を１０倍～１００倍容積のＤＰＢＳで希釈し、ＴＦＦ装置内のリザーバーにそれぞれ注ぎ、混合した。エクソソームとＰＥＧとの化学的結合を誘導するために、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）／Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）架橋過程を行った。１～１００ｍＭのＥＤＣ５００μＬと同じ濃度のＮＨＳ５００μＬとをエクソソーム／ＰＥＧ混合物に添加し、約１～３０分間リザーバーで反応させた。
前記過程の後、残留化学物質及びＰＥＧを除去するために洗浄工程を行った。図４に示すように、すべてのクランプを取り外した。ポンプ１を１０～２５０ｃｃ／分の速度で３０分～３時間作動させ、ポンプ２及び３を５～１０～５０ｃｃ／分の速度で３０分～３時間作動させた。ポンプ１は、混合溶液がＴＦＦとリザーバーを循環させる用途に使用され、ポンプ２及び３は、それぞれ洗浄（ウォッシング）用のＰＢＳをリザーバーに送達する用途、及び残留蛍光標識物質を含む廃棄溶液を回収する用途に使用された。前記工程中に、ＴＦＦフィルターのメンブレン孔よりも大きなエクソソームはフィルターに濾過されないが、メンブレン孔よりも小さな化学物質等は濾過されて、エクソソームと反応しない未反応物質は除去され、表面改質されたエクソソームのみが得られた。
７．ＰＥＧ化機能性エクソソームの特性分析
前記６により、ヒト脂肪由来幹細胞から抽出されたエクソソームの物理的特性変化をＤＬＳ及びゼータ電位で確認することにより、エクソソーム粒子の表面改質の有無を確認した。ＰＥＧ化機能性エクソソームは、未処理のエクソソームと比較して粒径分布が大きくなることが確認された（図９及び図１０）。
前記６により、ヒト脂肪由来幹細胞から抽出されたエクソソームの物理的特性変化をＤＬＳ及びゼータ電位で確認することにより、エクソソーム粒子の表面改質の有無を確認した。ＰＥＧ化機能性エクソソームは、未処理のエクソソームと比較して粒径分布が大きくなることが確認された（図９及び図１０）。
８．クロスフロー濾過方式を用いた薬物担持機能性エクソソームの調製
前記４（１）と類似する方法で薬物担持エクソソームを調製及び精製した。濃度５．０×１０９粒子／ｍＬのエクソソーム１ｍＬに１～１，０００μｇのドキソルビシンを１００μＬ添加した。混合物を１０倍～１００倍容積のＤＰＢＳで希釈し、ＴＦＦ装置内のシングルユースバッグ（Ｓｉｎｇｌｅ－ｕｓｅ ｂａｇ）にそれぞれ注ぎ、混合した。薬物のエクソソーム内への担持のために、混合物が入っているシングルユースバッグを、４℃以下に維持する超音波処理水浴（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ ｗａｔｅｒ ｂａｔｈ）に浸した状態で工程を行った。
前記４（１）と類似する方法で薬物担持エクソソームを調製及び精製した。濃度５．０×１０９粒子／ｍＬのエクソソーム１ｍＬに１～１，０００μｇのドキソルビシンを１００μＬ添加した。混合物を１０倍～１００倍容積のＤＰＢＳで希釈し、ＴＦＦ装置内のシングルユースバッグ（Ｓｉｎｇｌｅ－ｕｓｅ ｂａｇ）にそれぞれ注ぎ、混合した。薬物のエクソソーム内への担持のために、混合物が入っているシングルユースバッグを、４℃以下に維持する超音波処理水浴（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ ｗａｔｅｒ ｂａｔｈ）に浸した状態で工程を行った。
図３に示すＴＦＦ装置を用いてエクソソームと薬物との混合物を循環させて反応させる過程を施した。このとき、シングルユースバッグは、弱い超音波処理（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）が行われている水浴（ｗａｔｅｒ ｂａｔｈ）に浸されたまま維持された。ＴＦＦフィルターのＰ（パーミエイト）方向に接続されたチューブ及び洗浄用ＰＢＳが、リザーバーに流入するチューブをクランプで塞ぎ、反応物が外部に漏れたり、外部バッファーが混入したりすることを防止した。ポンプ１を１０～１００ｃｃ／分の速度で１０秒～１時間作動させ、溶液中のエクソソームと蛍光標識物質との混合溶液がＴＦＦフィルター内部を循環するようにした。前記過程でエクソソームに薬物が担持された。
前記過程の後、残留薬物を除去するために洗浄工程を行った。図４に示すように、すべてのクランプを取り外した。ポンプ１を１０～２５０ｃｃ／分の速度で３０分～３時間作動させ、ポンプ２及び３を５～１０～５０ｃｃ／分の速度で３０分～３時間作動させた。ポンプ１は、混合溶液がＴＦＦ及びリザーバーを循環させる用途に使用され、ポンプ２及び３は、それぞれ洗浄（ウォッシング）用のＰＢＳをリザーバーに送達する用途、及び残留薬物を含む廃棄溶液を回収する用途に使用された。前記工程中に、ＴＦＦフィルターのメンブレン孔よりも大きなエクソソームはフィルターに濾過されないが、メンブレン孔よりも小さな薬物は濾過されて、エクソソームに担持されていない薬物は除去され、蛍光標識されたエクソソームのみが得られた。
９．薬物担持機能性エクソソームの特性分析
薬物が担持されたエクソソームの薬物担持量を確認するために、１０８～１０１０個のエクソソームが分散したＤＰＢＳ１ｍＬにおいて、紫外可視分光光度計を用いてエクソソーム内部の薬物担持を確認した（図１１）。図１１によれば、エクソソーム５×１０９粒子に約２０μｇのドキソルビシンが担持されていることを確認した。
薬物が担持されたエクソソームの薬物担持量を確認するために、１０８～１０１０個のエクソソームが分散したＤＰＢＳ１ｍＬにおいて、紫外可視分光光度計を用いてエクソソーム内部の薬物担持を確認した（図１１）。図１１によれば、エクソソーム５×１０９粒子に約２０μｇのドキソルビシンが担持されていることを確認した。
１０．連続的なＴＦＦ工程を用いた高濃度のヒト脂肪由来幹細胞エクソソーム抽出
前記１で得られたヒト脂肪由来幹細胞培養液から、連続的なクロスフロー濾過方式（Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ Ｆｌｏｗ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）を用いてエクソソームを抽出及び精製した。一次クロスフロー濾過方式に１００または５００ＫＤａの濾過能を有するフィルターを使用し、細胞培養液を１０倍または１００倍濃縮してエクソソームを回収した。回収されたエクソソームを直ちに二次クロスフロー濾過方式のフィルターに適用し、一次クロスフロー濾過フィルターの０．５倍～０．０１倍の大きさを有する二次クロスフロー濾過フィルターを用いて、細胞培養液を１０倍又は１００倍さらに濃縮して高濃度のエクソソームを回収した。エクソソーム純度を高めるために、回収されたエクソソームを１０倍～１００倍容積のＤＰＢＳに希釈し、１００または５００ＫＤａの濾過能を有するフィルターを用いて再び濃縮した。抽出工程を図１２、図１３及び図１４に示した。連続的なＴＦＦ工程により得られたエクソソームの収率は、初期ＣＭ量に対して、生産されたエクソソーム及びタンパク質量で確認した（図１５）。
前記１で得られたヒト脂肪由来幹細胞培養液から、連続的なクロスフロー濾過方式（Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ Ｆｌｏｗ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）を用いてエクソソームを抽出及び精製した。一次クロスフロー濾過方式に１００または５００ＫＤａの濾過能を有するフィルターを使用し、細胞培養液を１０倍または１００倍濃縮してエクソソームを回収した。回収されたエクソソームを直ちに二次クロスフロー濾過方式のフィルターに適用し、一次クロスフロー濾過フィルターの０．５倍～０．０１倍の大きさを有する二次クロスフロー濾過フィルターを用いて、細胞培養液を１０倍又は１００倍さらに濃縮して高濃度のエクソソームを回収した。エクソソーム純度を高めるために、回収されたエクソソームを１０倍～１００倍容積のＤＰＢＳに希釈し、１００または５００ＫＤａの濾過能を有するフィルターを用いて再び濃縮した。抽出工程を図１２、図１３及び図１４に示した。連続的なＴＦＦ工程により得られたエクソソームの収率は、初期ＣＭ量に対して、生産されたエクソソーム及びタンパク質量で確認した（図１５）。
Claims (12)
- クロスフロー濾過（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ ｆｌｏｗ ｆｌｉｆｉｔｉｏｎ；ＴＦＦ）装置を用いてエクソソームを機能性物質で改質することを特徴とする、機能性エクソソームの調製方法。
- 前記機能性物質は、生体適合性高分子、タンパク質薬物、化学薬物及び標識分子からなる群から選ばれる少なくとも１つであることを特徴とする、請求項１に記載の機能性エクソソームの調製方法。
- 前記方法は
エクソソームと機能性物質とを混合する反応ステップ；
未反応機能性物質を除去する濾過及び濃縮ステップ；及び
エクソソーム溶液の溶媒を置換する洗浄ステップ；を含み、
前記反応ステップ、濾過及び濃縮ステップ、及び洗浄ステップは、１つのクロスフロー濾過装置（第１ＴＦＦ装置）を用いて行われることを特徴とする、請求項１に記載の機能性エクソソームの調製方法。 - 前記反応ステップは、エクソソームと機能性物質との混合液をＴＦＦ装置のポンプにより循環させる過程で行われることを特徴とする、請求項３に記載の機能性エクソソームの調製方法。
- 前記方法は、エクソソームと機能性物質とを反応させるための別途のバッチリアクター（Ｂａｔｃｈ ｒｅａｃｔｏｒ）を使用しないことを特徴とする、請求項３に記載の機能性エクソソームの調製方法。
- 前記方法は、ＴＦＦ装置以外の別途の攪拌設備及び洗浄設備を使用しないことを特徴とする、請求項３に記載の機能性エクソソームの調製方法。
- 前記方法は、ＴＦＦ装置を用いて前記反応ステップ、濾過及び濃縮ステップ、及び洗浄ステップを同時に行うことを特徴とする、請求項３に記載の機能性エクソソームの調製方法。
- 前記方法は、機能性エクソソームの大量生産（ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）のためのものである、請求項１に記載の機能性エクソソームの調製方法。
- 前記方法は、前記第１ＴＦＦ装置から得られた濃縮機能性エクソソームを多重ＴＦＦ連続濃縮装置に注入してエクソソームをさらに濃縮するステップをさらに含み、
前記多重ＴＦＦ連続濃縮装置はｎ個のＴＦＦ装置を含み、ｎ個のＴＦＦ装置が外部から隔離された１つのシステムとして接続され、ｎ個の濃縮工程を１つの閉鎖系（ｃｌｏｓｅｄ ｓｙｓｔｅｍ）内で連続的に行うことを特徴とする、請求項３に記載の機能性エクソソームの調製方法（ここで、前記ｎは１～１０の整数である）。 - エクソソームを含む原料溶液を、ｎ個のＴＦＦ装置が外部から隔離された１つのシステムとして接続された多重ＴＦＦ連続濃縮装置に注入するステップ；及び
前記多重ＴＦＦ連続濃縮装置を用いてｎ個の濃縮工程を１つの閉鎖系内で連続的に行うステップ；
を含む、超高濃度エクソソーム溶液の調製方法（ここで、前記ｎは１～１０の整数である）。 - 前記ｎ個の連続濃縮工程後に得られた最終エクソソームの濃度は、原料溶液中のエクソソームの濃度の２５～５０ｎ倍であることを特徴とする、請求項１０に記載の超高濃度エクソソーム溶液の調製方法。
- 前記ｎ個の連続濃縮工程後に得られた最終エクソソームの濃度は、１０７～１０１３粒子／ｍＬであることを特徴とする、請求項１０に記載の超高濃度エクソソーム溶液の調製方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR20200032225 | 2020-03-16 | ||
| KR10-2020-0032225 | 2020-03-16 | ||
| PCT/KR2021/003265 WO2021187880A1 (ko) | 2020-03-16 | 2021-03-16 | 기능성 엑소좀 제조를 위한 십자류 여과장치의 새로운 용도 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2023517361A true JP2023517361A (ja) | 2023-04-25 |
| JP7444365B2 JP7444365B2 (ja) | 2024-03-06 |
Family
ID=77771727
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2022555153A Active JP7444365B2 (ja) | 2020-03-16 | 2021-03-16 | 機能性エクソソーム調製のためのクロスフロー濾過装置の新たな用途 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20230106258A1 (ja) |
| EP (1) | EP4122475A1 (ja) |
| JP (1) | JP7444365B2 (ja) |
| KR (1) | KR20210117192A (ja) |
| CN (1) | CN115297876A (ja) |
| WO (1) | WO2021187880A1 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114317227A (zh) * | 2021-11-18 | 2022-04-12 | 宁波甬恒瑶瑶智能科技有限公司 | 一种外泌体纯化方法及其一体机装置 |
| CN114317400A (zh) * | 2021-11-18 | 2022-04-12 | 宁波甬恒瑶瑶智能科技有限公司 | 外泌体分离纯化检测方法及装置 |
| CN114317226A (zh) * | 2021-11-18 | 2022-04-12 | 宁波甬恒瑶瑶智能科技有限公司 | 一种外泌体纯化方法及其装置 |
| CN116536244A (zh) * | 2022-01-25 | 2023-08-04 | 国药中生生物技术研究院有限公司 | 一种规模化制备高纯度外泌体的方法 |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004525916A (ja) | 2001-03-08 | 2004-08-26 | ターゲサム・インコーポレーテッド | 安定化された治療剤および撮像剤 |
| JP5186807B2 (ja) * | 2007-05-28 | 2013-04-24 | 株式会社日立プラントテクノロジー | 液体濃縮システム |
| EP2380905A1 (en) | 2010-04-19 | 2011-10-26 | Thrombotargets Europe, S.L. | Phospholipid-enriched vesicles bearing tissue factor having haemostatic activities and uses thereof |
| GB2552301A (en) | 2016-07-11 | 2018-01-24 | Evox Therapeutics Ltd | Metabolic drug loading of EVs |
| KR102063571B1 (ko) * | 2017-06-12 | 2020-01-09 | 성균관대학교산학협력단 | 다양한 세포로부터의 표면개질된 엑소좀의 제조방법 |
| KR101895916B1 (ko) * | 2017-08-11 | 2018-09-07 | 주식회사 엑소코바이오 | 엑소좀 및/또는 세포외 소포체 및 이를 포함하는 조성물의 제조 방법 |
| US20190391136A1 (en) * | 2018-02-21 | 2019-12-26 | Milad Riazifar | Establishing clinical-grade exosome bank by developing novel isolation, potency protocols, and a novel cryoprotectant solution |
| GB201809622D0 (en) * | 2018-06-12 | 2018-07-25 | Evox Therapeutics Ltd | Engineering extracellular vesicles for affinity purification |
| CN112566626A (zh) | 2018-08-10 | 2021-03-26 | 欧姆尼斯普兰特有限公司 | 用于吸入的细胞外囊泡 |
-
2021
- 2021-03-16 US US17/909,939 patent/US20230106258A1/en active Pending
- 2021-03-16 JP JP2022555153A patent/JP7444365B2/ja active Active
- 2021-03-16 EP EP21771706.5A patent/EP4122475A1/en active Pending
- 2021-03-16 KR KR1020210034313A patent/KR20210117192A/ko not_active Application Discontinuation
- 2021-03-16 WO PCT/KR2021/003265 patent/WO2021187880A1/ko unknown
- 2021-03-16 CN CN202180021678.6A patent/CN115297876A/zh active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP7444365B2 (ja) | 2024-03-06 |
| CN115297876A (zh) | 2022-11-04 |
| EP4122475A1 (en) | 2023-01-25 |
| KR20210117192A (ko) | 2021-09-28 |
| US20230106258A1 (en) | 2023-04-06 |
| WO2021187880A1 (ko) | 2021-09-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7444365B2 (ja) | 機能性エクソソーム調製のためのクロスフロー濾過装置の新たな用途 | |
| Zhong et al. | High-quality milk exosomes as oral drug delivery system | |
| Paganini et al. | Scalable production and isolation of extracellular vesicles: available sources and lessons from current industrial bioprocesses | |
| Schulz-Siegmund et al. | Nucleic acid delivery with extracellular vesicles | |
| EP3317397B1 (en) | Secretomes and method for producing secretomes | |
| JP2000500028A (ja) | 核酸の精製方法 | |
| CN113388122B (zh) | 一种正电性表面外泌体及其制备方法与用途 | |
| CN115197908A (zh) | 一种自然杀伤细胞来源外泌体的提取、修饰方法及其应用 | |
| WO2016082882A1 (en) | Secretomes and method for producing secretomes | |
| Agrawal et al. | A review of tangential flow filtration: process development and applications in the pharmaceutical industry | |
| Zou et al. | Current knowledge and future perspectives of exosomes as nanocarriers in diagnosis and treatment of diseases | |
| Liu et al. | Extracellular vesicles: powerful candidates in nano-drug delivery systems | |
| Antunes et al. | Separation of polysaccharide and protein by ionic liquid-based extraction techniques | |
| CN113416693A (zh) | 一种间充质干细胞外泌体的制备方法 | |
| Yang et al. | Extracellular vesicles and their engineering strategies, delivery systems, and biomedical applications | |
| WO2022250035A1 (ja) | 細胞外小胞の分離精製方法 | |
| CN107384873A (zh) | 重组腺病毒的纯化方法 | |
| CN116536244A (zh) | 一种规模化制备高纯度外泌体的方法 | |
| CN110025814B (zh) | 一种氧化石墨烯的用途、包含氧化石墨烯的敷料和抗肿瘤颗粒 | |
| Pi et al. | Method of Large-Scale Exosome Purification and Its Use for Pharmaceutical Applications | |
| Dehghani et al. | Stem Cell Therapy and Its Products Such as Exosomes: Modern Regenerative Medicine Approach | |
| CN113230414B (zh) | 一种用于精准靶向肺肿瘤细胞的生物纳米递药系统及其制备方法、应用 | |
| CN115340978B (zh) | 一种乳源外泌体的制备方法 | |
| Kawai-Harada et al. | Scalable Isolation of Surface-Engineered Extracellular Vesicles and Separation of Free Proteins via Tangential Flow Filtration and Size Exclusion Chromatography (TFF-SEC) | |
| JP2023018676A (ja) | 限外濾過によるエクソソームの濃縮 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20220913 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20230822 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20231121 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20240116 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20240209 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7444365 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |