JP2023513749A - 心疾患を治療するための遺伝子療法ベクター - Google Patents

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Abstract

本開示は、心疾患の治療または予防に有用な方法および組成物を提供する。特に、本開示は、心疾患、例えば心筋症の治療または予防のための治療用遺伝子産物に動作可能に連結された改変トロポニンＴプロモーターを含むベクターを提供する。遺伝子産物はＭＹＢＰＣ３であってもよい。本開示はまた、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオン、ｒＡＡＶウイルスゲノム、およびその発現カセットおよび医薬組成物を提供する。本開示はさらに、心疾患などの疾患または障害を治療する方法を提供する。【選択図】図２Ａ

Description

関連出願への相互参照
本出願は、２０２０年７月２日に出願された米国仮出願番号第６３／０４７，６３３号、２０２０年２月１３日に出願された米国仮出願番号第６２／９７６，１６０号に対する優先権の利益を主張するものであり、その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
技術分野
本開示は、対象における心疾患（例えば、心筋症）の治療または予防のための組成物および方法に関する。特に、本開示は、心疾患（例えば、心筋症）の治療のための治療用遺伝子産物に連結された心臓特異的プロモーター操作性を含むベクターに関する。
配列表への参照
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に出願されており、．ｔｘｔ形式の電子的に提出された配列表を含む。．ｔｘｔファイルには、２０２１年２月９日に作成された８２４キロバイトのサイズの“ＴＥＮＡ＿０１５＿０２ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ”という名称の配列表が含まれている。この．ｔｘｔファイルに含まれる配列リストは、本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
背景
心疾患の治療のための遺伝子療法アプローチは、心臓細胞を効果的に形質導入し、心臓組織特異的な様式で導入遺伝子を発現するように構成されたベクターを用いることが多い。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、心臓特異的プロモーター、またはその両方を組み合わせて使用して、遺伝子産物（例えば、治療用タンパク質）をコードするポリヌクレオチドを心臓組織に送達し、それによって、その組織に遺伝子産物を発現させて、心疾患を治療することができる。心臓特異的プロモーターには、デスミン（Ｄｅｓ）、アルファ－ミオシン重鎖（α－ＭＨＣ）、ミオシン軽鎖２（ＭＬＣ－２）、および心臓トロポニンＣ（ＴＮＮＣ１またはｃＴｎＣ）プロモーターおよび６００塩基対の心臓トロポニンＴ（ＴＮＮＴ２）プロモーターが含まれる。しかしながら、大きなタンパク質をコードするポリヌクレオチドの送達は、部分的にはウイルスベクターのパッケージング限界のため、依然として困難である。
これらの課題を考慮すると、心臓疾患のための遺伝子療法ベクターの改善に対する当技術分野のニーズが依然としてある。
概要
本開示は、概して、心疾患（例えば、心筋症）の治療または予防のための組成物および方法に関する。第一の態様では、本開示は、例えば心筋症などの心疾患の予防の治療のための治療用遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドに操作可能に連結されたプロモーター、任意選択的に心臓特異的プロモーターを含むベクターを提供する。ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであってもよい。
一部の態様では、本開示は、３００ｂｐ～５００ｂｐを有するポリヌクレオチドを含む、心臓トロポニンＴプロモーターを提供する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１～８５のいずれか一つと少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも１００％の同一性を共有する配列を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１と少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも１００％の同一性を共有する配列を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号３と少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも１００％の同一性を共有する配列を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、トロポニンＴ遺伝子の転写開始部位の上流で、それを含むゲノムポリヌクレオチド配列と、少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を共有する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、トロポニンＴ遺伝子の転写開始部位に対して－４５０ｂｐ～＋１ｂｐのゲノムポリヌクレオチド配列と、少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を共有する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、トロポニンＴ遺伝子の転写開始部位に対して－３５０ｂｐ～＋１ｂｐのゲノムポリヌクレオチド配列と、少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を共有する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、トロポニンＴ遺伝子の転写開始部位に対して－２５０ｂｐ～＋１ｂｐのゲノムポリヌクレオチド配列と、少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を共有する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、トロポニンＴ遺伝子の転写開始部位に対して－４５０ｂｐ～＋５０ｂｐのゲノムポリヌクレオチド配列と、少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を共有する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、トロポニンＴ遺伝子の転写開始部位に対して－３５０ｂｐ～＋５０ｂｐのゲノムポリヌクレオチド配列と、少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を共有する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、トロポニンＴ遺伝子の転写開始部位に対して－２５０ｂｐ～＋５０ｂｐのゲノムポリヌクレオチド配列と、少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を共有する。一部の実施形態では、トロポニンＴ遺伝子はヒトトロポニンＴ遺伝子である。
一部の実施形態では、プロモーターは筋特異的プロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターは心臓細胞特異的プロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターは、心筋細胞特異的プロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターは、約６００ｂｐの天然トロポニンＴプロモーターと同じ細胞型特異性を有する。一部の実施形態では、本明細書に記載されるプロモーターは、配列番号１を含む参照プロモーターと同じ細胞型特異性を有する。一部の実施形態では、プロモーターは、天然トロポニンＴプロモーターよりも少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％多い、それと動作可能に連結された遺伝子産物を発現する。一部の実施形態では、本明細書に記載のプロモーターは、配列番号１を含む参照プロモーターよりも少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％多く動作可能に連結された遺伝子産物を発現する。
一部の態様では、本開示は、遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドに動作可能に連結された本明細書に記載のプロモーターのいずれか一つを含むベクターを提供する。いくつかの実施形態では、ベクターはウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）である。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、最大で約５．５ｋｂのパッケージング限界を有する。
一部の実施形態では、遺伝子産物は、ＭＹＢＰＣ３、ＫＣＮＨ２、ＴＲＰＭ４、ＤＳＧ２およびＡＴＰ２Ａ２タンパク質から選択される。一部の実施形態では、遺伝子産物はＣＡＣＮＡ１Ｃ、ＤＭＤ、ＤＭＰＫ、ＥＰＧ５、ＥＶＣ、ＥＶＣ２、ＦＢＮ１、ＮＦ１、ＳＣＮ５Ａ、ＳＯＳ１、ＮＰＲ１、ＥＲＢＢ４、ＶＩＰおよびＭＹＨ７タンパク質から選択される。一部の実施形態では、遺伝子産物は、任意でＳｐＣａｓ９、Ｓｔ１Ｃａｓ９およびＳａＣａｓ９から選択されるＣａｓ９である。
一部の実施形態では、本明細書に記載のベクターは、第二の遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、第二の遺伝子産物は機能性ＲＮＡ、任意選択的にマイクロＲＮＡまたはガイドＲＮＡである。
一部の態様では、本開示は、本明細書に記載されるプロモーターのいずれか一つを含む単離細胞を提供する。一部の実施形態では、単離細胞は、人工多能性幹細胞または単離された心筋細胞である。
一部の態様では、本開示は、本明細書に記載のベクターのいずれか一つを含む医薬組成物を提供する。
一部の態様では、本開示は、本明細書に記載される単離された細胞のいずれか一つを含む細胞療法組成物を提供する。
一部の態様では、本開示は、ＭＹＢＰＣ３タンパク質をコードするＭＹＢＰＣ３ポリヌクレオチド、またはその機能的バリアントおよびプロモーターを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターゲノムを提供し、プロモーターは、３００ｂｐ～５００ｂｐのポリヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１～８５のいずれか一つと少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも１００％の同一性を共有する配列を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１のいずれか一つと少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも１００％の同一性を共有する配列を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号３のいずれか一つと少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも１００％の同一性を共有する配列を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、トロポニンＴ遺伝子の転写開始部位の上流で、それを含むゲノムポリヌクレオチド配列と、少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を共有する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、トロポニンＴ遺伝子の転写開始部位に対して－４５０ｂｐ～＋１ｂｐのゲノムポリヌクレオチド配列と、少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を共有する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、トロポニンＴ遺伝子の転写開始部位に対して－３５０ｂｐ～＋１ｂｐのゲノムポリヌクレオチド配列と、少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を共有する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、トロポニンＴ遺伝子の転写開始部位に対して－２５０ｂｐ～＋１ｂｐのゲノムポリヌクレオチド配列と、少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を共有する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、トロポニンＴ遺伝子の転写開始部位に対して－４５０ｂｐ～＋５０ｂｐのゲノムポリヌクレオチド配列と、少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を共有する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、トロポニンＴ遺伝子の転写開始部位に対して－３５０ｂｐ～＋５０ｂｐのゲノムポリヌクレオチド配列と、少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を共有する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、トロポニンＴ遺伝子の転写開始部位に対して－２５０ｂｐ～＋５０ｂｐのゲノムポリヌクレオチド配列と、少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を共有する。一部の実施形態では、トロポニンＴ遺伝子はヒトトロポニンＴ遺伝子である。
一部の実施形態では、プロモーターは筋特異的プロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターは心臓細胞特異的プロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターは、心筋細胞特異的プロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターは、約６００ｂｐの天然トロポニンＴプロモーターと同じ細胞型特異性を有する。一部の実施形態では、プロモーターは、配列番号１を含む参照プロモーターと同じ細胞型特異性を有する。一部の実施形態では、プロモーターは、天然トロポニンＴプロモーターよりも少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％多い、それと動作可能に連結された遺伝子産物を発現する。一部の実施形態では、プロモーターは、配列番号１を含む参照プロモーターよりも少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％多く動作可能に連結された遺伝子産物を発現する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターゲノムは、ＭＹＢＰＣ３タンパク質をコードするＭＹＢＰＣ３ポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ＭＹＢＰＣ３ポリヌクレオチドは少なくとも約３．５ｋＢを含む。一部の実施形態では、ＭＹＢＰＣ３ポリヌクレオチドは、約３．８ｋＢを含む。一部の実施形態では、ＭＹＢＰＣ３は全長ＭＹＢＰＣ３である。いくつかの実施形態では、ＭＹＢＰＣ３は、短縮ＭＹＢＰＣ３である。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるｒＡＡＶベクターゲノムは、ＭＹＢＰＣ３を発現する。一部の実施形態において、ｒＡＡＶベクターゲノムは、約６００ｂｐの天然トロポニンＴプロモーターを含む参照ＡＡＶベクターとほぼ同じレベルでＭＹＢＰＣ３を発現する。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターゲノムは、約６００ｂｐの天然トロポニンＴプロモーターを含む参照ＡＡＶベクターよりも少なくとも約１０％高いレベルでＭＹＢＰＣ３を発現する。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターゲノムは、約６００ｂｐの天然トロポニンＴプロモーターを含む参照ＡＡＶベクターよりも少なくとも約２０％高いレベルでＭＹＢＰＣ３を発現する。
一部の態様では、本開示は、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターゲノムを提供し、５’から３’の順序で、プロモーターを含む５’セグメントを含む発現カセットと、遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドと、ポリＡシグナルを含む３’セグメントと、５’逆位末端リピート（ＩＴＲ）および３’ＩＴＲの一方または両方に任意で隣接されている発現カセットとを含み、遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドは、３ｋｂ～１１ｋｂ、３ｋｂ～５ｋｂ、３．５ｋｂ～４．５ｋｂまたは３．７ｋｂ～４ｋｂを含み、ａ）５’セグメントおよび３’セグメントは共に最大０．８ｋｂｐまたは最大０．９ｋｂｐを含み、ｂ）５’ＩＴＲ、５’セグメント、３’セグメントおよび３’ＩＴＲは共に最大１．２ｋｂｐ、最大１．３ｋｂｐを含み、並びに／またはｃ）ベクターゲノムは、最大４．７ｋｂｐ、最大４．８ｋｂｐ、最大４．９ｋｂｐまたは最大５．０ｋｂｐを含む。一部の実施形態では、５’セグメントは、最大５００ｂｐまたは最大４８０ｂｐを含む。一部の実施形態では、３’セグメントは、最大２００ｂｐまたは最大１５０ｂｐを含む。
一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターゲノムは、３．７ｋｂｐ～３．９ｋｂｐ、任意で３．８ｋｂｐを含む遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、遺伝子産物はＭＹＢＰＣ３またはその機能的バリアントである。一部の実施形態では、遺伝子産物はＭＹＢＰＣ３である。一部の実施形態では、ＭＹＢＰＣ３をコードするポリヌクレオチドは、配列番号８６と少なくとも９０％の同一性を共有する。一部の実施形態では、ＭＹＢＰＣ３をコードするポリヌクレオチドは、配列番号８６と少なくとも９５％の同一性を共有する。一部の実施形態では、ＭＹＢＰＣ３をコードするポリヌクレオチドは、配列番号８６である。一部の実施形態では、ＭＹＢＰＣ３は、配列番号１０３のポリぺプチド配列と少なくとも９０％の同一性を共有する。一部の実施形態では、ＭＹＢＰＣ３は、配列番号１０３のポリぺプチド配列と少なくとも９５％の同一性を共有する。一部の実施形態では、ＭＹＢＰＣ３は、配列番号１０３のポリぺプチド配列と１００％の同一性を共有する。
一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターゲノムはプロモーターを含み、プロモーターは３００ｂｐ～５００ｂｐを有するポリヌクレオチドである。一部の実施形態では、プロモーターは、配列番号１～８５または配列番号９１と少なくとも８０％の同一性を共有する配列を含む。一部の実施形態では、プロモーターは、配列番号１～８５または配列番号９１と少なくとも９０％の同一性を共有する配列を含む。一部の実施形態では、プロモーターは、配列番号１～８５または配列番号９１と少なくとも１００％の同一性を共有する配列を含む。
一部の実施形態において、ｒＡＡＶベクターゲノムは、ポリＡシグナルを含む。一部の実施形態において、ポリＡシグナルは、配列番号９２と少なくとも９０％の同一性を共有する配列を含む、本質的にからなる、またはからなる。一部の実施形態において、ポリＡシグナルは、配列番号９２と少なくとも９５％の同一性を共有する配列を含む、本質的にからなる、またはからなる。いくつかの実施形態では、ポリＡシグナルは、配列番号９２である。
一部の実施形態において、ｒＡＡＶベクターゲノムは、５’セグメントを含む。一部の実施形態では、５’セグメントは、配列番号９３と少なくとも８０％の同一性を共有する。一部の実施形態では、５’セグメントは、配列番号９３と少なくとも９０％の同一性を共有する。一部の実施形態では、５’セグメントは、配列番号９３と少なくとも９５％の同一性を共有する。一部の実施形態では、５’セグメントは配列番号９３である。
一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターゲノムは、３’セグメントを含む。一部の実施形態では、３’セグメントは、配列番号９４と少なくとも８０％の同一性を共有する。一部の実施形態では、３’セグメントは、配列番号９４と少なくとも９０％の同一性を共有する。一部の実施形態では、３’セグメントは、配列番号９４と少なくとも９５％の同一性を共有する。一部の実施形態では、３’セグメントは配列番号９４である。
一部の実施形態において、ｒＡＡＶベクターゲノムは、発現カセットを含む。一部の実施形態では、発現カセットは、配列番号９５と少なくとも８０％の同一性を共有する。一部の実施形態では、発現カセットは、配列番号９５と少なくとも９０％の同一性を共有する。一部の実施形態では、発現カセットは、配列番号９５と少なくとも９５％の同一性を共有する。いくつかの実施形態では、発現カセットは、配列番号９５である。
一部の実施形態では、ｒＡＡＶゲノムは、５’逆位末端リピート（ＩＴＲ）および３’ＩＴＲの一方または両方に隣接されている発現カセットを含む。一部の実施形態では、５’ＩＴＲは、配列番号９６と９５％の同一性を共有する配列を含む。一部の実施形態では、３’ＩＴＲは、配列番号９７と少なくとも９５％の同一性を共有する配列を含む。
一部の態様では、本開示は、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ビリオンを提供する。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、本明細書に記載のｒＡＡＶベクターゲノムおよびＡＡＶキャプシドタンパク質のうちのいずれか一つを含む。
一部の態様では、本開示は、本明細書に記載されるｒＡＡＶビリオンまたは本明細書に記載されるｒＡＡＶベクターゲノムのいずれか一つで細胞を形質導入することを含む、細胞においてＭＹＢＰＣ３タンパク質を発現する方法を提供する。一部の実施形態では、細胞はＭＹＢＰＣ３－／－細胞である。一部の実施形態では、細胞は、内因性ＭＹＢＰＣ３遺伝子の一方または両方のコピーに不活化変異を含む。
一部の態様では、本開示は、それを必要とする対象において心筋症を治療および／または予防する方法を提供し、本明細書に記載されるｒＡＡＶビリオンまたは本明細書に記載されるｒＡＡＶベクターゲノムのいずれか一つを対象に投与することを含み、任意選択的に、対象は心筋症に罹患しているか、または心筋症のリスクがある。
一部の態様では、本開示は、それを必要とする対象の心臓にＭＹＢＰＣ３タンパク質を発現させる方法を提供し、本明細書に記載されるｒＡＡＶビリオンまたは本明細書に記載されるｒＡＡＶベクターゲノムのいずれか一つを対象に投与することを含み、任意選択的に、対象は心筋症に罹患しているか、または心筋症のリスクがあり、任意選択的に対象は心筋症に罹患しているか、または心筋症のリスクがある。
一部の実施形態では、ＡＡＶベクターの投与は、対象の心臓にＭＹＢＰＣ３の特異的発現を引き起こす。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターの投与は、対象の骨格組織、脳および／または肝臓にＭＹＢＰＣ３の低いまたは検出不能な発現を引き起こし、任意選択的に、対象は心筋症に罹患しているか、または心筋症のリスクがある。
一部の態様では、本開示は、それを必要とする対象において、ＭＹＢＰＣ３変異によって引き起こされる心筋症を治療および／または予防する方法を提供し、本明細書に記載されるｒＡＡＶビリオンまたは本明細書に記載されるｒＡＡＶベクターゲノムのいずれか一つを対象に投与することを含み、任意選択的に、対象は心筋症に罹患しているか、または心筋症のリスクがある。
一部の態様では、本開示は、それを必要とする対象の心臓において、ＭＹＢＰＣ３活性を増加させる、および／または心機能を増加させる方法を提供し、本明細書に記載されるｒＡＡＶビリオンまたは本明細書に記載されるｒＡＡＶベクターゲノムのいずれか一つを対象に投与することを含み、任意選択的に、対象は心筋症に罹患しているか、または心筋症のリスクがある。
一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、心筋症を治療する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、心筋症を予防する。いくつかの実施形態では、心筋症は、肥大型心筋症である。
一部の実施形態では、本明細書に記載される方法は、本明細書に記載されるｒＡＡＶビリオンまたは本明細書に記載されるｒＡＡＶベクターゲノムのいずれか一つの対象への静脈内投与を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載される方法は、本明細書に記載されるｒＡＡＶビリオンまたは本明細書に記載されるｒＡＡＶベクターゲノムのいずれか一つの対象への心臓内投与を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載される方法は、本明細書に記載されるｒＡＡＶビリオンまたは本明細書に記載されるｒＡＡＶベクターゲノムのいずれか一つの対象への直接投与を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、１ｋｇ当たり約１０１１～約１０１４のｒＡＡＶビリオン、または１ｋｇ当たりウイルスゲノムの用量を投与することを含む。
一部の実施形態では、対象は哺乳類である。一部の実施形態では、対象はヒトである。一部の実施形態では、対象は成人である。
一部の実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、例えば心筋症などの心疾患の治療的または予防的治療における薬剤として使用するためのものである。
図１Ａは、大型カーゴに適合したＡＡＶベクターゲノムの挿入配列のマップを示し、二つのｃｉｓ－調節エレメントの欠失または切断を示している。
図１Ｂは、ヒト心臓線維芽細胞（ｎ＝２）、ＡＡＶパッケージング構築物を有するＭＯＩ １６０，０００の感染２日後のフローサイトメトリー分析を示す。
図１Ｃは、大型カーゴに適合したＡＡＶベクターゲノムの挿入配列のマップを示し、二つのｃｉｓ－調節エレメントの欠失または切断、イントロンの欠失、および配列３’～５’ＩＴＲの部分欠失を示す。
図２Ａは、心臓特異的トロポニン（ＴＮＮＴ２）プロモーターおよびミオシン結合タンパク質Ｃ（ＭＹＢＰＣ３）導入遺伝子を含むウイルスゲノムのオリジナルバージョンおよび改変バージョンの概略図を示す。
図２Ｂは、心臓特異的ＴＮＮＴ２プロモーターによって駆動されるＭＹＢＰＣ３をコードするＡＡＶ６パッケージ構築物で形質導入されたＭＹＢＰＣ３－／－ ｉＰＳＣ由来心筋細胞における免疫蛍光法によるＭＹＢＰＣ３タンパク質の検出を示す。
図３Ａは、様々な大きさ（４００～６００ｂｐ）の心臓特異的ＴＮＮＴ２プロモーターによって駆動されるヒトＭＹＢＰＣ３をコードするＡＡＶ６パッケージ構築物で形質導入されたＭＹＢＰＣ３－／－ ｉＰＳＣ由来心筋細胞におけるウエスタンブロット法によるＭＹＢＰＣ３タンパク質の検出を示す。ＧＡＰＤＨは負荷対照として使用した。
図３Ｂは、様々な大きさ（４００または６００ｂｐ）のヒト心臓ＴＮＮＴ２プロモーターによって駆動されるヒトＭＹＢＰＣ３をコードするＡＡＶ６パッケージ構築物で形質導入されたＭＹＢＰＣ３－／－ ｉＰＳＣ由来心筋細胞におけるウエスタンブロット法によるＭＹＢＰＣ３タンパク質の検出を示す。Ｋｏｚａｋ配列は負対照として使用せず、ＧＡＰＤＨは負荷対照として使用した。
図３Ｃは、様々な大きさ（４００または６００ｂｐ）のヒト心臓ＴＮＮＴ２プロモーターによって駆動されるヒトＭＹＢＰＣ３をコードするＡＡＶ６プラスミドでトランスフェクトされたＭＹＢＰＣ３－／－ｉＰＳＣ由来心筋細胞におけるウエスタンブロット法によるＭＹＢＰＣ３タンパク質の検出を示す。ＧＡＰＤＨは負荷対照として使用した。
図４Ａは、ＫＯ系統の創始マウスにおけるＭｙｂｐｃ３遺伝子のイントロンとＭＹＢＰＣ３タンパク質発現のドットブロットのマップを示す。
図４Ｂは、２週齢の野生型（ＷＴ）またはＫＯマウス（Ｍｙｂｐｃ３－／ －）の同腹仔の体重の棒グラフを示す。ＷＴ（ｎ＝１１）、Ｍｙｂｐｃ３＋／－（ｎ＝７）およびＭｙｂｐｃ３－／－（ｎ＝１３）。
図４Ｃは、２週齢の野生型（ＷＴ）、ヘテロ接合性ＫＯマウス（Ｍｙｂｐｃ３＋／－）またはホモ接合性ＫＯマウス（Ｍｙｂｐｃ３－／－）において、心エコー検査によって測定された駆出率（％）の棒グラフを示す。
図４Ｄは、２週齢の野生型（ＷＴ）、ヘテロ接合性ＫＯマウス（Ｍｙｂｐｃ３＋／－）またはホモ接合性ＫＯマウス（Ｍｙｂｐｃ３－／－）において、心エコー検査によって測定された短縮率の棒グラフを示す。
図４Ｅは、２週齢の野生型（ＷＴ）、ヘテロ接合性ＫＯマウス（Ｍｙｂｐｃ３＋／－）またはホモ接合性ＫＯマウス（Ｍｙｂｐｃ３－／－）の体重（ＢＷ）によって正規化された左心室（ＬＶ）の質量の棒グラフを示す。
図４Ｆは、２週齢の野生型（ＷＴ）、ヘテロ接合性ＫＯマウス（Ｍｙｂｐｃ３＋／－）またはホモ接合性ＫＯマウス（Ｍｙｂｐｃ３－／－）の体重によって正規化された心収縮中の左心室の内径（ＬＶＩＤ）の棒グラフを示す。
図４Ｇは、２週齢の野生型（ＷＴ）、ヘテロ接合性ＫＯマウス（Ｍｙｂｐｃ３＋／－）またはホモ接合性ＫＯマウス（Ｍｙｂｐｃ３－／－）の体重によって正規化された心拡張中の左心室の内径（ＬＶＩＤ）の棒グラフを示す。
図５は、様々なサイズ（４００または６００ｂｐ）のヒト心臓ＴＮＮＴ２プロモーターによって駆動されるヒトＭＹＢＰＣ３をコードするＥ１２ ＧＣ ＡＡＶ９パッケージ構築物を後眼窩注入したマウスから採取された心臓、骨格、脳および肝臓組織におけるｑＲＴ－ＰＣＲによるＭＹＢＰＣ３ ｍＲＮＡの検出を示す。
図６Ａは、４００ｂｐの改変ＴＮＮＴ２プロモーターカセットを含有するＡＡＶ９ベクターを静脈内投与した４週間後に、成人マウスの心臓および肝臓におけるゲノムＤＮＡのマイクログラム当たりのベクターゲノムの絶対定量を示す棒グラフを示す。
図６Ｂは、４００ｂｐの改変ＴＮＮＴ２プロモーターカセットを含有するＡＡＶ９ベクターを静脈内投与した４週間後に、成人マウスの心臓および肝臓における導入遺伝子ＲＮＡのビヒクルの倍増加を示す棒グラフを示す。
図７は、Ｍｙｂｐｃ３またはビヒクル、ＨＢＳＳをコードする１Ｅ１４ ｖｇ・ｋｇ－１のテストベクターを後眼窩注入した２週齢のホモ接合性Ｍｙｂｐｃ３－／－マウスにおけるＭＹＢＰＣ３タンパク質発現のウエスタンブロットを示す。
図８は、Ｍｙｂｐｃ３またはビヒクル、ＨＢＳＳをコードする３Ｅ１３ ｖｇ・ｋｇ－１および１Ｅ１４ ｖｇ・ｋｇ－１のテストベクターを後眼窩注入した２週齢のホモ接合性Ｍｙｂｐｃ３－／－マウスにおけるＭＹＢＰＣ３発現を示す棒グラフを示す。
図９Ａは、Ｍｙｂｐｃ３またはビヒクル、ＨＢＳＳをコードする１Ｅ１３ ｖｇ・ｋｇ－１、３Ｅ１３ ｖｇ・ｋｇ－１および１Ｅ１４ ｖｇ・ｋｇ－１のテストベクターを２週齢のホモ接合性Ｍｙｂｐｃ３－／－マウスに後眼窩注入してから６週間後の、体重に対して正規化された左心室の質量（ＬＶＭ／ＢＭ）を示す棒グラフを示す。
図９Ｂは、Ｍｙｂｐｃ３またはビヒクル、ＨＢＳＳをコードする１Ｅ１３ ｖｇ・ｋｇ－１、３Ｅ１３ ｖｇ・ｋｇ－１および１Ｅ１４ ｖｇ・ｋｇ－１のテストベクターを２週齢のホモ接合性Ｍｙｂｐｃ３－／－マウスに後眼窩注入してから６週間後の、収縮期と拡張期との間のＬＶ内径の変化をパーセントで示されたＦＡＳを示す棒グラフを示す。
図９Ｃは、Ｍｙｂｐｃ３またはビヒクル、ＨＢＳＳをコードする１Ｅ１３ ｖｇ・ｋｇ－１、３Ｅ１３ ｖｇ・ｋｇ－１および１Ｅ１４ ｖｇ・ｋｇ－１のテストベクターを２週齢のホモ接合性Ｍｙｂｐｃ３－／－マウスに後眼窩注入してから６週間後の、駆出率を示す棒グラフを示す。
図９Ｄは、Ｍｙｂｐｃ３またはビヒクル、ＨＢＳＳをコードする１Ｅ１３ ｖｇ・ｋｇ－１、３Ｅ１３ ｖｇ・ｋｇ－１および１Ｅ１４ ｖｇ・ｋｇ－１のテストベクターを２週齢のホモ接合性Ｍｙｂｐｃ３－／－マウスに後眼窩注入してから３１週間後の、体重に対して正規化された左心室の質量（ＬＶＭ／ＢＭ）を示す棒グラフを示す。
図９Ｅは、Ｍｙｂｐｃ３またはビヒクル、ＨＢＳＳをコードする１Ｅ１３ ｖｇ・ｋｇ－１、３Ｅ１３ ｖｇ・ｋｇ－１および１Ｅ１４ ｖｇ・ｋｇ－１のテストベクターを２週齢のホモ接合性Ｍｙｂｐｃ３－／－マウスに後眼窩注入してから３１週間後の、収縮期と拡張期との間のＬＶ内径の変化をパーセントで示されたＦＡＳを示す棒グラフを示す。
図９Ｆは、Ｍｙｂｐｃ３またはビヒクル、ＨＢＳＳをコードする１Ｅ１３ ｖｇ・ｋｇ－１、３Ｅ１３ ｖｇ・ｋｇ－１および１Ｅ１４ ｖｇ・ｋｇ－１のテストベクターを２週齢のホモ接合性Ｍｙｂｐｃ３－／－マウスに後眼窩注入してから３１週間後の、駆出率を示す棒グラフを示す。
図１０Ａは、５．４ｋｂｐまたは４．７ｋｂｐの発現カセットとの関連で、Ｍｙｂｐｃ３をコードするＡＡＶ９ベクターの図である。
図１０Ｂは、５．４ｋｂｐまたは４．７ｋｂｐのカセットとの関連で、Ｍｙｂｐｃ３をコードする３Ｅ１３ ｖｇ・ｋｇ－１または１Ｅ１４ ｖｇ・ｋｇ－１のＡＡＶ９ベクターを３月齢のホモ接合性Ｍｙｂｐｃ３－／－マウスに後眼窩注入してから、またはビヒクル対照、ＨＢＳＳを注入されてから１８週間後の駆出率を示す棒グラフを示す。
図１０Ｃは、５．４ｋｂｐまたは４．７ｋｂｐのカセットとの関連で、Ｍｙｂｐｃ３をコードする３Ｅ１３ ｖｇ・ｋｇ－１または１Ｅ１４ ｖｇ・ｋｇ－１のＡＡＶ９ベクターを３月齢のホモ接合性Ｍｙｂｐｃ３－／－マウスに後眼窩注入した後、またはビヒクル対照、ＨＢＳＳを注入された後の、駆出率の前進を示す棒グラフを示す。
図１０Ｄは、５．４ｋｂｐまたは４．７ｋｂｐのカセットとの関連で、Ｍｙｂｐｃ３をコードする３Ｅ１３ ｖｇ・ｋｇ－１または１Ｅ１４ ｖｇ・ｋｇ－１のＡＡＶ９ベクターを３月齢のホモ接合性Ｍｙｂｐｃ３－／－マウスに後眼窩注入してから、またはビヒクル対照、ＨＢＳＳを注入されてから１８週間後の体重に対して正規化された左心室の質量（ＬＶＭ／ＢＭ）を示す棒グラフを示す。
図１１Ａは、ＡＡＶ９キャプシドバリアントＣＲ９－１０の全身送達後の、成人マウスにおけるＧＦＰコードカセットまたはＧＦＰコードカセットを有するＡＡＶ９の心臓組織におけるＧＦＰ発現を示す棒グラフである（ｐ ＜ ０．０５、一方向ＡＮＯＶＡ、Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定）。
図１１Ｂは、１Ｅ１３ ｖｇ・ｋｇ－１および３Ｅ１３ ｖｇ・ｋｇ－１のＭｙｂｐｃ３をコードするＡＡＶ９ベクター、Ｍｙｂｐｃ３をコードするＣＲ９－１０ベクターまたはビヒクル対照ＨＢＳＳを２週齢のＭｙｂｐｃ３－／－マウスに後眼窩注入した時の、駆出率を示す棒グラフを示す。
図１１Ｃは、１Ｅ１３ ｖｇ・ｋｇ－１および３Ｅ１３ ｖｇ・ｋｇ－１の発現カセットＭｙｂｐｃ３遺伝子をコードするＡＡＶ９ベクター、発現カセットＭｙｂｐｃ３遺伝子をコードするＣＲ９－１０ベクターまたはビヒクル対照ＨＢＳＳを２週齢のＭｙｂｐｃ３－／－マウスに後眼窩注入した時の、投与前のベースライン（ΔＥＦ）と比較された駆出率を示す棒グラフを示す。
図１２Ａは、１４種類の異なるキャプシドタンパク質のうちの一つにパッケージングされたＧＦＰをコードする１Ｅ１３ ｖｇ・ｋｇ－１用量のＡＡＶベクターを静脈内送達してから１か月後、非ヒト霊長類の左心室のＧＦＰ発現を示す棒グラフである。
図１２Ｂは、１４種類の異なるキャプシドタンパク質のうちの一つにパッケージングされたＧＦＰをコードする１Ｅ１３ ｖｇ・ｋｇ－１用量のＡＡＶベクターを静脈内送達してから１か月後、非ヒト霊長類の肝臓のＧＦＰ発現を示す棒グラフである。
図１２Ｃは、１４種類の異なるキャプシドタンパク質のうちの一つにパッケージングされたＧＦＰをコードする１Ｅ１３ ｖｇ・ｋｇ－１用量のＡＡＶベクターを静脈内送達してから１か月後、非ヒト霊長類の左心室：肝臓のＧＦＰ発現の比を示す棒グラフである。
図１３Ａは、マウスＭｙｂｐｃ３遺伝子（ｍＭｙｂｐｃ３）（１Ｅ１４ ｖｇ・ｋｇ－１）をコードするＡＡＶ９、ヒトＭＹＢＰＣ３遺伝子（ｈＭＹＢＰＣ３）（１Ｅ１４ ｖｇ・ｋｇ－１）をコードするＡＡＶ９またはビヒクル、ＨＢＳＳを２週齢のホモ接合性Ｍｙｂｐｃ３－／－マウスに後眼窩注入した時の、駆出率の前進を示すプロットである。
図１３Ｂは、マウスＭｙｂｐｃ３遺伝子（ｍＭｙｂｐｃ３）（１Ｅ１４ ｖｇ・ｋｇ－１）をコードするＡＡＶ９、ヒトＭＹＢＰＣ３遺伝子（ｈＭＹＢＰＣ３）（１Ｅ１４ ｖｇ・ｋｇ－１）をコードするＡＡＶ９、またはビヒクル、ＨＢＳＳを２週齢のホモ接合性Ｍｙｂｐｃ３－／－マウスに後眼窩注入した時の、体重に対して正規化された左心室の質量（ＬＶＭ／ＢＷ）の前進を示すプロットである。
図１３Ｃは、マウスＭｙｂｐｃ３遺伝子（ｍＭｙｂｐｃ３）（１Ｅ１４ ｖｇ・ｋｇ－１）をコードするＡＡＶ９、ヒトＭＹＢＰＣ３遺伝子（ｈＭＹＢＰＣ３）（１Ｅ１４ ｖｇ・ｋｇ－１）をコードするＡＡＶ９またはビヒクル、ＨＢＳＳを２週齢のホモ接合性Ｍｙｂｐｃ３－／－マウスに後眼窩注入した時の、拡張期の左室後壁の厚み（ＬＶＰＷ；ｄ）を示す棒グラフである。
図１４Ａは、ヒトＭＹＢＰＣ３遺伝子またはビヒクル、ＨＢＳＳをコードする１Ｅ１３ ｖｇ・ｋｇ－１、１Ｅ１４ ｖｇ・ｋｇ－１および３Ｅ１４ ｖｇ・ｋｇ－１のテストベクターを２週齢のホモ接合性Ｍｙｂｐｃ３－／－マウスに後眼窩注入した時の、駆出率を示す棒グラフを示す。
図１４Ｂは、ヒトＭＹＢＰＣ３遺伝子またはビヒクル、ＨＢＳＳをコードする１Ｅ１３ ｖｇ・ｋｇ－１、１Ｅ１４ ｖｇ・ｋｇ－１および３Ｅ１４ ｖｇ・ｋｇ－１のテストベクターを２週齢のホモ接合性Ｍｙｂｐｃ３－／－マウスに後眼窩注入した時の、投与前のベースライン（ΔＥＦ）と比較された駆出率を示す棒グラフを示す。
図１４Ｃは、ヒトＭＹＢＰＣ３またはビヒクル、ＨＢＳＳをコードする１Ｅ１３ ｖｇ・ｋｇ－１、１Ｅ１４ ｖｇ・ｋｇ－１および３Ｅ１４ ｖｇ・ｋｇ－１のテストベクターを２週齢のホモ接合性Ｍｙｂｐｃ３－／－マウスに後眼窩注入した時の、体重に対して正規化された左心室の質量（ＬＶＭ／ＢＷ）を示す棒グラフを示す。
詳細な説明
本開示は、心臓細胞および／または大きな遺伝子を用いた遺伝子療法のための組成物および方法を提供する。開示されているポリヌクレオチドおよびベクターは、疾患（例えば、心筋症などの心疾患）の治療または予防に使用され得る。本開示は、心臓特異的プロモーター、発現カセット、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ウイルスゲノム、ｒＡＡＶビリオン、医薬組成物、および使用方法を提供する。発現カセットおよびｒＡＡＶウイルスゲノムは、遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドに操作可能に連結された心臓特異的プロモーターを含んでもよい。遺伝子産物は、治療用遺伝子産物であってもよく、このような治療用遺伝子産物は、心臓疾患、例えば心筋症を治療および／または予防するために使用される。本開示は、大型遺伝子産物を送達および発現するように操作されたｒＡＡＶウイルスゲノムおよび発現カセットをさらに提供する。一部の実施形態では、ベクターゲノムは、ＭＹＢＰＣ３ポリペプチド、またはその機能的バリアント、およびプロモーターをコードするポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、プロモーターは、心臓トロポニンＴプロモーター（すなわち、ＴＮＮＴ２プロモーター）である。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターゲノムは、遺伝子産物、例えばＭＹＢＰＣ３をコードするポリヌクレオチド、および例えば一つ以上の逆位末端リピートポリヌクレオチド配列に隣接したプロモーター、例えばＴＮＮＴ２プロモーターを含む発現カセットを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、本明細書に記載のｒＡＡＶベクターゲノムとＡＡＶキャプシドタンパク質とを含むポリヌクレオチドを含む。本開示はまた、本明細書に記載されるベクターゲノム、ｒＡＡＶベクターゲノム、およびｒＡＡＶビリオンを含む医薬組成物を提供する。また、本明細書に記載されるｒＡＡＶビリオンまたはベクターゲノムを投与することを含む、対象における心筋症を治療および／または予防する方法が提供される。
本発明の他の実施形態、特徴、および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかであり、それらによって包含される。
Ｉ．定義
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、内容が別途明確に指示しない限り、複数の参照を含む。
本明細書で使用されるとき、別段の示唆がない限り、用語「および／または」は、「および」または「または」のいずれかを意味するために本開示で使用される。
本明細書全体を通して、文脈が別途必要としない限り、用語「含む」、または「含む」などの変形は、指定された要素もしくは整数もしくは要素のグループもしくは整数の包含を暗示するが、他の要素もしくは整数もしくは要素のグループもしくは整数の排除を暗示するものではないと理解されるであろう。
本出願で使用される場合、用語「約」および「およそ」は、等価物として使用される。約／およその有無に関わらず、本出願で使用される任意の数字は、当業者によって認識される任意の正常な変動を網羅することを意味する。特定の実施形態において、用語「およそ」または「約」は、別段の記載がない限り、または文脈から別途明らかでない限り、記載される参照値の２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％またはいずれか小さい方の範囲の値（そのような数値が１００％を超える可能性がある場合を除く）を示す。
本明細書において互換的に使用される用語「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、約１００ヌクレオチドを超えるヌクレオチドのポリマー形態、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかを指す。したがって、この用語には、限定されないが、一本鎖、二本鎖または多鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、またはプリンおよびピリミジン塩基、もしくは他の天然、化学的または生化学的に修飾された、非天然、もしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーが含まれる。「オリゴヌクレオチド」は、一般的に、一本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＤＮＡの約５～約１００ヌクレオチドのポリヌクレオチドを指す。しかしながら、本開示の目的のために、オリゴヌクレオチドの長さの上限はない。オリゴヌクレオチドはまた、「オリゴマー」または「オリゴ」としても知られ、遺伝子から単離されてもよく、または当技術分野で公知の方法によって化学的に合成されてもよい。用語「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、記載される実施形態に該当する場合、一本鎖（センスまたはアンチセンスなど）および二本鎖ポリヌクレオチドを含むと理解されるべきである。
本明細書で使用される場合、用語「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼが結合する認識部位を有するポリヌクレオチド配列を指し、宿主細胞または標的細胞において、ＲＮＡポリメラーゼはプロモーターのポリヌクレオチド配列の「下流」を開始してＲＮＡに転写することができる。同様に、「プロモーター」は、プロモーターが活性である宿主または標的細胞において、ＲＮＡポリメラーゼが転写状態部位でポリヌクレオチドの転写を開始する場合、ポリヌクレオチド配列に操作可能に連結されるか、または動作可能に連結される。哺乳類細胞で作用するプロモーターは、概して、転写が開始される部位のおよそ２５～３０塩基上流に位置するＡＴリッチ領域、および／または転写の開始から７０～８０塩基上流で見出された別の配列、ＣＮＣＡＡＴ領域を含み、ここでＮは任意のヌクレオチドであってもよい。
用語「上流」および「上流端」は、転写開始部位（ＴＳＳ）を参照しながら、ポリヌクレオチドのセンス鎖（またはコード鎖）上の５’からＴＳＳ、およびポリヌクレオチドのアンチセンス鎖上の３’からＴＳＳである、ポリヌクレオチドの一部分を指す。用語「下流」および「下流端」は、ＴＳＳを参照しながら、ポリヌクレオチドのセンス鎖（またはコード鎖）上の３’からＴＳＳ、およびポリヌクレオチドのアンチセンス鎖上の５’からＴＳＳである、ポリヌクレオチドの一部分を指す。したがって、プロモーターの上流端からの欠失は、センス鎖上の５’からＴＳＳの（または、アンチセンス鎖上の３’からＴＳＳの）ポリヌクレオチドの非転写領域の一つ以上の塩基対の欠失である。プロモーターの下流端からの欠失は、センス鎖上の５’からＴＳＳの（または、アンチセンス鎖上の３’からＴＳＳの）ポリヌクレオチドの転写領域の一つ以上の塩基対の欠失である。
本明細書で使用される場合、用語「導入遺伝子」は、タンパク質またはＲＮＡ（例えば、治療用タンパク質）をコードする核酸配列を指し、それが導入されるトランスジェニック動物または細胞に対して、部分的にまたは完全に異種、すなわち外来であり、またはそれが導入されるトランスジェニック動物または細胞の内因性遺伝子に対して相同であるが、それが挿入される細胞のゲノムを変化させるように、動物のゲノムに挿入されるように設計される、または挿入されている（例えば、天然遺伝子とは異なる位置に挿入される、または挿入の結果、ノックアウトが生じる）。導入遺伝子は、一つ以上の転写調節配列、および選択された核酸の最適な発現に必要であり得るイントロンなどの任意の他の核酸を含み得る。
用語「配列同一性」は、同じであり、同じ相対位置にある二つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の間の塩基またはアミノ酸の割合を指す。このように、一つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列は、別のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列と比較して、ある一定の割合の配列同一性を有する。配列比較については、典型的には、一つの配列が参照配列として作用し、これに対して試験配列が比較される。用語「参照配列」は、試験配列が比較される分子を指す。
配列同一性パーセントの比較および決定のための配列アライメントの方法は、当該技術分野で周知である。比較のための配列の最適なアライメントは、例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８），ｂｙ ｃｏｍｐｕｔｅｒｉｚｅｄ ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅｓｅ ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ（ＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ，ＦＡＳＴＡ，ａｎｄ ＴＦＡＳＴＡ ｉｎ ｔｈｅ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ），ｂｙ ｍａｎｕａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ａｎｄ ｖｉｓｕａｌ ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ（ｓｅｅ，ｅ．ｇ．，Ｂｒｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００３）），ｂｙ ｕｓｅ ｏｆ ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ ｋｎｏｗ ｉｎ ｔｈｅ ａｒｔ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｔｈｅ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＢＬＡＳＴ ２．０ ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ，ｗｈｉｃｈ ａｒｅ ｄｅｓｃｒｉｂｅｄ ｉｎ Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２（１９７７）、およびＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０）によって実施されている。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センターを通じて公開されている。
一部の実施形態では、配列同一性の割合の決定は、局所的アラインメントの後に行われてもよい。そのようなアライメントは、当技術分野で周知であり、例えば、サービスＥＭＢＯＳＳ Ｍａｔｃｈｅｒは、ＬＡＬＩＧＮアプリケーション、バージョン２．０ｕ４に基づくアルゴリズムを使用して、二つの配列間の局所的類似性を識別する。一例では、二つの核酸配列間の同一性は、例えば、マトリクス（ＤＮＡｆｕｌｌ）、ギャップオープン（１６）、ギャップ伸長（４）、代替一致（１）などのデフォルトパラメータに設定されるサービスＭａｔｃｈｅｒ（ＥＭＢＯＳＳ）を使用して計算されてもよい。
「発現カセット」または「発現構築物」は、プロモーターに操作可能に連結されたＤＮＡポリヌクレオチド配列を指す。「操作可能に連結された」または「動作可能に連結された」とは、そのように記載される成分が、それらが意図された様式で機能することを可能にする関係にある並置を意味する。例えば、プロモーターがポリヌクレオチド配列の転写または発現に影響を及ぼす場合、プロモーターはポリヌクレオチド配列に操作可能に連結される。
本明細書で使用される場合、用語「送達」は、「形質導入」と互換的に使用されるが、外因性核酸分子が細胞内に位置するように細胞内に伝達されるプロセスを指す。核酸の送達は、核酸の発現とは異なるプロセスである。
用語「改変された」は、対応する非改変物質または化合物と比較して、変更または変更された物質または化合物（例えば、細胞、ポリヌクレオチド配列、および／またはポリペプチド配列）を指す。
用語「試料」は、分析および／または遺伝子改変に供される生物学的組成物（例えば、細胞または組織の一部分）を指す。一部の実施形態では、試料は、対象から直接取得されるという点で「一次試料」であり、一部の実施形態では、例えば、特定の成分を除去し、および／または特定の対象成分を単離もしくは精製するための一次試料の処理の結果である。
用語「遺伝子」または「組み換え遺伝子」は、エクソン配列および（任意で）イントロン配列の両方を含む、ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む核酸を指す。
用語「トランスフェクション」は、細胞による外来性ＤＮＡの取り込みを指す。外因性ＤＮＡが細胞膜内に導入されると、細胞は「トランスフェクト」されている。いくつかのトランスフェクション技術は、当技術分野で一般的に公知である。例えば、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：４５６（１９７３）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８９）；Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６）；Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １３：１９７（１９８１を参照されたい）。こうした技術を使用して、ヌクレオチド組み込みベクターおよび他の核酸分子などの一つ以上の外因性ＤＮＡ部分を適切な宿主細胞に導入することができる。この用語は、化学的および電気的トランスフェクション手順を捕捉する。
用語「発現」は、核酸がペプチドに翻訳される、またはＲＮＡに転写されるプロセスを指し、例えば、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に翻訳され得る。核酸がゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、適切な真核宿主細胞または生物が選択された場合、ｍＲＮＡのスプライシングを含む場合がある。異種核酸が宿主細胞に発現されるためには、最初に細胞内に送達され、その後、細胞内に一旦、最終的に核内に存在しなければならない。
「遺伝子療法」という用語は、治療または診断が求められている障害または状態を有する、哺乳類、特にヒトの細胞への異種ＤＮＡの伝達を伴う。ＤＮＡは、異種ＤＮＡが発現され、それによってコードされる治療産物が産生されるように、選択された標的細胞に導入される。あるいは、異種ＤＮＡは、治療用産物をコードするＤＮＡの発現を何らかの方法で媒介してもよく、ペプチドまたはＲＮＡなどの産物をコードしてもよく、何らかの方法で治療用産物の発現を、直接的または間接的に媒介する。遺伝子療法は、欠陥遺伝子を置き換えるために遺伝子産物をコードする核酸を送達する、または哺乳類もしくはそれが導入された細胞によって産生される遺伝子産物を補充するためにも使用されうる。導入した核酸は、通常哺乳類宿主で産生されない、または治療有効量で、または治療有効時間で産生されない治療用遺伝子産物をコードしてもよい。治療用産物をコードする異種ＤＮＡは、産物またはその発現を増強する、または他の方法で変更するために、罹患した宿主の細胞に導入する前に改変されてもよい。
本明細書で使用される場合、「異種」ポリヌクレオチドまたは核酸は、宿主生物以外の供給源、またはウイルスベクターについては、天然の非組み換えウイルスに由来するポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの一部を指す。異種ＤＮＡの例としては、限定されないが、薬剤抵抗性を付与するタンパク質などの追跡可能なマーカータンパク質をコードするＤＮＡ、抗癌剤、酵素およびホルモンなどの治療有効物質をコードするＤＮＡ、ならびに抗体などの他のタイプのタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。
用語「野生型」は、正常または健康な対象においてインビボで通常存在するタンパク質、もしくはその一部、もしくはタンパク質配列、またはその一部をそれぞれコードする天然のポリヌクレオチド配列を指す。
用語「バリアント」は、参照タンパク質または核酸の機能のすべてまたは実質的にすべてを返す、一つ以上の遺伝的変化（例えば、挿入、欠失、置換など）を有するタンパク質または核酸を指す。例えば、治療用タンパク質のバリアントは、同じまたは実質的に同じ活性を保持し、および／またはそれを必要とする対象に同じまたは実質的に同じ治療上の利益を提供する。プロモーター配列のバリアントは、参照プロモーターと同じまたは実質的に同じレベルで転写を開始する能力を保持し、同じまたは実質的に同じ細胞型特異性を保持する。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドバリアントは、配列参照と、少なくともまたは約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する。特定の実施形態では、タンパク質バリアントは、配列参照と、少なくともまたは約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する。
用語「対象」は、例えば哺乳類などの動物を含む。いくつかの実施形態では、哺乳類は霊長類である。いくつかの実施形態では、哺乳類はヒトである。一部の実施形態では、対象は、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ブタなどの家畜、またはイヌやネコなどの家庭用動物である。一部の実施形態では（例えば、特に研究背景において）、対象は、齧歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスター）、ウサギ、霊長類、または近交系ブタなどのブタである。用語「対象」および「患者」は、本明細書では互換的に使用される。
対象への「投与」という用語は、一つ以上の送達剤を一緒に、または別々に、対象に導入する、または適用して、対象に存在する標的細胞を最終的に薬剤と接触させる手順である。
本明細書で使用される場合、「治療する」とは、生理学的転帰に影響を及ぼすために、薬剤または組成物を対象に送達することを指す。
本明細書で使用される場合、用語「遺伝子産物」は、ポリヌクレオチドの転写によって産生されたタンパク質または核酸を指し、タンパク質遺伝子産物の場合、その後の転写物のタンパク質への翻訳を指す。「治療用遺伝子産物」は、対象において治療量で発現された時に、治療生理学的効果または利益を、必要とする対象に提供する遺伝子産物を指す。
本明細書で使用される場合、用語「治療用タンパク質」は、対象において治療量で発現または投与された場合に、治療生理学的効果または利益を、必要とする対象に提供するタンパク質またはポリペプチドを指す。一部の実施形態では、治療用タンパク質または治療用タンパク質を発現するベクターを用いた治療は、心疾患を有する対象（例えば、心筋症を有する対象）に、治療生理学的効果または利益を提供する。心疾患の治療のための例示的な治療用タンパク質を表２に提供する。
本明細書で使用される場合、用語「心筋症」は、何らかの理由による心筋（すなわち、実際の心筋）の機能の悪化を指す。心筋症を有する対象は、しばしば不整脈、突然の心臓死、またはその両方のリスクがある。
本明細書で使用される場合、用語「肥大型心筋症」は、心筋の一部が肥大する心臓および心筋の疾患を指す。
本明細書で使用される場合、用語「家族性肥大型心筋症」は、左心室の壁の厚さの成長（すなわち、肥大）の増加によって特徴付けられる遺伝的障害を指す。
本明細書で使用される場合、用語「有効量」は、特定の生理学的効果をもたらすために必要な薬剤または組成物の最小量を指す。特定の薬剤の有効量は、質量／体積、細胞数／体積、粒子／体積、（薬剤の質量）／（対象の質量）、細胞数／（対象の質量）、または粒子／（対象の質量）など、薬剤の性質に基づいて様々な方法で表されてもよい。特定の薬剤の有効量はまた、参照レベルと最大応答レベルとの間の中間である特定の生理学的応答の大きさをもたらす薬剤の濃度を指す、半最大有効濃度（ＥＣ５０）として表されてもよい。
ＩＩ．ポリヌクレオチド
一部の実施形態では、本開示は、心疾患（例えば、心筋症）の治療および／または予防のためのポリヌクレオチド配列を提供する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、心筋症の治療および／または予防のための一つ以上の治療用遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドに動作可能に連結された心臓特異的プロモーターを含む。
ポリヌクレオチドは、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも１０００、少なくとも５０００、少なくとも１００００、または少なくとも１５０００以上のヌクレオチド、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドのいずれか、またはヌクレオチドのいずれかの種類の改変された形態の長さならびに中間の長さのポリマー形態を指す。この文脈における「中間の長さ」は、６、７、８、９など、１０１、１０２、１０３など、１５１、１５２、１５３など、２０１、２０２、２０３など、引用された値の間の任意の長さを意味する。
遺伝子コードの縮退の結果として、本明細書に記載されるポリペプチドまたはそのバリアントの断片をコードする多くのヌクレオチド配列がある。これらのポリヌクレオチドの一部は、任意の天然遺伝子のヌクレオチド配列に対する最小限の相同性を有する。それにもかかわらず、コドン使用の違いにより変化するポリヌクレオチドは、特定の実施形態、例えば、ヒトおよび／または霊長類のコドン選択に最適化されたポリヌクレオチドにおいて特に意図される。さらに、本明細書に提供されるポリヌクレオチド配列を含む遺伝子の対立遺伝子も使用されうる。対立遺伝子は、ヌクレオチドの欠失、付加および／または置換など、一つ以上の変異の結果として改変される内因性遺伝子である。
本明細書で意図されるポリヌクレオチドは、コード配列自体の長さに関係なく、他のＤＮＡ配列、例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー、非翻訳領域（ＵＴＲ）、シグナル配列、コザック配列、ポリアデニル化シグナル、追加の制限酵素部位、複数のクローニング部位、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、リコンビナーゼ認識部位（例えば、ＬｏｘＰ、ＦＲＴおよびＡｔｔ部位）、終止コドン、転写終結シグナルおよび自己切断ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、エピトープタグ、本明細書の他の場所で開示される、または当技術分野で公知である、と結合してもよい。
ポリヌクレオチドは、当技術分野で既知かつ利用可能な様々な確立された技術のいずれかを使用して、調製、操作、および／または発現することができる。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチド配列はプロモーターである。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、心疾患（例えば、心筋症）の治療または予防のための治療用遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドに動作可能に連結されたプロモーターである。
一部の実施形態では、ベクターは、治療用遺伝子産物（例えば、治療用タンパク質、例えば、ＭＹＢＰＣ３タンパク質をコードする）をコードするポリヌクレオチドに動作可能に連結された心臓特異的プロモーターを含む。本明細書で使用される場合、「心臓特異的プロモーター」は、その心臓細胞における活性が他のどの非心臓細胞型よりも少なくとも２倍高いプロモーターを指す。好ましくは、本発明のベクターで使用されるのに適した心臓特異的プロモーターは、非心臓細胞型におけるその活性と比較して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、または少なくとも５０倍高い心臓細胞における活性を有する。
一部の実施形態では、ベクターは、治療用遺伝子産物（例えば、ＭＹＢＰＣ３タンパク質）をコードするポリヌクレオチドに動作可能に連結された心筋細胞特異的プロモーターを含む。本明細書で使用される場合、「心筋細胞特異的プロモーター」は、その心筋細胞における活性が、心筋細胞ではない任意の他の非心臓細胞型または心臓細胞よりも少なくとも２倍高いプロモーターを指定する。好ましくは、本開示のベクターで使用されるのに適した心筋細胞特異的プロモーターは、心筋細胞において、非心臓細胞型または心筋細胞ではない心臓細胞型におけるその活性と比較して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、または少なくとも５０倍高い活性を有する。
一部の実施形態では、心臓特異的または心筋細胞特異的プロモーターは、ヒトプロモーターである。心臓特異的または心筋細胞特異的プロモーターの例としては、以下に限定されないが、アルファミオシン重鎖プロモーター、ミオシン軽鎖２ｖプロモーター、アルファミオシン重鎖プロモーター、アルファ心臓アクチンプロモーター、アルファトロポミオシンプロモーター、心臓トロポニンＣプロモーター、心臓トロポニンＩプロモーター、心筋ミオシン結合タンパク質Ｃプロモーター、およびサルコ／小胞体Ｃａ２＋ＡＴＰａｓｅ（ＳＥＲＣＡ）プロモーター（例えば、ＳＥＲＣＡ２のアイソフォーム２）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、心臓特異的プロモーターは、心臓ＴＮＮＴ２プロモーターである。一部の実施形態では、心臓ＴＮＮＴ２プロモーターは、例えば、ポリヌクレオチドの欠失、挿入、または置換によって改変される。心臓ＴＮＮＴ２プロモーターの例示的なポリヌクレオチド配列を、以下の表１に示す。ＴＮＮＴ２プロモーターの転写開始部位（ＴＳＳ）は太字で下線が引かれている。
Figure 2023513749000002
一部の実施形態では、心臓ＴＮＮＴ２プロモーターは、約２００～５００塩基対、約２５０～５００塩基対、約３００～５００塩基対、約３５０～５００塩基対、約４００～５００塩基対、約４５０～５００塩基対、約２００～４５０塩基対、約２００～４００塩基対、約２００～３５０塩基対、約２００～３００塩基対、および約２００～２５０塩基対長のポリヌクレオチド配列を含むように改変される。一部の実施形態では、改変心臓ＴＮＮＴ２プロモーターは、約３５０塩基対～約４５０塩基対、約３７５塩基対～約４２５塩基対、約３７５塩基対～約４００塩基対、約３７５塩基対～約４２５塩基対、約４００塩基対～約４２５塩基対または約４００塩基対～約４５０塩基対のポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、心臓ＴＮＮＴ２プロモーターは、約４００塩基対のポリヌクレオチド配列を含む。
特定の実施形態では、改変心臓トロポニンＴプロモーターは、３００ｂｐ～５００ｂｐの配列番号１を含む。例えば、改変心臓トロポニンＴプロモーターは、配列番号３を含んでもよい。いくつかの実施例では、３００ｂｐ～５００ｂｐの配列は、さらなるポリヌクレオチド配列に連結されてもよいが、配列番号１に由来する追加の配列には連結されなくてもよい。例えば、一実施形態では、改変心臓トロポニンＴプロモーターは、５００ｂｐ以下の配列番号１を含んでもよいが、追加の非関連ポリヌクレオチド配列を含んでもよい。別の例では、改変心臓トロポニンＴプロモーターは、配列番号３を含み、配列番号１に由来する追加の配列を含まないが、追加の非関連ポリヌクレオチド配列を含んでもよい。
一部の実施形態では、心臓ＴＮＮＴ２プロモーターは、ポリヌクレオチドの欠失によって修飾される。改変は、一つ、二つ、三つ以上の内部欠失を含みうる。各欠失は、約６００塩基対を有する参照心臓ＴＮＮＴ２プロモーター（配列番号１）に関して、１塩基対、２塩基対、３塩基対、４塩基対、５塩基対、１０塩基対、１５塩基対、２０塩基対、２５塩基対、３０塩基対、４０塩基対、５０塩基対、６０塩基対、７０塩基対、８０塩基対、９０塩基対、１００塩基対、１２５塩基対、１５０塩基対、１７５塩基対、２００塩基対、２２５塩基対、２５０塩基対、２７５塩基対、または３００塩基対の欠失であってもよい。
一部の実施形態では、ＴＮＮＴ２プロモーターは、約６００塩基対を有する参照心臓ＴＮＮＴ２プロモーター（配列番号１）に関して、プロモーターの上流端からのポリヌクレオチドの欠失によって修飾される。改変は、約６００塩基対を有する参照心臓ＴＮＮＴ２プロモーター（配列番号１）に関して、プロモーターの上流端から１塩基対、２塩基対、３塩基対、４塩基対、５塩基対、１０塩基対、１５塩基対、２０塩基対、２５塩基対、３０塩基対、４０塩基対、５０塩基対、６０塩基対、７０塩基対、８０塩基対、９０塩基対、１００塩基対、１２５塩基対、１５０塩基対、１７５塩基対、２００塩基対、２２５塩基対、２５０塩基対、２７５塩基対、または３００塩基対の欠失を含んでもよい。一部の実施形態では、改変は、約６００塩基対を有する参照心臓ＴＮＮＴ２プロモーター（配列番号１）に関して、プロモーターの上流端から２００塩基対の欠失である。
一部の実施形態では、心臓ＴＮＮＴ２プロモーターは、約６００塩基対を有する参照心臓ＴＮＮＴ２プロモーター（配列番号１）に関して、プロモーターの下流端からのポリヌクレオチドの欠失によって修飾される。改変は、約６００塩基対を有する参照心臓ＴＮＮＴ２プロモーター（配列番号１）に関して、プロモーターの下流端から１塩基対、２塩基対、３塩基対、４塩基対、５塩基対、１０塩基対、１５塩基対、２０塩基対、２５塩基対、３０塩基対、４０塩基対、５０塩基対、６０塩基対、７０塩基対、８０塩基対、９０塩基対、１００塩基対、１２５塩基対、１５０塩基対、１７５塩基対、２００塩基対、２２５塩基対、２５０塩基対、２７５塩基対、または３００塩基対の欠失を含んでもよい。
一部の実施形態では、心臓ＴＮＮＴ２プロモーターは、ポリヌクレオチドの内部欠失によって修飾される。改変は、参照心臓ＴＮＮＴ２プロモーター（配列番号１）に関して、１塩基対、２塩基対、３塩基対、４塩基対、５塩基対、１０塩基対、１５塩基対、２０塩基対、３０塩基対、４０塩基対、５０塩基対、６０塩基対、７０塩基対、８０塩基対、９０塩基対、１００塩基対、１２５塩基対、１５０塩基対、１７５塩基対、２００塩基対、２２５塩基対、２５０塩基対、２７５塩基対、または３００塩基対の内部欠失を含んでもよい。
一部の実施形態では、心臓ＴＮＮＴ２プロモーターは、ポリヌクレオチドの挿入によって改変される。改変は、参照心臓ＴＮＮＴ２プロモーター（配列番号１）に関して、１塩基対、２塩基対、３塩基対、４塩基対、５塩基対、１０塩基対、１５塩基対、２０塩基対、２５塩基対、３０塩基対、３５塩基対、４０塩基対、４５塩基対、５０塩基対、５５塩基対、６０塩基対、６５塩基対、７０塩基対、７５塩基対、８０，塩基対、８５塩基対、９０塩基対、１００塩基対、１２５塩基対、１５０塩基対、１７５塩基対、２００塩基対、２２５塩基対、２５０塩基対、２７５塩基対または３００塩基対の挿入を含んでもよい。
一部の実施形態では、心臓ＴＮＮＴ２プロモーターは、ポリヌクレオチドの置換によって改変される。置換は、参照心臓ＴＮＮＴ２プロモーター（配列番号１）に関して、１塩基対、２塩基対、３塩基対、４塩基対、５塩基対、６塩基対、７塩基対、８塩基対、９塩基対、または１０塩基対の置換を含んでもよい。
一部の実施形態では、ＴＮＮＴ２プロモーターのポリヌクレオチド配列は、ヒトＴＮＮＴ２遺伝子の転写開始部位に対して、ポリヌクレオチド配列－４５０塩基対～＋１塩基対と少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を共有する。一部の実施形態では、ＴＮＮＴ２プロモーターのポリヌクレオチド配列は、ヒトＴＮＮＴ２遺伝子の転写開始部位に対して、ポリヌクレオチド配列－３５０塩基対～＋１塩基対と少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を共有する。一部の実施形態では、ＴＮＮＴ２プロモーターのポリヌクレオチド配列は、ヒトＴＮＮＴ２遺伝子の転写開始部位に対して、ポリヌクレオチド配列－２５０塩基対～＋１塩基対と少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を共有する。
一部の実施形態では、心臓ＴＮＮＴ２プロモーターのポリヌクレオチド配列は、ＴＮＮＴ２遺伝子の転写開始部位に対して、ポリヌクレオチド配列－４５０塩基対～＋５０塩基対と少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を共有する。一部の実施形態では、心臓ＴＮＮＴ２プロモーターのポリヌクレオチド配列は、ＴＮＮＴ２遺伝子の転写開始部位に対して、ポリヌクレオチド配列－３５０塩基対～＋５０塩基対と少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を共有する。一部の実施形態では、心臓ＴＮＮＴ２プロモーターのポリヌクレオチド配列は、ＴＮＮＴ２遺伝子の転写開始部位に対して、ポリヌクレオチド配列－２５０塩基対～＋５塩基対と少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を共有する。
一部の実施形態では、心臓ＴＮＮＴ２プロモーターは、配列番号１～８５のいずれか一つと少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を共有する配列を含むポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１～８５のいずれか一つと少なくとも８０％の同一性を共有する配列を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１～８５のいずれか一つと少なくとも９０％の同一性を共有する配列を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１～８５のいずれか一つと少なくとも１００％の同一性を共有する配列を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１と少なくとも８０％の同一性を共有する配列を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１と少なくとも９０％の同一性を共有する配列を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１と少なくとも１００％の同一性を共有する配列を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号３と少なくとも８０％の同一性を共有する配列を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号３と少なくとも９０％の同一性を共有する配列を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号３と少なくとも１００％の同一性を共有する配列を含む。
Ｂ．例示的な遺伝子産物（タンパク質）
本開示のプロモーターは、遺伝子産物（例えば、タンパク質または核酸）をコードする配列を含むポリヌクレオチドに動作可能に連結されてもよい。一部の実施形態では、遺伝子産物は治療用タンパク質である。治療用タンパク質は、表２に列挙された天然ヒトタンパク質、またはその機能的ホモログもしくはバリアントのいずれかであってもよい。本開示のプロモーターは、ウイルスベクターによって送達された場合に低レベルで発現され得るか、または発現されない大きな遺伝子での使用に適している。本明細書に開示されるいくつかの実施形態の利点は、例えば、ＡＡＶベクターなどの限定的なパッケージング能力を有するウイルスベクターにおいて治療用タンパク質（特に大きな治療用タンパク質）を発現する能力にある。「大きな」タンパク質は、そのサイズが選択されたベクターにおける発現に影響を与える任意のタンパク質である。一般に、「大きな」治療用タンパク質は、少なくとも約１０００以上のアミノ酸を含み、すなわち、タンパク質は、約３ｋｂｐｓ以上のポリヌクレオチド配列によってコードされる。大きなタンパク質を含む例示的なタンパク質を、以下の表２に提供する。
Figure 2023513749000003
３キロ塩基以上の長さを有する様々な治療用ポリヌクレオチド、またはポリヌクレオチドによりコードされた治療用タンパク質は、約６００塩基対のＴＮＮＴ２プロモーターと比較して、本開示の改変ＴＮＮＴ２プロモーターに動作可能に連結された場合、より効果的に発現される。本開示のプロモーターは、少なくとも以下の発現に有用である：ａ）機能喪失変異が心筋症（遺伝子置換療法）をもたらす大きな遺伝子、ｂ）心筋細胞におけるその発現が心臓保護性である大きな遺伝子、ｃ）心筋細胞におけるその共発現が有益である遺伝子の組み合わせ、およびｄ）心筋細胞特異的ゲノム編集のためのツール。「大きな」遺伝子は、そのサイズが選択されたベクターにおける発現に影響を与える任意の遺伝子である。一般に、「大きな」治療用遺伝子は、少なくとも約１０００以上のアミノ酸を含み、すなわち、遺伝子は、約３ｋｂｐｓ以上のポリヌクレオチド配列を含む。さらなる実施形態において、本開示のベクター及びプロモーターは、表３に挙げる疾患又は障害の治療に使用され、ここでポリヌクレオチドは表中に示される治療用タンパク質をコードする。
Figure 2023513749000004
ＭＹＢＰＣ３は、心臓細胞で発現される遺伝子である。ＭＹＢＰＣ３における様々な変異は、肥大型心筋症を引き起こすことが知られている。肥大型心筋症を引き起こす変異のほぼ半数は、ナンセンス変異、フレームシフト変異、またはスプライス部位変異（Ｍａｒｉａｎ ａｎｄ Ｂｒａｕｎｗａｌｄ，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．１２１：７４９－７７０（２０１７）；Ｗａｌｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔ．Ｍｅｄ．１９：１９２－２０３（２０１７）を介するトランケーションを生じる。未成熟終止コドンを含有するｍＲＮＡは、ナンセンス変異依存分解機構による監視および分解に供される。これは、筋切除術を受けたことのある肥大型心筋症の患者からの心臓組織の解析における変異型ＲＮＡのレベル低下と一致する（Ｍａｒｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．１０５：２１９－２２２（２００９）；ｖａｎ Ｄｉｊｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １１９：１４７３－１４８３（２００９）；Ｈｅｌｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｇｅｎｅｔ．７：４３４－４４３（２０１４）。さらに、任意の結果として生じる切断ポリペプチドは、ユビキチン－プロテアソーム分解系に感受性であるように見える。患者の筋切除試料では、九つの異なる変異について切断タンパク質は観察されなかった（Ｒｏｔｔｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１００：４７５－４８２（１９９７）；Ｍｏｏｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １０１：１３９６－１４０２（２０００）；Ｍａｒｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．１０５：２１９－２２２（２００９）；ｖａｎ Ｄｉｊｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃ．Ｈｅａｒｔ Ｆａｉｌ ５：３６－４６（２０１２））。ヘテロ接合型患者における野生型ＭＹＢＰＣ３対立遺伝子はわずかに上方制御されていると考えられるが、サルコメアに組み込まれるＭＹＢＰＣ３タンパク質の総量は、約６５％と大幅に正常を下回る（Ｍａｒｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．１０５：２１９－２２２（２００９）；ｖａｎ Ｄｉｊｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃ．Ｈｅａｒｔ Ｆａｉｌ ５：３６－４６（２０１２）；ＭｃＮａｍａｒａ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １２：ｅ０１８００６４（２０１７））。したがって、ＭＹＢＰＣ３切断変異を有する肥大型心筋症患者のサルコメア病態生理は、ハプロ不全に起因すると考えられる。
一部の実施形態では、本開示は、改変心臓ＴＮＮＴ２プロモーターに動作可能に連結されたＭＹＢＰＣ３タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。同様に、一部の実施形態では、心臓特異的プロモーター（例えば、改変心臓ＴＮＮＴ２プロモーター）に動作可能に連結されたポリヌクレオチド配列は、ＭＹＢＰＣ３、またはその変異体、バリアント、もしくは断片である。ヒトでは、ＭＹＢＰＣ３遺伝子は、ＭＹＢＰＣ３タンパク質（ＭｙＢＰ－Ｃとしても知られる）をコードし、筋肉収縮の基本単位である心筋サルコメアを調節する。心筋サルコメアは、太いフィラメントと薄いフィラメントから成り、ＭＹＢＰＣ３は太いフィラメントに付着して早期の分解を防ぐ。例示的なＭＹＢＰＣ３ポリヌクレオチド配列を以下の表４Ａに示す。一部の実施形態では、ＭＹＢＰＣ３をコードするポリヌクレオチドは、配列番号８６～８９のいずれか一つと少なくとも８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の同一性を共有する配列を共有する。例示的なＭＹＢＰＣ３タンパク質配列を表４Ｂに示す。一部の実施形態では、ＭＹＢＰＣ３をコードするベクターゲノムは、配列番号１０３～１０６のいずれか一つと少なくとも８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の同一性を共有するＭＹＢＰＣ３タンパク質をコードする。
Figure 2023513749000005
Figure 2023513749000006
Figure 2023513749000007
Figure 2023513749000008
Figure 2023513749000009
Figure 2023513749000010
Figure 2023513749000011
一部の実施形態では、本開示は、改変心臓ＴＮＮＴ２プロモーターに動作可能に連結された、カリウム電位依存性チャネルサブファミリーＨメンバー２（ＫＣＮＨ２）タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。同様に、一部の実施形態では、心臓特異的プロモーター（例えば、改変心臓ＴＮＮＴ２プロモーター）に動作可能に連結されたポリヌクレオチド配列は、ＫＣＮＨ２、またはその変異体、バリアント、もしくは断片である（例えば、配列番号１０７）。ヒトでは、ＫＣＮＨ２遺伝子は、ＫＣＮＨ２タンパク質（ｈＥＲＧ１、例えば、配列番号１０８としても知られる）をコードし、これは他のＫＣＮＨ２タンパク質とカリウムチャネルを形成して、細胞からカリウムを輸送する。ＫＣＨＮ２タンパク質は心筋に豊富に発現し、心筋は各心拍後に心臓組織をリチャージして規則的なリズムを維持する。一部の実施形態では、ＫＣＮＨ２をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１０７と少なくとも９０％、９５％、９９％または１００％の同一性を共有する。一部の実施形態では、ＫＣＮＨ２タンパク質は、配列番号１０８と少なくとも９０％、９５％、９９％または１００％の同一性を共有する。
一部の実施形態では、本開示は、改変心臓ＴＮＮＴ２プロモーターに動作可能に連結された、一過性受容器電位チャネルサブファミリーＭ膜４（ＴＲＰＭ４）タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。同様に、一部の実施形態では、心臓特異的プロモーター（例えば、改変心臓ＴＮＮＴ２プロモーター）に動作可能に連結されたポリヌクレオチド配列は、ＴＲＰＭ４、またはその変異体、バリアント、もしくは断片である（例えば、配列番号１０９）。ヒトでは、ＴＲＰＭ４遺伝子は、細胞への、および細胞からのカチオンの流れを制御するチャネルとして機能するＴＲＰＭ４タンパク質（例えば、配列番号１１０）をコードする。ＴＲＰＭ４チャネルは心臓細胞に豊富に発現し、電気信号の生成および送信において重要な役割を果たす。一部の実施形態では、ＴＲＰＭ４をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１０９と少なくとも９０％、９５％、９９％または１００％の同一性を共有する。一部の実施形態では、ＴＲＰＭ４タンパク質は、配列番号１１０と少なくとも９０％、９５％、９９％または１００％の同一性を共有する。
一部の実施形態では、本開示は、改変心臓ＴＮＮＴ２プロモーターに動作可能に連結された、デスモグレイン２（ＤＳＧ２）タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。同様に、一部の実施形態では、心臓特異的プロモーター（例えば、改変心臓ＴＮＮＴ２プロモーター）に動作可能に連結されたポリヌクレオチド配列は、ＤＳＧ２、またはその変異体、バリアント、もしくは断片である（例えば、配列番号１１１）。ヒトでは、ＤＳＧ２遺伝子は、膜貫通糖タンパク質であり、かつデスモソームの成分であるＤＳＧ２タンパク質（例えば、配列番号１１２）をコードする。デスモソームは、組織に機械的強度を与える細胞間の強い接着を提供する細胞間接合部である。一部の実施形態では、ＤＳＧ２をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１１１と少なくとも９０％、９５％、９９％または１００％の同一性を共有する。一部の実施形態では、ＤＳＧ２タンパク質は、配列番号１１２と少なくとも９０％、９５％、９９％または１００％の同一性を共有する。
一部の実施形態では、本開示は、改変心臓ＴＮＮＴ２プロモーターに動作可能に連結された、ＡＴＰａｓｅ筋小胞体／小胞体カルシウム輸送２（ＡＴＰ２Ａ２）タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。同様に、一部の実施形態では、心臓特異的プロモーター（例えば、改変心臓ＴＮＮＴ２プロモーター）に動作可能に連結されたポリヌクレオチド配列は、ＡＴＰ２Ａ２、またはその変異体、バリアント、もしくは断片である（例えば、配列番号１１３）。ヒトにおいて、ＡＴＰ２Ａ２遺伝子は、サルコ（エンド）小胞体カルシウム－ＡＴＰａｓｅ ２（ＳＥＲＣＡ２）タンパク質（例えば、配列番号１１４）をコードし、カルシウムのサイトゾルから小胞体内腔への転置と連結させるＡＴＰの加水分解を触媒する。筋小胞体内外へのカルシウムイオンの調節は、筋肉の収縮および弛緩を助ける。一部の実施形態では、ＡＴＰ２Ａ２をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１１３と少なくとも９０％、９５％、９９％または１００％の同一性を共有する。一部の実施形態では、ＡＴＰ２Ａ２タンパク質は、配列番号１１４と少なくとも９０％、９５％、９９％または１００％の同一性を共有する。
一部の実施形態では、本開示は、改変心臓ＴＮＮＴ２プロモーターに動作可能に連結された、カルシウム電位依存性チャネルサブユニットアルファ１Ｃ（ＣＡＣＮＡ１Ｃ）タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。同様に、一部の実施形態では、心臓特異的プロモーター（例えば、改変心臓ＴＮＮＴ２プロモーター）に動作可能に連結されたポリヌクレオチド配列は、ＣＡＣＮＡ１Ｃ、またはその変異体、バリアント、もしくは断片である（例えば、配列番号１１５）。ヒトでは、ＣＡＣＮＡ１Ｃ遺伝子は、電位依存性カルシウムチャネルタンパク質のアルファ１サブユニット（例えば、配列番号１１６）をコードし、これは膜偏光によりカルシウムイオンの流入を細胞内に媒介する機能を果たす。一部の実施形態では、ＣＡＣＮＡ１Ｃをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１１５と少なくとも９０％、９５％、９９％または１００％の同一性を共有する。一部の実施形態では、ＣＡＣＮＡ１Ｃタンパク質は、配列番号１１６と少なくとも９０％、９５％、９９％または１００％の同一性を共有する。
一部の実施形態では、本開示は、改変心臓ＴＮＮＴ２プロモーターに動作可能に連結された、ジストロフィン（ＤＭＤ）タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。同様に、一部の実施形態では、心臓特異的プロモーター（例えば、改変心臓ＴＮＮＴ２プロモーター）に動作可能に連結されたポリヌクレオチド配列は、ＤＭＤ、またはその変異体、バリアント、もしくは断片である（例えば、配列番号１１７）。ヒトでは、ＤＭＤ遺伝子は、ジストロフィン－糖タンパク質複合体（ＤＧＣ）の成分を形成するＤＭＤタンパク質（例えば、配列番号１１８）をコードする。ＤＧＣはアンカーとして作用し、細胞骨格を細胞外基質と接続し、それによって筋線維を強化し、筋肉が収縮し弛緩するにつれて損傷から保護する。一部の実施形態では、ＤＭＤをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１１７と少なくとも９０％、９５％、９９％または１００％の同一性を共有する。一部の実施形態では、ＤＭＤタンパク質は、配列番号１１８と少なくとも９０％、９５％、９９％または１００％の同一性を共有する。
一部の実施形態では、本開示は、改変心臓ＴＮＮＴ２プロモーターに動作可能に連結された、ＤＭ１タンパク質キナーゼ（ＤＭＰＫ）タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。同様に、一部の実施形態では、心臓特異的プロモーター（例えば、改変心臓ＴＮＮＴ２プロモーター）に動作可能に連結されたポリヌクレオチド配列は、ＤＭＰＫ、またはその変異体、バリアント、もしくは断片である（例えば、配列番号１１９）。ヒトでは、ＤＭＰＫ遺伝子は、筋緊張ジストロフィータンパク質キナーゼタンパク質（例えば、配列番号１２０）をコードし、これは、脳、筋肉、および心臓の発生および恒常性において重要な役割を果たしている。筋緊張ジストロフィータンパク質キナーゼは、筋緊張と弛緩の役割を果たすミオシンホスファターゼを阻害する。一部の実施形態では、ＤＭＰＫをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１１９と少なくとも９０％、９５％、９９％または１００％の同一性を共有する。一部の実施形態では、ＤＭＰＫタンパク質は、配列番号１２０と少なくとも９０％、９５％、９９％または１００％の同一性を共有する。
一部の実施形態では、本開示は、改変心臓ＴＮＮＴ２プロモーターに動作可能に連結された、異所性Ｐ顆粒タンパク質５ホモログ（ＥＰＧ５）タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。同様に、一部の実施形態では、心臓特異的プロモーター（例えば、改変心臓ＴＮＮＴ２プロモーター）に動作可能に連結されたポリヌクレオチド配列は、ＥＰＧ５、またはその変異体、バリアント、もしくは断片である（例えば、配列番号１２１）。ヒトでは、ＥＰＧ５遺伝子は、ＥＰＧ５タンパク質（例えば、配列番号１２２）をコードし、これはオートファジーで機能して、オートファゴソームとリソソームとの間の相互作用を促進する。一部の実施形態では、ＥＰＧ５をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１２１と少なくとも９０％、９５％、９９％または１００％の同一性を共有する。一部の実施形態では、ＥＰＧ５タンパク質は、配列番号１２２と少なくとも９０％、９５％、９９％または１００％の同一性を共有する。
一部の実施形態では、本開示は、改変心臓ＴＮＮＴ２プロモーターに動作可能に連結された、ＥｖＣ毛様体複合体サブユニット１（ＥＶＣ）タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。同様に、一部の実施形態では、心臓特異的プロモーター（例えば、改変心臓ＴＮＮＴ２プロモーター）に動作可能に連結されたポリヌクレオチド配列は、ＥＶＣ、またはその変異体、バリアント、もしくは断片である（例えば、配列番号１２３）。ヒトでは、ＥＶＣ遺伝子は、主に線毛に見出されるＥＶＣタンパク質（例えば、配列番号１２４）をコードし、細胞間で情報を伝達する機能を果たす。ＥＶＣタンパク質はまた、細胞の成長および分化に関与するソニック・ヘッジホッグも調節する。一部の実施形態では、ＥＶＣをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１２３と少なくとも９０％、９５％、９９％または１００％の同一性を共有する。一部の実施形態では、ＥＶＣタンパク質は、配列番号１２４と少なくとも９０％、９５％、９９％または１００％の同一性を共有する。
一部の実施形態では、本開示は、改変心臓ＴＮＮＴ２プロモーターに動作可能に連結された、リンビンタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。同様に、一部の実施形態では、心臓特異的プロモーター（例えば、改変心臓ＴＮＮＴ２プロモーター）に動作可能に連結されたポリヌクレオチド配列は、ＥＶＣ２、またはその変異体、バリアント、もしくは断片である（例えば、配列番号１２５）。ヒトでは、ＥＶＣ２遺伝子は、リンビンタンパク質（例えば、配列番号１２６）をコードする。リンビンの機能は不明であるが、正常な成長と発達、特に骨と歯の発達には重要である。一部の実施形態では、リンビンをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１２５と少なくとも９０％、９５％、９９％または１００％の同一性を共有する。一部の実施形態では、リンビンタンパク質は、配列番号１２６と少なくとも９０％、９５％、９９％または１００％の同一性を共有する。
一部の実施形態では、本開示は、改変心臓ＴＮＮＴ２プロモーターに動作可能に連結された、フィブリリン－１タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。同様に、一部の実施形態では、心臓特異的プロモーター（例えば、改変心臓ＴＮＮＴ２プロモーター）に動作可能に連結されたポリヌクレオチド配列は、ＦＢＮ１、またはその変異体、バリアント、もしくは断片である（例えば、配列番号１２７）。ヒトでは、ＦＢＮ１遺伝子は、フィブリリン－１およびアスプロシンタンパク質（例えば、配列番号１２８）をコードする。フィブリリン－１は、カルシウム結合マイクロフィブリルの構造成分としての役割を果たす糖タンパク質であり、体全体にわたって弾性および非弾性の結合組織に力を与える支持を提供する。アスプロシンは、グルコースの恒常性を調節するために白色脂肪組織によって通常分泌されるホルモンである。一部の実施形態では、フィブリリン－１をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１２７と少なくとも９０％、９５％、９９％または１００％の同一性を共有する。一部の実施形態では、フィブリリン－１タンパク質は、配列番号１２８と少なくとも９０％、９５％、９９％または１００％の同一性を共有する。
一部の実施形態では、本開示は、改変心臓ＴＮＮＴ２プロモーターに動作可能に連結された、ニューロフィブロミン（ＮＦ１）タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。同様に、一部の実施形態では、心臓特異的プロモーター（例えば、改変心臓ＴＮＮＴ２プロモーター）に動作可能に連結されたポリヌクレオチド配列は、ＮＦ１、またはその変異体、バリアント、もしくは断片である（例えば、配列番号１２９）。ヒトでは、ＮＦ１遺伝子は、細胞の成長および分裂を刺激するＲａｓシグナル伝達経路の腫瘍抑制因子および陰性調節因子として機能するＮＦ１タンパク質（例えば、配列番号１３０）をコードする。一部の実施形態では、ＮＦ１をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１２９と少なくとも９０％、９５％、９９％または１００％の同一性を共有する。一部の実施形態では、ＮＦ１タンパク質は、配列番号１３０と少なくとも９０％、９５％、９９％または１００％の同一性を共有する。
一部の実施形態では、本開示は、改変心臓ＴＮＮＴ２プロモーターに動作可能に連結された、ナトリウムチャネルタンパク質５型サブユニットアルファ（ＳＣＮ５Ａ）タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。同様に、一部の実施形態では、心臓特異的プロモーター（例えば、改変心臓ＴＮＮＴ２プロモーター）に動作可能に連結されたポリヌクレオチド配列は、ＳＣＮ５Ａ、またはその変異体、バリアント、もしくは断片である（例えば、配列番号１３１）。ヒトでは、ＳＣＮ５Ａ遺伝子は、テトロドトキシン耐性電位依存性ナトリウムチャネルサブユニットであるＳＣＮ５Ａタンパク質（例えば、配列番号１３２）をコードする。ＳＣＮ５Ａは、主に心筋に見られ、心電図における活動電位の初期アップストロークに関与する。一部の実施形態では、ＳＣＮ５Ａをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１３１と少なくとも９０％、９５％、９９％または１００％の同一性を共有する。一部の実施形態では、ＳＣＮ５Ａタンパク質は、配列番号１３２と少なくとも９０％、９５％、９９％または１００％の同一性を共有する。
一部の実施形態では、本開示は、改変心臓ＴＮＮＴ２プロモーターに動作可能に連結された、ＳＯＳ１（ｓｏｎ ｏｆ ｓｅｖｅｎｌｅｓｓ ｈｏｍｏｌｏｇ １）タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。同様に、一部の実施形態では、心臓特異的プロモーター（例えば、改変心臓ＴＮＮＴ２プロモーター）に動作可能に連結されたポリヌクレオチド配列は、ＳＯＳ１、またはその変異体、バリアント、もしくは断片である（例えば、配列番号１３３）。ヒトでは、ＳＯＳ１遺伝子は、Ｒａｃ特異的グアニンヌクレオチド交換因子活性を促進することによってＲａｓからＲａｃへの形質導入シグナルに関与する３量体複合体の成分として機能するＳＯＳ１タンパク質（例えば、配列番号１３４）をコードする。一部の実施形態では、ＳＯＳ１をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１３３と少なくとも９０％、９５％、９９％または１００％の同一性を共有する。一部の実施形態では、ＳＯＳ１タンパク質は、配列番号１３４と少なくとも９０％、９５％、９９％または１００％の同一性を共有する。
一部の実施形態では、本開示は、改変心臓ＴＮＮＴ２プロモーターに動作可能に連結された、ナトリウム利尿ペプチド受容体１（ＮＰＲ１）タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。同様に、一部の実施形態では、心臓特異的プロモーター（例えば、改変心臓ＴＮＮＴ２プロモーター）に動作可能に連結されたポリヌクレオチド配列は、ＮＰＲ１、またはその変異体、バリアント、もしくは断片である（例えば、配列番号１３５）。ヒトにおけるＮＰＲ１遺伝子は、細胞内グアニリルシクラーゼ活性を有する膜貫通型触媒受容体であるＮＰＲ１タンパク質（ＧＣ－Ａとも呼称される）（例えば、配列番号１３６）をコードする。ＮＰＲ１は、心臓血管の恒常性において重要な役割を果たす血管活性ホルモンである、房室および脳のナトリウム利尿ペプチドの両方の受容体としての役割を果たす。一部の実施形態では、ＮＰＲ１をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１３５と少なくとも９０％、９５％、９９％または１００％の同一性を共有する。一部の実施形態では、ＮＰＲ１タンパク質は、配列番号１３６と少なくとも９０％、９５％、９９％または１００％の同一性を共有する。
一部の実施形態では、本開示は、改変心臓ＴＮＮＴ２プロモーターに動作可能に連結された、受容体チロシンタンパク質キナーゼｅｒｂＢ－４（ＥＲＢＢ４）タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。同様に、一部の実施形態では、心臓特異的プロモーター（例えば、改変心臓ＴＮＮＴ２プロモーター）に動作可能に連結されたポリヌクレオチド配列は、ＥＲＢＢ４、またはその変異体、バリアント、もしくは断片である（例えば、配列番号１３７）。ヒトのＥＲＢＢ４遺伝子は、ヒトのＥＲＢＢ４タンパク質（例えば、配列番号１３８）をコードし、これは上皮成長因子ファミリーの膜貫通型受容体である。ＥＲＢＢ４受容体を介したシグナル伝達は、有糸分裂や分化など、様々な細胞応答を誘導する。一部の実施形態では、ＥＲＢＢ４をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１３７と少なくとも９０％、９５％、９９％または１００％の同一性を共有する。一部の実施形態では、ＥＲＢＢ４タンパク質は、配列番号１３８と少なくとも９０％、９５％、９９％または１００％の同一性を共有する。
一部の実施形態では、本開示は、改変心臓ＴＮＮＴ２プロモーターに動作可能に連結された、血管活性腸ペプチド（ＶＩＰ）をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。同様に、一部の実施形態では、心臓特異的プロモーター（例えば、改変心臓ＴＮＮＴ２プロモーター）に動作可能に連結されたポリヌクレオチド配列は、ＶＩＰ、またはその変異体、バリアント、もしくは断片である（例えば、配列番号１３９）。ヒトでは、ＶＩＰ遺伝子は、神経調節物質および神経伝達物質として機能する血管活性腸ペプチド（例えば、配列番号１４０）をコードする。ＶＩＰは、強力な血管拡張薬であり、消化管における平滑筋活性、上皮細胞分泌および血流を調節する。一部の実施形態では、ＶＩＰをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１３９と少なくとも９０％、９５％、９９％または１００％の同一性を共有する。一部の実施形態では、ＶＩＰタンパク質は、配列番号１４０と少なくとも９０％、９５％、９９％または１００％の同一性を共有する。
一部の実施形態では、本開示は、改変心臓ＴＮＮＴ２プロモーターに動作可能に連結された、ベータ－ミオシン重鎖（ＭｙＨＣ－β）をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。同様に、一部の実施形態では、心臓特異的プロモーター（例えば、改変心臓ＴＮＮＴ２プロモーター）に動作可能に連結されたポリヌクレオチド配列は、ＭＹＨ７、またはその変異体、バリアント、もしくは断片である（例えば、配列番号１４１）。ヒトでは、ＭＹＨ７遺伝子は、心筋の太いフィラメントの大部分を形成する六量体非対様性運動であるＭｙＨＣ－βタンパク質（例えば、配列番号１４２）をコードする。ミオシン頭部におけるＡＴＰａｓｅの酵素活性は、ＡＴＰを加水分解し、脳室内の圧力および電力を生成するためにサルコメアを短縮するプロセスをあおる。一部の実施形態では、ＭｙＨＣ－βをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１４１と少なくとも９０％、９５％、９９％または１００％の同一性を共有する。一部の実施形態では、ＭｙＨＣ－βタンパク質は、配列番号１４２と少なくとも９０％、９５％、９９％または１００％の同一性を共有する。
ＩＩＩ．ベクター
一部の実施形態では、本開示は、心疾患の治療または予防のためのベクターを提供する。特に、本明細書に記載のベクターは、治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチドに動作可能に連結された心臓特異的プロモーターを含み、治療用タンパク質の発現は、それを必要とする対象（例えば、心筋症を有する対象）を治療する。例えば、一部の実施形態では、ベクターは、心筋症の治療または予防のためにＭＹＢＰＣ３タンパク質をコードするポリヌクレオチドに動作可能に結合された心臓ＴＮＮＴ２プロモーターを含むＡＡＶベースのベクターである。
一部の実施形態では、ベクターは、本明細書に記載される心臓特異的プロモーター（例えば、改変心臓トロポニンＴプロモーター）および治療用遺伝子産物（例えば、ＭＹＢＰＣ３タンパク質）に加えて、トランスフェクト、形質導入、または感染された細胞の同定または選択を容易にするマーカー遺伝子を含む。マーカー遺伝子の例としては、以下に限定されないが、蛍光タンパク質、例えば、強化緑色蛍光タンパク質、Ｄｓ－Ｒｅｄ（ＤｓＲｅｄ：Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ ｓｐ．ｒｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ（ＲＦＰ）；Ｂｅｖｉｓ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０（１１）：８３－８７）、黄色蛍光タンパク質、ｍＣｈｅｒｒｙ、およびシアノ蛍光タンパク質、ならびに選択剤、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ブラストシジン耐性遺伝子などに対する耐性を付与するタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。
一部の実施形態では、ベクターは、最大で約４．０キロ塩基、最大で約４．５キロ塩基、最大で約５キロ塩基、最大で約５．１キロ塩基、最大で約５．２キロ塩基、最大で約５．３キロ塩基、最大で約５．４キロ塩基、または最大で約５．５キロ塩基のサイズを有するポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、ベクターは、最大で約４．５キロ塩基のサイズを有するポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ベクターは、最大で約５キロ塩基のサイズを有するポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、ベクターは、最大で約５．５キロ塩基のサイズを有するポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ベクターは、最大で約６キロ塩基のサイズを有するポリヌクレオチド配列を備える。
宿主細胞にポリヌクレオチドを導入する方法は当該技術分野で公知であり、本明細書に記載されるポリヌクレオチドを細胞内に導入するために任意の公知の方法を使用することができる。適切な方法には、例えば、ウイルスまたはバクテリオファージ感染、トランスフェクション、コンジュゲーション、プロトプラスト融合、リポフェクション、電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）介在性トランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン介在性トランスフェクション、リポソーム介在性トランスフェクション、粒子銃技術、リン酸カルシウム沈殿物、直接マイクロ注入、ナノ粒子介在性核酸送達、マイクロ流体送達方法などが含まれる。
Ａ．非ウイルスベクター
一部の実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、トランスポゾン、ナノ粒子（例えば、脂質ナノ粒子）、リポソーム、エクソソーム、弱毒化細菌、またはウイルス様粒子などの非ウイルスベクター中の細胞に送達される。いくつかの実施形態では、非ウイルスベクターは、哺乳類ウイルス様粒子である。例えば、哺乳類ウイルス様粒子を生成することができる（例えば、哺乳類ウイルス様粒子の「空の」精製によって、その後、所望のカーゴと哺乳類ウイルス様粒子のエクスビボアセンブリによって）。非ウイルスベクターは、標的組織の特異性を変えるために標的化リガンドを組み込むように操作されてもよい。
Ｂ．ウイルスベクター
一部の実施形態では、ベクターはウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクターである。本明細書で使用される場合、用語「レトロウイルス」または「レトロウイルス」は、そのゲノムＲＮＡを直鎖二本鎖ＤＮＡコピーに逆転写し、その後そのゲノムＤＮＡを宿主ゲノムに共有結合するＲＮＡウイルスを指す。レトロウイルスベクターは、遺伝子送達のための一般的なツールである（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ．３５７：４５５－４６０（２０００））。ウイルスが宿主ゲノムに組み込まれると、それを「プロウイルス」と呼ぶ。プロウイルスは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの鋳型として機能し、ウイルスによってコードされるＲＮＡ分子の発現を指示する。一部の実施形態では、レトロウイルスベクターは、宿主細胞ゲノムに組み込まれないように改変される。
例示的なレトロウイルス（レトロウイルス科）には、（１）モルニーマウス白血病ウイルス（Ｍ－ＭｕＬＶ）、モロニーマウス肉腫ウイルス（ＭｏＭＳＶ）、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭｕＭＴＶ）、Ｇｉｂｂｏｎ ａｐｅ白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、およびネコ白血病ウイルス（ＦＬＶ）などの属、（２）サル泡沫状ウイルスなどのスプマウイルス属、（３）ヒト免疫不全ウイルス－１およびサル免疫不全ウイルスなどのレンチウイルス属が挙げられる。
本明細書で使用される場合、用語「レンチウイルスの」または「レンチウイルス」は、複雑なレトロウイルスの群（または属）を指す。例示的なレンチウイルスには以下が含まれるが、これらに限定されない：ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス、ＨＩＶ１型およびＨＩＶ２型を含む）、ビスナ・マエディウイルス（ＶＭＶ）ウイルス、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）。
いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクターである。アデノウイルスの遺伝子構成は、およそ３６ｋｂの直鎖二本鎖ＤＮＡウイルスを含み、これはアデノウイルスＤＮＡの大きな断片を７ｋｂまでの外来配列で置換することを可能にする（Ｇｒｕｎｈａｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｍｉｎａｒ ｉｎ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２００（２）：５３５－５４６，１９９２）。
いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＶＶ）ベクター、例えば、血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、および１０、またはそれらに由来するキメラＡＡＶからなる群から選択されるＡＡＶベクターである。
一部の実施形態では、ＡＡＶ発現ベクターは、標的化を強化するためにシュードタイプ化される。シュードタイピング戦略は、遺伝子導入を促進し、標的細胞型での発現を維持することができる。例えば、ＡＡＶ２ゲノムは、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７またはＡＡＶ８などの別のＡＡＶ血清型のキャプシドにパッケージングすることができ、それぞれ、ＡＶ２／５、ＡＡＶ２／７およびＡＡＶ２／８などのシュードタイプ化ベクターを産生し、Ｂａｌａｊｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｓｕｒｇ Ｒｅｓ．Ｓｅｐ；１８４（１）：６９１－６９８（２０１３）に記載されている。一部の実施形態では、ＡＡＶ９は、筋線維芽細胞様系列の発現を標的するために使用することができ、Ｐｉｒａｓ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２３：４６９－４７８（２０１６）に記載されている。一部の実施形態では、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６またはＡＡＶ９が使用され、一部の実施形態では、ＡＡＶは、Ａｓｏｋａｒｉ ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．Ｎｏｖ；２４（１１）：９０６－９１３（２０１３）；Ｐｏｚｓｇａｉ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．Ａｐｒ ５；２５（４）：８５５－８６９（２０１７）；Ｋｏｔｔｅｒｍａｎ，Ｍ．Ａ．ａｎｄ Ｄ．Ｖ．Ｓｃｈａｆｆｅｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓｅｓ ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１５：４４５－４５１（２０１４）；およびＵＳ２０１６０３４０３９３Ａ１をＳｃｈａｆｆｅｒ ｅｔ ａｌに記載されているように操作される。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、ＵＳ２０１８００６６２８５Ａ１に記載される標的細胞感染性を増加させるように操作されたＡＡＶである。
Ｃ．調節要素
一部の実施形態では、本開示は、治療用タンパク質または核酸をコードするポリヌクレオチドに動作可能に結合された一つ以上の調節要素を含むベクターを提供する。一部の実施形態では、調節要素は、心疾患の治療のための治療用タンパク質または核酸に動作可能に連結された心臓特異的プロモーター（例えば、改変ＴＮＮＴ２プロモーター）である。
本明細書で使用される場合、用語「調節要素」は、転写および翻訳を実施するために、宿主細胞タンパク質と相互作用するベクターの非翻訳領域（例えば、複製の起源、選択カセット、プロモーター、エンハンサー、翻訳開始シグナル（Ｓｈｉｎｅ Ｄａｌｇａｒｎｏ配列またはＫｏｚａｋ配列）イントロン、ポリアデニル化配列、５’および３’非翻訳領域）を指す。こうした要素は、その強度および特異性において変化し得る。転写調節要素は、真核細胞（例えば、哺乳類細胞）または原核細胞（例えば、細菌細胞または原始細胞）のいずれかで機能してもよい。一部の実施形態では、本明細書に記載される治療用遺伝子産物（例えば、治療用タンパク質または核酸）をコードするポリヌクレオチド配列は、原核細胞および真核細胞の両方でポリヌクレオチドの発現を可能にする複数の制御要素に動作可能に連結される。
本明細書で使用される場合、用語「転写開始部位」または「ＴＳＳ」は、ＲＮＡポリメラーゼが転写を開始する時に、ＲＮＡポリメラーゼによって転写された第一の塩基対を指す。ＴＳＳは、開始コドン（キノニカル、ＡＴＧ）とは異なっており、これはポリヌクレオチドの転写領域のＴＳＳの下流でなければならない。転写開始部位の位置は、実験的に、または様々な予測アルゴリズムのいずれかを使用した予測によって決定することができる。注釈付きＴＳＳは、真核生物プロモーターデータベースおよびＵＣＳＣゲノムブラウザから入手可能である。ＴＮＮＴ２の複数のＴＳＳは、ＵＣＳＣゲノムブラウザで特定される。
本明細書で使用される場合、ＴＮＮＴ２のＴＳＳは、ｄｂＴＳＳによって識別されるモチーフの５’末端でＣによって識別される配列であると定義される：ＣＴＣＣＡＴＣ。
本明細書で使用される場合、用語「改変心臓ＴＮＮＴ２プロモーター」は、各々が、配列番号１として表１に提供されるＴＮＮＴ２ｐ－６００セグメントの対応するセグメントと７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を共有する一つ以上の連続的または不連続のポリヌクレオチドセグメントを含む、少なくとも２００塩基対のポリヌクレオチド配列を含むプロモーターを指す。それが「プロモーター」である場合、改変心臓ＴＮＮＴ２プロモーターは、プロモーター内のＴＳＳで、またはその近傍（すなわち、本明細書に定義されるＴＮＮＴ２のＴＴＳで、またはその近傍）で、宿主細胞又は標的細胞において、ＲＮＡポリメラーゼによる転写の開始を促進することができなければならず、または、ＴＮＮＴ２の内因性ＴＳＳが、改変心臓ＴＮＮＴ２プロモーターに存在せず、その後、最大１００塩基対の異種ＴＳＳで、改変心臓ＴＮＮＴ２プロモーターの下流（センス鎖の３’）から下流（３’）端で、ＲＮＡポリメラーゼによる転写の開始を促進することができなければならない。同様に、改変心臓ＴＮＮＴ２プロモーターは、ＴＮＮＴ２のＴＳＳの上流の配列のみを含み、またはＴＮＮＴ２のＴＳＳを含む。
プロモーター（例えば、改変心臓ＴＮＮＴ２プロモーター）、非常に多くの塩基対を「有する」プロモーターの長さは、本明細書で使用される場合、プロモーターの５’末端からその３’末端までのポリヌクレオチド配列中の塩基対の数に従って定義され、末端を含み、参照プロモーター配列（例えば、ヒトまたはその他の生物の内因性心臓ＴＮＮＴ２プロモーター）と整列しない任意の介在配列を含む。プロモーターの５’末端および３’末端は、配列がＢＬＡＳＴアルゴリズムまたは同等物によって整列される場合、参照プロモーター配列の対応する配列に合致するように、いずれかの方向の最後の塩基対として定義される。したがって、ベクター中のプロモーターの長さは、ベクターのポリヌクレオチド配列を使用して、参照生物のゲノムを含有するヌクレオチドデータベースを検索することによって、および約１～５ｋｂの内因性遺伝子を含むまたはその範囲にある一つ以上の整列領域を特定することによって、またはベクターを所定の参照プロモーターに整列することによって決定することができる。プロモーターが、連続セグメントとして参照ゲノムまたは参照プロモーター配列と整列する場合、プロモーターの長さは、報告される長さの整列である（３’末端位置から５’末端位置を引いたもの、ＴＳＳが含まれない限り＋ １）。プロモーターが複数のセグメント（例えば、２、３、４、または５セグメント）で整列する場合、プロモーターの長さは、参照ゲノムまたは参照プロモーター配列の３’セグメントの３’末端位置から、参照ゲノムまたは参照プロモーター配列の５’セグメントの５’末端位置を減算し、およびＴＳＳが含まれない限り１を加算（計算された長さが両方の終点を含むように）することによって計算することができる。例えば、ＴＳＳ（－１００ｂｐ）の前の塩基対１００ｂｐから、ＴＳＳ（－５ｂｐ）の前の５ｂｐまで延在するプロモーターの長さは、－５－（－１００）＋１＝１００－５＋１＝９６ｂｐである。ＴＳＳは、＋１ｂｐと番号付けされる。したがって、ＴＳＳ（－１００ｂｐ）の前の塩基対１００ｂｐから、ＴＳＳ（＋５ｂｐ）の後の５ｂｐまで延在するプロモーターの長さは、＋５－（－１００）＝１００＋５＝１０５ｂｐである。
用語「エンハンサー」は、転写強化をもたらすことができる配列を含有するＤＮＡのセグメントを指し、一部の例では、別の制御配列に対してその配向とは無関係に機能し得る。エンハンサーは、プロモーターおよび／または他のエンハンサー要素と協働的にまたは相加的に機能することができる。エンハンサーは、プロモーターと重複してもよく、またはプロモーターの上流もしくは下流であってもよい。一部の実施形態では、改変心臓ＴＮＮＴ２プロモーターは、一つ以上のエンハンサーを含む。いくつかの実施形態では、改変された心臓ＴＮＮＴ２プロモーターは、エンハンサーを含まない。
改変心臓ＴＮＮＴ２プロモーターに加えて、またはその代わりに、一部の実施形態は、他の真核性プロモーターを採用しており、これらに限定されないが、以下を含む：最初期のサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ、ウイルスサルウイルス４０（ＳＶ４０）（例えば、初期および後期ＳＶ４０）、脾臓焦点形成ウイルス（ＳＦＦＶ）プロモーター、レトロウイルスからの長末端リピート（ＬＴＲ）（例えば、、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）ＬＴＲプロモーターまたはＲｏｕｓ肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲ、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（チミジンキナーゼ）プロモーター、Ｈ５、Ｐ７．５、およびワクシニアウイルス由来のＰ１１プロモーター、伸長因子１－アルファ（ＥＦ１α）プロモーター、初期増殖応答１（ＥＧＲ１）プロモーター、フェリチンＨ（ＦｅｒＨ）プロモーター、フェリチンＬ（ＦｅｒＬ）プロモーターと、グリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモーター、真核翻訳開始因子４Ａ１（ＥＩＦ４Ａ１）プロモーター、熱ショック７０ｋＤａタンパク質５（ＨＳＰＡ５）プロモーターと、を含み、熱ショックタンパク質９０ｋＤａベータ、メンバー１（ＨＳＰ９０Ｂ１）プロモーター、熱ショックタンパク質７０ｋＤａ（ＨＳＰ７０）プロモーター、β－キネシン（β－ＫＩＮ）プロモーター、ヒトＲＯＳＡ ２６座位（Ｉｒｉｏｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２５、１４７７－１４８２（２００７）、ユビキチンＣ（ＵＢＣ）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ－１（ＰＧＫ）プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ－アクチン（ＣＡＧ）プロモーター、β－アクチンプロモーターおよび骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、削除された負対照領域、ｄｌ５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーター、およびマウスメタロチオネイン－ｌ。ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位および転写ターミネーターを含有してもよい。ベクターはまた、発現を増幅するためのポリヌクレオチド配列を含んでもよい。ベクターはまた、部位特異的修飾ポリペプチドに融合されたタンパク質タグ（例えば、６ｘＨｉｓタグ、ヘマグルチニンタグ、緑色蛍光タンパク質など）をコードするポリヌクレオチド配列を含んでもよく、それゆえキメラポリペプチドが生じる。
一部の実施形態では、本開示のプロモーターは組織特異的である。用語「組織特異的プロモーター」は、プロモーターとして機能するポリヌクレオチド配列を意味し、すなわち、プロモーターに動作可能に連結された選択されたポリヌクレオチド配列の発現を調節し、筋細胞または心筋細胞などの組織の特定の細胞における選択されたポリヌクレオチド配列の発現に影響を及ぼす。一部の実施形態では、組織特異的プロモーターは心臓特異的プロモーターである。一部の実施形態では、心臓特異的プロモーターは、ＴＮＮＴ２または改変ＴＮＮＴ２プロモーターである。組織特異的プロモーターは、参照組織よりも対象の組織において、５倍、１０倍、２０倍、２５倍またはそれ以上のレベルで、動作可能に連結されたポリヌクレオチド、またはそのポリヌクレオチドによってコードされた遺伝子産物の発現を引き起こす。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のベクターは、転写終結シグナルを含む。異種核酸転写物の効率的な終結およびポリアデニル化を指示する要素は、異種遺伝子発現を増加させる。転写終結シグナルは、ポリアデニル化シグナルの下流に一般的に見出される。一部の実施形態では、ベクターは、発現されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのポリアデニル化配列３’を含む。本明細書で使用される場合、用語「ポリＡ部位」または「ポリＡ配列」は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによる新生ＲＮＡ転写物の終結およびポリアデニル化の両方を指示するＤＮＡ配列を示す。ポリアデニル化配列は、ポリＡテールをコード配列の３’末端に添加することによって、ｍＲＮＡ安定性を促進し得、それゆえ、翻訳効率の向上に寄与する。切断およびポリアデニル化は、ＲＮＡ中のポリ（Ａ）配列によって指示される。哺乳類プレｍＲＮＡのコアポリ（Ａ）配列は、切断－ポリアデニル化部位に隣接する二つの認識要素を有する。典型的には、ほぼ不変のＡＡＵＡＡＡヘキサマーは、Ｕ残基またはＧＵ残基が豊富な、より可変的な要素の２０～５０ヌクレオチド上流に存在する。新生転写物の切断は、これら二つの要素の間に発生し、５’切断産物に最大２５０個のアデノシンを添加することに連結される。特定の実施形態では、コアポリ（Ａ）配列は、理想的なポリＡ配列（例えば、ＡＡＴＡＡＡ、ＡＴＴＡＡＡ、ＡＧＴＡＡＡ）である。特定の実施形態では、ポリ（Ａ）配列は、ＳＶ４０ポリＡ配列、ウシ成長ホルモンポリＡ配列（ＢＧＨｐＡ）、ウサギβ－グロビンポリＡ配列（ｒβｇｐＡ）、そのバリアント、または当技術分野で公知の別の適切な異種または内因性ポリＡ配列である。
ＩＶ．組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ウイルスゲノム、発現カセット、およびｒＡＡＶビリオン
本開示は、導入遺伝子、例えばＭＹＢＰＣ３ポリペプチド、またはその機能的バリアントをコードする配列をコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットを提供する。発現カセット中の導入遺伝子ポリヌクレオチド配列は、例えば、タンパク質をコードするオープンリーディングフレームであってもよい。発現カセットは、任意選択的に、導入遺伝子に動作可能に連結されたプロモーター、任意選択的にイントロン領域、任意選択的にポリアデニル化（ポリ（Ａ））シグナル、任意選択的にウッドチャック肝炎ウイルス転写後因子（ＷＰＲＥ）、および任意選択的に転写終結シグナルを含んでもよい。発現カセットは、一つ以上の逆位末端リピート（ＩＴＲ）に隣接してもよい。一つ以上のＩＴＲに隣接した発現カセットは、本明細書では「ウイルスゲノム」と呼ばれる。発現カセット中のＩＴＲは、発現カセットのウイルスパッケージングに使用されるマーカーとしての役目を果たす（Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．６：１３２９－４１（１９９５））。本開示のウイルスゲノムの例示的および非限定的な実施形態を図１Ａ、図１Ｃ、および図２Ａに示す。発現カセットをコードするポリヌクレオチドは、宿主細胞内で導入遺伝子を発現する機能を提供する。発現カセットは、例えば、キャプシドタンパク質を含むｒＡＡＶビリオンおよび発現カセットを含むウイルスゲノムで宿主細胞に感染させることによって、宿主細胞ゲノム内に統合することができる。
発現カセットのプロモーター配列は、存在する場合、導入遺伝子をコードするポリヌクレオチド、例えばＭＹＢＰＣ３をコードする配列またはその機能的バリアントの発現を制御する。様々なプロモーターを使用することができる。プロモーターは、細胞型特異的であってもよい。構成的プロモーターは、発現カセットに使用され、例えば、ニワトリβ－アクチンプロモーター（ＣＡＧ）に融合されるサイトメガロウイルスエンハンサー、サルウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、および単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫ）プロモーター（Ｄａｍｄｉｎｄｏｒｊ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．９：ｅ１０６４７２（２０１４））であってもよい。他の細胞型特異的プロモーターも使用されうる。心臓細胞特異的プロモーターは、例えば、ＭＬＣ２ｖプロモーター（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ ｅｔ ａｌ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ．３９：６５１－５（２００２））および心臓トロポニン－Ｔ（ｃＴｎＴ）プロモーター（Ｋｏｎｋａｌｍａｔｔ ｅｔ ａｌ．Ｃｉｒｃ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｉｍａｇｉｎｇ．６：４７８－４８６（２０１３））。
一部の態様では、本開示は、プロモーターが、特定のサイズの導入遺伝子を収容するように、心臓細胞特異的発現および長さに最適化されている。一実施形態では、本明細書に記載のｒＡＡＶベクターゲノムのプロモーターは、３００ｂｐ～５００ｂｐを有するポリヌクレオチドである。
本開示の発現カセット配列およびウイルスゲノム配列の例は、表５に見出すことができる。一部の実施形態では、発現カセットは、配列番号９５、配列番号９９、または配列番号１０１と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を共有するポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ウイルスゲノムは、配列番号９８、配列番号１００、または配列番号１０２と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を共有するポリヌクレオチド配列を含む。別の実施形態では、発現カセットは、導入遺伝子に隣接するポリヌクレオチド領域に従ってセグメント化され得る。カセットの５’末端から導入遺伝子の５’末端に及ぶポリヌクレオチド配列は、本明細書では発現カセットの５’セグメントと呼ばれる。導入遺伝子の３’末端から発現カセットの３’末端に及ぶポリヌクレオチド配列は、本明細書では発現カセットの３’セグメントと呼ばれる。一実施形態では、発現カセットの５’セグメントは、配列番号９３と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を共有するポリヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、発現カセットの３’セグメントは、配列番号９４と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を共有するポリヌクレオチド配列を含む。
ｒＡＡＶベクターまたはｒＡＡＶビリオンによって送達される大きな導入遺伝子を発現する能力は限定的である。ｒＡＡＶベクターゲノムサイズは、約５ｋｂの最大配列長を有し、したがって、制御要素、例えば、プロモーター、および導入遺伝子、例えば、ＭＹＢＰＣ３を含む発現カセットに必要なすべての要素の長さの限界を提供し、ｒＡＡＶベクターゲノムは、５ｋｂを超えると、ｒＡＡＶビリオンパッケージの間にベクターゲノム切断をもたらす、または導入遺伝子の発現を切断する（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．１８：８０－８６（２０１０））。一部の実施形態では、本開示は、大きな導入遺伝子を担持するために最適化されたｒＡＡＶベクターゲノムを提供する。ベクターゲノムのエレメントは、より大きな導入遺伝子を収容するために、長さが短くなっている。一実施形態では、発現カセットの５’セグメントおよび３’セグメントは共に、最大で０．８ｋｂｐまたは最大で０．９ｋｂｐを含む。別の実施形態では、５’ＩＴＲ、５’セグメント、３’セグメント、および３’ＩＴＲは共に、１．２ｋｂｐを含む、または最大で１．３ｋｂｐを含む。一実施形態では、５’セグメントは、最大５００ｂｐまたは最大４８０ｂｐを含む。一実施形態では、３’セグメントは、最大２００ｂｐまたは最大１５０ｂｐを含む。別の実施形態では、ベクターゲノムは最大で４．７ｋｂｐ、４．８ｋｂｐ、４．９ｋｂｐまたは５．０ｋｂｐ含む。一部の実施形態では、遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドは、３ｋｂ～１１ｋｂ、３ｋｂｐ～５ｋｂｐ、３．５ｋｂｐ～４．５ｋｂｐまたは３．７ｋｂｐ～４ｋｂｐを含む。一部の実施形態では、遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドは、３．７ｋｂｐ～３．９ｋｂｐを含む。一部の実施形態では、遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドは、３．８ｋｂｐを含む。
Figure 2023513749000012
Figure 2023513749000013
Figure 2023513749000014
Figure 2023513749000015
Figure 2023513749000016
本開示の一部の態様では、ｒＡＡＶビリオンは、本明細書に記載される発現カセットを、例えば、心筋症を治療するために、対象の心臓細胞に送達するために使用される。したがって、本開示は、ｒＡＡＶビリオン、ＡＡＶキャプシドを含むｒＡＡＶビリオン、およびプロモーターに動作可能に連結された導入遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットを提供する。
本開示のｒＡＡＶビリオンは、キャプシドタンパク質を含む。Ｃａｐｓｉｄタンパク質は、発現カセットを含むｒＡＡＶビリオンのアセンブルされた正二十面体パッケージを構成する構造タンパク質である。キャプシドタンパク質は、血清型によって分類される。ｒＡＡＶビリオン中の野生型キャプシド血清型は、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１またはＡＡＶ１２であってもよい（Ｎａｓｏ ｅｔ ａｌ．ＢｉｏＤｒｕｇｓ ３１：３１７－３３４（２０１７））。操作されたキャプシドタイプには、キメラキャプシドおよびモザイクキャプシドを含む（Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：２９９－３１０（２００５））。キャプシドは、特定の組織または細胞型を形質導入する能力に基づいて、ｒＡＡＶビリオンに選択される（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｄｅｓ．２１：３２４８－５６（２０１５））。
本明細書に記載される導入遺伝子の送達のために、心臓細胞へのｒＡＡＶビリオン遺伝子導入を促進することができる任意のキャプシドタンパク質を使用することができる。高発現をもたらす心臓細胞への導入遺伝子送達のためのｒＡＡＶビリオンに使用されるキャプシドタンパク質は、例えば、ＡＡＶ４、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９があり得る（Ｚｉｎｃａｒｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１６：Ｐ１０７３－１０８０（２００８））。複合ライブラリーを介して生成されたキメラキャプシドなどの人工キャプシドは、高発現をもたらす心臓細胞への導入遺伝子送達にも使用され得る（米国特許第６３／０１２，７０３号を参照、その内容物は参照により本明細書に組み込まれる）。様々な特徴を有する他のキャプシドタンパク質も、本開示のｒＡＡＶビリオンに使用することができる。ＡＡＶベクターおよびキャプシドは、米国特許出願 公開 番号 ＵＳ１００１１６４０Ｂ２；ＵＳ７８９２８０９Ｂ２、ＵＳ８６３２７６４Ｂ２、ＵＳ８８８９６４１Ｂ２、ＵＳ９４７５８４５Ｂ２、ＵＳ１０８８９８３３Ｂ２、ＵＳ１０４８００１１Ｂ２およびＵＳ１０８９４９４９Ｂ２に提供されており、その内容は参照により本明細書に組み込まれる、ならびに国際特許 公開 番号 ＷＯ２０２０１９８７３７Ａ１、ＷＯ２０１９０２８３０６Ａ２、ＷＯ２０１６０５４５５４Ａ１、ＷＯ２０１８１５２３３３Ａ１、ＷＯ２０１７１０６２３６Ａ１、ＷＯ２００８１２４７２４Ａ１、ＷＯ２０１７２１２０１９Ａ１、ＷＯ２０２０１１７８９８Ａ１、ＷＯ２０１７１９２７５０Ａ１、ＷＯ２０２０１９１３００Ａ１、およびＷＯ２０１７１００６７１Ａ１、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、本開示のｒＡＡＶビリオンは、操作されたキャプシドタンパク質を含む。操作されたキャプシドタンパク質は、親、例えば、野生型、キャプシドに由来し得、例えば、一つ以上の部位で親キャプシド配列に関してバリアントポリペプチド配列を含む。例えば、親キャプシドのバリアント部位は、ＶＲ－ＩＶ部位、ＶＲ－Ｖ部位、ＶＲ－ＶＩＩ部位、および／またはＶＲ－ＶＩＩＩ部位で発生し得る（例えば、Ｂｕｎｉｎｇ ａｎｄ Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ．１２：２４８－２６５（２０１９）を参照されたい。
いくつかの実施形態では、キャプシドタンパク質は、ＡＡＶ５／ＡＡＶ９キメラキャプシドタンパク質である。いくつかの実施形態では、キメラキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ５キャプシドタンパク質（配列番号 １４４）に由来する少なくとも１、２、３、４、５以上のポリペプチドセグメントを含む。いくつかの実施形態では、キメラキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ９キャプシドタンパク質（配列番号 １４３）に由来する少なくとも１、２、３、４、５以上のポリペプチドセグメントを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも一つのポリペプチドセグメントは、ＡＡＶ５キャプシドタンパク質に由来し、少なくとも一つのポリペプチドセグメントは、ＡＡＶ９キャプシドタンパク質に由来している。
いくつかの実施形態では、キャプシドタンパク質は、組合せキャプシドタンパク質である。本明細書で使用される場合、「組合せキャプシドタンパク質」は、ＡＡＶ５／ＡＡＶ９キメラキャプシドタンパク質を指し、これは一つ以上の部位でのキメラ親配列に対するアミノ酸変異をさらに含む。いくつかの実施形態では、キメラ親配列の一つまたは複数の部位は、ＡＡＶ９キャプシドタンパク質のＶＲ－ＩＶ部位、ＶＲ－Ｖ部位、ＶＲ－ＶＩＩ部位、およびＶＲ－ＶＩＩＩ部位にあたる部位から選択される。
いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、表６から選択される操作されたキャプシドタンパク質を含む。
Figure 2023513749000017
Figure 2023513749000018
一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、ｒＡＡＶビリオンが独立してそのゲノムをさらに複製およびパッケージングすることができないという点で、複製欠損である。例えば、心臓細胞がｒＡＡＶビリオンで標的化されている場合、導入遺伝子は標的心臓細胞で発現されるが、標的心臓細胞がＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子およびアクセサリー機能遺伝子を欠くため、ｒＡＡＶは複製することができない。
一部の実施形態では、本明細書に記載の発現カセットを封入する本開示のｒＡＡＶビリオンは、ヘルパーフリー生産を使用して生産することができる。ｒＡＡＶは、複製欠損ウイルスであり、通常、感染ｒＡＡＶビリオンのパッケージングのための宿主細胞中のアデノウイルスなどの生きたヘルパーウイルスからの成分を必要とする。ｒＡＡＶヘルパーフリー生産システムは、生きているヘルパーウイルスなしで感染ｒＡＡＶビリオンの生産を可能にする。ヘルパーフリーシステムでは、宿主パッケージング細胞株は、三つのプラスミドと同時導入される。第一のプラスミドは、ｒＡＡＶビリオンのパッケージングに必要なアデノウイルス遺伝子産物（例えば、Ｅ２Ａ、Ｅ４およびＶＡ ＲＮＡ遺伝子）を含有してもよい。第二のプラスミドは、必要なＡＡＶ遺伝子（例えば、ＲＥＰ遺伝子およびＣＡＰ遺伝子）を含有してもよい。第三のプラスミドは、対象の導入遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列と、ＩＴＲに隣接したプロモーターを含有する。宿主細胞パッケージング細胞株は、例えば、ＡＡＶ－２９３宿主細胞であってもよい。適切な宿主細胞は、プラスミドによって供給されない感染性ｒＡＡＶビリオンのパッケージングに必要な追加の構成要素を含有する。いくつかの実施形態では、ＣＡＰ遺伝子は、例えば、本明細書に記載のＡＡＶキャプシドタンパク質をコードしてもよい。
ＩＶ．治療方法
本開示はまた、本明細書に開示されるｒＡＡＶベクターゲノムまたはｒＡＡＶビリオン、ならびに一つ以上の薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤を含む医薬組成物を提供する。特定の実施形態では、医薬組成物は、心臓特異的プロモーター（例えば、改変ＴＮＮＴ２プロモーター）に動作可能に連結された治療用タンパク質または核酸をコードするポリヌクレオチド配列を含む、本明細書に記載されるｒＡＡＶベクターゲノムまたはｒＡＡＶビリオンを含む。例えば、一部の実施形態では、医薬組成物は、ＭＹＢＰＣ３タンパク質（配列番号８６）に動作可能に結合された改変心臓ＴＮＮＴ２プロモーター（配列番号３）を含むＡＡＶ９ベクターである。例えば、心筋症の予防または治療における使用のための、心臓の収縮機能を回復させることができる治療用タンパク質または核酸をコードするポリヌクレオチド配列を含む治療有効量のベクターを含む、医薬組成物が提供される。
本開示は、ポリヌクレオチドを細胞に発現する方法を提供する。方法は、例えば、本明細書に記載されるｒＡＡＶビリオン、ｒＡＡＶベクターゲノムまたは発現カセットを用いて標的細胞を形質導入することを含み得る。標的細胞は、例えば、心臓細胞、筋細胞、人工多能性幹細胞由来心筋細胞（ｉＰＳＣ－ＣＭ）、心筋細胞、またはＭＹＢＰＣ３－／－ ｉＰＳＣ－ＣＭであり得るが、これらに限定されない。一態様では、細胞内でＭＹＢＰＣ３タンパク質を発現する方法は、本明細書に記載されるｒＡＡＶビリオンまたはｒＡＡＶベクターゲノムを用いて、標的細胞または標的細胞の集団を形質導入することを含む。一実施形態では、細胞はＭＹＢＰＣ３－／－細胞である。一実施形態では、細胞は、内因性ＭＹＢＰＣ３遺伝子の一方または両方のコピーに不活化変異を含む。
本明細書に記載される組成物は、心臓疾患または状態を有する対象を治療する方法に使用することができる。「治療する」または「それを必要とする状態または対象の治療」とは、（１）症状の減少などの臨床結果を含む有益または望ましい結果を得るための措置を講じること、（２）疾患を予防すること、例えば、疾患の臨床症状が疾患にかかりやすい患者に発現させないが、疾患の症状を経験していない、または症状を呈していないこと、（３）疾患を阻害すること、例えば、疾患またはその臨床症状の発現を停止または低減すること、（４）疾患を軽減し、例えば 疾患またはその臨床症状の退縮を引き起こすこと、または（５）疾患を遅らせること、を指す。本発明の目的のために、有益または所望の臨床結果には、以下に限定されないが、心サルコメアの収縮を促進することが含まれる。
本開示の組成物および方法を使用した治療を必要とする対象としては、以下に限定されないが、先天性心疾患を有する個体、変性性筋疾患に罹患している個体、虚血性心臓組織をもたらす状態を罹患している個体（例えば、冠動脈疾患を有する個人）などが挙げられる。一部の例では、方法は、変性性筋疾患または状態（例えば、家族性心筋症、拡張型心筋症、肥大型心筋症、拘束型心筋症、または結果として生じる虚血性心筋症を伴う冠動脈疾患）を治療するために有用である。いくつかの実施例では、対象の方法は、心臓または心血管の疾患または障害を有する個体を治療するために有用であり、例えば心臓血管疾患、動脈瘤、狭窄、不整脈、アテローム性動脈硬化症、脳血管障害（脳卒中）、脳血管疾患、先天性心疾患、うっ血性心不全、心筋炎、冠状動脈疾患、拡張動脈疾患、拡張障害、心内膜炎、高血圧（高血圧症）、心筋症、肥大型心筋症、拘束性心筋症、結果として生じる虚血性心筋症を伴う冠動脈疾患、僧帽弁逸脱、心筋梗塞（心臓発作）、または静脈血栓塞栓症である。一部の例では、対象は心筋症に罹患しているか、または心筋症のリスクがある。
一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法は、対象における心筋症の予防および／または治療に使用することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、心筋ミオシン結合タンパク質Ｃ（ＭＹＢＰＣ３）の変異、例えば、肥大型心筋症および家族性肥大型心筋症に関連する心筋症を治療するために使用することができる。本明細書に記載される組成物および方法によって治療される心筋症はまた、肺塞栓、静脈血栓、心筋梗塞、一過性虚血性発作、末梢血管障害、アテローム性動脈硬化症、虚血性心疾患、および／または他の心筋損傷または血管疾患に関連する心筋症を含み得る。特定の実施形態では、本明細書に記載される組成物および方法によって治療される心筋症は、左心室の過収縮に関連する心不全など、心筋組織の過収縮に関連する心疾患を含み得る。
一部の実施形態では、本明細書に記載される組成物および方法は、治療用タンパク質もしくは核酸（例えば、ＭＹＢＰＣ３タンパク質）、またはその変異体、バリアント、もしくは断片の検出可能な発現を誘導して、それを必要とする対象において心筋組織の収縮機能を調節することができる。一部の実施形態では、対象に投与された心筋組織における収縮機能を調節する組成物の量、濃度、および量は、有害な副作用を軽減しながら、心臓の機能パラメータを実質的に改善するように制御および／または最適化することができる。
心筋組織に投与される収縮機能を調節する組成物の量は、治療用タンパク質または核酸（例えば、ＭＹＢＰＣ３タンパク質）または変異体、バリアント、またはその断片の心臓における検出可能な発現を生じさせる、収縮機能を保存および／または改善する、心筋症の出現を遅らせるか、または疾患の病理学的経過を逆転させる、筋細胞生存率を増加させる、筋線維機能を改善する、左室肥大を阻害する、心肥大を退縮させる、心臓の収縮期機能と拡張期機能を正常にする、筋線維線維層レベルで正常なクロスブリッジ挙動を復元するに必要な量であってもよい。
一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法は、治療される対象の心臓細胞におけるＭＹＢＰＣ３タンパク質、またはその変異体、バリアント、または断片の検出可能な発現をもたらす。一部の実施形態では、本明細書に記載されるｒＡＡＶベクターゲノムまたはｒＡＡＶビリオンの投与は、対象の心臓におけるＭＹＢＰＣ３タンパク質の特異的発現を引き起こす。一部の実施形態では、本明細書に記載されるｒＡＡＶベクターゲノムまたはｒＡＡＶビリオンの投与は、対象の骨格組織、脳および／または肝臓にＭＹＢＰＣ３の低いまたは検出不能な発現を引き起こし、任意選択的に、対象は心筋症に罹患しているか、または心筋症のリスクがある。
一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法は、治療される対象の心臓細胞において、ＫＣＮＨ２タンパク質またはその変異体、バリアント、または断片の検出可能な発現をもたらす。
一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法は、治療される対象の心臓細胞において、ＴＲＰＭ４タンパク質またはその変異体、バリアント、または断片の検出可能な発現をもたらす。
一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法は、治療される対象の心臓細胞において、ＤＳＧ２タンパク質またはその変異体、バリアント、または断片の検出可能な発現をもたらす。
一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法は、治療される対象の心臓細胞において、ＡＴＰ２Ａ２タンパク質、またはその変異体、バリアント、または断片の検出可能な発現をもたらす。
一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法は、治療される対象の心臓細胞において、ＣＡＣＮＡ１Ｃ、ＤＭＤ、ＤＭＰＫ、ＥＰＧ５、ＥＶＣ、ＥＶＣ２、ＦＢＮ１、ＮＦ１、ＳＣＮ５Ａ、ＳＯＳ１、ＮＰＲ１、ＥＲＢＢ４、ＶＩＰもしくはＭＹＨ７、またはその変異体、バリアント、もしくは断片の検出可能な発現をもたらす。
「検出可能な発現」は、一般的には、ベクターで処置されていない対照対象または組織と比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％またはそれ以上の発現を指す。いくつかの実施形態では、検出可能な発現は、ベクターなし対照よりも１．５倍、２倍、２．５倍、または３倍大きい発現を意味する。発現は、以下の実施例に記載されるようなウエスタンブロット、または酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、または当技術分野で公知の他の方法によって評価することができる。一部の事例では、発現は、標準曲線を使用して定量的に測定される。標準曲線は、精製タンパク質、例えば、精製ＭＹＢＰＣ３タンパク質を使用して、実施例に記載される方法または当技術分野で公知の方法によって生成することができる。あるいは、治療用遺伝子産物の発現は、対応するｍＲＮＡの定量によって評価することができる。
一部の実施形態では、心臓組織における治療用遺伝子産物の検出可能な発現は、対象の体重キログラム（ｋｇ）あたりのベクターゲノムが３×１０１４ｖｇ／ｋｇ以下、２×１０１４ｖｇ／ｋｇ以下、１×１０１４ｖｇ／ｋｇ以下、９×１０１３ｖｇ／ｋｇ以下、８×１０１３ｖｇ／ｋｇ以下、７×１０１３ｖｇ／ｋｇ以下、６×１０１３ｖｇ／ｋｇ以下、５×１０１３ｖｇ／ｋｇ以下、４×１０１３ｖｇ／ｋｇ以下、３×１０１３ｖｇ／ｋｇ以下、２×１０１３ｖｇ／ｋｇ以下または１×１０１３ｖｇ／ｋｇ以下の用量で生じる。
様々な実施形態において、本明細書に記載される組成物は、本明細書に記載されるｒＡＡＶビリオンまたはベクターゲノム、ならびに一つ以上の薬学的に許容される賦形剤を含有する。薬学的に許容可能な賦形剤は、注射することができる製剤に薬学的に許容可能なビヒクル（例えば、担体、希釈剤および賦形剤）を含み得る。これらは、特に、等張性の滅菌生理食塩水溶液（リン酸一ナトリウムもしくはリン酸二ナトリウム、ナトリウム、カリウム、カルシウムもしくは塩化マグネシウム等またはこのような塩の混合物）であってもよく、または滅菌水もしくは生理食塩水の事例に応じて、添加時に注射用溶液の構成を可能にする、乾燥、特に凍結乾燥組成物であってもよい。注射可能な使用に適した例示的な医薬品形態としては、例えば、滅菌水溶液または分散液、ゴマ油、ピーナッツ油または水性プロピレングリコールを含む製剤、および滅菌注射溶液または分散液の即時調製のための滅菌粉末が挙げられる。
様々な実施形態において、本開示の医薬組成物は、約１×１０８ゲノムコピー／ミリリットル（ＧＣ／ｍＬ）、約５×１０８ＧＣ／ｍＬ、約１×１０９ＧＣ／ｍＬ、約５×１０９ＧＣ／ｍＬ、約１×１０１０ＧＣ／ｍＬ、約５×１０１０ＧＣ／ｍＬ、約１×１０１１ＧＣ／ｍＬ、約５×１０１１ＧＣ／ｍＬ、約１×１０１２ＧＣ／ｍＬ、約５×１０１２ＧＣ／ｍＬ、約５×１０１３ＧＣ／ｍＬ、約１×１０１４ＧＣ／ｍＬ、または約５×１０１４ＧＣ／ｍＬのウイルスベクター（例えば、ｒＡＡＶビリオン）を含む。
様々な実施形態において、本開示の医薬組成物は、約１×１０８ウイルスゲノムコピー／ミリリットル（ＧＣ／ｍＬ）、５×１０８ｖｇ／ｍＬ、約１×１０９ｖｇ／ｍＬ、約５×１０９ｖｇ／ｍＬ、約１×１０１０ｖｇ／ｍＬ、約５×１０１０ｖｇ／ｍＬ、約１×１０１１ｖｇ／ｍＬ、約５×１０１１ｖｇ／ｍＬ、約１×１０１２ｖｇ／ｍＬ、約５×１０１２ｖｇ／ｍＬ、約５×１０１３ｖｇ／ｍＬ、約１×１０１４ｖｇ／ｍＬ、または約５×１０１４ｖｇ／ｍＬのウイルスベクター（例えば、ｒＡＡＶビリオン）を含む。
一部の実施形態では、本開示の医薬組成物は、約１ｍＬ、５ｍＬ、１０ｍＬ、約２０ｍＬ、約２５ｍＬ、約３０ｍＬ、約３５ｍＬ、約４０ｍＬ、約４５ｍＬ、約５０ｍＬ、約５５ｍＬ、約６０ｍＬ、６５ｍＬ、約７０ｍＬ、約７５ｍＬ、約８０ｍＬ、約８５ｍＬ、約９０ｍＬ、約９５ｍＬ、約１００ｍＬ、約１０５ｍＬ、約１１０ｍＬ、約１１５ｍＬ、約１２０ｍＬ、約１２５ｍＬ、約１３０ｍＬ、約１３５ｍＬ、約１４０ｍＬ、約１４５ｍＬ、約１５０ｍＬ、約１５５ｍＬ、約１６０ｍＬ、約１６５ｍＬ、約１７０ｍＬ、約１７５ｍＬ、約１８０ｍＬ、約１８５ｍＬ、約１９０ｍＬ、約２００ｍＬ、約２０５ｍＬ、約２１０ｍＬ、約２１５ｍＬ、または約２２０ｍＬの合計量で投与される。
一部の実施形態では、本開示の方法は、約１×１０８ゲノムコピー／ミリリットル（ＧＣ／ｍＬ）、約５×１０８ＧＣ／ｍＬ、約１×１０９ＧＣ／ｍＬ、約５×１０９ＧＣ／ｍＬ、約１×１０１０ＧＣ／ｍＬ、約５×１０１０ＧＣ／ｍＬ、約１×１０１１ＧＣ／ｍＬ、約５×１０１１ＧＣ／ｍＬ、約１×１０１２ＧＣ／ｍＬ、約５×１０１２ＧＣ／ｍＬ、約５×１０１３ＧＣ／ｍＬ、約１×１０１４ＧＣ／ｍＬ、または約５×１０１４ＧＣ／ｍＬのｒＡＡＶビリオンの用量で、ＭＹＢＰＣ３をコードするｒＡＡＶビリオンを投与することを含む。
好ましい実施形態では、本開示の方法は、約３×１０１２ＧＣ／ｍＬ、約３×１０１３ＧＣ／ｍＬ、約１×１０１４ＧＣ／ｍＬ、または約３×１０１４ＧＣ／ｍＬのｒＡＡＶビリオンの用量で、ＭＹＢＰＣ３をコードするｒＡＡＶビリオンを静脈内投与することを含む。
好ましい実施形態では、本開示の方法は、約３×１０１１ＧＣ／ｍＬ、約３×１０１２ＧＣ／ｍＬ、約１×１０１３ＧＣ／ｍＬ、または約３×１０１３ＧＣ／ｍＬのｒＡＡＶビリオンの用量で、ＭＹＢＰＣ３をコードするｒＡＡＶビリオンを、心臓に局所送達することによって投与することを含む。
一部の実施形態では、本開示の方法は、約１×１０８ウイルスゲノム／ミリリットル（ｖｇ／ｍＬ）、約５×１０８ｖｇ／ｍＬ、約１×１０９ｖｇ／ｍＬ、約５×１０９ｖｇ／ｍＬ、約１×１０１０ｖｇ／ｍＬ、約５×１０１０ｖｇ／ｍＬ、約１×１０１１ｖｇ／ｍＬ、約５×１０１１ｖｇ／ｍＬ、約１×１０１２ｖｇ／ｍＬ、約５×１０１２ｖｇ／ｍＬ、約５×１０１３ｖｇ／ｍＬ、約１×１０１４ｖｇ／ｍＬ、または約５×１０１４ｖｇ／ｍＬのｒＡＡＶビリオンの用量で、ＭＹＢＰＣ３をコードするｒＡＡＶビリオンを投与することを含む。
好ましい実施形態では、本開示の方法は、約３×１０１２ｖｇ／ｍＬ、約３×１０１３ｖｇ／ｍＬ、約１×１０１４ｖｇ／ｍＬ、または約３×１０１４ｖｇ／ｍＬのｒＡＡＶビリオンの用量で、ＭＹＢＰＣ３をコードするｒＡＡＶビリオンを静脈内投与することを含む。
好ましい実施形態では、本開示の方法は、約３×１０１１ｖｇ／ｍＬ、約３×１０１２ｖｇ／ｍＬ、約１×１０１３ｖｇ／ｍＬ、または約３×１０１３ｖｇ／ｍＬのｒＡＡＶビリオンの用量で、ＭＹＢＰＣ３をコードするｒＡＡＶビリオンを、心臓に局所送達することによって投与することを含む。
１ミリリットル当たりのゲノムコピーは、ウイルスのポリヌクレオチドゲノムの既知の濃度を有する参照試料を用いて生成された標準曲線を使用して、定量的ポリメラーゼ変化反応（ｑＰＣＲ）によって決定することができる。ＡＡＶについては、参照試料は、ｒＡＡＶビリオンの生成に使用されるトランスファープラスミドであることが多いが、他の参照サンプルを使用してもよい。
あるいは、または追加的に、ウイルスベクターの濃度を、細胞株のベクターの力価を測定することによって決定することができる。ウイルス力価は、一般的に、単位体積当たりのウイルス粒子（ｖｐ）（例えば、ｖｐ／ｍＬ）として表される。様々な実施形態において、本開示の医薬組成物は、約１×１０８ウイルス粒子／ミリリットル（ｖｐ／ｍＬ）、約５×１０８ｖｐ／ｍＬ、約１×１０９ｖｐ／ｍＬ、約５×１０９ｖｐ／ｍＬ、約１×１０１０ｖｐ／ｍＬ、約５×１０１０ｖｐ／ｍＬ、約１×１０１１ｖｐ／ｍＬ、約５×１０１１ｖｐ／ｍＬ、約１×１０１２ｖｐ／ｍＬ、約５×１０１２ｖｐ／ｍＬ、約５×１０１３ｖｐ／ｍＬ、または約１×１０１４ｖｐ／ｍＬ、または約５×１０１４のウイルスベクター（例えば、ｒＡＡＶビリオン）を含む。
一実施形態では、本開示は、本明細書に記載の医薬組成物を収容する容器を含むキットを提供する。
本開示のｒＡＡＶビリオンまたはベクターゲノムは、全身適用、例えば、動物モデルに示されているものと類似して、ベクターの静脈内、動脈内または腹腔内送達することによって、それを必要とする対象に投与することができる（Ｋａｔｚ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１９：６５９－６６９）。一部の実施形態では、本開示のｒＡＡＶビリオンまたはベクターゲノムは、肥大型心筋症を治療または予防し、この場合において当該ベクターは全身的に投与される。
一部の実施形態では、本開示のｒＡＡＶビリオンまたはベクターゲノムは、例えば、冠動脈内投与によって心臓組織に直接的投与することによって送達され得る。いくつかの実施形態では、ベクターは、標準的な５Ｆまたは６Ｆのガイドまたは診断カテーテル（Ｊａｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｊ Ｃａｒｄ Ｆａｉｌ．１５：１７１－１８１）を使用して、血管造影（血管バルーン閉塞を伴わない経皮冠動脈内送達）後の心臓カテーテル検査室で１０分間にわたって、順行性の心外膜冠動脈注入によって単回投与として投与される。
本開示の組成物、組成物、および方法を使用した治療に適している対象は、心臓状態を有する個体（例えば、ヒトなどの哺乳類対象、非ヒト霊長類、家畜哺乳類、マウス、ラットなどの実験的非ヒト哺乳類対象）を含む。
一部の実施形態では、本開示のｒＡＡＶビリオンまたはベクターゲノムを使用して、それを必要とする対象を治療することができる。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、心血管疾患を治療する必要のある対象に投与することができる。一部の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンまたはベクターゲノムは、心筋症を治療するために対象に投与される。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、全身的に投与される。他の実施形態では、ウイルスベクターは、心臓組織への直接投与によって送達される。
ｒＡＡＶビリオンまたはベクターゲノムは、心臓への直接注射または心臓カテーテル挿入を含むがこれに限定されない様々な経路によって投与することができる。好ましい実施形態では、ＭＹＢＰＣ３をコードするｒＡＡＶビリオンを含む医薬組成物は、逆行性冠静脈洞注入（ＲＣＳＩ）を介した心臓内カテーテル送達によって投与される。あるいは、ウイルスベクターは、静脈内注入などにより全身的に投与することができる。直接注射を用いる場合、開心手術または低侵襲手術のいずれかで実施されうる。一部の事例では、ウイルスベクターは、注射または注入によって心膜腔に送達される。
対象に投与されたウイルスベクターは、様々な方法によって追跡され得る。例えば、マーカー（緑色蛍光タンパク質、またはベータガラクトシダーゼなど）で標識または発現する組換えウイルスを容易に検出することができる。組換えウイルスは、標的細胞に、表面発現タンパク質または蛍光タンパク質などのマーカータンパク質を発現させるように操作されてもよい。あるいは、組換えウイルスによる標的細胞の感染は、試験に利用される動物によって発現されない細胞マーカー（例えば、実験動物に細胞を注射する際にヒト特異的抗原）の発現によって検出され得る。標的細胞の存在および表現型は、蛍光顕微鏡法（例えば、緑色蛍光タンパク質、またはベータガラクトシダーゼ）、免疫組織化学法（例えば、ヒト抗原に対する抗体を使用する）、ＥＬＩＳＡ法（ヒト抗原に対する抗体を使用する）、またはプライマーおよび心臓表現型を示すＲＮＡに特異的である増幅を引き起こすハイブリダイゼーション条件を使用するＲＴ－ＰＣＲ分析によって評価することができる。
本明細書において参照および識別される全ての特許、特許刊行物、およびその他の刊行物は、すべての目的に対し、その全体が参照により個別におよび明示的に本明細書に組み込まれる。
実施例１：大型カーゴ用のベクターゲノムの設計
この研究の目的は、ベクターの非コード部分に欠失を有するベクターを親ベクターに評価することである。これは、驚くべきことに、非コード領域における欠失がベクターの能力を増加させることを示す。
最適な導入遺伝子発現のための二つのインタクトな隣接ＩＴＲ配列（各約１３０ｂｐ）、プロモーター、イントロン、ＷＰＲＥおよびポリアデニル化シグナル、ならびに標準シス－調節配列で、典型的なＡＡＶベクターゲノムは、約１．８～２．０ｋｂｐの非コードＤＮＡ配列を必要とする。３．８ｋｂｐの導入遺伝子ＭＹＢＰＣ３のように、約３．０ｋｂｐ以上の導入遺伝子により、ベクターゲノムは５．０ｋｂｐを超える。例えば、Ｍｅａｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ５：５５１５（２０１４）は、５．４ｋｂｐのベクターゲノムサイズを有するＭＹＢＰＣ３をコードするＡＡＶベクターを報告している。ＩＴＲ配列がない場合、これは約５．２ｋｂｐである。
ＡＡＶベクターが短縮された非コード領域を許容するかどうかを試験するために、レポーターシステムを作成した。ＣＡＧプロモーター、イントロン、ＷＰＲＥ、および標準ポリＡ配列を有する従来のＡＡＶベクターを、ＷＰＲＥ（５８９ｂｐ）を除去し、ポリＡ配列を短縮する（１７０ｂｐ除去）ために改変した（図１Ａ）。複数のクローニング部位（ＭＣＳ）にクローニングされたＧＦＰレポーターの発現は維持されたが、これらのベクターエレメントが欠失または短縮された時にわずかに減少した（図１Ｂ）。ベクターはさらに、イントロンおよび配列３’の一部から５’ＩＴＲまで欠失するによって切断された（図１Ｃ）。最終ベクターゲノムは約１．１ｋｐｂ（ＩＴＲなしで０．８ｋｐｂ）であった。
実施例２：ｉｎ ｖｉｔｒｏでの誘発された心筋細胞におけるＭＹＢＰＣ３導入遺伝子の発現
本試験の目的は、ＡＡＶベースのベクターシステムを使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで誘発された心筋細胞において治療用遺伝子産物の発現のための改善された組織特異的プロモーターを提供することであった。ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は、前述したように、中胚葉誘導、心臓仕様および代謝選択を使用して心筋細胞に分化された（Ｔｏｈｙａｍａ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．２０１３；１２（１）：１２７－３７；Ｌｉａｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ａ．２０１２；１０９（２７）：Ｅ１８４８－５７；Ｂｕｒｒｉｄｇｅ ＰＷ，Ｈｏｌｍｓｔｒｏｍ Ａ，Ｗｕ ＪＣ．Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．２０１５；８７：２１ ３ １－１５．）ｉＰＳＣ－ＣＭウイルス形質導入を、指定された感染の多重性でＡＡＶ６を用いて実施した。
図２Ａに記載されている遺伝子発現カセットは、心筋症の治療のためのＡＡＶベースのベクターシステムのために構築された。図１Ｃに記載されているベクターに基づくＡＡＶベクターは、二つの逆位末端リピート（ＩＴＲ、２６０ｂｐずつ）、ポリアデニル化シグナル（Ａ、４９ｂｐ）、および全長（配列番号１）または改変心筋トロポニンＴ（ＴＮＮＴ２）プロモーター（配列番号２～４）を含む、いくつかのシス－調節エレメントを含んでいた。ＷＰＲＥを含まず、ポリＡシグナルと配列３’から５’ＩＴＲは両方とも短縮された。改変ＴＮＮＴ２プロモーターは、野生型ＴＮＮＴ２プロモーターの５’（上流）末端に１００～２００ｂｐの欠失を含有していた。３．８２５ｋｂのポリヌクレオチド配列長を有するヒトミオシン結合タンパク質Ｃ（ＭＹＢＰＣ３、配列番号８６）を、ｉＰＳＣ由来心筋細胞における治療用遺伝子産物として試験した。
野生型または改変ＴＮＮＴ２プロモーターがＭＹＢＰＣ３タンパク質の検出可能な発現を誘導できるかどうかを決定するために、ＭＹＢＰＣ３－／－ｉＰＳＣ由来心筋細胞を、６×１０４ ＭＯＩでＡＡＶ６粒子で形質導入した。感染の５～１５日後に免疫蛍光法またはウエスタンブロット法によりＭＹＢＰＣ３タンパク質の発現について細胞を分析した。
図２Ｂは、野生型ＴＮＮＴ２プロモーター（配列番号１）を含むＡＡＶベクターがＭＹＢＰＣ３－／－ ｉＰＳＣ由来心筋細胞のサルコメアにおけるＭＹＢＰＣ３タンパク質の発現を駆動することを示す。
図３Ａ～図３Ｃは、４００ｂｐの改変ＴＮＮＴ２プロモーター（配列番号３）を含むＡＡＶベクターが、遺伝子導入されたＭＹＢＰＣ３－／－ｉＰＳＣ由来心筋細胞において、６００ｂｐの野生型ＴＮＮＴ２（配列番号１）または５００ｂｐの改変ＴＮＮＴ２（配列番号２）プロモーターのいずれかよりも高いＭＹＢＰＣ３タンパク質発現を駆動することを示す。対照的に、６００ｂｐの野生型ＴＮＮＴ２（配列番号１）または４００ｂｐの改変ＴＮＮＴ２プロモーター（配列番号３）のいずれかの制御下で、ＭＹＢＰＣ３をコードするプラスミド（ウイルスで形質導入されるのではなく）でトランスフェクトされたＭＹＢＰＣ３－／－ｉＰＳＣ由来心筋細胞は、類似のＭＹＢＰＣ３タンパク質発現を示した。
実施例３：Ｍｙｂｐｃ３－／－マウスモデル肥大型重症心筋症
ホモ接合性Ｍｙｂｐｃ３ノックアウトマウス（ＫＯ）を、エクソン１およびエクソン２のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９対ｇＲＮＡ削除によって、Ｃ５７Ｂｌ／６バックグラウンドに生成した（図４Ａ）。ＫＯマウスは、正常なメンデル比および野生型同腹仔と同等の体重にもかかわらず、心臓機能（図４Ｃおよび図４Ｄ）および顕著な心臓肥大（図４Ｅ～４Ｇ）の重度の欠損を２週齢で示した（図４Ｂ）。このモデルは、他のモデルよりも重度の心肥大を有する（Ｓｃｈｌｏｓｓａｒｅｋ ｅｔ ａｌ．Ｂａｓｉｃ Ｒｅｓ．Ｃａｒｄｉｏｌ．１０７：１－１３（２０１２））。我々のＫＯマウスは、ヒトの小児におけるＨＣＭの発症をモデルとする若年者（２週齢のマウス）において、ならびに成人における後期のＨＣＭにおいて、重度で早期発症のＨＣＭを示す。Ｌｅｋａｎｎｅ Ｄｅｐｒｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ ４３：８２９－８３２（２００６）；Ｘｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ Ｐａｒｔ Ａ １４３Ａ：２６６２－２６６７（２００７）；Ｚａｈｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅａｒｔ ９４：１３２６－１３３０（２００８）；Ｍａｒｚｉｌｉａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｏｎａｔｏｌｏｇｙ １０２：２５４－２５８（２０１２）；Ｗｅｓｓｅｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ ２３：９２２－９２８（２０１５）を参照されたい。
実施例４：ｉｎ ｖｉｖｏでの心臓組織におけるＭＹＢＰＣ３導入遺伝子の発現
この研究の目的は、改変心臓特異的プロモーターを含むＡＡＶベースのベクターシステムを使用して、インビボでの治療用タンパク質の発現を調べることであった。
ＭＹＢＰＣ３をコードするポリヌクレオチドに動作可能に連結された６００ｂｐの野生型ＴＮＮＴ２（配列番号１）または４００ｂｐの改変ＴＮＮＴ２（配列番号３）プロモーターのいずれかを含むＡＡＶ９組換えウイルスを、成人マウスに後眼窩注入した。心臓、骨格筋（前脛骨筋）、肝臓および全脳からの組織試料を、感染の２週間後に採取した。ＲＮＡをすべての組織から抽出し、ｃＤＮＡに合成し、ヒトＭＹＢＰＣ３に特異的なプライマーを使用してｑＲＴ－ＰＣＲにより分析した。
図５に示すように、野生型または改変ＴＮＮＴ２プロモーターのいずれかを含むＡＡＶ９ベースのベクターを注射されたマウスは、骨格、脳または肝臓組織と比較して、心臓組織において高レベルのＭＹＢＰＣ３ ｍＲＮＡを示した。４００ｂｐの改変ＴＮＮＴ２プロモーターは、６００ｂｐの野生型ＴＮＮＴ２プロモーターと比較して、心臓組織におけるＭＹＢＰＣ３ ｍＲＮＡの発現の増加を示した。
図６Ａ～６Ｂに示されるように、成人マウスに、４００ｂｐの改変ＴＮＮＴ２プロモーターカセットを有するＡＡＶ９ベクターを用いて尾静脈注射により静脈内投与した。心臓および肝臓からの組織試料を、注射の４週間後に採取した。ゲノムＤＮＡのマイクログラム当たりのウイルスゲノムの絶対定量を、線形化された標準を使用したｑＰＣＲにより評価した。ＲＮＡをすべての組織から抽出し、ｃＤＮＡに合成し、ヒトＭＹＢＰＣ３に特異的なプライマーを使用してｑＲＴ－ＰＣＲにより分析した。驚くべきことに、４００ｂｐのＴＮＮＴ２プロモーターは、心臓に対する高い選択性を保持し、成人投与動物では、投与後４週間で心臓よりも肝臓に検出されたベクターゲノムが１００倍大きいにもかかわらず（図６Ａ、対数スケール）、導入遺伝子の肝臓発現は、心臓発現の１／１０，０００未満であった（図６Ｂ、対数スケール）。
まとめると、これらの結果は、野生型ＴＮＮＴ２プロモーター、すなわち４００ｂｐの改変ＴＮＮＴ２プロモーター（配列番号３）からの２００ｂｐの欠失が、プロモーター配列の実質的な部分の欠失にもかかわらず、高い選択性を有する心筋細胞におけるＭＹＢＰＣ３タンパク質の発現を効果的に駆動することを示唆する。
実施例５：Ｍｙｂｐｃ３ヌルマウスにおける心機能の回復
本実施例は、実施例１に記載される大型カーゴ用に設計されたベクター、ならびに実施例２および３に記載される４００ｂｐの改変ｈＴＮＮＴ２プロモーターを使用して、マウスのＭｙｂｐｃ３における機能喪失の機能的救済を示す。
４００ｂｐのｈＴＮＮＴ２プロモーターおよびマウスＭｙｂｐｃ３遺伝子を、図１Ｃに示されるベクターにクローンした。このベクターをＡＡＶ９キャプシドを使用してパッケージして、試験ベクターを生成した。
最初の実験では、ホモ接合性Ｍｙｂｐｃ３－／－マウスにＭｙｂｐｃ３またはビヒクル、ＨＢＳＳをコードする１Ｅ１４ ｖｇ・ｋｇ－１のテストベクターを２週齢で後眼窩注入した。心臓組織は、２週間後（４週間後）に、野生型同腹仔の組織とともに採取された。実験用ベクターは、注射の２週間後に、Ｍｙｂｐｃ３－／－マウスにおけるＭＹＢＰＣ３タンパク質発現の野生型レベルを達成した（図７）。試験用ベクターは、１Ｅ１４ ｖｇ・ｋｇ－１ほどの低用量で、若年動物において生理学的レベルでＭＹＢＰＣ３を発現することができたと結論付けた。
第二の実験では、第一の実験を、より低い用量の３Ｅ１３ ｖｇ・ｋｇ－１で繰り返した。ホモ接合性Ｍｙｂｐｃ３－／－マウスにＭｙｂｐｃ３またはビヒクル、ＨＢＳＳをコードする３Ｅ１３ ｖｇ・ｋｇ－１および１Ｅ１４ ｖｇ・ｋｇ－１のテストベクターを２週齢で後眼窩注入した。心臓ＭＹＢＰＣ３タンパク質発現の野生型レベルは、注射の２週間後および６週間後に、Ｍｙｂｐｃ３－／－マウスにおいてＥＬＩＳＡにより検出された（図８）。試験ベクターは、３Ｅ１３ ｖｇ・ｋｇ－１ほどの低用量で、若年動物において生理学的レベルでＭＹＢＰＣ３を発現することができたと結論付けた。
第三の実験では、肥大型心筋症に関連するアッセイを使用して心機能を評価した。肥大型心筋症は、生理学的には、（１）ｍｇ ｇ－１における左室重量／総体重量（ＬＶＭ／ＢＷ）の比率として報告される心臓サイズの増加として提示され、（２）心エコー検査により測定される分画短縮（ＦＡＳ）として提示される。
ホモ接合性Ｍｙｂｐｃ３－／－ マウスに、Ｍｙｂｐｃ３またはビヒクルであるＨＢＳＳをコードする試験ベクターの１Ｅ１３ ｖｇ・ｋｇ－１、３Ｅ１３ ｖｇ・ｋｇ－１および１Ｅ１４ ｖｇ・ｋｇ－１を２週齢で後眼窩注入した。試験されたすべての用量（１Ｅ１３ ｖｇ・ｋｇ－１、３Ｅ１３ ｖｇ・ｋｇ－１および１Ｅ１４ ｖｇ・ｋｇ－１）で、用量依存的な心機能の回復が観察された。ＬＶＭ／ＢＭは、注射の６週間後、試験されたすべての用量で、ビヒクル対照から減少した（図９Ａ）。ＦＡＳ（収縮期と拡張期の間のＬＶの内寸法を変化率として表される、図９Ｂ）および駆出分画（図９Ｃ）を、注射の６週間後にすべての試験用量でビヒクル対照から増加した。ＬＶＭ／ＢＭのさらなる改善（図９Ｄ）、ＦＡＳ（図９Ｅ）、およびＥＦ（図９Ｆ）が、注射の３１週間後に観察された。３Ｅ１３ ｖｇ・ｋｇ－１および １Ｅ１４ ｖｇ・ｋｇ－１用量（図８を参照）で観察された等しいレベルのＭＹＢＰＣ３タンパク質発現と一致して、３Ｅ１３ ｖｇ・ｋｇ－１または１Ｅ１４ ｖｇ・ｋｇ －１で処置された動物は、肥大、ＦＡＳまたはＥＦの改善において同様の改善を示す。１Ｅ１３ ｖｇ・ｋｇ－１用量のみであっても、肥大、ＦＡＳおよびＥＦはすべて、ビヒクル対照と比較して改善される。
試験ベクターは、１Ｅ１３ ｖｇ・ｋｇ－１ほどの低用量で、若年動物の心機能を回復する能力があると結論付けた。
症候性若年マウスにおける機能の回復は、肥大型心筋症の場合、肥大型心筋症が進行性障害であるため、乳児における機能低下の予防よりも困難である。高齢の動物は、若年の動物よりも重篤な疾患を呈する。私たちの知る限り、症状のある若年動物におけるＭＹＢＰＣ３の機能喪失の回復は、ＡＡＶでこれまでに実証されていない。我々のモデルは、突然変異による部分的な機能喪失ではない、Ｍｙｂｐｃ３遺伝子の欠失によって引き起こされた機能の完全な喪失でもある。
我々の結果をＭｅａｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．５：５５１５（２０１４）の報告と比較し、内因性Ｍｙｂｐｃ３遺伝子の単一のヌクレオチド多型を有するマウスに、Ｍｙｂｐｃ３をコードする５．４ ｋｂの発現カセットを使用した。Ｍｅａｒｎｉらは、同じＭｙｂｐｃ３遺伝子をコードするＡＡＶ９ベクターの平均新生児質量１．５ｇに基づき、非常に高用量（１Ｅ１２ ｖｇおよび３Ｅ１２ ｖｇ、７Ｅ１４ ｖｇ・ｋｇ －１および２Ｅ１５ ｖｇ・ｋｇ－１に相当する）の新生児（症候性若年者ではない）として注射されたマウスにおいて、２週齢で高いＬＶＭ／ＢＷの予防を報告した。Ｍｅａｒｎｉらは、本発明の４００ｂｐの改変ｈＴＮＮＴ２プロモーターではなく、５５０ｂｐのｈＴＮＮＴ２プロモーターを使用した。Ｍｅａｒｉｎｉらのベクターは、２Ｅ１５ ｖｇ・ｋｇ －１であっても、ＦＡＳの減少をそれほど予防しない。対照的に、本発明のベクターは、少なくとも１Ｅ１３ ｖｇ・ｋｇ－１～１Ｅ１４ ｖｇ・ｋｇ－１ほどの低用量で、若年動物（新生児のみではない）における生理学的パラメータの改善を示す。
ベクターおよびプロモーターの修飾は、ベクターの効力を劇的にかつ驚くほど増加させる。
実施例６：５．４ｋｂｐカセットと４．７ｋｂｐカセットの直接比較
本実施例は、進行した疾患を有する成熟（生後２．５ヵ月）ホモ接合性マウスにおいて、Ｍｙｂｐｃ３遺伝子をコードする５．４ｋｂｐのカセットを、Ｍｙｂｐｃ３遺伝子をコードする４．７ｋｂｐのカセットと直接比較する。
ホモ接合性Ｍｙｂｐｃ３－／－マウスに、５．４ｋｂｐまたは４．７ｋｂｐのカセット（図１０Ａ）との関連で、Ｍｙｂｐｃ３をコードするＡＡＶ９ベクターの３Ｅ１３ ｖｇ・ｋｇ－１または１Ｅ１４ ｖｇ・ｋｇ－１を後方眼窩注入する、またはビヒクル対照であるＨＢＳＳを注入した。心機能低下のこの進行期に投与した場合でさえ、４．７ｋｂｐのカセットは、ビヒクル（Ｖｅｈ）または５．４ｋｂｐのカセットで処置された動物とは異なり、駆出分画率（ＥＦ）に基づいて心臓機能を著しく改善し（図１０Ｂ）、投与前のベースラインを上回る明確な機能回復を示した（図１０Ｃ）。さらに、５．４ｋｂｐカセットと比較して、４．７ｋｂｐカセットは、注射の１８週間後にＬＶＭ／ＢＭによって示されるように、肥大を有意に減少させることもできた（図１０Ｄ）。
本実施例は、実施例１～３に記載されるベクター骨格およびプロモーターの改変を使用して、マウスのＭｙｂｐｃ３における機能喪失の機能的回復を示す。
本実施例はまた、困難な疾患モデルである成人のホモ接合性Ｍｙｂｐｃ３－／－マウスにおいて、低用量で５．４ｋｂｐのベクター（配列番号２０１）は、生理学的改善を生じさせないが、本開示による４．７ｋｂｐのベクターは、３Ｅ１３ｖｇ・ｋｇ－１ほどの低用量で心筋症に関連する生理学的パラメータの統計的に有意な改善を引き起こすことを示す。
実施例７：ＭＹＢＰＣ３をコードする改善されたＡＡＶキャプシドによるより大きな有効性
本実施例は、大型カーゴベクター（実施例１）およびＭｙｂｐｃ３－／－マウス（実施例５）の回復に基づく改変プロモーター（実施例２および３）の改善された能力が、操作されたＡＡＶキャプシドの使用によってどのようにさらに改善され得るかを示す。
ＡＡＶ９キャプシドバリアントであるＣＲ９－１０は、ＥＬＩＳＡにより決定されたＧＦＰコードカセットを有するＡＡＶ９よりも、成人マウスにおいて全身送達時に有意に高い心臓形質導入を示した（ｐ＜０．０５、一方向ＡＮＯＶＡ；Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定）（図１１Ａ）。
第二の実験では、マウスＭｙｂｐｃ３遺伝子をコードする発現カセットをＡＡＶ９またはＣＲ９－１０のいずれかにパッケージし、Ｍｙｂｐｃ３－／－マウスにおける心臓救済の能力を比較した。ホモ接合性Ｍｙｂｐｃ３－／－マウスに、ＡＡＶ９ベクター、ＣＲ９－１０ベクターまたはビヒクル対照ＨＢＳＳの１Ｅ１３ ｖｇ・ｋｇ－１および３Ｅ１３ ｖｇ・ｋｇ－１を２週齢で後眼窩注入した。すべての試験物質は、投与前のベースラインを上回る明らかな機能の回復（ΔＥＦ）（図１１Ｃ）で、駆出分画率（ＥＦ）に基づいて心臓機能を大幅に改善した（図１１Ｂ）。心臓形質導入の改善と一致して、ＣＲ９－１０はＡＡＶ９よりも大きなＥＦ改善をもたらした。
実施例８．操作されたＡＡＶキャプシドバリアントの非ヒト霊長類試験
操作されたキャプシドを有するＡＡＶベクターの生体分布（米国仮特許出願６３／０１２，７０３号、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を、静脈内送達後にオスのカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）で評価した。
ＡＡＶ９を含む１４種類の異なるキャプシドで生成されたＡＡＶベクターをプールし、１Ｅ１３ ｖｇ・ｋｇ－１の用量でＮＨＰに注射した（ｎ＝３）。ウイルスＤＮＡを、全身送達の１か月後に左心室および肝臓から抽出した。マウスの結果と一致して、ＣＲ９－１０は、ＡＡＶ９と比較して心臓形質導入の増加を示した（図１２Ａ）。さらに、多くのバリアントは、ＡＡＶ９と比較して肝ウイルス量を減少させ（図１２Ｂ）、肝臓感染に対する左心室の形質導入の比率を改善した（図１２Ｃ）。
実施例１０：Ｍｙｂｐｃ３ｃヌルマウスのヒトＭＹＢＰＣ３遺伝子による心臓機能の回復
本実施例は、Ｍｙｂｐｃ３－／－マウスを回復させるするヒトＭＹＢＰＣ３遺伝子の能力を示す。
マウスＭｙｂｐｃ３遺伝子（ｍＭｙｂｐｃ３）（１Ｅ１４ ｖｇ・ｋｇ－１）をコードするＡＡＶ９、ヒトＭＹＢＰＣ３遺伝子（ｈＭＹＢＰＣ３）（１Ｅ１４ ｖｇ・ｋｇ－１）をコードするＡＡＶ９、またはビヒクルであるＨＢＳＳを、ホモ接合性Ｍｙｂｐｃ３－／－マウスに２週齢で後眼窩注入した。心臓のサイズおよび機能は、注入後８ヵ月まで心エコー検査によりモニタリングされた。この結果は、Ｍｙｂｐｃ３－／－マウスにおけるｍＭｙｂｐｃ３およびｈＭＹＢＰＣ３のいずれかのＡＡＶ９媒介性心臓ＭＹＢＰＣ３置換が、心臓サイズおよび機能の回復をもたらしたことを示している。駆出分画（ＥＦ）は、ＭＹＢＰＣ３のヒトオルソログとマウスオルソログの両方によって有意に改善され、ｍＭｙｂｐｃ３は、ｈＭＹＢＰＣ３と比較してＥＦにより大きな改善をもたらした（図１３Ａ）。重要なことに、ｈＭＹＢＰＣ３は、体重に対して正規化された左心室質量（ＬＶＭ／ＢＷ）によって証明されるように、経時的に心臓肥大を減少させるｍＭｙｂｐｃ３と同じくらい強力であった（図１３Ｂ）。これはさらに、拡張期中の左室後壁厚の同等の減少によって検証された（ＬＶＰＷ；ｄ）（図１３Ｃ）。決定的には、すべての改善は、注射後８ヵ月まで強固な安定性を示した。
第二の研究では、ｈＭＹＢＰＣ３の有効性を、ウイルス用量の範囲にわたって評価した。ホモ接合性Ｍｙｂｐｃ３－／－マウスに、ヒトＭＹＢＰＣ３遺伝子またはビヒクルであるＨＢＳＳをコードする試験ベクターの１Ｅ１３ ｖｇ・ｋｇ－１、１Ｅ１４ ｖｇ・ｋｇ－１および３Ｅ１４ ｖｇ・ｋｇ－１を２週齢で後眼窩注入した。注射後１４週で、ＥＦ（図１４Ａ）に示されるように、全ての試験用量（１Ｅ１３ ｖｇ・ｋｇ－１、１Ｅ１４ ｖｇ・ｋｇ－１および３Ｅ１４ ｖｇ・ｋｇ－１）について、１Ｅ１４ ｖｇ・ｋｇ－１および３Ｅ１４ ｖｇ・ｋｇ－１の処置について投与前のベースラインを上回る著しい改善で心機能の用量依存的改善が観察された（図１４Ｂ）。ＬＶＭ／ＢＷ（図１４Ｃ）に基づいて、１Ｅ１４ ｖｇ・ｋｇ－１および３Ｅ１４ ｖｇ・ｋｇ－１の処置について、心肥大の著しい減少も観察された。ｈＭＹＢＰＣ３試験ベクターは、１Ｅ１３ ｖｇ・ｋｇ－１ほどの低用量で、成人動物の心機能を保持する能力があると結論付けた。
実施例１１：肥大型心筋症（ＨＣＭ）の治療
心筋症は、１８歳未満の小児における突然の心停止の第一の原因である。肥大型心筋症（ＨＣＭ）は、５０万人のアメリカ人が罹患し、心不全または突然死に至る可能性がある。ミオシン結合タンパク質Ｃ３、ＭＹＢＰＣ３における機能喪失変異は、ＨＣＭの最も一般的な遺伝的原因である。ＨＣＭの原因であるＭＹＢＰＣ３変異の大部分は、ナンセンス変異、フレームシフト変異、またはスプライス部位変異を介して切断される。ＭＹＢＰＣ３変異を有するＨＣＭ患者の大部分のサルコメア病態生理は、サルコメアに組み込まれたＭＹＢＰＣ３タンパク質の総量が正常を大幅に下回るため、ハプロ不全によるものと考えられる。ＭＹＢＰＣ３のサルコメアレベルの減少は、アクチンフィラメント上により多くのミオシンヘッドが係合するミオシン阻害の減少をもたらし、結果として過収縮をもたらす。
ハプロ不全の治療への最も明確な経路は、不十分な遺伝子産物の回復であり、この場合、野生型ＭＹＢＰＣ３である。したがって、全身送達時にＭＹＢＰＣ３を心筋細胞に選択的に復元するための優れた特性を有するＡＡＶベクター（ＴＮ－２０１）を設計することに成功した。決定的には、疾患の症状マウスモデルにおいて、心臓機能障害と肥大を回復させるマウス代理とＴＮ－２０１の両方の能力をＡＡＶで初めて実証した。
用量範囲有効性試験では、野生型ＭＹＢＰＣ３タンパク質の回復と、臨床的に関連する用量の３Ｅ１３ ｖｇ／ｋｇでの心臓改善の飽和が示された。さらに、１０倍を超える有効用量を注射された成人および幼児マウスにおけるパイロット安全性試験は、臨床所見、心機能の変化、および病理組織学的所見を示さなかった。重要なことに、高度にスケーラブルなＳｆ９プラットフォームを利用して生産されたＴＮ－２０１は、疾患のＭｙｂｐｃ３－／－モデルにおいて同様に強力な有効性をもたらすことが判明した。最後に、我々は、我々が観察した有効性は、注射後８カ月までの安定した利益、ならびに後期ホモ接合体疾患においても心機能障害の回復に対して十分に有意義であることを確立した。
実施例１２：臨床試験
本明細書に記載されるＭＹＢＰＣ３をコードするｒＡＡＶビリオンを含む医薬組成物は、静脈内または逆行性冠動脈洞（ＲＣＳＩ）によって投与される。機能的有効性は、心機能状態評価（例えば、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｈｅａｒｔ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ＮＹＨＡ；心肺運動検査、ＣＰＥＴ）、生活の質質問票（例：Ｋａｎｓａｓ Ｃｉｔｙ Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ Ｑｕｅｓｔｉｏｎｎａｉｒｅ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｑｕａｌｉｔｙ Ｓｃｏｒｅ、ＫＣＣＱ－ＣＳＳ）、心臓撮像（例えば、心エコー検査）、心臓バイオマーカー（例えば、トロポニンおよびＮＴ－ｐｒｏＢＮＰ）、心臓リズムと免疫学的評価、心機能状態評価（例えば、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｉｎｔｅｒａｇｅｎｃｙ Ｒｅｇｉｓｔｒｙ ｆｏｒ Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌｌｙ Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｃｉｒｃｕｌａｔｏｒｙ Ｓｕｐｐｏｒｔ、ＰＥＤＩＭＡＣＳ；Ｒｏｓｓ分類）、および／またはＭａｊｏｒ Ａｄｖｅｒｓｅ Ｃａｒｄｉａｃ Ｅｖｅｎｔｓ（ＭＡＣＥ）（全死、心臓移植、導入性の開始、換気の開始、または機械的循環支持）によって決定される。臨床試験には、最大１０年間、年１回、安全性および継続有効性（例えば、有害事象、重度の有害事象、心電図、心臓酵素、バイオマーカー、機能状態、左室（ＬＶ）機能／質量、生活の質、血清化学検査、肝機能検査）のモニタリングを含んでもよい。

Claims (44)

  1. ３００ｂｐ～５００ｂｐを有するポリヌクレオチドを含む、改変心臓トロポニンＴプロモーター。
  2. 前記ポリヌクレオチドが、配列番号１～８５のいずれか一つと少なくとも８０％、少なくとも９０％または１００％の同一性を共有する配列を含む、請求項１に記載のプロモーター。
  3. 前記ポリヌクレオチドが、配列番号３と少なくとも８０％、少なくとも９０％または１００％の同一性を共有する配列を含む、請求項１に記載のプロモーター。
  4. 前記ポリヌクレオチドが、
    （ｉ）トロポニンＴ遺伝子の転写開始部位の上流にあり、かつこれを含む、もしくは
    （ｉｉ）トロポニンＴ遺伝子の転写開始部位に対して、－４５０ｂｐ～＋１ｂｐ、－３５０ｂｐ～＋１ｂｐ、－２５０ｂｐ～＋１ｂｐ、－４５０ｂｐ～＋５０ｂｐ、－３５０ｂｐ～＋５０ｂｐまたは－２５０ｂｐ～＋５０ｂｐである、
    ゲノムポリヌクレオチド配列と、少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を共有し、任意で前記トロポニンＴ遺伝子がヒトトロポニンＴ遺伝子である、請求項１に記載のプロモーター。
  5. 前記プロモーターが、
    （ｉ）筋特異的プロモーター、および／または
    （ｉｉ）心臓細胞特異的プロモーター、および／または
    （ｉｉｉ）心筋細胞特異的プロモーターである、請求項１～４のいずれか一項に記載のプロモーター。
  6. 前記プロモーターが、
    （ｉ）約６００ｂｐの天然トロポニンＴプロモーター、および／または
    （ｉｉ）配列番号１を含む参照プロモーター、と同じ細胞型特異性を有する、請求項１～５のいずれか一項に記載のプロモーター。
  7. 前記プロモーターが、それと動作可能に連結された遺伝子産物を、天然のトロポニンＴプロモーターよりも少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％多く発現し、任意選択的に、前記天然のトロポニンＴプロモーターが、配列番号１を含む参照プロモーターである、請求項１～６のいずれか一項に記載のプロモーター。
  8. 遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドに動作可能に結合された、請求項１～７のいずれか一項に記載のプロモーターを含むベクター。
  9. 前記ベクターがウイルスベクターであり、任意選択的に、
    前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）であり、および／または前記ウイルスベクターが、最大で約５．５ｋＢのパッケージング限界を有し、
    任意選択的に、前記ＡＡＶベクターがＡＡＶ９またはそのバリアントである、請求項８に記載のベクター。
  10. 前記遺伝子産物が、
    （ｉ）ＭＹＢＰＣ３、ＫＣＮＨ２、ＴＲＰＭ４、ＤＳＧ２およびＡＴＰ２Ａ２タンパク質、または
    （ｉｉ）ＣＡＣＮＡ１Ｃ、ＤＭＤ、ＤＭＰＫ、ＥＰＧ５、ＥＶＣ、ＥＶＣ２、ＦＢＮ１、ＮＦ１、ＳＣＮ５Ａ、ＳＯＳ１、ＮＰＲ１、ＥＲＢＢ４、ＶＩＰ、およびＭＹＨ７タンパク質から選択される、請求項８または請求項９に記載のベクター。
  11. 前記遺伝子産物が、任意選択的にＳｐＣａｓ９、Ｓｔ１Ｃａｓ９、およびＳａＣａｓ９から選択されるＣａｓ９である、請求項８～１０のいずれか一項に記載のベクター。
  12. 前記ベクターが、第二の遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドを含み、任意選択的に、前記第二の遺伝子産物が機能性ＲＮＡ、任意選択的にマイクロＲＮＡまたはガイドＲＮＡである、請求項８～１１のいずれか一項に記載のベクター。
  13. 請求項１～７のいずれか一項に記載のプロモーターを含む、単離細胞。
  14. 前記単離細胞が、人工多能性幹細胞または単離された心筋細胞である、請求項１３に記載の単離細胞。
  15. 請求項８～１２のいずれか一項に記載のベクターを含む、医薬組成物。
  16. 請求項１３または請求項１４に記載の細胞を含む、細胞療法組成物。
  17. ＭＹＢＰＣ３タンパク質、またはその機能的バリアントをコードするＭＹＢＰＣ３ポリヌクレオチド、およびプロモーターを含み、前記プロモーターが、請求項１～７のいずれか一項に記載の改変心臓トロポニンＴプロモーターである、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターゲノム。
  18. 前記ＭＹＢＰＣ３ポリヌクレオチドが、少なくとも約３．５ｋＢを含む、約３．８ｋＢを含む、全長ＭＹＢＰＣ３である、または短縮型ＭＹＢＰＣ３である、請求項１７に記載のｒＡＡＶベクターゲノム。
  19. 前記ＭＹＢＰＣ３がヒトＭＹＢＰＣ３である、請求項１７または請求項１８に記載のｒＡＡＶベクターゲノム。
  20. 前記ベクターが、約６００ｂｐの天然トロポニンＴプロモーターを含む参照ＡＡＶベクターとほぼ同じレベルで、少なくとも約１０％高い、または少なくとも約２０％高いＭＹＢＰＣ３を発現する、請求項１７～１９のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクターゲノム。
  21. ５’から３’の順で、プロモーターを含む５’セグメント、遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド、およびポリＡシグナルを含む３’セグメントを含む発現カセットを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターゲノムであって、前記発現カセットが、任意選択的に５’逆位末端リピート（ＩＴＲ）および３’ＩＴＲの一方または両方に隣接し、
    前記遺伝子産物をコードする前記ポリヌクレオチドが、３ｋｂ～１１ｋｂ、３ｋｂ～５ｋｂ、３．５ｋｂ～４．５ｋｂまたは３．７ｋｂ～４ｋｂを含み、
    ａ）前記５’セグメントおよび前記３’セグメントが共に、最大で０．８ｋｂｐまたは最大で０．９ｋｂｐを含み、
    ａ）前記５’ＩＴＲ、５’セグメント、前記３’セグメントおよび３’ＩＴＲが共に、最大で１．２ｋｂｐまたは最大で１．３ｋｂｐを含み、および／または
    ｃ）前記ベクターゲノムは、最大で４．７ｋｂｐ、最大で４．８ｋｂｐ、最大で４．９ｋｂｐ、最大で５．０ｋｂｐ、または最大で５．２ｋｂｐを含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターゲノム。
  22. 前記５’セグメントが、最大で５００ｂｐまたは最大で４８０ｂｐを含み、および／または３’セグメントが、最大で２００ｂｐまたは最大で１５０ｂｐを含む、請求項２１に記載のｒＡＡＶベクターゲノム。
  23. 前記遺伝子産物をコードする前記ポリヌクレオチドは、３．７ｋｂｐ～３．９ｋｂｐ、任意選択で３．８ｋｂｐを含む、請求項２１または請求項２２に記載のｒＡＡＶベクターゲノム。
  24. 前記遺伝子産物が、ＭＹＢＰＣ３またはその機能的バリアントであり、任意選択的に、
    ＭＹＢＰＣ３をコードする前記ポリヌクレオチドが、配列番号８６と少なくとも９０％の同一性、配列番号８６と少なくとも９５％の同一性を共有し、または配列番号８６である、および／または
    ＭＹＢＰＣが、配列番号１０３のポリペプチド配列と少なくとも９０％の同一性、配列番号１０３のポリペプチド配列と少なくとも９５％の同一性を共有する、または配列番号１０３のポリペプチド配列である、請求項２１～２３のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクターゲノム。
  25. 前記プロモーターが、請求項１～８のいずれか一項に記載の改変心臓トロポニンＴプロモーターである、請求項２１～２４のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクターゲノム。
  26. （ｉ）前記プロモーターが、配列番号９１と少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または１００％の同一性を共有する配列を含み、および／または
    （ｉｉ）前記ポリＡシグナルが、配列番号９２と少なくとも９０％の同一性を共有する、少なくとも９５％の同一性を共有する、または配列番号９２である配列を含む、本質的にからなる、またはからなり、
    （ｉｉｉ）前記５’セグメントが、配列番号９３と少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性を共有する、または配列番号９３であり、および／または
    （ｉｉｉ）前記３’セグメントが、配列番号９４と少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性を共有する、または配列番号９４である、請求項２５に記載のｒＡＡＶベクターゲノム。
  27. 前記発現カセットが、配列番号９５と少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性を共有する、または配列番号９５であり、および／または前記ｒＡＡＶベクターゲノムが、配列番号１０２と少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性を共有する、または配列番号１０２である、請求項２１～２６のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクターゲノム。
  28. 前記５’ＩＴＲが、配列番号９６と９５％の同一性を共有する配列を含み、および／または前記３’ＩＴＲが、配列番号９７と少なくとも９５％の同一性を共有する配列を含む、請求項２１～２７のいずれか一項に記載のＡＡＶベクターゲノム。
  29. 請求項１７～２８のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクターゲノムおよびＡＡＶキャプシドタンパク質を含む、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ビリオンであって、
    任意選択的に、前記ｒＡＡＶビリオンが、血清型ＡＡＶ９ビリオン、またはそのバリアントであり、および／または前記ＡＡＶキャプシドタンパク質が、ＡＡＶ９キャプシドタンパク質またはそのバリアントである、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ビリオン。
  30. 細胞にＭＹＢＰＣ３タンパク質を発現するｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏの方法であって、請求項２９に記載のｒＡＡＶビリオン、または請求項１７～２８のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクターゲノムで前記細胞を形質導入することを含む、方法。
  31. 前記細胞がＭＹＢＰＣ３－／－細胞である、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記細胞が、内因性ＭＹＢＰＣ３遺伝子の一方または両方のコピーに不活化変異を含む、請求項３０または請求項３１に記載の方法。
  33. 薬剤として使用するための、請求項２９に記載のｒＡＡＶビリオンまたは請求項１７～２８のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクターゲノム。
  34. 対象において心筋症を治療および／または予防する方法で使用し、任意選択的に、前記心筋症が肥大型心筋症である、請求項２９に記載のｒＡＡＶビリオン、または請求項１７～２８のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクターゲノム。
  35. 対象のＭＹＢＰＣ３変異によって引き起こされる疾患または障害を治療および／または予防する方法に使用するための、請求項２９に記載のｒＡＡＶビリオンまたは請求項１７～２８のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクターゲノム。
  36. 前記方法が、ＭＹＢＰＣ３タンパク質を発現すること、および／またはＭＹＢＰＣ３活性を増加させること、および／または前記対象の心臓の心機能を増加させることを含む、請求項３４または請求項３５に記載の使用のためのｒＡＡＶビリオンまたはｒＡＡＶベクターゲノム。
  37. 前記ｒＡＡＶビリオンまたはｒＡＡＶベクターゲノムの投与が、前記対象の心臓におけるＭＹＢＰＣ３の特異的発現を生じさせる、請求項３３～３６のいずれか一項に記載の使用のためのｒＡＡＶビリオンまたはｒＡＡＶベクターゲノム。
  38. 前記ｒＡＡＶビリオンまたはｒＡＡＶベクターゲノムの投与が、前記対象の骨格組織、脳、および／または肝臓におけるＭＹＢＰＣ３の低または検出不能な発現を引き起こす、請求項３３～３７のいずれか一項に記載の使用のためのｒＡＡＶビリオンまたはｒＡＡＶベクターゲノム。
  39. 前記対象がＭＹＢＰＣ３変異を含む、請求項３４～３８のいずれか一項に記載の使用のためのｒＡＡＶビリオンまたはｒＡＡＶベクターゲノム。
  40. 前記方法が、
    （ｉ）前記対象に前記ｒＡＡＶビリオンまたはｒＡＡＶベクターゲノムを静脈内投与すること、
    （ｉ）前記対象に前記ｒＡＡＶビリオンまたはｒＡＡＶベクターゲノムを心臓内投与すること、
    （ｉｉｉ）前記対象に前記ｒＡＡＶビリオンまたはｒＡＡＶベクターゲノムを直接注射すること、を含む、請求項３４～３９のいずれかの一項に記載の使用のためのｒＡＡＶビリオンまたはｒＡＡＶベクターゲノム。
  41. 前記対象が哺乳類であり、任意選択的に前記対象がヒトである、請求項３４～４０のいずれか一項に記載の使用のためのｒＡＡＶビリオンまたはｒＡＡＶベクターゲノム。
  42. 前記対象が若年である、請求項３４～４１のいずれか一項に記載の使用のためのｒＡＡＶビリオンまたはｒＡＡＶベクターゲノム。
  43. 前記対象が成人である、請求項３４～４１のいずれか一項に記載の使用のためのｒＡＡＶビリオンまたはｒＡＡＶベクターゲノム。
  44. 前記ｒＡＡＶビリオンまたはｒＡＡＶベクターゲノムが、約１０１１ｖｇ／ｋｇ～約１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項３３～４３のいずれか一項に記載の使用のためのｒＡＡＶビリオンまたはｒＡＡＶベクターゲノム。
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