CN114317226A - 一种外泌体纯化方法及其装置 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种外泌体纯化方法，包括S1二次两级切向流超滤、S2超滤液处理以及S3冻干处理，通过本发明制备获得的外泌体产品纯度高，且制备方法简单；本发明还提供了一种外泌体纯化装置，通过本发明的外泌体纯化装置以及方法可用于高纯度、高通量大规模工厂化样品的分离纯化生产，具有较高的商用价值与推广价值。

Description

一种外泌体纯化方法及其装置

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种一种外泌体纯化方法及其装置。

背景技术

2013年，诺贝尔生理或医学奖授予研究细胞囊泡运输调控机制领域研究的三位科学家，之后外泌体研究逐渐成为科研热点。外泌体(Exosome)是由活细胞分泌的直径约为30-150nm的小囊泡，具有典型的脂质双分子层结构，广泛存在于细胞培养上清液、血液、唾液、尿液、精液、羊水以及其它生物体液中。其携带有多种蛋白质、脂类、RNA等重要信息，在细胞与细胞间的物质和信息传递中起重要作用，可以调控细胞代谢、细胞凋亡以及免疫调节等作用，可作为医疗美容、再生医学、疾病诊断等行业，被誉为细胞治疗的下一个前沿领域。

目前，外泌体的分离富集提取方法主要靠人工操作，主要技术方法包括离心、沉淀、超滤、免疫亲和及微流控等，随着科学技术的发展和人们健康观念和追求美的观念的普及，外泌体市场需求变大，传统外泌体分离技术方法规模化提取分离与纯化受限产能不足，造成外泌体供不应求，因此外泌体规模化生产迫在眉睫。

由于当前外泌体分离提取多为人工操作，整个分离提取过程繁琐，历经时间较长，现有自动分离提取设备产量低，耗时长，成本高，难以满足市场需求。各外泌体商家迫切需要一套能够快速、大量获取高纯度外泌体制备平台。例如超速离心法，过程繁琐，耗时耗力，对操作人员经验依懒性强，收集结果重复性差，回收率低，限制了其在外泌体工业化生产和临床应用；亲和层析、离子交换层析等层析法具备一定的工业纯化生产中，虽然可对目标纯化物进行定量、浓度检测等，但受制于层析柱的对进料样品的PH、缓冲和电导率以及纯化物自身的等电点等参数要求，在工业化进程中具有一定的局限性；免疫磁珠法和微流控法成本较高，经济性差，技术要求较高，适于微量纯化操作，难以大规模制备等问题。

发明内容

本发明要解决的技术问题是一种外泌体纯化方法，以解决目前市面上常规外泌体纯化方法纯化过程繁琐、历时较长、成本高的问题。

为解决上述问题，本发明提供一种外泌体纯化方法，包括以下步骤：

S1二次两级切向超滤：将含有外泌体的待提取液通入第一级切向流超滤装置，将超滤后的目液体回收得到渗透液，将杂质截留，降低样品溶液中杂质的含量并能够进行除菌；之后将所述渗透液泵入第二级切向流超滤装置，回收过滤液得到富集液，富集外泌体；

所述第一级切向流超滤系统超滤膜的孔径大于所述第二级切向流超滤装置超滤膜的孔径，外泌体能够穿过第一级切向流超滤装置的滤膜。所述第二级切向流超滤装置内超滤膜的孔径小于所述外泌体直径，外泌体不能够穿过第二级切向流超滤装置的滤膜。二次两级切向流超滤系统是在pH7.6±0.6运行的。并且外泌体能够穿过第一级切向流超滤系统中的超滤膜，但是外泌体不能够穿过第二级切向流超滤系统中的超滤膜。第二级切向流超滤系统是在第一级切向流超滤系统下游运行；

S2富集液处理:将含有外泌体的富集液通入至快速蛋白液相色谱设备中进行层析处理后得到层析后的液体；

S3冻干:将层析后的液体进行冻干处理后得到冻干粉，完成外泌体的纯化。

作为优选的方案，所述步骤S1中，所述第一级切向流超滤装置超滤膜的孔径大于等于0.18μm，所述第二级切向流超滤装置超滤膜的孔径为小于等于0.03μm。

作为优选的方案，所述步骤S3的具体操作为：在富集液中加入赋形剂，之后将富集液装瓶后转入真空冷冻干燥机，冻干后得到冻干粉。

作为优选的方案，所述步骤S1中，层析处理的条件如下：层析柱选用亲和层析柱，平衡液为0.06M Tris-HCl，0.5M NaCl，PH7.9；洗脱液为0.06MTris-HCl，0.5M NaCl，0.6M咪唑，PH7.9；平衡4个柱床，洗脱1个柱床，流速为4mL/min。

作为优选的方案，所述步骤S1中，所述步骤S1中，所述含有外泌体的待提取液包括细胞培养基上清液、血液、尿液、唾液、羊水、尿液、精液中的一种或多种。

本发明的方法中，相对于超速离心、尺寸排阻色谱和免疫沉淀方法，超滤技术具有时间短，简单高效的优点，切向流超滤更加有效减少对外泌体的损伤，可用于高纯度、高通量大规模工厂化样品的分离纯化生产，本款设备通过二次两级切向流超滤，极大提高外泌体的分离纯度，具有缩短分析周期，提高分离纯化能力，增加灵敏度；通过2级不同孔径大小的切向流超滤，先将样本中的细胞、细胞碎片、凋亡小体过滤掉得到渗透液，然后将外泌体渗透液二次切向流超滤得到富集液，富集液冻干后得到纯度和回收率较高的外泌体冻干粉。

本发明要解决的另一个技术问题是：提供一种外泌体纯化一体化设备，以解决目前市面上常见外泌体纯化设备生产效率低，操作复杂的问题。并且该方法可以用来分离纯化来自细胞培养系统、尿液、血液等细胞培养基或者体液中的外泌体。

为解决上述问题，本发明提供一种外泌体纯化装置，包括通过管路连通的切向流超滤系统、快速蛋白液相色谱系统以及用于驱动的蠕动泵；所述切向流超滤系统包括相连通的第一级切向流超滤装置与第二级切向流超滤装置，所述第一级切向流超滤装置与第二级切向流超滤装置内均设置有超滤膜，且所述第一级切向流超滤装置的超滤膜孔径大于所述第二级切向流超滤装置的超滤膜孔径；所述第二级切向流超滤装置与所述快速蛋白液相色谱系统的进口相连接。

作为优选的方案，所述第一级切向流超滤装置上设置有第一级进口、第一级出口，所述第二级切向流超滤装置上设置有第二级进口、第二级出口，且所述第一级出口与所述第二级进口相连通。

作为优选的方案，所述快速蛋白液相色谱系统还与一冻干冷藏系统相连接。

作为优选的方案，所述冻干冷藏系统包括机械驱动装置、冷冻干燥机、低温仓储空间，且所述机械驱动装置用于将冷冻干燥机冷冻后的产品移动至低温仓储空间。

本发明所设计外泌体纯化装置可实现高通量、大规模、工厂化外泌体的提取分离富集，解决外泌体产能不足的问题，进而满足市场需求，具有较高的商用价值与推广价值。

附图说明

图1为本发明中外泌体纯化装置的结构示意图；

图2为本发明的工作原理示意图；

图3为本发明的工作过程图。

附图标记说明：

1、切向流超滤系统；11、第一级切向流超滤装置；111、第一级进口；112、第一级出口；12、第二级切向流超滤装置；121、第二级进口；122、第二级出口；2、快速蛋白液相色谱系统；3、冷冻干燥机；4、机械驱动装置；5、低温仓储空间。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施例做详细的说明。

实施例1：

本实施例提供外泌体纯化的具体方法：

S1二次切向超滤：将含有外泌体的带提取液通入第一级切向流超滤装置中，并通过第一级超滤膜，将超滤后的目液体回收得到渗透液，将杂质截留；之后将继续所述渗透液流经所述第二级切向流超滤装置中，经所述第二级切向流超滤装置的超滤膜孔径小于所述外泌体直径，将其截留，回收得到富集液；

所述第一级TFF超滤膜的孔径等于0.20μm，所述第二级TFF超滤膜的孔径等于0.01μm；

S2富集液处理：将缓冲液流动相经过真空抽滤或超声15min脱气处理以除去气泡；快速蛋白液相色谱设备的进口管从20％乙醇保护液先转移至去离子水泵冲洗，后转移至缓冲液泵冲洗，其流速0.7mL/min，泵压报警0.2MPa。

将富集液通入至快速蛋白质液相色谱设备中进行层析处理后得到层析后的液体；

本实施例中，层析柱选用亲和层析柱，平衡液为0.06M Tris-HCl，0.5MNaCl，PH7.9；洗脱液为0.06M Tris-HCl，0.5M NaCl，0.6M咪唑，PH7.9；平衡4个柱床，洗脱1个柱床，流速为4mL/min。

S3冻干:将富集液进行冻干处理后得到冻干粉，完成外泌体的纯化。冻干冷藏系统由一个冷冻干燥机、机械臂、低温仓储组成(图中未标示)。将层析液在冷冻干燥机里进行冻干，由机械臂分装到西林瓶里，然后再由机械臂转移到低温仓储里面。低温仓储自带仓满报警系统。

实施例2：

本实施例提供外泌体纯化的具体方法：

S1二次切向超滤：将含有外泌体的带提取液通入第一级切向流超滤装置中，并通过第一级超滤膜，将超滤后的目液体回收得到渗透液，将杂质截留；之后将继续所述渗透液流经所述第二级切向流超滤装置中，经所述第二级切向流超滤装置的超滤膜孔径大于所述外泌体，将其截留，回收得到的富集液；

所述第一级TFF超滤膜的孔径等于0.19μm，所述第二级TFF超滤膜的孔径等于0.02μm；

S2富集液处理：将缓冲液流动相经过真空抽滤或超声15min脱气处理以除去气泡；将完成装柱的亲和层析柱安装在快速蛋白液相色谱设备上，快速蛋白液相色谱设备的进口管从20％乙醇保护液先转移至去离子水泵冲洗，后转移至缓冲液泵冲洗，其流速0.7mL/min，泵压报警0.2MPa。

将富集液通入至快速蛋白液相色谱设备中进行层析处理后得到层析后的液体；

本实施例中，层析柱选用亲和层析柱，平衡液为0.06M Tris-HCl，0.5MNaCl，PH7.9；洗脱液为0.06M Tris-HCl，0.5M NaCl，0.6M咪唑，PH7.9；平衡4个柱床，洗脱1个柱床，流速为4mL/min。

S3冻干:将富集液进行冻干处理后得到冻干粉，完成外泌体的纯化。冻干冷藏系统由一个冷冻干燥机、机械臂、低温仓储组成(图中未标示)。将层析液在冷冻干燥机里进行冻干，由机械臂分装到西林瓶里，然后再由机械臂转移到低温仓储里面。低温仓储自带仓满报警系统。

实施例3：

本实施例提供外泌体纯化的具体方法：

S1二次切向超滤：将含有外泌体的带提取液通入第一级切向流超滤装置中，并通过第一级超滤膜，将超滤后的目液体回收得到渗透液，将杂质截留；之后将继续所述渗透液流经所述第二级切向流超滤装置中，经所述第二级切向流超滤装置的超滤膜孔径小于所述外泌体直径，将其截留，回收得到的富集液；

所述第一级TFF超滤膜的孔径等于0.18μm，所述第二级TFF超滤膜的孔径等于0.03μm；

S2富集液处理：将缓冲液流动相经过真空抽滤或超声15min脱气处理以除去气泡；快速蛋白液相色谱设备的进口管从20％乙醇保护液先转移至去离子水泵冲洗，后转移至缓冲液泵冲洗，其流速0.7mL/min，泵压报警0.2MPa。

将富集液通入至快速蛋白液相色谱设备中进行层析处理后得到层析后的液体；

本实施例中，层析柱选用亲和层析柱，平衡液为0.06M Tris-HCl，0.5MNaCl，PH7.9；洗脱液为0.06M Tris-HCl，0.5M NaCl，0.6M咪唑，PH7.9；平衡4个柱床，洗脱1个柱床，流速为4mL/min。

S3冻干:将富集液进行冻干处理后得到冻干粉，完成外泌体的纯化。冻干冷藏系统由一个冷冻干燥机、机械臂、低温仓储组成(图中未标示)。将层析液在冷冻干燥机里进行冻干，由机械臂分装到西林瓶里，然后再由机械臂转移到低温仓储里面。低温仓储自带仓满报警系统。

实施例4：

本实施例提供了外泌体纯化一体化设备，具体包括通过管路依次相连通的切向流超滤系统1、快速蛋白液相色谱系统2以及用于驱动的蠕动泵；所述蠕动泵用于驱动设备内部液体的流动；通过加入含有外泌体的待提取液至设备中，待提取液依次流经切向流超滤系统1、快速蛋白液相色谱系统2、纳米颗粒示踪分析系统完成外泌体的纯化；

所述切向流超滤系统1包括相连通的第一级切向流超滤装置2与第二级切向流超滤装置12，所述第一级切向流超滤装置2上设置有第一级进口111、第一级出口112，所述第二级切向流超滤装置12上设置有第二级进口121、第二级出口122，且所述第一级出口112与所述第二级进口121相连通，使得通入的待提取液先进入至第一级切向流超滤装置2进行超滤，之后流入到第二级切向流超滤装置12中进行再次地超滤；

所述第一级切向流超滤装置2与第二级切向流超滤装置12内均设置有超滤膜，且所述第一级切向流超滤系统1超滤膜的孔径大于所述第二级切向流超滤系统1超滤膜的孔径；且第二级切向流超滤系统1超滤膜的孔径小于通入的待提取液中外泌体的直径；

所述第二级切向流超滤装置12与所述快速蛋白液相色谱系统2的进口相连接；

所述快速蛋白液相色谱系统2还与一冻干冷藏系统相连接，所述冻干冷藏系统包括机械驱动装置4、冷冻干燥机3、低温仓储空间5，且所述机械驱动装置4用于将冷冻干燥机3冷冻后的产品移动至低温仓储空间5。

虽然本公开披露如上，但本公开的保护范围并非仅限于此。本领域技术人员，在不脱离本公开的精神和范围的前提下，可进行各种变更与修改，这些变更与修改均将落入本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种外泌体纯化方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1二次两级切向超滤：将含有外泌体的提取液通入第一级切向流超滤装置，将超滤后的液体回收得到渗透液，将杂质截留，降低样品溶液中杂质的含量并能够进行除菌；之后将所述渗透液泵入第二级切向流超滤装置，回收过滤液后得到富集液；

所述第一级切向流超滤装置的超滤膜孔径大于所述第二级切向流超滤装置的超滤膜孔径，使得外泌体能够穿过第一级切向流超滤装置的滤膜；所述第二级切向流超滤装置内超滤膜的孔径小于所述外泌体，使得外泌体无法够穿过第二级切向流超滤装置的滤膜；

S2富集液处理:将步骤S1处理后得到的富集液通入至快速蛋白液相色谱设备中进行层析处理后得到层析后的液体；

S3冻干:将富集液进行冻干处理后得到冻干粉，完成外泌体的纯化。

2.根据权利要求1所述的外泌体纯化方法，其特征在于：所述步骤S2中，所述第一级切向流超滤装置超滤膜的孔径大于等于0.18μm，所述第二级切向流超滤装置超滤膜的孔径小于等于0.03μm。

3.根据权利要求1所述的外泌体纯化方法，其特征在于：所述步骤S3的具体操作为：在富集液中加入赋形剂，之后将富集液装瓶后转入真空冷冻干燥机，冻干后得到冻干粉。

4.根据权利要求1所述的外泌体纯化方法，其特征在于：所述步骤S2中，所述层析处理的条件如下：层析柱选用亲和层析柱，平衡液为0.06M Tris-HCl，0.5M NaCl，PH7.9；洗脱液为0.06M Tris-HCl，0.5M NaCl，0.6M咪唑，PH7.9；平衡4个柱床，洗脱1个柱床，流速为4mL/min。

5.根据权利要求1所述的外泌体纯化方法，其特征在于：所述步骤S1中，所述含有外泌体的待提取液包括细胞培养基上清液、血液、尿液、唾液、羊水、尿液、精液中的一种或多种。

6.一种外泌体纯化装置，其特征在于：包括通过管路连通的切向流超滤系统(1)、快速蛋白液相色谱系统(2)以及用于驱动的蠕动泵；所述切向流超滤系统(1)包括相连通的第一级切向流超滤装置(11)与第二级切向流超滤装置(12)，所述第一级切向流超滤装置(11)与第二级切向流超滤装置(12)内均设置有超滤膜，且所述第一级切向流超滤装置(11)的超滤膜孔径大于所述第二级切向流超滤装置(12)的超滤膜孔径；所述第二级切向流超滤装置(12)与所述快速蛋白液相色谱系统(2)的进口相连接。

7.根据权利要求6所述的一种外泌体纯化装置，其特征在于：所述第一级切向流超滤装置上设置有第一级进口(111)、第一级出口(112)，所述第二级切向流超滤装置上设置有第二级进口(121)、第二级出口(122)，且所述第一级出口(112)与所述第二级进口(121)相连通。

8.根据权利要求6所述的一种外泌体纯化装置，其特征在于：所述快速蛋白液相色谱系统(2)还与一冻干冷藏系统相连接。

9.根据权利要求8所述的一种外泌体纯化装置，其特征在于：所述冻干冷藏系统包括机械驱动装置(4)、冷冻干燥机(3)、低温仓储空间(5)，且所述机械驱动装置(4)用于将冷冻干燥机(3)冷冻后的产品移动至低温仓储空间(5)。

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