JPWO2007049752A1 - Rnaウイルスまたはdnaウイルスのスパイクタンパク質でシュードタイプ化したレンチウイルスベクターを用いた気道上皮幹細胞への遺伝子導入 - Google Patents
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Abstract
Description
〔1〕 RNAウイルスまたはDNAウイルスのスパイクタンパク質でシュードタイプ化されている、気道上皮幹細胞へ遺伝子を導入するためのレンチウイルスベクター、
〔2〕 RNAウイルスが気道系組織に感染するRNAウイルスである、〔1〕に記載のレンチウイルスベクター、
〔3〕 RNAウイルスがマイナス鎖RNAウイルスである、〔1〕に記載のレンチウイルスベクター、
〔4〕 マイナス鎖RNAウイルスがパラミクソウイルスである、〔3〕に記載のレンチウイルスベクター、
〔5〕 パラミクソウイルスがセンダイウイルスである、〔4〕に記載のレンチウイルスベクター、
〔6〕 マイナス鎖RNAウイルスがオルソミクソウイルスである、〔3〕に記載のレンチウイルスベクター、
〔7〕 オルソミクソウイルスがインフルエンザウイルスである、〔6〕に記載のレンチウイルスベクター、
〔8〕 マイナス鎖RNAウイルスがフィロウイルスである、〔3〕に記載のレンチウイルスベクター、
〔9〕 フィロウイルスがエボラ出血熱ウイルスである、〔8〕に記載のレンチウイルスベクター、
〔10〕 RNAウイルスがプラス鎖RNAウイルスである、〔1〕に記載のレンチウイルスベクター、
〔11〕 プラス鎖RNAウイルスがコロナウイルスである、〔10〕に記載のレンチウイルスベクター、
〔12〕 コロナウイルスがSARSコロナウイルスである、〔11〕に記載のレンチウイルスベクター、
〔13〕 DNAウイルスが気道系組織に感染するDNAウイルスである、〔1〕に記載のレンチウイルスベクター、
〔14〕 DNAウイルスがバキュロウイルスである、〔13〕に記載のレンチウイルスベクター、
〔15〕 レンチウイルスベクターが組み換えサル免疫不全ウイルスベクターである、〔1〕から〔14〕のいずれかに記載のレンチウイルスベクター、
〔16〕 組み換えサル免疫不全ウイルスベクターがagm株由来である、〔15〕に記載のレンチウイルスベクター、
〔17〕 組み換えサル免疫不全ウイルスベクターが自己不活性化型である、〔15〕または〔16〕に記載のレンチウイルスベクター、
〔18〕 レンチウイルスベクターがウマ伝染性貧血ウイルスベクター、ヒト免疫不全ウイルス1および2ベクター、またはネコ免疫不全ウイルスベクターである、〔1〕から〔14〕のいずれかに記載のレンチウイルスベクター、
〔19〕 外来遺伝子を発現可能に保持する、〔1〕から〔18〕のいずれかに記載のレンチウイルスベクター、
〔20〕 外来遺伝子が、グリーン蛍光タンパク質、ベータ−ガラクトシダーゼおよびルシフェラーゼから選ばれるタンパク質をコードする遺伝子である、〔19〕に記載のレンチウイルスベクター、
〔21〕 外来遺伝子が、先天的、あるいは後天的に機能不全になっているタンパク質をコードする遺伝子である、〔19〕に記載のレンチウイルスベクター、
〔22〕 外来遺伝子が、先天的、あるいは後天的に機能不全になっている嚢胞性線維症(CF)原因因子をコードする遺伝子である、〔19〕に記載のレンチウイルスベクター、
〔23〕 外来遺伝子が、先天的、あるいは後天的に機能不全になっているCFTR(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator)タンパク質をコードする遺伝子である、〔19〕に記載のレンチウイルスベクター、
〔24〕 外来遺伝子が、嚢胞性線維症に対して治療効果のあるタンパク質をコードする遺伝子である、〔19〕に記載のレンチウイルスベクター、
〔25〕 外来遺伝子が、遺伝性の疾患で機能不全になっているタンパク質をコードする遺伝子である、〔19〕に記載のレンチウイルスベクター、
〔26〕 遺伝性の疾患で機能不全になっているタンパク質が、CFTRをコードする遺伝子である、〔25〕に記載のレンチウイルスベクター、
〔27〕 〔1〕から〔26〕のいずれかに記載のレンチウイルスベクターを、気道上皮細胞に接触させる工程を含む、気道上皮幹細胞に遺伝子を導入する方法、
〔28〕 〔1〕から〔26〕のいずれかに記載のレンチウイルスベクターが導入された気道上皮幹細胞、
〔29〕 〔1〕から〔26〕のいずれかに記載のレンチウイルスベクターを有効成分として含有する、気道上皮幹細胞用遺伝子導入剤、
〔30〕 疾患治療に必要なタンパク質を供給するために、肺を生産組織として利用することを特徴とする、〔29〕に記載の気道上皮幹細胞用遺伝子導入剤、
〔31〕 〔1〕から〔26〕のいずれかに記載のレンチウイルスベクターを有効成分として含有する、遺伝性呼吸器疾患治療剤、
〔32〕 遺伝性呼吸器疾患が嚢胞性線維症である、〔31〕に記載の治療剤、
に関する。
ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus; HIV);
(例えばHIV1またはHIV2)、
サル免疫不全ウイルス(simian immunodeficiency virus; SIV)、
ネコ免疫不全ウイルス(feline immunodeficiency virus ; FIV)、
マエディ・ビスナウイルス(Maedi-Visna-like virus ; EV1)、
ウマ伝染性貧血ウイルス(equine infectious anemia virus ; EIAV)、
ヤギ関節炎脳炎ウイルス(caprine arthritis encephalitis virus ;CAEV)
「DNAウイルスのスパイクタンパク質でシュードタイプ化されている、レンチウイルスべクター」とは、DNAウイルスのスパイクタンパク質を有するレンチウイルスベクターをいう。また、該レンチウイルスベクターの天然型が保持していない1つまたはそれ以上のDNAウイルスのスパイクタンパク質を保持しているレンチウイルスベクターをいう。
ラッサウイルスなどのアレナウイルス科(Arenaviridae)
インフルエンザウイルスなどのオルソミクソウイルス科(Orthomyxoviridae)
SARSコロナウイルスなどのコロナウイルス科(Coronaviridae)
風疹ウイルスなどのトガウイルス科(Togaviridae)
ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、センダイウイルス、RSウイルスなどのパラミクソウイルス科(Paramyxoviridae)
ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、エコーウイルスなどのピコルナウイルス科(Picornaviridae)
マールブルグウイルス、エボラ出血熱ウイルスなどのフィロウイルス科(Filoviridae)
黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、C型肝炎ウイルス、G型肝炎ウイルスなどのフラビウイルス科(Flaviviridae)
ブンヤウイルス科(Bunyaviridae)
狂犬病ウイルスなどのラブドウイルス科(Rhabdoviridae)
レオウイルス科(Reoviridae)
SARSウイルスなどのコロナウイルス科(Coronaviridae)
ノロウイルスなどのカリシウイルス科(Caliciviridae)
ピコルナウイルス科(Picornaviridae)
アストロウイルスなどのアストロウイルス科(Astroviridae)
トガウイルス科(Togaviridae)
フラビウイルス科(Flaviviridae)
ヒト免疫不全ウイルスなどのレトロウイルス科(Retroviridae)
ブンヤウイルス科(Bunyaviridae)
パラミクソウイルス属 NP P/C/V M F HN - L
ルブラウイルス属 NP P/V M F HN (SH) L
モービリウイルス属 NP P/C/V M F H - L
インフルエンザAウイルス属 PB2・PB1・PA・HA・NP・NA・M1+M2・NS1+NS2
インフルエンザBウイルス属 PB2・PB1・PA・・HA・NP・NA+NB・M1+M2・NS1+NS2
インフルエンザCウイルス属 PB2・PB1・P3 (PA)・HE (HA)・NP・M・NS1+NS2
トゴトウイルス属 PB2・PB1・PA・GP-75 (THOV)・GP-64 (DHOV)・NP・M
1)ヒトにおいて後天性免疫不全症候群(acquired immune deficiency syndrome, AIDS)の原因となるHIV-1とチンパンジーより分離されたSIVcpzを含むHIV-1グループ、
2)スーティーマンガベイ Cercocebus atys より分離されたSIVsmmとアカゲザル Macaca mulatta より分離されたSIVmac、およびヒトに対し低頻度ではあるが病原性を示すHIV-2(Jaffar, S. et al., J. Acquir. Immune Defic. Syndr. Hum. Retrovirol., 16(5), 327-32, 1997)よりなるHIV-2グループ、
3)アフリカミドリザル Cercopithecus aethiops から分離されたSIVagmに代表されるSIVagmグループ、
4)マンドリル Papio sphinx から分離されたSIVmndに代表されるSIVmndグループ
からなっている。
例えば、嚢胞性線維症(CF)の場合は、先天的あるいは後天的に機能不全になっている嚢胞性線維症原因因子(タンパク質)をコードする遺伝子、好ましくは先天的あるいは後天的に機能不全になっているCFTR(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator)タンパク質をコードする遺伝子を挙げることができる。
あるいは本発明における外来遺伝子としては、遺伝性の疾患で機能不全になっているタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。例えば、CFTRタンパク質をコードする遺伝子を挙げることができる。
(1)細胞質側領域置換型HN発現プラスミドの構築
HN蛋白の細胞質側領域をSIVエンベロープ蛋白の細胞質側領域に置換したHN発現プラスミドを構築した(図1)。3組の合成オリゴヌクレオチド(Xho+Xma/Xma-Xho、Xma+131/135-Xma、132+Bam/Bam-136)をアニーリング後、順にpBluescript KS+ (Stratagene) のXhoI-BamHI部位へ組み込んだ。pCAGGS (Gene, vol.108, pp.193-200, 1991) のXhoI-Bsu36I部位に前記組み換えプラスミドをXhoIとDraIIIで切断した合成オリゴヌクレオチド連結断片を精製したもの、HN蛋白発現プラスミドpCAGGS-HNをDraIIIとBsu36Iで切断したHN蛋白3'側を含む断片を精製したものを組み込んだ。以上の方法により得られたプラスミドをSIV細胞質側領域置換型HN発現プラスミドpCAGGS-SIVct/HNとした。
SIVエンベロープ蛋白の細胞質側領域をHN蛋白に付加したHN発現プラスミドを構築した(図2)。SIVエンベロープ蛋白の細胞質側と一部のHN蛋白を含む領域を上記細胞質側領域置換型HN発現プラスミドをテンプレートとし、プライマーFSIVhnおよびRhnSIVを用いたPCRにより増幅した。増幅断片をXhoIおよびAccIにより切断後、上記(1)にて作製した3組の合成オリゴヌクレオチドを組み込んだpBluescript KS+(Stratagene)のXhoI-AccI部位へ組み、SIVエンベロープの細胞質側領域を含む断片と置換した。この組み換えプラスミドをXhoIとDraIIIで切断した合成オリゴヌクレオチド連結断片を精製したもの、HN蛋白発現プラスミドpCAGGS-HNをDraIIIとBsu36Iで切断したHN蛋白3’側を含む断片をpCAGGS(Gene,vol.108,pp.193-200,1991)のXhoI-Bsu36I部位に組み込んだ。以上の方法により得られたプラスミドをSIV細胞質側領域付加型HN発現プラスミドpCAGGS-SIVct+HNとした。
F蛋白細胞質側領域のアミノ酸を5'側より27、14および4個残し、それぞれ15、28および38個のアミノ酸を欠失させたF蛋白発現プラスミドを構築した(図3)。F蛋白の全領域をpBluescript KS+ (Stratagene) のSmaI部位へ組み込んだプラスミドpBluescript KS+/SmaI/Fをテンプレートとし、15、28および38アミノ酸欠失型をそれぞれプライマーXhFFとNotF1650、NotF1611およびNotF1581を用いたPCRにより増幅した。増幅断片をXhoIおよびNotIにより切断後、pCAGGS (Gene, vol.108, pp.193-200, 1991) のEcoRI部位にXhoI/NotIリンカーを組み込んだプラスミドのXhoI-NotI部位に組み、プラスミド (15アミノ酸欠失型:pCAGGS-Fct27、28アミノ酸欠失型:pCAGGS-Fct14および38アミノ酸欠失型:pCAGGS-Fct4) を構築した。pCAGGS-Fct4をシュードタイプ化SIVベクターに使用した。
細胞質側領域欠失型F蛋白 (F蛋白細胞質側領域のアミノ酸数は(3)で作製したプラスミドと同数) にSIV細胞質側領域5'側より11アミノ酸 (SIVct11) を付加したプラスミドを構築した(図4)。F蛋白の全領域をpBluescript KS+ (Stratagene) のSmaI部位へ組み込んだプラスミドpBluescript KS+/SmaI/Fをテンプレートとし、上記3種のアミノ酸欠失型にSIV細胞質側領域を付加したものをそれぞれプライマーXhFFとSA-F1650、SA-F1611およびSA-F1581を用いたPCRにより増幅した。増幅断片をXhoIおよびNotIにより切断後、pCAGGS (Gene, vol.108, pp.193-200, 1991) のEcoRI部位にXhoI/NotIリンカーを組み込んだプラスミドのXhoI-NotI部位に組み、プラスミド (SIVct11付加15アミノ酸欠失型:pCAGGS-Fct27/SIVct11、SIVct11付加28アミノ酸欠失型:pCAGGS-Fct14/SIVct11およびSIVct11付加38アミノ酸欠失型:pCAGGS-Fct4/SIVct11) を構築した。
FSIVhn: 5'-GAGACTCGAGATGTGGTCTGAGTTAAAAATCAGG-3'(配列番号:9)
RhnSIV: 5'-AGAGGTAGACCAGTACGAGTCACGTTTGCCCCTATCACCATCCCTAACCCTCTGTCCATAAAC-3'(配列番号:10)
XhFF: 5'-CCGCTCGAGCATGACAGCATATATCCAGAGA-3'(配列番号:11)
NotF1650: 5'-ATAGTTTAGCGGCCGCTCATCTGATCTTCGGCTCTAATGT-3'(配列番号:12)
NotF1611: 5'-ATAGTTTAGCGGCCGCTCAACGGTCATCTGGATTACCCAT-3'(配列番号:13)
NotF1581: 5'-ATAGTTTAGCGGCCGCTCACCTTCTGAGTCTATAAAGCAC-3'(配列番号:14)
SA-F1650: 5'-ATAGTTTAGCGGCCGCCTATGGAGATAGAGGAACATATCCCTGCCTAACCCTTCTGATCTTCGGCTCTAATGT-3'(配列番号:15)
SA-F1611: 5'-ATAGTTTAGCGGCCGCCTATGGAGATAGAGGAACATATCCCTGCCTAACCCTACGGTCATCTGGATTACCCAT-3'(配列番号:16)
SA-F1581: 5'-ATAGTTTAGCGGCCGCCTATGGAGATAGAGGAACATATCCCTGCCTAACCCTCCTTCTGAGTCTATAAAGCAC-3'(配列番号:17)
eGFPを搭載したF/HNシュードタイプ化SIVベクター(n=3、一頭あたり4 x 10e8 TU; 100マイクロリットル)を細いカテーテルを用いてマウス鼻腔;左鼻孔に、pre-conditioningなしに、投与した。導入遺伝子の発現期間をDay-3からDay-360までとし、マウス鼻腔断面の解剖学的な解析はMeryら(Mery et al. Toxicol. Pathol. Vol. 22, p353-372, 1994)の方法に従った。マウス鼻骨先端から1 〜 4 mm (距離で1, 2, 3, 4 mmの断面) の鼻腔断面におけるGFP発現を評価した。
Claims (32)
- RNAウイルスまたはDNAウイルスのスパイクタンパク質でシュードタイプ化されている、気道上皮幹細胞へ遺伝子を導入するためのレンチウイルスベクター。
- RNAウイルスが気道系組織に感染するRNAウイルスである、請求項1に記載のレンチウイルスベクター。
- RNAウイルスがマイナス鎖RNAウイルスである、請求項1に記載のレンチウイルスベクター。
- マイナス鎖RNAウイルスがパラミクソウイルスである、請求項3に記載のレンチウイルスベクター。
- パラミクソウイルスがセンダイウイルスである、請求項4に記載のレンチウイルスベクター。
- マイナス鎖RNAウイルスがオルソミクソウイルスである、請求項3に記載のレンチウイルスベクター。
- オルソミクソウイルスがインフルエンザウイルスである、請求項6に記載のレンチウイルスベクター。
- マイナス鎖RNAウイルスがフィロウイルスである、請求項3に記載のレンチウイルスベクター。
- フィロウイルスがエボラ出血熱ウイルスである、請求項8に記載のレンチウイルスベクター。
- RNAウイルスがプラス鎖RNAウイルスである、請求項1に記載のレンチウイルスベクター。
- プラス鎖RNAウイルスがコロナウイルスである、請求項10に記載のレンチウイルスベクター。
- コロナウイルスがSARSコロナウイルスである、請求項11に記載のレンチウイルスベクター。
- DNAウイルスが気道系組織に感染するDNAウイルスである、請求項1に記載のレンチウイルスベクター。
- DNAウイルスがバキュロウイルスである、請求項13に記載のレンチウイルスベクター。
- レンチウイルスベクターが組み換えサル免疫不全ウイルスベクターである、請求項1から14のいずれかに記載のレンチウイルスベクター。
- 組み換えサル免疫不全ウイルスベクターがagm株由来である、請求項15に記載のレンチウイルスベクター。
- 組み換えサル免疫不全ウイルスベクターが自己不活性化型である、請求項15または16に記載のレンチウイルスベクター。
- レンチウイルスベクターがウマ伝染性貧血ウイルスベクター、ヒト免疫不全ウイルス1ベクター、ヒト免疫不全ウイルス2ベクター、またはネコ免疫不全ウイルスベクターである、請求項1から14のいずれかに記載のレンチウイルスベクター。
- 外来遺伝子を発現可能に保持する、請求項1から18のいずれかに記載のレンチウイルスベクター。
- 外来遺伝子が、グリーン蛍光タンパク質、ベータ−ガラクトシダーゼおよびルシフェラーゼから選ばれるタンパク質をコードする遺伝子である、請求項19に記載のレンチウイルスベクター。
- 外来遺伝子が、先天的、あるいは後天的に機能不全になっているタンパク質をコードする遺伝子である、請求項19に記載のレンチウイルスベクター。
- 外来遺伝子が、先天的、あるいは後天的に機能不全になっている嚢胞性線維症(CF)原因因子をコードする遺伝子である、請求項19に記載のレンチウイルスベクター。
- 外来遺伝子が、先天的、あるいは後天的に機能不全になっているCFTRタンパク質をコードする遺伝子である、請求項19に記載のレンチウイルスベクター。
- 外来遺伝子が、嚢胞性線維症に対して治療効果のあるタンパク質をコードする遺伝子である、請求項19に記載のレンチウイルスベクター。
- 外来遺伝子が、遺伝性の疾患で機能不全になっているタンパク質をコードする遺伝子である、請求項19に記載のレンチウイルスベクター。
- 遺伝性の疾患で機能不全になっているタンパク質が、CFTRをコードする遺伝子である、請求項25に記載のレンチウイルスベクター。
- 請求項1から26のいずれかに記載のレンチウイルスベクターを、気道上皮細胞に接触させる工程を含む、気道上皮幹細胞に遺伝子を導入する方法。
- 請求項1から26のいずれかに記載のレンチウイルスベクターが導入された気道上皮幹細胞。
- 請求項1から26のいずれかに記載のレンチウイルスベクターを有効成分として含有する、気道上皮幹細胞用遺伝子導入剤。
- 疾患治療に必要なタンパク質を供給するために、肺を生産組織として利用することを特徴とする、請求項29に記載の気道上皮幹細胞用遺伝子導入剤。
- 請求項1から26のいずれかに記載のレンチウイルスベクターを有効成分として含有する、遺伝性呼吸器疾患治療剤。
- 遺伝性呼吸器疾患が嚢胞性線維症である、請求項31に記載の治療剤。
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