CN116096394A - 用于治疗心脏病的基因疗法载体 - Google Patents

用于治疗心脏病的基因疗法载体 Download PDF

Info

Publication number
CN116096394A
CN116096394A CN202180028001.5A CN202180028001A CN116096394A CN 116096394 A CN116096394 A CN 116096394A CN 202180028001 A CN202180028001 A CN 202180028001A CN 116096394 A CN116096394 A CN 116096394A
Authority
CN
China
Prior art keywords
promoter
raav
mybpc3
seq
identity
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202180028001.5A
Other languages
English (en)
Inventor
L·伦巴第
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tenaya Therapeutics Inc
Original Assignee
Tenaya Therapeutics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tenaya Therapeutics Inc filed Critical Tenaya Therapeutics Inc
Priority claimed from PCT/US2021/017699 external-priority patent/WO2021163357A2/en
Publication of CN116096394A publication Critical patent/CN116096394A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0276—Knock-out vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A61K48/0058—Nucleic acids adapted for tissue specific expression, e.g. having tissue specific promoters as part of a contruct
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0075—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the delivery route, e.g. oral, subcutaneous
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4716—Muscle proteins, e.g. myosin, actin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0657—Cardiomyocytes; Heart cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0696—Artificially induced pluripotent stem cells, e.g. iPS
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/035—Animal model for multifactorial diseases
    • A01K2267/0375—Animal model for cardiovascular diseases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C12N15/864—Parvoviral vectors, e.g. parvovirus, densovirus
    • C12N15/8645—Adeno-associated virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/008—Vector systems having a special element relevant for transcription cell type or tissue specific enhancer/promoter combination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/50—Vector systems having a special element relevant for transcription regulating RNA stability, not being an intron, e.g. poly A signal

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Transplantation (AREA)

Abstract

本公开提供了可用于治疗或预防心脏病的方法和组合物。具体地，本公开提供了一种载体，其包括与治疗或预防心脏病，例如心肌病的治疗性基因产物操作性地连接的经修饰的肌钙蛋白T启动子。本公开还提供了重组腺相关病毒(rAAV)病毒粒子、rAAV病毒基因组以及其表达盒和药物组合物。本公开还提供了用于治疗如心脏病等疾病或病症的方法。

Description

用于治疗心脏病的基因疗法载体
相关申请交叉引用
本申请要求于2020年7月2日提交的美国临时专利申请序列号63/047,633和于2020年2月13日提交的美国临时专利申请序列号62/976,160的优先权的权益，所述美国临时专利申请的内容特此通过引用整体并入本文。
技术领域
本公开涉及用于治疗或预防受试者的心脏病(例如，心肌病)的组合物和方法。具体地，本公开涉及一种载体，其包括与治疗心脏病(例如，心肌病)的治疗性基因产物可操作地连接的心脏特异性启动子。
对序列表的参考
本申请经由EFS-Web电子申请并且包含呈.txt格式的电子提交的序列表。.txt文件含有2021年2月9日创建的名为“TENA_015_02WO_SeqList_ST25.txt”的序列表，并且大小为824千字节。此.txt文件中含有的序列表是说明书的一部分，并且通过引用整体并入本文。
背景技术
用于治疗心脏病的基因疗法方法通常采用被配置成有效转导心脏细胞并且以心脏组织特异性方式表达转基因的载体。腺相关病毒(AAV)载体、心脏特异性启动子或两者组合可以用于将编码基因产物(例如，治疗性蛋白)的多核苷酸递送到心脏组织，从而在所述组织中表达基因产物以治疗心脏病。心脏特异性启动子包含肌间线蛋白(Des)、α-肌球蛋白重链(a-MHC)、肌球蛋白轻链2(MLC-2)和心肌肌钙蛋白C(TNNC1或cTnC)启动子以及600个碱基对的心脏肌钙蛋白T(TNNT2)启动子。然而，部分由于病毒载体的包装限制，编码大蛋白的多核苷酸的递送仍然具有挑战性。
鉴于这些挑战，本领域仍然需要针对心脏病的改进的基因疗法载体。
发明内容
本公开总体涉及用于治疗或预防心脏病(例如心肌病)的组合物和方法。在第一方面，本公开提供了载体，其包括与编码治疗预防心脏病，例如心肌病的治疗性基因产物的多核苷酸可操作地连接的启动子，任选地心脏特异性启动子。所述载体可以是腺相关病毒(AAV)载体。
在一些方面，本公开提供了一种心肌肌钙蛋白T启动子，其包括具有介于300bp与500bp之间的多核苷酸。在一些实施例中，所述多核苷酸包括与SEQ ID NO:1至85中的任何一个共有至少80％、至少90％或至少100％同一性的序列。在一些实施例中，所述多核苷酸包括与SEQ ID NO:1共有至少80％、至少90％或至少100％同一性的序列。在一些实施例中，所述多核苷酸包括与SEQ ID NO:3共有至少80％、至少90％或至少100％同一性的序列。在一些实施例中，多核苷酸与位于肌钙蛋白T基因的转录起始位点上游并且包含其转录起始位点的基因组多核苷酸序列共有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在一些实施例中，相对于肌钙蛋白T基因的转录起始位点，多核苷酸与-450bp至+1bp的基因组多核苷酸序列共有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在一些实施例中，相对于肌钙蛋白T基因的转录起始位点，多核苷酸与-350bp至+1bp的基因组多核苷酸序列共有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在一些实施例中，相对于肌钙蛋白T基因的转录起始位点，多核苷酸与-250bp至+1bp的基因组多核苷酸序列共有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在一些实施例中，相对于肌钙蛋白T基因的转录起始位点，多核苷酸与-450bp至+50bp的基因组多核苷酸序列共有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在一些实施例中，相对于肌钙蛋白T基因的转录起始位点，多核苷酸与-350bp至+50bp的基因组多核苷酸序列共有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在一些实施例中，相对于肌钙蛋白T基因的转录起始位点，多核苷酸与-250bp至+50bp的基因组多核苷酸序列共有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在一些实施例中，所述肌钙蛋白T基因是人肌钙蛋白T基因。
在一些实施例中，所述启动子是肌肉特异性启动子。在一些实施例中，所述启动子是心脏细胞特异性启动子。在一些实施例中，所述启动子是心肌细胞特异性启动子。在一些实施例中，启动子具有与约600bp的天然肌钙蛋白T启动子相同的细胞类型特异性。在一些实施例中，本文所描述的启动子具有与包括SEQ ID NO:1的参考启动子相同的细胞类型特异性。在一些实施例中，相较于天然肌钙蛋白T启动子，所述启动子表达与其操作性地连接的基因产物高至少约10％、至少约20％、至少约30％。在一些实施例中，本文所描述的启动子表达与其操作性地连接的基因产物比包括SEQ ID NO:1的参考启动子高至少约10％、至少约20％、至少约30％。
在一些方面，本公开提供了一种载体，其包括与编码基因产物的多核苷酸操作性地连接的本文所描述的启动子中的任何一种启动子。在一些实施例中，所述载体是病毒载体。在一些实施例中，所述病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体。在一些实施例中，病毒载体具有至多约5.5kb的包装限制。
在一些实施例中，基因产物选自MYBPC3、KCNH2、TRPM4、DSG2和ATP2A2蛋白。在一些实施例中，基因产物选自CACNA1C,DMD,DMPK,EPG5,EVC,EVC2,FBN1,NF1,SCN5A,SOS1,NPR1,ERBB4,VIP和MYH7蛋白。在一些实施例中，基因产物是Cas9，任选地选自SpCas9、St1Cas9和SaCas9。
在一些实施例中，本文所描述的载体包括编码第二基因产物的多核苷酸。在一些实施例中，所述第二基因产物是功能性RNA，任选地微RNA或向导RNA。
在一些方面，本公开提供了一种分离的细胞，其包括本文所描述的启动子中的任何一种启动子。在一些实施例中，所述分离的细胞是诱导的多能干细胞或分离的心肌细胞。
在一些方面，本公开提供了一种药物组合物，其包括本文所描述的载体中的任何一种载体。
在一些方面，本公开提供了一种细胞疗法组合物，其包括本文所描述的分离的细胞中的任何一种分离的细胞。
在一些方面，本公开提供了一种重组腺相关病毒(AAV)载体基因组，其包括编码MYBPC3蛋白或其功能变体的MYBPC3多核苷酸以及启动子，其中所述启动子具有介于300bp与500bp之间的多核苷酸。在一些实施例中，所述多核苷酸包括与SEQ ID NO:1至85中的任何一个共有至少80％、至少90％或至少100％同一性的序列。在一些实施例中，所述多核苷酸包括与SEQ ID NO:1中的任何一个共有至少80％、至少90％或至少100％同一性的序列。在一些实施例中，所述多核苷酸包括与SEQ ID NO:3中的任何一个共有至少80％、至少90％或至少100％同一性的序列。在一些实施例中，多核苷酸与位于肌钙蛋白T基因的转录起始位点上游并且包含其转录起始位点的基因组多核苷酸序列共有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在一些实施例中，相对于肌钙蛋白T基因的转录起始位点，多核苷酸与-450bp至+1bp的基因组多核苷酸序列共有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在一些实施例中，相对于肌钙蛋白T基因的转录起始位点，多核苷酸与-350bp至+1bp的基因组多核苷酸序列共有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在一些实施例中，相对于肌钙蛋白T基因的转录起始位点，多核苷酸与-250bp至+1bp的基因组多核苷酸序列共有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在一些实施例中，相对于肌钙蛋白T基因的转录起始位点，多核苷酸与-450bp至+50bp的基因组多核苷酸序列共有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在一些实施例中，相对于肌钙蛋白T基因的转录起始位点，多核苷酸与-350bp至+50bp的基因组多核苷酸序列共有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在一些实施例中，相对于肌钙蛋白T基因的转录起始位点，多核苷酸与-250bp至+50bp的基因组多核苷酸序列共有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在一些实施例中，所述肌钙蛋白T基因是人肌钙蛋白T基因。
在一些实施例中，所述启动子是肌肉特异性启动子。在一些实施例中，所述启动子是心脏细胞特异性启动子。在一些实施例中，所述启动子是心肌细胞特异性启动子。在一些实施例中，启动子具有与约600bp的天然肌钙蛋白T启动子相同的细胞类型特异性。在一些实施例中，启动子具有与包括SEQ ID NO:1的参考启动子相同的细胞类型特异性。在一些实施例中，相较于天然肌钙蛋白T启动子，所述启动子表达与其操作性地连接的基因产物高至少约10％、至少约20％、至少约30％。在一些实施例中，启动子表达与其操作性地连接的基因产物比包括SEQ ID NO:1的参考启动子高至少约10％、至少约20％、至少约30％。
在一些实施例中，本文所描述的重组腺相关病毒(AAV)载体基因组包括编码MYBPC3蛋白的MYBPC3多核苷酸。在一些实施例中，MYBPC3多核苷酸包括至少约3.5kB。在一些实施例中，MYBPC3多核苷酸包括约3.8kB。在一些实施例中，MYBPC3是全长MYBPC3。在一些实施例中，MYBPC3是截短MYBPC3。
在一些实施例中，本文所描述的rAAV载体基因组表达MYBPC3。在一些实施例中，rAAV载体基因组表达MYBPC3的水平与包括约600bp的天然肌钙蛋白T启动子的参考AAV载体约相同。在一些实施例中，rAAV载体基因组表达MYBPC3的水平是包括约600bp的天然肌钙蛋白T启动子的参考AAV载体的至少约10％。在一些实施例中，rAAV载体基因组表达MYBPC3的水平是包括约600bp的天然肌钙蛋白T启动子的参考AAV载体的至少约20％。
在一些方面，本公开提供了一种重组腺相关病毒(AAV)载体基因组，其包括表达盒，所述表达盒按5'至3'的顺序包括：包含启动子的5'区段；多核苷酸，其编码基因产物；以及3'区段，所述3'区段包括polyA信号，所述表达盒任选地侧接有5'末端反向重复序列(ITR)和3'ITR中的一者或两者，其中所述编码所述基因产物的多核苷酸包括3kb到11kb、3kb到5kb、3.5kb到4.5kb或3.7kb到4kb；并且其中：a)所述5'区段和所述3'区段一起包括至多0.8kbp或至多0.9kbp；b)所述5'ITR、5'区段、所述3'区段和3'ITR一起包括或为至多1.2kbp、至多1.3kbp；和/或c)所述载体基因组包括至多4.7kbp、至多4.8kbp、至多4.9kbp或至多5.0kbp。在一些实施例中，所述5'区段包括至多500bp或至多480bp。在一些实施例中，所述3'区段包括至多200bp或至多150bp。
在一些实施例中，rAAV载体基因组包括编码基因产物的多核苷酸，其包括3.7kbp至3.9kbp，任选地3.8kbp。在一些实施例中，所述基因产物是MYBPC3或其功能变体。在一些实施例中，基因产物是MYBPC3。在一些实施例中，编码MYBPC3的多核苷酸与SEQ ID NO:86共有至少90％同一性。在一些实施例中，编码MYBPC3的多核苷酸与SEQ ID NO:86共有至少95％同一性。在一些实施例中，编码MYBPC3的多核苷酸是SEQ ID NO:86。在一些实施例中，MYBPC3与SEQ ID NO:103的多肽序列共有至少90％同一性。在一些实施例中，MYBPC3与SEQID NO:103的多肽序列共有至少95％同一性。在一些实施例中，MYBPC3与SEQ ID NO:103的多肽序列共有100％同一性。
在一些实施例中，rAAV载体基因组包括启动子，其中启动子是具有介于300bp与500bp之间的多核苷酸。在一些实施例中，启动子包括与SEQ ID NO:1至85或SEQ ID NO:91共有至少80％同一性的序列。在一些实施例中，启动子包括与SEQ ID NO:1至85或SEQ IDNO:91共有至少90％同一性的序列。在一些实施例中，启动子包括与SEQ ID NO:1至85或SEQID NO:91共有至少100％同一性的序列。
在一些实施例中，rAAV载体基因组包括polyA信号。在一些实施例中，所述polyA信号包括与SEQ ID NO:92共有至少90％同一性的序列、基本上由其组成或由其组成。在一些实施例中，所述polyA信号包括与SEQ ID NO:92共有至少95％同一性的序列、基本上由其组成或由其组成。在一些实施例中，polyA信号是SEQ ID NO:92。
在一些实施例中，rAAV载体基因组包括5'区段。在一些实施例中，5'区段与SEQ IDNO:93共有至少80％同一性。在一些实施例中，5'区段与SEQ ID NO:93共有至少90％同一性。在一些实施例中，5'区段与SEQ ID NO:93共有至少95％同一性。在一些实施例中，5'区段是SEQ ID NO:93。
在一些实施例中，rAAV载体基因组包括3'区段。在一些实施例中，3'区段与SEQ IDNO:94共有至少80％同一性。在一些实施例中，3'区段与SEQ ID NO:94共有至少90％同一性。在一些实施例中，3'区段与SEQ ID NO:94共有至少95％同一性。在一些实施例中，3'区段是SEQ ID NO:94。
在一些实施例中，rAAV载体基因组包括表达盒。在一些实施例中，表达盒与SEQ IDNO:95共有至少80％同一性。在一些实施例中，表达盒与SEQ ID NO:95共有至少90％同一性。在一些实施例中，表达盒与SEQ ID NO:95共有至少95％同一性。在一些实施例中，表达盒是SEQ ID NO:95。
在一些实施例中，rAAV基因组包括侧接有5'末端反向重复序列(ITR)和3'ITR中的一者或两者的表达盒。在一些实施例中，5'ITR包括与SEQ ID NO:96共有95％同一性的序列。在一些实施例中，3'ITR包括与SEQ ID NO:97共有至少95％同一性的序列。
在一些方面，本公开提供了一种重组AAV(rAAV)病毒粒子。在一些实施例中，rAAV病毒粒子包括本文所描述的rAAV载体基因组和AAV衣壳蛋白中的任何一种。
在一些方面，本公开提供一种在细胞中表达MYBPC3蛋白的方法，所述方法包括用本文所描述的rAAV病毒粒子或本文所描述的rAAV载体基因组中的任何一种转导细胞。在一些实施例中，所述细胞是MYBPC3-/-细胞。在一些实施例中，所述细胞包括在内源性MYBPC3基因的一个或两个拷贝中的失活突变。
在一些方面，本公开提供了一种治疗和/或预防有需要的受试者的心肌病的方法，所述方法包括向受试者施用本文所描述的rAAV病毒粒子或本文所描述的rAAV载体基因组中的任何一种，其中任选地，受试者患有心肌病或有患心肌病的风险。
在一些方面，本公开提供了一种表达有需要的受试者的心脏中的MYBPC3蛋白的方法，所述方法包括将本文所描述的rAAV病毒粒子或本文所描述的rAAV载体基因组中的任何一种施用于受试者，任选地患有心肌病或有患心肌病的风险的受试者，其中任选地受试者患有心肌病或有患心肌病的风险。
在一些实施例中，施用AAV载体引起MYBPC3在受试者心脏中的特异性表达。在一些实施例中，施用AAV载体导致MYBPC3在受试者的骨骼组织、脑和/或肝中的表达低或不可检测的表达，其中任选地受试者患有心肌病或有患心肌病的风险。
在一些方面，本公开提供了一种治疗有需要的受试者的由MYBPC3突变引起的疾病的方法，所述方法包括向受试者施用所描述的rAAV病毒粒子或本文所描述的rAAV载体基因组中的任何一种，其中任选地，受试者患有心肌病或有患心肌病的风险。
在一些方面，本公开提供了一种增加有需要的受试者的心脏中的MYBPC3活性和/或增加心脏功能的方法，所述方法包括向受试者施用本文所描述的rAAV病毒粒子或本文所描述的rAAV载体基因组中的任何一种，其中任选地，受试者患有心肌病或有患心肌病的风险。
在一些实施例中，本文所描述的方法治疗心肌病。在一些实施例中，本文所描述的方法预防心肌病。在一些实施例中，心肌病是肥厚型心肌病。
在一些实施例中，本文所描述的方法包括向所述受试者静脉内施用本文所描述的rAAV病毒粒子或本文所描述的rAAV载体基因组中的任何一种。在一些实施例中，本文所描述的方法包括向所述受试者心脏内施用本文所描述的rAAV病毒粒子或本文所描述的rAAV载体基因组中的任何一种。在一些实施例中，本文所描述的方法包括向所述受试者直接注射本文所描述的rAAV病毒粒子或本文所描述的rAAV载体基因组中的任何一种。在一些实施例中，本文所描述的方法包括施用每kg约1011至约1014rAAV病毒粒子或每kg约1011至约1014病毒基因组的剂量。
在一些实施例中，所述受试者是哺乳动物。在一些实施例中，所述受试者是人。在一些实施例中，所述受试者是成人。
在一些实施例中，本文所描述的药物组合物用作心脏病，例如心肌病的治疗或预防性治疗的药物。
附图说明
图1A示出了适于大货物的AAV载体基因组的插入序列图，示出了两个顺式调节元件的缺失或截短。
图1B示出了人心脏成纤维细胞(n＝2)使用AAV包装的构建体以MOI160,000感染后两天时进行的流式细胞术分析。
图1C示出了适于大货物的AAV载体基因组的插入序列图，示出了两个顺式调节元件的缺失或截短、内含子的缺失和序列3'至5'ITR的部分缺失。
图2A示出了包括心脏特异性肌钙蛋白(TNNT2)启动子和肌球蛋白结合蛋白C(MYBPC3)转基因的病毒基因组的原始和改变版本的示意图。
图2B示出了在MYBPC3-/-iPSC衍生的心肌细胞中通过免疫荧光检测MYBPC3蛋白，所述心肌细胞用编码由心脏特异性TNNT2启动子驱动的MYBPC3的AAV6包装的构建体转导。
图3A示出了在MYBPC3-/-iPSC衍生的心肌细胞中通过蛋白质印迹检测MYBPC3蛋白，所述心肌细胞用编码由各种大小(400至600bp)的心脏特异性TNNT2启动子驱动的人MYBPC3的AAV6包装的构建体转导。将GAPDH用作上样对照。
图3B示出了在MYBPC3-/-iPSC衍生的心肌细胞中通过蛋白质印迹检测MYBPC3蛋白，所述心肌细胞用编码由各种大小(400或600bp)的人心脏TNNT2启动子驱动的人MYBPC3的AAV6包装的构建体转导。没有Kozak序列用作阴性对照，并且GAPDH用作上样对照。
图3C示出了在MYBPC3-/-iPSC衍生的心肌细胞中通过蛋白质印迹检测MYBPC3蛋白，所述心肌细胞用编码由各种大小(400或600bp)的人心脏TNNT2启动子驱动的人MYBPC3的AAV6转染。将GAPDH用作上样对照。
图4A示出了Mybpc3基因的内含子和KO系的创始小鼠中MYBPC3蛋白表达的斑点印迹的图。
图4B示出了两周龄时野生型(WT)或KO小鼠(Mybpc3-/-)同窝仔体重的条形图。WT(n＝11)，Mybpc3+/-(n＝7)和Mybpc3-/-(n＝13)。
图4C示出了在两周龄时在野生型(WT)、杂合KO小鼠(Mybpc3+/-)或纯合KO小鼠(Mybpc3-/-)中通过超声心动图测量的射血分数(％)的条形图。
图4D示出了在两周龄时在野生型(WT)、杂合KO小鼠(Mybpc3+/-)或纯合KO小鼠(Mybpc3-/-)中通过超声心动图测量的短缩分数的条形图。
图4E示出了在两周龄时在野生型(WT)、杂合KO小鼠(Mybpc3+/-)或纯合KO小鼠(Mybpc3-/-)中相对于体重(BW)归一化的左心室(LV)质量的条形图。
图4F示出了在两周龄时在野生型(WT)、杂合KO小鼠(Mybpc3+/-)或纯合KO小鼠(Mybpc3-/-)中相对于体重归一化的收缩期间左心室内径(LVID)的条形图。
图4G示出了在两周龄时在野生型(WT)、杂合KO小鼠(Mybpc3+/-)或纯合KO小鼠(Mybpc3-/-)中相对于体重归一化的舒张期间左心室内径(LVIDd)的条形图。
图5示出了通过qRT-PCR检测心脏、骨骼、脑和肝组织中MYBPC3mRNA，所述组织从被眶后注射编码人MYBPC3的E12 GC AAV9包装的构建体的小鼠中采集，所述构建体由各种大小(400或600bp)的人心脏TNNT2启动子驱动。
图6A示出了条形图，所述条形图示出了在静脉内施用含有400bp经修饰的TNNT2启动子盒的AAV9载体后4周，成年小鼠心脏和肝中每微克基因组DNA的载体基因组的绝对定量。
图6B示出了条形图，所述条形图示出了在静脉内施用含有400bp经修饰的TNNT2启动子盒的AAV9载体后4周，成年小鼠心脏和肝中相对于转基因RNA的媒剂的倍数增加。
图7示出了在两周龄时被眶后注射编码Mybpc3的1E14 vg·kg-1测试载体或媒剂HBSS的纯合Mybpc3-/-小鼠中的MYBPC3蛋白表达的蛋白质印迹。
图8示出了条形图，所述条形图示出了在两周龄时被眶后注射编码Mybpc3的3E13vg·kg-1和1E14 vg·kg-1测试载体和媒剂HBSS的纯合Mybpc3-/-小鼠中的MYBPC3表达。
图9A示出了条形图，所述条形图示出了在纯合Mybpc3-/-小鼠在两周龄时被眶后注射编码Mybpc3的1E13 vg·kg-1、3E13 vg·kg-1和1E14 vg·kg-1测试载体或媒剂HBSS后6周，所述小鼠的相对于体重归一化的左心室质量(LVM/BM)。
图9B示出了条形图，所述条形图示出了在纯合Mybpc3-/-小鼠在两周龄时被眶后注射编码Mybpc3的1E13 vg·kg-1、3E13 vg·kg-1和1E14 vg·kg-1测试载体或媒剂HBSS后6周，所述小鼠的表示为收缩与舒张之间LV内部尺寸的百分比％变化的FAS。
图9C示出了条形图，所述条形图示出了在纯合Mybpc3-/-小鼠在两周龄时被眶后注射编码Mybpc3的1E13 vg·kg-1、3E13 vg·kg-1和1E14 vg·kg-1测试载体或媒剂HBSS后6周，所述小鼠的射血分数。
图9D示出了条形图，所述条形图示出了在纯合Mybpc3-/-小鼠在两周龄时被眶后注射编码Mybpc3的1E13 vg·kg-1、3E13 vg·kg-1和1E14 vg·kg-1测试载体或媒剂HBSS后31周，所述小鼠的相对于体重归一化的左心室质量(LVM/BM)。
图9E示出了条形图，所述条形图示出了在纯合Mybpc3-/-小鼠在两周龄时被眶后注射编码Mybpc3的1E13 vg·kg-1、3E13 vg·kg-1和1E14 vg·kg-1测试载体或媒剂HBSS后31周，所述小鼠的表示为收缩与舒张之间LV内部尺寸的百分比％变化的FAS。
图9F示出了条形图，所述条形图示出了在纯合Mybpc3-/-小鼠在两周龄时被眶后注射编码Mybpc3的1E13 vg·kg-1、3E13 vg·kg-1和1E14 vg·kg-1测试载体或媒剂HBSS后31周，所述小鼠的射血分数。
图10A是在5.4kbp或4.7kbp表达盒的背景下编码Mybpc3的AAV9载体的图示。
图10B是条形图，所述条形图示出了在纯合Mybpc3-/-小鼠在三个月龄时，在5.4kbp或4.7kbp盒的背景下，被眶后注射编码Mybpc3的3E13 vg·kg-1或1E14 vg·kg-1AAV9载体或注射媒剂对照HBSS后18周，所述小鼠的射血分数。
图10C是示出了以下的图：在纯合Mybpc3-/-小鼠在三个月龄时，在5.4kbp或4.7kbp盒的背景下，被眶后注射编码Mybpc3的3E13 vg·kg-1或1E14vg·kg-1AAV9载体或注射媒剂对照HBSS后，所述小鼠的射血分数进展。
图10D是条形图，所述条形图示出了在纯合Mybpc3-/-小鼠在三个月龄时，在5.4kbp或4.7kbp盒的背景下，被眶后注射编码Mybpc3的3E13 vg·kg-1或1E14 vg·kg-1AAV9载体或注射媒剂对照HBSS后18周，所述小鼠的相对于体重归一化的左心室质量(LVM/BM)。
图11A是条形图，所述条形图示出了在成年小鼠中全身递送具有GFP编码盒的AAV9衣壳变体CR9-10或具有GFP编码盒的AAV9后，心脏组织中的GFP表达(p<0.05，单向ANOVA；邓尼特多重比较测试(Dunnett's multiple comparison test))。
图11B是条形图，所述条形图示出了在两周龄时被眶后注射1E13vg·kg-1和3E13vg·kg-1的编码Mybpc3的AAV9载体、编码Mybpc3的CR9-10载体或媒剂对照HBSS的Mybpc3-/-小鼠的射血分数。
图11C是条形图，所述条形图示出了与给药前基线(ΔEF)相比，在两周龄时被眶后注射1E13 vg·kg-1和3E13 vg·kg-1的编码表达盒Mybpc3基因的AAV9载体、编码表达盒Mybpc3基因的CR9-10载体或媒剂对照HBSS的Mybpc3-/-小鼠的射血分数。
图12A是条形图，所述条形图示出了在静脉内递送1E13 vg·kg-1剂量的编码包装在十四种不同衣壳蛋白之一中的GFP的AAV载体后一个月，非人灵长类动物左心室中的GFP表达。
图12B是条形图，所述条形图示出了在静脉内递送1E13 vg·kg-1剂量的编码包装在十四种不同衣壳蛋白之一中的GFP的AAV载体后一个月，非人灵长类动物肝中的GFP表达。
图12C是条形图，所述条形图示出了在静脉内递送1E13 vg·kg-1剂量的编码包装在十四种不同衣壳蛋白之一中的GFP的AAV载体后一个月，非人灵长类动物的左心室:肝脏中GFP表达的比率。
图13A是示出以下的图：在两周龄时被眶后注射编码小鼠Mybpc3基因(mMybpc3)的AAV9(在1E14 vg·kg-1下)、编码人MYBPC3基因(hMYBPC3)的AAV9(在1E14 vg·kg-1下)或媒剂HBSS的纯合Mybpc3-/-小鼠的射血分数进展。
图13B是示出以下的图：在两周龄时被眶后注射编码小鼠Mybpc3基因(mMybpc3)的AAV9(在1E14 vg·kg-1下)、编码人MYBPC3基因(hMYBPC3)的AAV9(在1E14 vg·kg-1下)或媒剂HBSS的纯合Mybpc3-/-小鼠的相对于体重归一化的左心室质量(LVM/BW)。
图13C是条形图，在两周龄时被眶后注射编码小鼠Mybpc3基因(mMybpc3)的AAV9(在1E14 vg·kg-1下)、编码人MYBPC3基因(hMYBPC3)的AAV9(在1E14 vg·kg-1下)或媒剂HBSS的纯合Mybpc3-/-小鼠的舒张期间左心室后壁厚度(LVPW；d)。
图14A是条形图，所述条形图示出了在两周龄时被眶后注射编码人MYBPC3基因的1E13 vg·kg-1、1E14 vg·kg-1和3E14 vg·kg-1测试载体或媒剂HBSS的纯合Mybpc3-/-小鼠的射血分数。
图14B是条形图，所述条形图示出了与给药前基线(ΔEF)相比，在两周龄时被眶后注射编码人MYBPC3基因的1E13 vg·kg-1、1E14 vg·kg-1和3E14vg·kg-1测试载体或媒剂HBSS的纯合Mybpc3-/-小鼠的射血分数。
图14C是条形图，所述条形图示出了在两周龄时被眶后注射编码人MYBPC3基因的1E13 vg·kg-1、1E14 vg·kg-1和3E14 vg·kg-1测试载体或媒剂HBSS的纯合Mybpc3-/-小鼠的相对于体重归一化的左心室质量(LVM/BW)。
具体实施方式
本公开提供了用于心脏细胞和/或大基因中的基因疗法的组合物和方法。所公开的多核苷酸和载体可用于治疗或预防疾病(例如，如心肌病等心脏病)。本公开提供了心脏特异性启动子、表达盒、重组腺相关病毒(rAAV)病毒基因组、rAAV病毒粒子、药物组合物和使用方法。表达盒和rAAV病毒基因组可以包括与编码基因产物的多核苷酸可操作地连接的心脏特异性启动子。基因产物可以是治疗性基因产物，此类治疗性基因产物用于治疗和/或预防心脏病，例如心肌病。本公开还提供了经工程化以递送和表达大基因产物的rAAV病毒基因组和表达盒。在一些实施例中，载体基因组包括编码MYBPC3多肽或其功能变体的多核苷酸和启动子。在一些实施例中，启动子是心肌肌钙蛋白T启动子(即，TNNT2启动子)。在一些实施例中，rAAV载体基因组包括表达盒，所述表达盒包括编码基因产物例如MYBPC3的多核苷酸和侧接有一个或多个末端反向重复序列多核苷酸序列的启动子，例如TNNT2启动子。在一些实施例中，rAAV病毒粒子包括包含如本文所描述的rAAV载体基因组和AAV衣壳蛋白的多核苷酸。本公开还提供了包括本文所描述的载体基因组、rAAV载体基因组和rAAV病毒粒子的药物组合物。还提供了治疗和/或预防受试者的心肌病的方法，所述方法包括施用本文所描述的rAAV病毒粒子或载体基因组。
根据以下详细描述和权利要求，本发明的其它实施例、特征和优点将变得显而易见并被其涵盖在内。
I.定义
如在本说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一个”、“一种”以及“所述”包含复数指代，除非上下文另有明确指示。
如在本说明书中所使用的，除非另有指示，否则在本公开中使用术语“和/或”来意指“和”或“或”。
贯穿本说明书，除非上下文另外要求，否则词语“包括(comprise)”或如“包括(comprises)”或“包括(comprising)”等变型应当理解为暗示包含所述的要素或整体或要素或整体组，但不排除任何其它要素或整体或要素或整体组。
如本申请中使用的，术语“约”和“大约”用作等同物。本申请中使用的有或无约/大约的任何数值意指涵盖相关领域普通技术人员所了解的任何正常波动。在某些实施例中，术语“大约”或“约”是指在陈述的参考值的任一方向(大于或小于)的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小的值的范围，除非另外陈述或另外从上下文明显可见(除了这种数字将会超过可能值的100％的情况)。
本文可互换使用的术语“多核苷酸”和“核酸”是指多于约100个核苷酸的(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)的核苷酸的聚合物形式。因此，此术语包含但不限于单链、双链或多链DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂交体或包括嘌呤和嘧啶碱基或其它天然的、经化学或生化修饰的、非天然的或衍生的核苷酸碱基的聚合物。“寡核苷酸”通常是指单链或双链DNA的约5至约100个核苷酸之间的多核苷酸。然而，出于本公开的目的，寡核苷酸的长度没有上限。寡核苷酸也称为“寡聚物(oligomer)”或“寡聚物(oligo)”，并且可以从基因中分离出来，或通过本领域已知的方法化学合成。应了解术语“多核苷酸”和“核酸”包含单链(例如有义或反义)和双链多核苷酸(如果所描述的实施例适用的话)。
如本文所使用的，术语“启动子”是指具有一个或多个识别位点的多核苷酸序列，所述一个或多个识别位点与RNA聚合酶结合，使得在宿主或靶细胞中，RNA聚合酶可以启动启动子“下游”的多核苷酸序列并将其转录成RNA。类似地，如果“启动子”在宿主或靶细胞中，则所述启动子与多核苷酸序列可操作地连接或操作性地连接，在所述宿主或靶细胞中，启动子是活性的，RNA聚合酶在转录状态位点处启动多核苷酸的转录。哺乳动物细胞中可操作的启动子一般包括定位在引发转录的位点上游大约25个至30个碱基处的AT富含区和/或发现于距离转录起始点上游70个至80个碱基处的另一个序列，即CNCAAT区，其中N可以是任何核苷酸。
术语“上游”和“上游端”是指多核苷酸的一部分，即，关于转录起始位点(TSS)，多核苷酸的有义链(或编码链)上TSS的5'；以及多核苷酸反义链上TSS的3'。术语“下游”和“下游端”是指多核苷酸的一部分，即，关于TSS，多核苷酸的有义链(或编码链)上TSS的3'；以及多核苷酸反义链上TSS的5'。因此，从启动子上游端的缺失是多核苷酸的非转录区域中一个或多个碱基对的缺失，即有义链上TSS的5'(或等效地，反义链上TSS的3')。从启动子下游端的缺失是多核苷酸的转录区域中一个或多个碱基对的缺失，即有义链上TSS的3'(或等效地，反义链上TSS的5')。
如本文所使用的，术语“转基因”是指编码蛋白质或RNA(例如，治疗性蛋白)的核酸序列，所述核酸序列对于引入它的转基因动物或细胞而言是部分或完全异源的，即外源的，或者与引入它的转基因动物或细胞的内源基因是同源的，但所述核酸序列被设计成插入或被插入动物基因组中，以改变它所插入的细胞的基因组(例如，它插入到与天然基因不同的位置处或其插入导致敲除)。转基因可以包含一个或多个转录调节序列和对于所选择的核酸的最佳表达所必需的任何其它核酸，如内含子。
术语“序列同一性”是指在两个多核苷酸或多肽序列之间相同且相对位置相同的碱基或氨基酸的百分比。因此，一个多核苷酸或多肽序列与另一多核苷酸或多肽序列相比具有一定百分比的序列同一性。为了进行序列比较，通常一个序列充当与测试序列进行比较的参考序列。术语“参考序列”是指与测试序列进行比较的分子。
用于比较和确定序列同一性百分比的序列比对方法是本领域众所周知的。用于比较的序列的最佳比对可以例如分别通过以下进行：Needleman和Wunsch的同源性比对算法,《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》48:443(1970)；Pearson和Lipman的相似性搜索方法,《美国国家科学院院刊(Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA)》85:2444(1988)；这些算法的计算机化实施方案(威斯康星州麦迪逊科学大道575号遗传学计算机组(Genetics Computer Group,575 Science Dr.,Madison,WI)的威斯康星遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)；手动比对和视觉检查(参见例如，Brent等人,《当代分子生物学实验指南(CurrentProtocols in Molecular Biology)》(2003))；通过使用本领域已知的算法，包含BLAST和BLAST 2.0算法，其描述于以下中：Altschul等人,《核酸研究(Nuc.Acids Res.)》25:3389-3402(1977)；以及Altschul等人,《分子生物学杂志》215:403-410(1990)。用于执行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation)公开获得。
在一些实施例中，序列同一性百分比的确定可以在局部比对之后进行。此类比对是本领域众所周知的，例如服务EMBOSS匹配器使用基于LALIGN应用2.0u4版本的算法来鉴定两个序列之间的局部相似性。在一实例中，可以使用设置为默认参数的服务匹配器(EMBOSS)来计算两个核酸序列之间的同一性，例如矩阵(DNAfull)、空位开放(16)、空位延伸(4)、替代匹配(1)。
“表达盒”或“表达构建体”是指与启动子可操作地连接的DNA多核苷酸序列。“可操作地连接”或“操作性地连接”是指并置，其中如此描述的组分处于允许所述组分按其预期方式起作用的关系。例如，如果启动子影响多核苷酸序列的转录或表达，则启动子与多核苷酸序列可操作地连接。
如本文所使用的，与“转导”可互换使用的术语“递送”是指外源性核酸分子通过其转移到细胞中使得所述外源性核酸分子位于细胞内部的过程。核酸的递送是与核酸表达不同的过程。
术语“经修饰的”是指与对应的未经修饰的物质或化合物相比已经改变或变化的物质或化合物(例如，细胞、多核苷酸序列和/或多肽序列)。
术语“样品”是指经受分析和/或遗传修饰的生物组合物(例如，细胞或组织的一部分)。在一些实施例中，样品是直接从受试者获得的“原始样品”；在一些实施例，“样品”是加工原始样品例如以去除某些组分和/或以分离或以纯化所关注的某些组分的结果。
术语“基因”或“重组基因”是指包括编码多肽的开放阅读框的核酸，所述开放阅读框包含外显子和(任选地)内含子序列两者。
术语“转染”是指细胞对外源DNA的摄取。当外源DNA被引入细胞膜内时，细胞已被“转染”。许多转染技术通常是本领域已知的。参见例如，Graham等人，《病毒学(Virology)》52:456(1973)；Sambrook等人,《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A LaboratoryManual)》(1989)；Davis等人,《分子生物学基础方法(Basic Methods in MolecularBiology)》(1986)；Chu等人,《基因(Gene)》,13:197(1981)。此类技术可以用于将一种或多种外源DNA部分如核苷酸整合载体和其它核酸分子引入到合适的宿主细胞中。所述术语捕获化学和电转染程序。
术语“表达”是指将核酸翻译成肽或转录成RNA的过程，例如，核酸可以翻译成肽、多肽或蛋白质。如果核酸源自基因组DNA，则如果选择适当的真核宿主细胞或生物体，则表达可以包含mRNA的剪接。对于要在宿主细胞中表达的异源核酸，它必须首先被递送到细胞中，然后一旦进入细胞，最终驻留在细胞核中。
术语“基因疗法”涉及将异源DNA转移到哺乳动物，特别是人的细胞中，所述哺乳动物患有寻求疗法或诊断的疾病或病症。以使异源DNA表达并产生由此编码的治疗产物的方式将DNA引入到所选择的靶细胞中。可替代地，异源DNA可以某种方式介导编码治疗性产物的DNA的表达；其可以编码以一些方式直接或间接介导治疗性产物表达的产物，如肽或RNA。基因疗法还可以用于递送编码基因产物的核酸以替换缺陷基因或补充由哺乳动物或补充由哺乳动物或引入基因产物的细胞产生的基因产物。引入的核酸可以编码在哺乳动物宿主中通常不产生或不以治疗有效量或在治疗有用的时间产生的治疗性基因产物。编码治疗性产物的异源DNA可以在引入到受损害宿主的细胞中之前进行修饰，以便增强或以其它方式改变产物或其表达。
如本文所使用的，“异源”多核苷酸或核酸是指衍生自宿主生物以外的来源的多核苷酸或多核苷酸的一部分，或对于病毒载体，衍生自天然非重组病毒。异源DNA的实例包含但不限于编码可追踪标志物蛋白的DNA，如赋予药物抗性的蛋白质；编码治疗有效物质的DNA，如抗癌剂、酶和激素，以及编码其它类型的蛋白质的DNA，如抗体。
术语“野生型”是指分别编码蛋白质或其一部分、或蛋白质序列或其一部分的天然多核苷酸序列，因为它通常存在于正常或健康受试者体内。
术语“变体”是指具有一个或多个遗传变化(例如插入、缺失、取代等)的蛋白质或核酸，所述蛋白质或核酸返回参考蛋白质或核酸的所有或基本上所有功能。例如，治疗性蛋白的变体保留相同或基本上相同的活性和/或向有需要的受试者提供相同或基本上相同的治疗益处。启动子序列的变体保留以与参考启动子相同或基本上相同的水平启动转录的能力，并且保留相同或基本上相同的细胞类型特异性。在特定实施例中，多核苷酸变体与参考序列具有至少或约50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在特定实施例中，蛋白质变体与参考序列具有至少或约50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。
术语“受试者”包含动物，例如哺乳动物。在一些实施例中，哺乳动物是灵长类动物。在一些实施例中，哺乳动物是人。在一些实施例中，受试者是家畜，如牛、绵羊、山羊、奶牛、猪等；或家养动物，如狗和猫。在一些实施例中(例如，具体地在研究环境中)，受试者是啮齿动物(例如，小鼠、大鼠、仓鼠)、兔子、灵长类动物或猪，如近交系猪等。术语“受试者”和“患者”在本文中可互换使用。
术语向受试者“施用”是这样一种程序：通过所述程序将一种或多种递送剂一起或单独地引入或施加到受试者上，使得受试者中存在的靶细胞最终与药剂接触。
如本文所使用的，“治疗”是指将药剂或组合物递送到受试者以影响生理结果。
如本文所使用的，术语“基因产物”是指由多核苷酸转录产生的蛋白质或核酸，并且在蛋白质基因产物的情况下，转录物随后翻译成蛋白质。“治疗性基因产物”是指当在受试者中以治疗量表达时向有需要的受试者提供治疗性生理作用或益处的基因产物。
如本文所使用的，术语“治疗性蛋白”是指当在受试者中以治疗量表达或施用时向有需要的受试者提供治疗性生理作用或益处的蛋白质或多肽。在一些实施例中，用治疗性蛋白或表达治疗性蛋白的载体的治疗为患有心脏病的受试者(例如，患有心肌病的受试者)提供了治疗性生理学作用或益处。表2中提供了用于治疗心脏病的说明性治疗性蛋白。
如本文所使用的，术语“心肌病”是指心肌(即，实际的心脏肌)功能因任何原因而恶化。患有心肌病的受试者经常处于心律失常或心脏突然死亡的风险或两者兼而有之。
如本文所使用的，术语“肥厚型心肌病”是指其中心肌的一部分是肥厚的心脏和心肌疾病。
如本文所使用的，术语“家族性肥厚型心肌病”是指特征在于左心室壁厚度增加(即，肥大)的遗传病症。
如本文所使用的，术语“有效量”是指产生特定生理作用所需的药剂或组合物的最小量。特定药剂的有效量可以基于药剂的性质以多种方式表示，如质量/体积、细胞数/体积、颗粒/体积、(药剂的质量)/(受试者质量)、细胞数/(受试者质量)或粒子/(受试者质量)。特定药剂的有效量也可以表示为半最大有效浓度(EC50)，其是指使特定生理应答的幅度介于参考水平与最大应答水平之间的药剂的浓度。
II.多核苷酸
在一些实施例中，本公开提供了用于治疗和/或预防心脏病(例如，心肌病)的多核苷酸序列。在一些实施例中，多核苷酸序列包括与编码治疗和/或预防心肌病的一种或多种治疗性基因产物的多核苷酸操作性地连接的心脏特异性启动子。
多核苷酸是指长度为至少5个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少40个、至少50个、至少100个、至少200个、至少300个、至少400个、至少500个、至少1000个、至少5000个、至少10000个或至少15000个或更多个核苷酸以及所有中间长度的核苷酸的聚合形式，或者是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或者是任一类型核苷酸的修饰形式。在此上下文中，“中间长度”意指所引用值之间的任何长度，如6、7、8、9等，101、102、103等；151、152、153等；201、202、203等。
由于遗传密码的简并性，存在许多对多肽或其变体片段进行编码的核苷酸序列，如本文所描述的。这些多核苷酸中的一些多核苷酸与任何天然基因的核苷酸序列具有最小的同源性。尽管如此，在特定实施例中具体地设想了由于密码子使用的差异而变化的多核苷酸，例如针对人和/或灵长类动物密码子选择而优化的多核苷酸。此外，还可以使用包括本文所提供的多核苷酸序列的基因的等位基因。等位基因是由于如核苷酸的缺失、添加和/或取代等一个或多个突变而改变的内源基因。
如本文其它地方所公开的或如本领域已知的，无论编码序列本身的长度如何，本文所设想的多核苷酸可以与其它DNA序列组合，如启动子和/或增强子、非转译区(UTR)、信号序列、Kozak序列、多腺苷酸化信号、另外的限制酶位点、多克隆位点、内部核糖体进入位点(IRES)、重组酶识别位点(例如，LoxP位点、FRT位点和Att位点)、终止密码子、转录终止信号以及编码自切割多肽、表位标记的多核苷酸。
可以使用本领域中熟知且可获得的各种既定技术来制备、操纵和/或表达多核苷酸。
在一些实施例中，多核苷酸序列是启动子。在一些实施例中，多核苷酸序列是与编码治疗或预防心脏病(例如，心肌病)的治疗性基因产物的多核苷酸操作性地连接的启动子。
在一些实施例中，载体包括与编码治疗性基因产物(例如，编码治疗性蛋白，例如，MYBPC3蛋白)的多核苷酸可操作地连接的心脏特异性启动子。如本文所使用的，“心脏特异性启动子”是指其在心脏细胞中的活性是在任何其它非心脏细胞类型中的活性的至少2倍的启动子。优选地，适合用于本发明的载体中的心脏特异性启动子在心脏细胞中的活性是其在非心脏细胞类型中的活性的至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍或至少50倍。
在一些实施例中，载体包括与编码治疗性基因产物(例如，MYBPC3蛋白)的多核苷酸可操作性连接的心肌细胞特异性启动子。如本文所使用的，“心肌细胞特异性启动子”指定其在心肌细胞中的活性是在任何其它非心脏细胞类型或不是心肌细胞的心脏细胞中的活性的至少2倍的启动子。优选地，适合用于本公开的载体中的心肌细胞特异性启动子在心肌细胞中具有比其在非心脏细胞类型或不是心肌细胞的心脏细胞类型中的活性高至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍或至少50倍的活性。
在一些实施例中，心脏特异性或心肌细胞特异性启动子是人启动子。心脏特异性或心肌细胞特异性启动子的实例包含但不限于α肌球蛋白重链启动子、肌球蛋白轻链2v启动子、α肌球蛋白重链启动子、α-心脏肌动蛋白启动子、α-原肌球蛋白启动子、心脏肌钙蛋白C启动子、心脏肌钙蛋白I启动子、心脏肌球蛋白结合蛋白C启动子和肌质网/内质网Ca2+ATPase(SERCA)启动子(例如，SERCA2的同工型2)。
在一些实施例中，心脏特异性启动子是心脏TNNT2启动子。在一些实施例中，心脏TNNT2启动子例如通过多核苷酸的缺失、插入或取代进行修饰。心脏TNNT2启动子的说明性多核苷酸序列在下表1中示出。TNNT2启动子的转录起始位点(TSS)用粗体并且加下划线。
表1.说明性TNNT2启动子
Figure BDA0003886249370000201
在一些实施例中，心脏TNNT2启动子被修饰成包括长度介于约200与500个碱基对之间、介于约250与500个碱基对之间、约300至500个碱基对、约350至500个碱基对、约400至500个碱基对、约450至500个碱基对、约200到450个碱基对、介于约200与400个碱基对之间、介于约200与350个碱基对、介于约200与300个碱基对以及介于约200与250个碱基对之间的多核苷酸序列。在一些实施例中，经修饰的心脏TNNT2启动子包括约350个碱基对至约450个碱基对、约375个碱基对至约425个碱基对、约375个碱基对至约400个碱基对、约375个碱基对至约425个碱基对、约400个碱基对至约425个碱基对或约400个碱基对至约450个碱基对的多核苷酸序列。在一些实施例中，心脏TNNT2启动子包括约400个碱基对的多核苷酸序列。
在特定实施例中，经修饰的心脏肌钙蛋白T启动子包括介于300bp与500bp之间的SEQ ID NO:1。例如，经修饰的心脏肌钙蛋白T启动子可以包括SEQ ID NO:3。在一些实例中，300bp至500bp序列可以与另外的多核苷酸序列连接，但可以不与衍生自SEQ ID NO:1的另外的序列连接。例如，在一实施例中，经修饰的心脏肌钙蛋白T启动子可以包含不超过500bp的SEQ ID NO:1，但可以包含另外的不相关的多核苷酸序列。在另一个实例中，经修饰的心脏肌钙蛋白T启动子可以包含SEQ ID NO:3，即没有衍生自SEQ ID NO:1的另外的序列，但可以包含另外的不相关的多核苷酸序列。
在一些实施例中，心脏TNNT2启动子通过多核苷酸的缺失进行修饰。修饰可以包含一个、两个、三个或更多内部缺失。相对于具有约600个碱基对的参考心脏TNNT2启动子(SEQID NO:1)，每个缺失可以是1个碱基对、2个碱基对、3个碱基对、4个碱基对、5个碱基对、10个碱基对、15个碱基对、20个碱基对、25个碱基对、30个碱基对、40个碱基对、50个碱基对、60个碱基对、70个碱基对、80个碱基对、90个碱基对、100个碱基对、125个碱基对、150个碱基对、175个碱基对、200个碱基对、225个碱基对、250个碱基对、275个碱基对或300个碱基对的缺失。
在一些实施例中，相对于具有约600个碱基对的参考心脏TNNT2启动子(SEQ IDNO:1)，TNNT2启动子通过多核苷酸从启动子的上游端的缺失而进行修饰。相对于具有约600个碱基对的参考心脏TNNT2启动子(SEQ ID NO:1)，修饰可以包含从启动子的上游端的1个碱基对、2个碱基对、3个碱基对、4个碱基对、5个碱基对、10个碱基对、15个碱基对、20个碱基对、25个碱基对、30个碱基对、40个碱基对、50个碱基对、60个碱基对、70个碱基对、80个碱基对、90个碱基对、100个碱基对、125个碱基对、150个碱基对、175个碱基对、200个碱基对、225个碱基对、250个碱基对、275个碱基对或300个碱基对的缺失。在一些实施例中，相对于具有约600个碱基对的参考心脏TNNT2启动子(SEQ ID NO:1)，修饰是从启动子的上游端的200个碱基对缺失。
在一些实施例中，相对于具有约600个碱基对的参考心脏TNNT2启动子(SEQ IDNO:1)，心脏TNNT2启动子通过多核苷酸从启动子的下游端的缺失而进行修饰。相对于具有约600个碱基对的参考心脏TNNT2启动子(SEQ ID NO:1)，修饰可以包含从启动子的下游端的1个碱基对、2个碱基对、3个碱基对、4个碱基对、5个碱基对、10个碱基对、15个碱基对、20个碱基对、25个碱基对、30个碱基对、40个碱基对、50个碱基对、60个碱基对、70个碱基对、80个碱基对、90个碱基对、100个碱基对、125个碱基对、150个碱基对、175个碱基对、200个碱基对、225个碱基对、250个碱基对、275个碱基对或300个碱基对的缺失。
在一些实施例中，心脏TNNT2启动子通过多核苷酸的内部缺失进行修饰。相对于参考心脏TNNT2启动子(SEQ ID NO:1)，修饰可以包含1个碱基对、2个碱基对、3个碱基对、4个碱基对、5个碱基对、10个碱基对、15个碱基对、20个碱基对、30个碱基对、40个碱基对、50个碱基对、60个碱基对、70个碱基对、80个碱基对、90个碱基对、100个碱基对、125个碱基对、150个碱基对、175个碱基对、200个碱基对、225个碱基对、250个碱基对、275个碱基对或300个碱基对的内部缺失。
在一些实施例中，心脏TNNT2启动子通过多核苷酸的插入进行修饰。相对于参考心脏TNNT2启动子(SEQ ID NO:1)，修饰可以包含1个碱基对、2个碱基对、3个碱基对、4个碱基对、5个碱基对、10个碱基对、15个碱基对、20个碱基对、25个碱基对、30个碱基对、35个碱基对、40个碱基对、45个碱基对、50个碱基对、55个碱基对、60个碱基对、65个碱基对、70个碱基对、75个碱基对、80个碱基对、85个碱基对、90个碱基对、100个碱基对、125个碱基对、150个碱基对、175个碱基对、200个碱基对、225个碱基对、250个碱基对、275个碱基对或300个碱基对的插入。
在一些实施例中，心脏TNNT2启动子通过多核苷酸的取代进行修饰。相对于参考心脏TNNT2启动子(SEQ ID NO:1)，修饰可以包含1个碱基对、2个碱基对、3个碱基对、4个碱基对、5个碱基对、6个碱基对、7个碱基对、8个碱基对、9个碱基对或10个碱基对的取代。
在一些实施例中，相对于人TNNT2基因的转录起始位点，TNNT2启动子的多核苷酸序列与-450个碱基对至+1个碱基对的多核苷酸序列共有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在一些实施例中，相对于人TNNT2基因的转录起始位点，TNNT2启动子的多核苷酸序列与-350个碱基对至+1个碱基对的多核苷酸序列共有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或和100％序列同一性。在一些实施例中，相对于人TNNT2基因的转录起始位点，TNNT2启动子的多核苷酸序列与-250个碱基对至+1个碱基对的多核苷酸序列共有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或和100％序列同一性。
在一些实施例中，相对于TNNT2基因的转录起始位点，心脏TNNT2启动子的多核苷酸序列与-450个碱基对至+50个碱基对的多核苷酸序列共有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或和100％序列同一性。在一些实施例中，相对于TNNT2基因的转录起始位点，心脏TNNT2启动子的多核苷酸序列与-350个碱基对至+50个碱基对的多核苷酸序列共有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或和100％序列同一性。在一些实施例中，相对于TNNT2基因的转录起始位点，心脏TNNT2启动子的多核苷酸序列与-250个碱基对至+5个碱基对的多核苷酸序列共有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或和100％序列同一性。
在一些实施例中，心脏TNNT2启动子包括多核苷酸，所述多核苷酸包括与SEQ IDNO:1至85中的任何一个共有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。在一些实施例中，所述多核苷酸包括与SEQ ID NO:1至85中的任何一个共有至少80％同一性的序列。在一些实施例中，所述多核苷酸包括与SEQ ID NO:1至85中的任何一个共有至少90％同一性的序列。在一些实施例中，所述多核苷酸包括与SEQ ID NO:1至85中的任何一个共有至少100％同一性的序列。在一些实施例中，所述多核苷酸包括与SEQ ID NO:1共有至少80％同一性的序列。在一些实施例中，所述多核苷酸包括与SEQ ID NO:1共有至少90％同一性的序列。在一些实施例中，所述多核苷酸包括与SEQ ID NO:1共有至少100％同一性的序列。在一些实施例中，所述多核苷酸包括与SEQ ID NO:3共有至少80％同一性的序列。在一些实施例中，所述多核苷酸包括与SEQ ID NO:3共有至少90％同一性的序列。在一些实施例中，所述多核苷酸包括与SEQ ID NO:3共有至少100％同一性的序列。
B.说明性基因产物(蛋白质)
本公开的启动子可以与包括编码基因产物(例如，蛋白质或核酸)的序列的多核苷酸操作性地连接。在一些实施例中，基因产物是治疗性蛋白。治疗性蛋白可以是表2中列出的天然人蛋白质中的任何天然人蛋白质或其功能性同源物或变体。本公开的启动子特别适合与大基因一起使用，大基因原本可以其它方式以低水平表达，或者在通过病毒载体递送时不表达。本文公开的一些实施例的优点在于在具有有限包装能力的病毒载体，例如AAV载体中表达治疗性蛋白(特别是大治疗性蛋白)的能力。“大”蛋白是其大小影响所选择的载体中的表达的任何蛋白质。通常，“大”治疗性蛋白包括至少约1000或更多个氨基酸——即，蛋白质由约3kbps或更大的多核苷酸序列编码。包含大蛋白质的说明性蛋白质在下表2中提供。
表2.说明性蛋白质
Figure BDA0003886249370000241
与约600个碱基对的TNNT2启动子相比，当与本公开的经修饰的TNNT2启动子操作性地连接时，具有3千碱基或更大的长度的各种治疗性多核苷酸或由多核苷酸编码的治疗性蛋白更有效表达。本公开的启动子可用于至少表达以下：a)其中功能丧失突变导致心肌病(基因替代疗法)的大基因；b)在心肌细胞中表达具有心脏保护性的大基因；c)在心肌细胞中共表达是有益的基因的组合；以及d)用于心肌细胞特异性基因组编辑的工具。“大”基因是其大小影响所选择的载体中的表达的任何基因。通常，“大”治疗性基因编码包括至少约1000个或更多个氨基酸的蛋白质——即，基因包括约3kbps或更大的多核苷酸序列。在另外的实施例中，本公开的载体和启动子用于治疗表3中的疾病或病症，其中多核苷酸编码表中指示的治疗性蛋白。
表3.心脏病的示例性治疗性基因产物
Figure BDA0003886249370000251
*与ELP生物聚合物(例如，PB1046)融合以增加体内稳定性的VIP
MYBPC3是在心脏细胞中表达的基因。已知MYBPC3中的各种突变会导致肥厚型心肌病。导致肥厚型心肌病的所有突变中几乎一半通过无义、移码或剪接位点突变导致截短(Marian和Braunwald,《循环研究(Circ.Res.)》121:749-770(2017)；Walsh等人,《遗传医学(Genet.Med.)》19:192-203(2017)。含有过早终止密码子的mRNA经受无义介导的衰变机制的监测和降解。这与接受了肌切除术的肥厚型心肌病患者的心脏组织分析中突变RNA水平降低是一致的(Marston,《循环研究》105:219-222(2009)；van Dijk等人,《循环(Circulation)》119:1473-1483(2009)；Helms等人,《循环-心血管遗传学(Circ.Cardiovasc.Genet.)》7:434-443(2014)。进一步地，任何所得截短多肽似乎对泛素-蛋白酶体降解系统敏感。在患者肌切除术样品中，没有观察到九种不同突变的截短蛋白质(Rottbauer等人,《临床研究杂志(J.Clin.Invest.)》100:475-482(1997)；Moolman等人,《循环》101:1396-1402(2000)；Marston等人,《循环研究》105:219-222(2009)；van Dijk等人,《循环-心力衰竭(Circ.Heart Fail)》5:36-46(2012))。尽管杂合患者中的野生型MYBPC3等位基因似乎略有上调，但掺入肌节的MYBPC3蛋白总量明显低于正常值约65％(Marston等人,《循环研究》105:219-222(2009)；van Dijk等人,《循环-心力衰竭》5:36-46(2012)；McNamara等人,《公共科学图书馆·综合(PLoS One)》12:e0180064(2017))。因此，具有MYBPC3截短突变的肥厚型心肌病患者的肌节病理生理学似乎是由于单倍体不足。
在一些实施例中，本公开提供了一种载体，其包括与经修饰的心脏TNNT2启动子操作性地连接的编码MYBPC3蛋白的多核苷酸序列。类似地，在一些实施例中，与心脏特异性启动子(例如，经修饰的心脏TNNT2启动子)操作性地连接的多核苷酸序列是MYBPC3或其突变型、变体或片段。在人中，MYBPC3基因编码MYBPC3蛋白(也称为MyBP-C)，其调节心脏肌节，即肌肉收缩的基本单位。心脏肌肉肌节由粗丝和细丝组成，并且MYBPC3与厚丝附接以防止过早降解。示例性MYBPC3多核苷酸序列示于下表4A中。在一些实施例中，编码MYBPC3的多核苷酸与SEQ ID NO:86至89中的任何一个共有至少85％、90％、95％、99％或100％同一性。示例性MYBPC3蛋白序列示出于表4B中。在一些实施例中，载体基因组编码与SEQ ID NO:103至106中的任何一个共有至少85％、90％、95％、99％或100％同一性的MYBPC3蛋白。
表4A.说明性MYBPC3多核苷酸序列
Figure BDA0003886249370000271
Figure BDA0003886249370000281
Figure BDA0003886249370000291
Figure BDA0003886249370000301
Figure BDA0003886249370000311
Figure BDA0003886249370000321
Figure BDA0003886249370000331
表4B.说明性MYBPC3蛋白序列
Figure BDA0003886249370000332
Figure BDA0003886249370000341
Figure BDA0003886249370000351
在一些实施例中，本公开提供了一种载体，其包括编码与经修饰的心脏TNNT2启动子操作性地连接的钾电压门控通道亚家族H成员2(KCNH2)蛋白的多核苷酸序列。类似地，在一些实施例中，与心脏特异性启动子(例如，经修饰的心脏TNNT2启动子)操作性地连接的多核苷酸序列是KCNH2或其突变型、变体或片段(例如，SEQ ID NO:107)。在人中，KCNH2基因编码KCNH2蛋白(也称为hERG1，例如，SEQ ID NO:108)，其与其它KCNH2蛋白形成钾通道以将钾输送出细胞。KCHN2蛋白在心脏肌肉中充分表达，其在每次心跳后用于再灌注心脏组织以维持规律的节律。在一些实施例中，编码KCNH2的多核苷酸与SEQ ID NO:107共有至少90％、95％、99％或100％同一性。在一些实施例中，KCNH2蛋白与SEQ ID NO:108共有至少90％、95％、99％或100％同一性。
在一些实施例中，本公开提供了一种载体，其包括编码与经修饰的心脏TNNT2启动子操作性地连接的瞬态受体潜在阳离子通道亚家族M膜4(TRPM4)蛋白的多核苷酸序列。类似地，在一些实施例中，与心脏特异性启动子(例如，经修饰的心脏TNNT2启动子)操作性地连接的多核苷酸序列是TRPM4或其突变型、变体或片段(例如，SEQ ID NO:109)。在人中，TRPM4基因编码TRPM4蛋白(例如，SEQ ID NO:110)，其充当控制阳离子流入和流出细胞的通道。TRPM4通道在心脏细胞中充分表达，并且在产生和传输电信号中发挥关键作用。在一些实施例中，编码TRPM4的多核苷酸与SEQ ID NO:109共有至少90％、95％、99％或100％同一性。在一些实施例中，TRPM4蛋白与SEQ ID NO:110共有至少90％、95％、99％或100％同一性。
在一些实施例中，本公开提供了一种载体，其包括与经修饰的心脏TNNT2启动子操作性地连接的编码桥粒芯蛋白2(DSG2)蛋白的多核苷酸序列。类似地，在一些实施例中，与心脏特异性启动子(例如，经修饰的心脏TNNT2启动子)操作性地连接的多核苷酸序列是DSG2或其突变型、变体或片段(例如，SEQ ID NO:111)。在人中，DSG2基因编码DSG2蛋白(例如，SEQ ID NO:112)，所述DSG2蛋白是跨膜糖蛋白和桥粒的组分。桥粒是在细胞之间提供强粘附力，从而为组织提供机械强度的细胞间连接。在一些实施例中，编码DSG2的多核苷酸与SEQ ID NO:111共有至少90％、95％、99％或100％同一性。在一些实施例中，DSG2蛋白与SEQID NO:112共有至少90％、95％、99％或100％同一性。
在一些实施例中，本公开提供了一种载体，其包括与经修饰的心脏TNNT2启动子操作性地连接的编码ATP酶肌质网/内质网钙转运2(ATP2A2)蛋白的多核苷酸序列。类似地，在一些实施例中，与心脏特异性启动子(例如，经修饰的TNNT2启动子)操作性地连接的多核苷酸序列是ATP2A2或其突变型、变体或片段(例如，SEQ ID NO:113)。在人中，ATP2A2基因编码肌质(内质)网钙-ATP酶2(SERCA2)蛋白(例如，SEQ ID NO:114)，其催化ATP的水解以及钙从胞质溶胶易位到肌质网腔。钙离子进出肌质网的调节有助于肌肉收缩和放松。在一些实施例中，编码ATP2A2的多核苷酸与SEQ ID NO:113共有至少90％、95％、99％或100％同一性。在一些实施例中，ATP2A2蛋白与SEQ ID NO:114共有至少90％、95％、99％或100％同一性。
在一些实施例中，本公开提供了一种载体，其包括编码与经修饰的心脏TNNT2启动子操作性地连接的钙电压门控通道亚基α1C(CACNA1C)蛋白的多核苷酸序列。类似地，在一些实施例中，与心脏特异性启动子(例如，经修饰的TNNT2启动子)操作性地连接的多核苷酸序列是CACNA1C或其突变型、变体或片段(例如，SEQ ID NO:115)。在人中，CACNA1C基因编码电压依赖性钙通道蛋白(例如，SEQ ID NO:116)的α1亚基，其用于在膜极化时介导钙离子流入细胞。在一些实施例中，编码CACNA1C的多核苷酸与SEQ ID NO:115共有至少90％、95％、99％或100％同一性。在一些实施例中，CACNA1C蛋白与SEQ ID NO:116共有至少90％、95％、99％或100％同一性。
在一些实施例中，本公开提供了一种载体，其包括与经修饰的心脏TNNT2启动子操作性地连接的编码肌营养不良蛋白(DMD)蛋白的多核苷酸序列。类似地，在一些实施例中，与心脏特异性启动子(例如，经修饰的TNNT2启动子)操作性地连接的多核苷酸序列是DMD或其突变型、变体或片段(例如，SEQ ID NO:117)。在人中，DMD基因编码DMD蛋白(例如，SEQ IDNO:118)，其形成肌营养不良蛋白-糖蛋白复合物(DGC)的组分。DGC充当锚，将细胞骨架与细胞外基质连接起来，从而增强肌肉纤维并在肌肉收缩和放松时保护它们免受损伤。在一些实施例中，编码DMD的多核苷酸与SEQ ID NO:117共有至少90％、95％、99％或100％同一性。在一些实施例中，DMD蛋白与SEQ ID NO:118共有至少90％、95％、99％或100％同一性。
在一些实施例中，本公开提供了一种载体，其包括与经修饰的心脏TNNT2启动子操作性地连接的编码DM1蛋白激酶(DMPK)蛋白的多核苷酸序列。类似地，在一些实施例中，与心脏特异性启动子(例如，经修饰的TNNT2启动子)操作性地连接的多核苷酸序列是DMPK或其突变型、变体或片段(例如，SEQ ID NO:119)。在人中，DMPK基因编码强直性营养不良蛋白激酶蛋白(例如，SEQ ID NO:120)，其在脑、肌肉和心脏发育和体内平衡中起重要作用。强直性营养不良蛋白激酶抑制肌球蛋白磷酸酶，所述肌球蛋白磷酸酶在肌肉紧张和放松中起作用。在一些实施例中，编码DMPK的多核苷酸与SEQ ID NO:119共有至少90％、95％、99％或100％同一性。在一些实施例中，DMPK蛋白与SEQ ID NO:120共有至少90％、95％、99％或100％同一性。
在一些实施例中，本公开提供了一种载体，其包括与经修饰的心脏TNNT2启动子操作性地连接的编码异位P颗粒蛋白5同源物(EPG5)蛋白的多核苷酸序列。类似地，在一些实施例中，与心脏特异性启动子(例如，经修饰的TNNT2启动子)操作性地连接的多核苷酸序列是EPG5或其突变型、变体或片段(例如，SEQ ID NO:121)。在人中，EPG5基因编码EPG5蛋白(例如，SEQ ID NO:122)，其在自噬中起作用以促进自噬体与溶酶体之间的相互作用。在一些实施例中，编码EPG5的多核苷酸与SEQ ID NO:121共有至少90％、95％、99％或100％同一性。在一些实施例中，EPG5蛋白与SEQ ID NO:122共有至少90％、95％、99％或100％同一性。
在一些实施例中，本公开提供了一种载体，其包括与经修饰的心脏TNNT2启动子操作性地连接的编码EvC睫状复合物亚基1(EVC)蛋白的多核苷酸序列。类似地，在一些实施例中，与心脏特异性启动子(例如，经修饰的TNNT2启动子)操作性地连接的多核苷酸序列是EVC或其突变型、变体或片段(例如，SEQ ID NO:123)。在人中，EVC基因编码主要见于纤毛中的EVC蛋白(例如，SEQ ID NO:124)，并且用于在细胞之间传递信息。EVC蛋白还调节音猬因子，所述音猬因子在细胞生长和分化中发挥作用。在一些实施例中，编码EVC的多核苷酸与SEQ ID NO:123共有至少90％、95％、99％或100％同一性。在一些实施例中，EVC蛋白与SEQID NO:124共有至少90％、95％、99％或100％同一性。
在一些实施例中，本公开提供了一种载体，其包括与经修饰的心脏TNNT2启动子操作性地连接的编码肢蛋白蛋白的多核苷酸序列。类似地，在一些实施例中，与心脏特异性启动子(例如，经修饰的TNNT2启动子)操作性地连接的多核苷酸序列是EVC2或其突变型、变体或片段(例如，SEQ ID NO:125)。在人中，EVC2基因编码肢蛋白蛋白(例如，SEQ ID NO:126)。虽然肢蛋白的功能是未知的，但它对于正常生长和发育，尤其是骨骼和牙齿的发展是重要的。在一些实施例中，编码肢蛋白的多核苷酸与SEQ ID NO:125共有至少90％、95％、99％或100％同一性。在一些实施例中，肢蛋白蛋白与SEQ ID NO:126共有至少90％、95％、99％或100％同一性。
在一些实施例中，本公开提供了一种载体，其包括与经修饰的心脏TNNT2启动子操作性地连接的编码原纤蛋白-1蛋白的多核苷酸序列。类似地，在一些实施例中，与心脏特异性启动子(例如，经修饰的TNNT2启动子)操作性地连接的多核苷酸序列是FBN1或其突变型、变体或片段(例如，SEQ ID NO:127)。在人中，FBN1基因编码原纤蛋白-1和白脂素蛋白(例如，SEQ ID NO:128)。原纤蛋白-1是充当钙结合微纤维的结构组分的糖蛋白，其在全身的弹性和非弹性结缔组织中提供有力的支撑。白脂素是一种通常由白色脂肪组织分泌以调节葡萄糖稳态的激素。在一些实施例中，编码原纤蛋白-1的多核苷酸与SEQ ID NO:127共有至少90％、95％、99％或100％同一性。在一些实施例中，原纤蛋白-1蛋白与SEQ ID NO:128共有至少90％、95％、99％或100％同一性。
在一些实施例中，本公开提供了一种载体，其包括与经修饰的心脏TNNT2启动子操作性地连接的编码神经纤维瘤蛋白(NF1)蛋白的多核苷酸序列。类似地，在一些实施例中，与心脏特异性启动子(例如，经修饰的TNNT2启动子)操作性地连接的多核苷酸序列是NF1或其突变型、变体或片段(例如，SEQ ID NO:129)。在人中，NF1基因编码NF1蛋白(例如，SEQ IDNO:130)，其充当肿瘤抑制因子和刺激细胞生长和分裂的Ras信号传导通路的负调节剂。在一些实施例中，编码NF1的多核苷酸与SEQ ID NO:129共有至少90％、95％、99％或100％同一性。在一些实施例中，NF1蛋白与SEQ ID NO:130共有至少90％、95％、99％或100％同一性。
在一些实施例中，本公开提供了一种载体，其包括与经修饰的心脏TNNT2启动子操作性地连接的编码钠通道蛋白5型亚基α(SCN5A)蛋白的多核苷酸序列。类似地，在一些实施例中，与心脏特异性启动子(例如，经修饰的TNNT2启动子)操作性地连接的多核苷酸序列是SCN5A或其突变型、变体或片段(例如，SEQ ID NO:131)。在人中，SCN5A基因编码SCN5A蛋白(例如，SEQ ID NO:132)，所述SCN5A蛋白是一种河豚毒素抗性电压门控钠通道亚基。SCN5A主要见于心脏肌肉中，并且负责心电图中动作电位的初始上升。在一些实施例中，编码SCN5A的多核苷酸与SEQ ID NO:131共有至少90％、95％、99％或100％同一性。在一些实施例中，SCN5A蛋白与SEQ ID NO:132共有至少90％、95％、99％或100％同一性。
在一些实施例中，本公开提供了一种载体，其包括与经修饰的心脏TNNT2启动子操作性地连接的编码无七同源物之子1(SOS1)蛋白的多核苷酸序列。类似地，在一些实施例中，与心脏特异性启动子(例如，经修饰的TNNT2启动子)操作性地连接的多核苷酸序列是SOS1或其突变型、变体或片段(例如，SEQ ID NO:133)。在人中，SOS1基因编码SOS1蛋白(例如，SEQ ID NO:134)，其充当通过促进Rac特异性鸟嘌呤核苷酸交换因子活性而参与从Ras至Rac的转导信号的三聚体复合物的组分。在一些实施例中，编码SOS1的多核苷酸与SEQ IDNO:133共有至少90％、95％、99％或100％同一性。在一些实施例中，SOS1蛋白与SEQ ID NO:134共有至少90％、95％、99％或100％同一性。
在一些实施例中，本公开提供了一种载体，其包括与经修饰的心脏TNNT2启动子操作性地连接的编码利钠肽受体1(NPR1)蛋白的多核苷酸序列。类似地，在一些实施例中，与心脏特异性启动子(例如，经修饰的TNNT2启动子)操作性地连接的多核苷酸序列是NPR1或其突变型、变体或片段(例如，SEQ ID NO:135)。人的NPR1基因编码NPR1蛋白(也称为GC-A)(例如，SEQ ID NO:136)，所述NPR1蛋白是一种具有细胞内鸟苷酸环化酶活性的跨膜催化受体。NPR1是心房和脑利钠肽的受体，心房和脑利钠肽是在心血管稳态中起关键作用的血管活性激素。在一些实施例中，编码NPR1的多核苷酸与SEQ ID NO:135共有至少90％、95％、99％或100％同一性。在一些实施例中，NPR1蛋白与SEQ ID NO:136共有至少90％、95％、99％或100％同一性。
在一些实施例中，本公开提供了一种载体，其包括与经修饰的心脏TNNT2启动子操作性地连接的编码受体酪氨酸-蛋白激酶erbB-4(ERBB4)蛋白的多核苷酸序列。类似地，在一些实施例中，与心脏特异性启动子(例如，经修饰的TNNT2启动子)操作性地连接的多核苷酸序列是ERBB4或其突变型、变体或片段(例如，SEQ ID NO:137)。人中的ERBB4基因编码人中的ERBB4蛋白(例如，SEQ ID NO:138)，所述ERBB4蛋白是表皮生长因子家族中的跨膜受体。通过ERBB4受体的信号传导诱导多种细胞应答，包含有丝分裂和分化。在一些实施例中，编码ERBB4的多核苷酸与SEQ ID NO:137共有至少90％、95％、99％或100％同一性。在一些实施例中，ERBB4蛋白与SEQ ID NO:138共有至少90％、95％、99％或100％同一性。
在一些实施例中，本公开提供了一种载体，其包括与经修饰的TNNT2启动子操作性地连接的编码血管活性肠肽(VIP)蛋白的多核苷酸序列。类似地，在一些实施例中，与心脏特异性启动子(例如，经修饰的TNNT2启动子)操作性地连接的多核苷酸序列是VIP或其突变型、变体或片段(例如，SEQ ID NO:139)。在人中，VIP基因编码血管活性肠肽(例如，SEQ IDNO:140)，其用作神经调节剂和神经递质。VIP是一种有效的血管扩张剂，调节胃肠道的平滑肌活性、上皮细胞分泌和血流。在一些实施例中，编码VIP的多核苷酸与SEQ ID NO:139共有至少90％、95％、99％或100％同一性。在一些实施例中，VIP蛋白与SEQ ID NO:140共有至少90％、95％、99％或100％同一性。
在一些实施例中，本公开提供了一种载体，其包括与经修饰的心脏TNNT2启动子操作性地连接的编码β-肌球蛋白重链(MyHC-β)的多核苷酸序列。类似地，在一些实施例中，与心脏特异性启动子(例如，经修饰的TNNT2启动子)操作性地连接的多核苷酸序列是MYH7或其突变型、变体或片段(例如，SEQ ID NO:141)。在人中，MYH7基因编码MyHC-β蛋白(例如，SEQ ID NO:142)，它是形成心脏肌肉中大部分粗丝的六聚体不对称马达。肌球蛋白头中的ATP酶的酶活性水解ATP，从而促进缩短肌节以便产生心室内压力和功率的过程。在一些实施例中，编码MyHC-β的多核苷酸与SEQ ID NO:141共有至少90％、95％、99％或100％同一性。在一些实施例中，MyHC-β蛋白与SEQ ID NO:142共有至少90％、95％、99％或100％同一性。
III.载体
在一些实施例中，本公开提供了用于治疗或预防心脏病的载体。具体地，本文所描述的载体包括与编码治疗性蛋白的多核苷酸操作性地连接的心脏特异性启动子，其中治疗性蛋白的表达治疗有需要的受试者(例如，患有心肌病的受试者)。例如，在一些实施例中，载体是基于AAV的载体，所述载体包括与编码用于治疗或预防心肌病的MYBPC3蛋白的多核苷酸操作性地连接的心脏TNNT2启动子。
在一些实施例中，除了本文所描述的心脏特异性启动子(例如，经修饰的心脏肌钙蛋白T启动子)和治疗性基因产物(例如，MYBPC3蛋白)之外，所述载体包括促进鉴定或选择已转染、转导或感染的细胞的标志物基因。标志物基因的实例包含但不限于编码荧光蛋白的基因，例如增强型绿色荧光蛋白、Ds-Red(DsRed：香菇珊瑚红色荧光蛋白(RFP)；Bevis等人(2002)《自然生物技术(Nat.Biotechnol.)》20(11):83-87)、黄色荧光蛋白、mCherry和氰基荧光蛋白；以及编码赋予选择剂抗性的蛋白质的基因，例如新霉素抗性基因、嘌呤霉素抗性基因、杀稻瘟素抗性基因等。
在一些实施例中，载体包括大小为至多约4.0千碱基、至多约4.5千碱基、至多约5千碱基、至多约5.1千碱基、至多约5.2千碱基、至多约5.3千碱基、至多约5.4千碱基或至多约5.5千碱基的多核苷酸序列。在一些实施例中，载体包括大小为至多约4.5千碱基的多核苷酸序列。在一些实施例中，载体包括大小为至多约5千碱基的多核苷酸序列。在一些实施例中，载体包括大小为至多约5.5千碱基的多核苷酸序列。在一些实施例中，载体包括大小为至多约6千碱基的多核苷酸序列。
将多核苷酸引入到宿主细胞的方法是本领域已知的，并且可以使用任何已知方法将本文所描述的多核苷酸引入到细胞中。合适的方法包含例如病毒或噬菌体感染、转染、缀合、原生质体融合、脂转染、电穿孔、磷酸钙沉淀、聚乙烯亚胺(PEI)介导的转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质体介导的转染、粒子枪技术、磷酸钙沉淀、直接微量注射、纳米颗粒介导的核酸递送、微流体递送方法等。
A.非病毒载体
在一些实施例中，本文所描述的多核苷酸被递送到非病毒载体中的细胞，如转座子、纳米颗粒(例如脂质纳米颗粒)、脂质体、外泌体、减毒细菌或病毒样颗粒。在一些实施例中，非病毒载体是哺乳动物病毒样颗粒。例如，可以生成哺乳动物病毒样颗粒(例如，通过纯化“空的”哺乳动物病毒样颗粒，随后将哺乳动物病毒样颗粒与期望的货物进行离体组装)。也可以对非病毒载体进行工程化以掺入靶向配体，从而改变靶组织特异性。
B.病毒载体
在一些实施例中，所述载体是病毒载体。在一些实施例中，所述病毒载体是逆转录病毒载体，例如慢病毒载体。如本文所用，术语“逆转录病毒(retrovirus或retroviral)”是指RNA病毒，所述RNA病毒将其基因组RNA逆转录为线性双链DNA拷贝并且随后将其基因组DNA共价整合到宿主基因组中。逆转录病毒载体是用于基因递送的常见工具(Miller,《自然(Nature)》.357:455-460(2000))。一旦病毒整合到宿主基因组中，其就被成为“前病毒”。前病毒用作RNA聚合酶II的模板，并且指导由病毒编码的RNA分子的表达。在一些实施例中，逆转录病毒载体被改变以使其不整合到宿主细胞基因组中。
说明性逆转录病毒(逆转录病毒科属)包含但不限于：(1)γ逆转录病毒属，如莫洛尼鼠类白血病病毒(M-MuLV)、莫洛尼鼠类肉瘤病毒(MoMSV)、鼠类乳腺肿瘤病毒(MuMTV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)和猫白血病病毒(FLV)，(2)泡沫病毒属，如猿猴泡沫病毒，(3)慢病毒属，如人类免疫缺陷病毒-1和猿猴免疫缺陷病毒。
如本文所使用的，术语“慢病毒(lentiviral或lentivirus)”是指复杂逆转录病毒的组(或属)。说明性慢病毒包含但不限于：HIV(人免疫缺陷病毒；包含HIV 1型和HIV 2型)；维斯纳-梅迪病毒(visna-maedi virus，VMV)病毒；山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)；马感染性贫血病毒(EIAV)；猫免疫缺陷病毒(FIV)；牛免疫缺陷病毒(BIV)；以及猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。
在一些实施例中，所述病毒载体是腺病毒载体。腺病毒的遗传结构包含大约36kb的线性双链DNA病毒，所述病毒允许用长达7kb的外源序列取代大片段的腺病毒DNA(Grunhaus等人,《病毒学研讨会(Seminar in Virology)》200(2):535-546,1992)。
在一些实施例中，病毒载体是腺相关病毒(AVV)载体，如选自由以下组成的组的AAV载体：血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9和10或其衍生的嵌合AAV。
在一些实施例中，AAV表达载体被假型化以增强靶向。假型策略可以促进基因转移并维持靶细胞类型中的表达。例如，可以将AAV2基因组包装到如AAV5、AAV7或AAV8等另一种AAV血清型的衣壳中，分别产生如AAV2/5、AAV2/7和AAV2/8等假型载体，如以下中所描述的：Balaji等人《外科研究杂志(J Surg Res.)》9月；184(1):691–698(2013)。在一些实施例中，AAV9可以用于靶向在肌成纤维细胞样谱系中的表达，如以下中所描述的：Piras等人《基因疗法(Gene Therapy)》23:469–478(2016)。在一些实施例中，使用AAV1、AAV6或AAV9，并且在一些实施例中，AAV是工程化的，如以下中所描述的：Asokari等人《人类基因疗法(Hum GeneTher.)》11月；24(11):906–913(2013)；Pozsgai等人《分子疗法(Mol Ther.)》4月5日；25(4):855-869(2017)；Kotterman,M.A.和D.V.Schaffer用于临床基因疗法的工程化腺相关病毒(Engineering Adeno-Associated Viruses for Clinical Gene Therapy.)《自然评论：遗传学(Nature Reviews Genetics)》,15:445-451(2014)；以及Schaffer等人的US20160340393A1。在一些实施例中，病毒载体经过AAV工程化以增加靶细胞感染性，如US20180066285A1中所描述的。
C.调节元件
在一些实施例中，本公开提供了一种载体，其包括一种或多种调节元件，所述一种或多种调节元件与编码治疗性蛋白或核酸的多核苷酸操作性地连接。在一些实施例中，调节元件是与用于治疗心脏病的治疗性蛋白或核酸操作性地连接的心脏特异性启动子(例如，经修饰的TNNT2启动子)。
如本文所使用的，术语“调节元件”是指载体的那些非翻译区(例如，复制起点、选择盒、启动子、增强子、翻译起始信号(Shine Dalgarno序列或Kozak序列)内含子、多聚腺苷酸化序列、5'和3'非翻译区)，所述非翻译区与宿主细胞蛋白相互作用以进行转录和翻译。此类元件的强度和特异性可以不同。转录调节元件可以在真核细胞(例如，哺乳动物细胞)或原核细胞(例如，细菌或古细菌细胞)中起作用。在一些实施例中，编码本文所描述的治疗性基因产物(例如，治疗性蛋白或核酸)的多核苷酸序列与允许多核苷酸在原核细胞和真核细胞中表达的多个控制元件可操作地连接。
如本文所使用的，术语“转录起始位点”或“TSS”是指当RNA聚合酶启动转录时由RNA聚合酶转录的第一碱基对。TSS与起始密码子(典型地，ATG)不同，所述起始密码子必须位于多核苷酸的转录区中的TSS下游。转录起始位点的位置可以通过实验确定或通过使用各种预测算法中的任何预测算法的预测来确定。注释的TSS可从真核启动子数据库和UCSC基因组浏览器中获得。在UCSC基因组浏览器中鉴定了TNNT2的多个TSS。
如本文所使用的，TNNT2的TSS定义为由dbTSS鉴定的基序的5'端处的C鉴定的序列：CTCCATC。
如本文所使用的，术语“经修饰的心脏TNNT2启动子”是指包括至少200个碱基对的多核苷酸序列的启动子，所述多核苷酸序列包括一个或多个连续或不连续的多核苷酸区段，每个多核苷酸区段与表1中提供的TNNT2p-600区段的对应区段如SEQ ID NO:1共有70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。由于它是“启动子”，因此经修饰的心脏TNNT2启动子必须能够促进宿主或靶细胞中RNA聚合酶在启动子内的TSS处或附近(即，如本文定义的TNNT2的TTS处或附近)启动转录，或者如果TNNT2的内源性TSS不存在于经修饰的心脏TNNT2启动子中，则在异源性TSS处下游(有义链上的3')至经修饰的心脏TNNT2启动子的下游(3')端最多100个碱基对。类似地，经修饰的心脏TNNT2启动子可以仅包括TNNT2的TSS上游的序列，或更多包括TNNT2的TSS。
如本文所使用的，启动子(例如，经修饰的心脏TNNT2启动子)的长度，即“具有”如此多碱基对的启动子，是根据启动子的多核苷酸序列中从其5'端至其3'端的碱基对数量定义的，包含端点并且包含不与参考启动子序列比对的任何中间序列(例如，人或其它生物体的内源性心脏TNNT2启动子)。当序列由BLAST算法或等同物比对时，启动子的5'端和3'端被定义为在任一方向上的最后碱基对，以匹配参考启动子序列中的对应序列。因此，可以通过使用载体的多核苷酸序列搜索含有参考生物体的基因组的核苷酸数据库，并且鉴定涵盖约1至5kb内源性基因或在其内的一个或多个比对区，或者通过将载体与预定参考启动子比对来确定载体中的启动子的长度。如果启动子作为连续区段与参考基因组或参考启动子序列比对，则启动子的长度是报告的长度比对(3'端位置减去5'端位置，+1，除非包含TSS)。如果启动子在多个区段(例如，2、3、4或5个区段)中比对，则启动子的长度可以通过以下来计算：参考基因组或参考启动子序列的最3'区段的3'端位置减去参考基因组或参考启动子序列的最5'区段的5'端位置，加1，除非包含TSS(使得计算的长度包含两个端点)。例如，从TSS前碱基对100bp(-100bp)延伸到TSS前5bp(-5bp)的启动子长度为-5-(-100)+1＝100-5+1＝96bp。TSS计数为+1bp。因此，从TSS前碱基对100bp(-100bp)延伸到TSS后5bp(+5bp)的启动子长度为+5-(-100)＝100+5＝105bp。
术语“增强子”是指含有能够提供增强的转录的序列并且在一些情况下可以不依赖于其相对于另一个控制序列的朝向而起作用的DNA的区段。增强子可以与启动子和/或另一个增强子元件协作地或加性地起作用。增强子可以与启动子重叠或者在启动子的上游或下游。在一些实施例中，经修饰的心脏TNNT2启动子包括一种或多种增强子。在一些实施例中，经修饰的心脏TNNT2启动子不包括增强子。
除了或代替经修饰的心脏TNNT2启动子之外，一些实施例采用其它真核启动子，包含但不限于：巨细胞病毒(CMV)即刻早期、单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶、病毒猿猴病毒40(SV40)(例如，早期和晚期SV40)、脾脏病灶形成性病毒(SFFV)启动子、来自逆转录病毒的长末端重复序列(LTR)(例如，莫洛尼鼠白血病病毒(Moloney murine leukemia virus，MoMLV)LTR启动子或劳斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus，RSV)LTR)、单纯疱疹病毒(HSV)(胸苷激酶)启动子、来自牛痘病毒的H5、P7.5和P11启动子、延伸因子1-α(EF1α)启动子、早期生长应答1(EGR1)启动子、铁蛋白H(FerH)启动子、铁蛋白L(FerL)启动子、甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)启动子、真核翻译起始因子4A1(EIF4A1)启动子、热休克70kDa蛋白5(HSPA5)启动子、热休克蛋白90kDaβ、成员1(HSP90B1)启动子、热休克蛋白70kDa(HSP70)启动子、β-驱动蛋白(β-KIN)启动子、人ROSA 26基因组(Irions等人,《自然生物技术》25,1477-1482(2007))、泛素C(UBC)启动子、磷酸甘油酸激酶-1(PGK)启动子、巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白(CAG)启动子、β-肌动蛋白启动子和骨髓增生性肉瘤病毒增强子、阴性控制区缺失的、经dl587rev引物结合位点取代(MND)的启动子以及小鼠金属硫蛋白-l。载体还可以含有用于转译启动的核糖体结合位点以及转录终止子。载体还可以包含用于扩增表达的多核苷酸序列。载体还可以包含编码与位点导向的修饰多肽融合的蛋白质标签(例如，6xHis标签、血凝素标签、绿色荧光蛋白等)的多核苷酸序列，从而产生嵌合多肽。
在一些实施例中，本公开的启动子是组织特异性的。术语“组织特异性启动子”意指充当启动子的多核苷酸序列，即调节与启动子可操作地连接的所选择的多核苷酸序列的表达，并且影响所选择的多核苷酸序列在组织的如肌细胞或心肌细胞等特定细胞中的表达。在一些实施例中，组织特异性启动子是心脏特异性启动子。在一些实施例中，心脏特异性启动子是TNNT2或经修饰的TNNT2启动子。组织特异性启动子导致操作性地连接的多核苷酸或由所述多核苷酸编码的基因产物在所关注的组织中以是参考组织中的5x、10x、20x、25x或更高的水平表达。
在一些实施例中，本文所描述的载体包括转录终止信号。引导异源核酸转录物的高效终止和多腺苷酸化的元件增加异源基因表达。转录终止信号通常存在于多腺苷酸化信号的下游。在一些实施例中，载体包括对待表达的多肽进行编码的多核苷酸的3'处的多腺苷酸化序列。如本文所使用的，术语“polyA位点”或“polyA序列”表示通过RNA聚合酶II引导新生RNA转录物的终止和多腺苷酸化二者的DNA序列。多腺苷酸化序列可以通过向编码序列的3'端添加polyA尾来促进mRNA稳定性，并且因此有助于提高转译效率。切割和多腺苷酸化由RNA中的poly(A)序列引导。哺乳动物前mRNA的核心poly(A)序列具有位于切割-多腺苷酸化位点两侧的两个识别元件。通常，几乎不变的AAUAAA六聚体位于富含U或GU残基的更加可变元件的上游20至50个核苷酸处。新生转录物的切割发生在这两种元件之间，并且与向5'切割产物添加的多达250个腺苷偶联。在特定实施例中，核心poly(A)序列是理想的polyA序列(例如，AATAAA、ATTAAA、AGTAAA)。在特定实施例中，poly(A)序列是SV40 polyA序列、牛生长激素polyA序列(BGHpA)、兔β-球蛋白polyA序列(rβgpA)、其变体或本领域已知的另一适合的异源或内源polyA序列。
IV.重组腺相关病毒(rAAV)病毒基因组、表达盒和rAAV病毒粒子
本公开提供了一种表达盒，其包括编码转基因的多核苷酸，例如编码MYBPC3多肽或其功能变体的序列。表达盒中的转基因多核苷酸序列可以是例如编码蛋白质的开放阅读框。表达盒可以任选地包括与转基因操作性地连接的启动子、任选地内含子区、任选地聚腺苷酸化(poly(A))信号、任选地土拨鼠肝炎病毒转录后元件(WPRE)和任选地转录终止信号。表达盒可以侧接有一个或多个末端反向重复序列(ITR)。侧接有一个或多个ITR的表达盒在本文中称为“病毒基因组”。表达盒中的ITR用作用于表达盒病毒包装的标志物(Clark等人《人类基因疗法》6:1329-41(1995))。本公开的病毒基因组的说明性和非限制性实施例示出于图1A、图1C和图2A中。编码表达盒的多核苷酸提供了在宿主细胞内表达转基因的功能。可以通过例如用包括衣壳蛋白的rAAV病毒粒子和包括表达盒的病毒基因组感染宿主细胞来将表达盒整合到宿主细胞基因组中。
当存在时，表达盒的启动子序列控制编码转基因的多核苷酸的表达，例如编码MYBPC3或其功能变体的序列。可以使用各种启动子。启动子可以是细胞型特异性的。组成型启动子用于表达盒，并且可以是例如与鸡β-肌动蛋白启动子(CAG)、猿病毒40(SV40)启动子和单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)启动子融合的巨细胞病毒增强子(Damdindorj等人《公共科学图书馆·综合》.9:e106472(2014))。也可以使用其它细胞型特异性启动子。心脏细胞特异性启动子可以是例如MLC2v启动子(Phillips等人《高血压(Hypertension)》.39:651-5(2002))和心脏肌钙蛋白-T(cTnT)启动子(Konkalmatt等人《循环心血管成像(CircCardiovasc Imaging)》.6:478–486(2013))。
在一些方面，本公开提供了启动子已针对心脏细胞特异性表达和长度进行优化，以容纳指定大小的转基因。在一个实施例中，本文所描述的rAAV载体基因组的启动子是具有介于300bp与500bp之间的多核苷酸。
本公开的示例性表达盒和病毒基因组序列可以见于表5中。在一些实施例中，表达盒包括与SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:99或SEQ ID NO:101共有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多核苷酸序列。在一些实施例中，病毒基因组包括与SEQ IDNO:98、SEQ ID NO:100或SEQ ID NO:102共有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多核苷酸序列。在另一个实施例中，表达盒可以根据侧接转基因的多核苷酸区域进行分段。跨越盒5'端至转基因5'端的多核苷酸序列在本文中被称为表达盒的5'区段。跨越转基因3'端至表达盒3'端的多核苷酸序列在本文中被称为表达盒的3'区段。在一个实施例中，表达盒的5'区段包括与SEQ ID NO:93共有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多核苷酸序列。在一个实施例中，表达盒的3'区段包括与SEQ ID NO:94共有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多核苷酸序列。
表达由rAAV载体或rAAV病毒粒子递送的大转基因的能力是有限的。rAAV载体基因组大小的最大序列长度为约5kb，因此为表达盒中所需的所有元件的长度提供了限制，所述元件包含调节元件，例如启动子和转基因，例如MYBPC3。超过5kb的rAAV载体基因组会在rAAV病毒粒子包装期间导致载体基因组截短，并且降低或消除转基因表达(Wu等人《分子疗法》18:80-86(2010))。在一些实施例中，本公开提供了针对携带大转基因而优化的rAAV载体基因组。载体基因组的元件的长度已减少，以便容纳更大的转基因。在一个实施例中，表达盒的5'区段和3'区段一起包括至多0.8kbp或至多0.9kbp。在另一个实施例中，5'ITR、5'区段、3'区段和3'ITR一起包括包括1.2kbp或最多包括1.3kbp。在一个实施例中，所述5'区段包括至多500bp或至多480bp。在一个实施例中，所述3'区段包括至多200bp或至多150bp。在另一个实施例中，载体基因组包括最多4.7kbp、4.8kbp、4.9kbp或5.0kbp。在一些实施例中，编码基因产物的多核苷酸包括3kbp到11kbp、3kbp到5kbp、3.5kbp到4.5kbp、或3.7kbp到4kbp。在一些实施例中，编码基因产物的多核苷酸包括3.7kbp至3.9kbp。在一些实施例中，编码基因产物的多核苷酸包括3.8kbp。
表5.说明性表达盒和病毒基因组
Figure BDA0003886249370000491
Figure BDA0003886249370000501
Figure BDA0003886249370000511
Figure BDA0003886249370000521
Figure BDA0003886249370000531
Figure BDA0003886249370000541
在本公开的一些方面，rAAV病毒粒子用于将本文所描述的表达盒递送到受试者的心脏细胞，例如以治疗心肌病。因此，本公开提供了rAAV病毒粒子，所述rAAV病毒粒子包括AAV衣壳和表达盒，所述表达盒包括编码与启动子操作性地连接的转基因的多核苷酸。
本公开的rAAV病毒粒子包括衣壳蛋白。衣壳蛋白是构成含有表达盒的rAAV病毒粒子的组装二十面体包装的结构蛋白。衣壳蛋白通过血清型进行分类。rAAV病毒粒子中的野生型衣壳血清型可以是，例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11或AAV12(Naso等人《生物制药(BioDrugs)》31:317–334(2017))。工程化衣壳类型包含嵌合衣壳和镶嵌衣壳(Choi等人《当代基因疗法(Curr Gene Ther.)》5:299–310(2005))。针对rAAV病毒粒子选择衣壳是基于它们转导特定组织或细胞类型的能力(Liu等人《当前药物设计(Curr Pharm Des.)》21:3248-56(2015))。
可以使用如本文所描述的可以促进rAAV病毒粒子转导到心脏细胞中以递送转基因的任何衣壳蛋白。rAAV病毒粒子中用于将转基因递送到导致高表达的心脏细胞的衣壳蛋白可以是例如AAV4、AAV6、AAV7、AAV8和AAV9(Zincarelli等人《分子疗法》16:P1073-1080(2008))。人工衣壳，如通过组合文库生成的嵌合衣壳，也可以用于将转基因递送到导致高表达的心脏细胞(参见US 63/012,703，所述文献的内容通过引用并入本文)。具有各种特征的其它衣壳蛋白也可以用于本公开的rAAV病毒粒子。AAV载体和衣壳提供于美国专利公开第US10011640B2号；第US7892809B2号、第US8632764B2号、第US8889641B2号、第US9475845B2号、第US10889833B2号、第US10480011B2号和第US10894949B2号，所述文献的内容通过引用并入本文；以及国际专利公开第WO2020198737A1号、第WO2019028306A2号、第WO2016054554A1号、第WO2018152333A1号、第WO2017106236A1号、第WO2008124724A1号、第WO2017212019A1号、第WO2020117898A1号、第WO2017192750A1号、第WO2020191300A1号和第WO2017100671A1号，所述文献的内容通过引用并入本文。
在一些实施例中，本公开的rAAV病毒粒子包括工程化衣壳蛋白。工程化衣壳蛋白可以衍生自亲本，例如野生型衣壳，并且包含例如相对于亲本衣壳序列在一个或多个位点处的变体多肽序列。例如，亲本衣壳的变体位点可以出现在VR-IV位点、VR-V位点、VR-VII位点和/或VR-VIII位点处(参见例如Büning和Srivastava.《分子疗法-方法和临床发展(MolTher Methods Clin Dev.)》12:248-265(2019))。
在一些实施例中，衣壳蛋白是AAV5/AAV9嵌合衣壳蛋白。在一些实施例中，嵌合衣壳蛋白包括至少1、2、3、4、5或更多个衍生自AAV5衣壳蛋白的多肽区区段(SEQ ID NO.144)。在一些实施例中，嵌合衣壳蛋白包括至少1、2、3、4、5或更多个衍生自AAV9衣壳蛋白的多肽区区段(SEQ ID NO:143)。在一些实施例中，至少一种多肽区段衍生自AAV5衣壳蛋白并且至少一种多肽区段衍生自AAV9衣壳蛋白。
在一些实施例中，衣壳蛋白是一种组合衣壳蛋白。如本文所使用的，“组合衣壳蛋白”是指AAV5/AAV9嵌合衣壳蛋白，所述嵌合衣壳蛋白进一步包括相对于嵌合亲本序列在一个或多个位点处的氨基酸变化。在一些实施例中，嵌合亲本序列的一个或多个位点选自与AAV9衣壳蛋白的VR-IV位点、VR-V位点、VR-VII位点和VR-VIII位点等效的那些位点。
在一些实施例中，rAAV病毒粒子包括选自表6的工程化衣壳蛋白。
表6.工程化衣壳蛋白
Figure BDA0003886249370000561
在一些实施例中，rAAV为复制缺陷型的，因为rAAV病毒粒子不能独立地对其基因组进行进一步复制和包装。例如，当用rAAV病毒粒子靶向心脏细胞时，转基因在靶向心脏细胞中表达，然而，由于靶向的心脏细胞缺乏AAV rep和cap基因以及辅助功能基因，rAAV无法复制。
在一些实施例中，封装如本文所描述的表达盒的本公开的rAAV病毒粒子可以使用无辅助产生来产生。rAAV是复制缺陷型病毒，并且通常需要宿主细胞中来自如腺病毒等活辅助病毒的组分来包装感染性rAAV病毒粒子。rAAV无辅助产生系统允许在不使用活辅助病毒的情况下产生感染性rAAV病毒粒子。在无辅助系统中，宿主包装细胞系与三个质粒共转染。第一质粒可以含有包装rAAV病毒粒子所需的腺病毒基因产物(例如，E2A、E4和VA RNA基因)。第二质粒可以含有所需的AAV基因(例如，REP和CAP基因)。第三质粒含有编码所关注的转基因的多核苷酸序列和侧接有ITR的启动子。宿主包装细胞系可以是例如AAV-293宿主细胞。合适的宿主细胞含有包装感染性rAAV病毒粒子所需的另外组分，所述组分不是由质粒提供的。在一些实施例中，CAP基因可以编码例如，如本文所描述的AAV衣壳蛋白。
IV.治疗方法
本公开还提供了药物组合物，其包括本文所公开的rAAV载体基因组或rAAV病毒粒子和一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在特定实施例中，药物组合物包括如本文所描述的rAAV载体基因组或rAAV病毒粒子，所述rAAV载体基因组或rAAV病毒粒子包括编码与心脏特异性启动子(例如，经修饰的TNNT2启动子)操作性地连接的治疗性蛋白或核酸的多核苷酸序列。例如，在一些实施例中，药物组合物是AAV9载体，所述AAV9载体包括与MYBPC3蛋白(SEQ ID NO:86)操作性地连接的经修饰的心脏TNNT2启动子(SEQ ID NO:3)。提供了例如用于预防或治疗心肌病的药物组合物，所述药物组合物包括治疗有效量的载体，所述载体包括编码治疗性蛋白或核酸的多核苷酸序列，所述治疗性蛋白或核酸可以恢复心脏收缩功能。
本公开提供了表达多核苷酸细胞的方法。所述方法可以包括，例如，用本文所描述的rAAV病毒粒子、rAAV载体基因组或表达盒转导靶细胞。靶细胞可以是例如但不限于心脏细胞、肌肉细胞、诱导的多能干细胞衍生的心肌细胞(iPSC-CM)、心肌细胞或MYBPC3-/-iPSC-CM。一方面，在细胞中表达MYBPC3蛋白的方法包括用本文所描述的rAAV病毒粒子或rAAV载体基因组转导靶细胞或靶细胞群体。在一个实施例中，所述细胞是MYBPC3-/-细胞。在一个实施例中，所述细胞包括在内源性MYBPC3基因的一个或两个拷贝中的失活突变。
本文所描述的组合物可以用于治疗患有心脏病或病状的受试者的方法。“治疗(treating或treatment of)”病状或有需要的受试者是指(1)采取措施获得有益的或期望的结果，包含临床结果，如症状减轻；(2)预防疾病，例如使可能易患疾病但尚未经历或表现出疾病症状的患者不会发展疾病的临床症状；(3)抑制疾病，例如，阻止或减少疾病或其临床症状的发展；(4)缓解疾病，例如，使疾病或临床症状消退；或(5)延缓疾病。出于本发明的目的，有益或期望的临床结果包含但不限于促进心脏肌节收缩。
需要使用本公开的组合物和方法进行治疗的受试者包含但不限于患有先天性心脏缺陷的个体、患有退行性肌肉疾病的个体、患有导致缺血性心脏组织的病状的个体(例如，患有冠状动脉疾病的个体)等。在一些实例中，一种方法可用于治疗退行性肌肉疾病或病状(例如，家族性心肌病、扩张型心肌病、肥厚型心肌病、限制性心肌病或冠状动脉疾病导致的缺血性心肌病)。在一些实例中，主题方法可用于治疗患有心脏或心血管疾病或病症的个体，例如心血管疾病、动脉瘤、心绞痛、心律失常、动脉粥样硬化、脑血管意外(中风)、脑血管疾病、先天性心脏病、充血性心力衰竭、心肌炎、冠状动脉瓣膜病、扩张型动脉疾病、舒张功能障碍、心内膜炎、高血压(high blood pressure/hypertension)、心肌病、肥厚型心肌病、限制性心肌病、冠状动脉疾病导致的缺血性心肌病、二尖瓣脱垂、心肌梗塞(心脏病发作)或静脉血栓栓塞。在一些实例中，受试者患有心肌病或有患心肌病的风险。
在一些实施例中，本文所公开的组合物和方法可以用于预防和/或治疗受试者的心肌病。在一些实施例中，本文所描述的组合物和方法可以用于治疗与心肌肌球蛋白结合蛋白C(MYBPC3)突变相关的心肌病，如肥厚型心肌病和家族性肥厚型心肌病。通过本文所描述的组合物和方法治疗的心肌病还可以包含与肺栓塞、静脉血栓形成、心肌梗塞、短暂性脑缺血发作、外周血管疾病、动脉粥样硬化、缺血性心脏病和/或其它心肌损伤或血管疾病相关的心肌病。在某些实施例中，通过本文所描述的组合物和方法治疗的心肌病可以包含与心肌组织过度收缩相关的心脏病，如与左心室过度收缩相关的心力衰竭。
在一些实施例中，本文所描述的组合物和方法可以诱导治疗性蛋白或核酸(例如，MYBPC3蛋白)或其突变体、变体或片段的可检测的表达，以调节有需要的受试者的心肌组织的收缩功能。在一些实施例中，可以控制和/或优化施用于受试者的调节心肌组织收缩功能的组合物的量、浓度和体积，以显著改善心脏的功能参数，同时减轻不良副作用。
施用于心肌组织的调节收缩功能的组合物的量也可以是以下所需的量：导致治疗性蛋白或核酸(例如，MYBPC3蛋白)或其突变体、变体或片段在心脏中可检测的表达；保持和/或改善收缩功能；延迟心肌病的出现或逆转疾病的病理过程；增加肌细胞活力；改善肌丝功能；抑制左心室肥大；心脏肥大消退，使心脏中的收缩和舒张压正常化；并且在肌丝水平下恢复正常的跨桥行为。
在一些实施例中，本文所公开的组合物和方法导致MYBPC3蛋白或其突变体、变体或片段在被治疗的受试者的心脏细胞中的可检测的表达。在一些实施例中，施用本文所描述的rAAV载体基因组或rAAV病毒粒子引起MYBPC3蛋白在受试者心脏中的特异性表达。在一些实施例中，施用本文所描述的rAAV载体基因组或rAAV病毒粒子导致MYBPC3在受试者的骨骼组织、脑和/或肝中的表达低或不可检测的表达，其中任选地受试者患有心肌病或有患心肌病的风险。
在一些实施例中，本文所公开的组合物和方法导致KCNH2蛋白或其突变体、变体或片段在被治疗的受试者的心脏细胞中的可检测的表达。
在一些实施例中，本文所公开的组合物和方法导致TRPM4蛋白或其突变体、变体或片段在被治疗的受试者的心脏细胞中的可检测的表达。
在一些实施例中，本文所公开的组合物和方法导致DSG2蛋白或其突变体、变体或片段在被治疗的受试者的心脏细胞中的可检测的表达。
在一些实施例中，本文所公开的组合物和方法导致ATP2A2蛋白或其突变体、变体或片段在被治疗的受试者的心脏细胞中的可检测的表达。
在一些实施例中，本文所公开的组合物和方法导致CACNA1C、DMD、DMPK、EPG5、EVC、EVC2、FBN1、NF1、SCN5A、SOS1、NPR1、ERBB4、VIP或MYH7或其突变体、变体或片段在被治疗的受试者的心脏细胞中的可检测的表达。
“可检测的表达”通常是指与未用载体处理的对照受试者或组织相比至少5％、10％、15％、20％或更多的表达。在一些实施例中，可检测的表达意指是无载体对照的1.5倍、2倍、2.5倍或3倍的表达。可以通过如以下实例中所描述的蛋白质印迹或酶联免疫吸附测定(ELISA)或本领域已知的其它方法评估表达。在一些情况下，使用标准曲线定量测量表达。标准曲线可以使用纯化的蛋白质，例如纯化的MYBPC3蛋白，通过实例中描述的或本领域已知的方法生成。可替代地，治疗性基因产物的表达可以通过对应mRNA的定量来评估。
在一些实施例中，治疗性基因产物在心脏组织中的可检测的表达以载体基因组(vg)每千克受试者体重(kg)3×1014vg/kg或更少、2×1014vg/kg或更少、1×1014vg/kg或更少、9×1013vg/kg或更少、8×1013vg/kg或更少、7×1013vg/kg或更少、6×1013vg/kg或更少、5×1013vg/kg或更少、4×1013vg/kg或更少、3×1013vg/kg或更少、2×1013vg/kg或更少或1×1013vg/kg或更少的剂量发生。
在各个实施例中，本文所描述的组合物含有本文所描述的rAAV病毒粒子或载体基因组以及一种或多种药学上可接受的赋形剂。药学上可接受的赋形剂可以包含对于能够注射的调配物而言是药学上可接受的媒剂(例如，载体、稀释剂和赋形剂)。这些可以具体地是等渗的无菌盐水溶液(磷酸一钠或磷酸二钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙或氯化镁等或此类盐的混合物)或干燥的尤其是冷冻干燥的组合物，所述组合物在视情况添加例如无菌水或生理盐水后允许构成可注射溶液。适用于可注射用途的说明性药物形式包含例如无菌水溶液或分散体；包含芝麻油、花生油或丙二醇水溶液的调配物；以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。
在各个实施例中，本公开的药物组合物包括约1×108个基因组拷贝/毫升(GC/mL)、约5×108GC/mL、约1×109GC/mL、约5×109GC/mL、约1×1010GC/mL、约5×1010GC/mL、约1×1011GC/mL、约5×1011GC/mL、约1×1012GC/mL、约5×1012GC/mL、约5×1013GC/mL、约1×1014GC/mL或约5×1014GC/mL的病毒载体(例如，rAAV病毒粒子)。
在各个实施例中，本公开的药物组合物包括约1×108个病毒基因组/毫升(vg/mL)、约5×108vg/mL、约1×109vg/mL、约5×109vg/mL、约1×1010vg/mL、约5×1010vg/mL、约1×1011vg/mL、约5×1011vg/mL、约1×1012vg/mL、约5×1012vg/mL、约5×1013vg/mL、约1×1014vg/mL或约5×1014vg/mL的病毒载体(例如，rAAV病毒粒子)。
在一些实施例中，本公开的药物组合物以约1mL、5mL、10mL、约20mL、约25mL、约30mL、约35mL、约40mL、约45mL、约50mL、约55mL、约60mL、65mL、约70mL、约75mL、约80mL、约85mL、约90mL、约95mL、约100mL、约105mL、约110mL、约115mL、约120mL、约125mL、约130mL、约135mL、约140mL、约145mL、约150mL、约155mL、约160mL、约165mL、约170mL、约175mL、约180mL、约185mL、约190mL、约200mL、约205mL、约210mL、约215mL或约220mL的总体积施用。
在一些实施例中，本公开的方法包括以约1×108个基因组拷贝/毫升(GC/mL)、约5×108GC/mL、约1×109GC/mL、约5×109GC/mL、约1×1010GC/mL、约5×1010GC/mL、约1×1011GC/mL、约5×1011GC/mL、约1×1012GC/mL、约5×1012GC/mL、约5×1013GC/mL、约1×1014GC/mL或约5×1014GC/mL的rAAV病毒粒子的剂量施用编码MYBPC3的rAAV病毒粒子。
在优选的实施例中，本公开的方法包括以约3×1012GC/mL、约3×1013GC/mL、约1×1014GC/mL或约3×1014GC/mL的rAAV病毒粒子的剂量静脉内施用编码MYBPC3的rAAV病毒粒子。
在优选的实施例中，本公开的方法包括通过向心脏局部递送以约3×1011GC/mL、约3×1012GC/mL、约1×1013GC/mL或约3×1013GC/mL的rAAV病毒粒子的剂量施用编码MYBPC3的rAAV病毒粒子。
在一些实施例中，本公开的方法包括以约1×108个病毒基因组/毫升(vg/mL)、约5×108vg/mL、约1×109vg/mL、约5×109vg/mL、约1×1010vg/mL、约5×1010vg/mL、约1×1011vg/mL、约5×1011vg/mL、约1×1012vg/mL、约5×1012vg/mL、约5×1013vg/mL、约1×1014vg/mL或约5×1014vg/mL的rAAV病毒粒子的剂量施用编码MYBPC3的rAAV病毒粒子。
在优选的实施例中，本公开的方法包括以约3×1012vg/mL、约3×1013vg/mL、约1×1014vg/mL或约3×1014vg/mL的rAAV病毒粒子的剂量静脉内施用编码MYBPC3的rAAV病毒粒子。
在优选的实施例中，本公开的方法包括通过向心脏局部递送以约3×1011vg/mL、约3×1012vg/mL、约1×1013vg/mL或约3×1013vg/mL的rAAV病毒粒子的剂量施用编码MYBPC3的rAAV病毒粒子。
每毫升的基因组拷贝可以通过定量聚合酶变化反应(qPCR)使用由具有已知病毒的多核苷酸基因组浓度的参考样品生成的标准曲线来确定。对于AAV，使用的参考样品通常是用于生成rAAV病毒粒子的转移质粒，但也可以使用其它参考样品。
可替代地或另外，病毒载体的浓度可以通过测量细胞系上载体的滴度来确定。病毒滴度通常表示为每单位体积的病毒颗粒(vp)(例如，vp/mL)。在各个实施例中，本公开的药物组合物包括约1×108病毒颗粒/毫升(vp/mL)、约5×108vp/mL、约1×109vp/mL、约5×109vp/mL、约1×1010vp/mL、约5×1010vp/mL、约1×1011vp/mL、约5×1011vp/mL、约1×1012vp/mL、约5×1012vp/mL、约5×1013vp/mL或约1×1014vp/mL或约5×1014的病毒载体(例如，rAAV病毒粒子)。
在一个实施例中，本公开提供了一种试剂盒，其包括容纳如本文所描述的药物组合物的容器。
本公开的rAAV病毒粒子或载体基因组可以通过全身应用来施用于有需要的受试者，例如通过类似于动物模型中示出的载体的载体的静脉内、动脉内或腹膜内递送(Katz等人,2012,《基因疗法》19:659-669。在一些实施例中，本公开的rAAV病毒粒子或载体基因组治疗或预防肥厚型心肌病，其中所述载体被全身施用。
在一些实施例中，本公开的rAAV病毒粒子或载体基因组可以通过直接施用于心脏组织递送，例如通过冠状动脉内施用。在一些实施例中，在使用标准5F或6F引导或诊断导管进行血管造影(在无血管球囊阻塞的情况下，经皮冠状动脉内递送)后，在心脏导管检查实验室中通过10分钟时间段的顺行心外膜冠状动脉输注将载体作为单剂量施用(Jaski等人,2009,《心力衰竭杂志(J Card Fail.)》15:171-181)。
适合使用本公开的组合物、组合物和方法治疗的具有心脏病状的受试者包含个体(例如，哺乳动物受试者，如人、非人灵长类动物、家养哺乳动物、实验非人哺乳动物受试者如小鼠、大鼠等)。
在一些实施例中，本公开的rAAV病毒粒子或载体基因组可以用于治疗有需要的受试者。在一些实施例中，可以将病毒载体施用于需要治疗心血管疾病的受试者。在一些实施例中，将rAAV病毒粒子或载体基因组施用于受试者以治疗心肌病。在一些实施例中，病毒载体是全身施用的。在其它实施例中，病毒载体通过直接施用递送到心脏组织。
rAAV病毒粒子或载体基因组可以通过各种途径施用，包含但不限于直接注射到心脏或心导管插入中。在优选的实施例中，包括编码MYBPC3的rAAV病毒粒子的药物组合物通过逆行冠状窦输注(RCSI)通过心内导管递送来施用。可替代地，病毒载体可以全身施用，如通过静脉输注。当使用直接注射时，可以通过心内直视手术或微创手术进行。在一些情况下，病毒载体通过注射或输注被递送到心包空间。
可以通过多种方法追踪施用于受试者的病毒载体。例如，可以很容易地检测到用标志物(如绿色荧光蛋白或β-半乳糖苷酶)标记或表达的重组病毒。可以对重组病毒进行工程化以使靶细胞表达标志物蛋白，如表面表达的蛋白或荧光蛋白。可替代地，重组病毒对靶细胞的感染可以通过其对细胞标志物的表达来检测，所述细胞标志物不被用于测试的动物表达(例如，将细胞注射到实验动物中时的人特异性抗原)。靶细胞的存在和表型可以通过荧光显微镜(例如，绿色荧光蛋白或β-半乳糖苷酶)、免疫组织化学(例如，使用针对人抗原的抗体)、ELISA(使用针对人抗原的抗体)或使用引物和杂交条件的RT-PCR分析来评估，所述引物和杂交条件导致扩增对指示心脏表型的RNA具有特异性。
在本说明书中引用和鉴定的所有专利、专利公开和其它公开出于所有目的单独并明确地通过引用整体并入本文。
实例
实例1：大货物的载体基因组的设计
此研究的目的是评估在载体的非编码部分中具有缺失的载体与亲本载体。所述研究表明，令人惊讶的是，非编码区的缺失增加了载体的效力。
利用两个完整的侧接ITR序列(每个约130bp)、启动子、内含子、WPRE和聚腺苷酸化信号，以及用于优化转基因表达的标准顺式调节序列，典型的AAV载体基因组需要约1.8至2.0kbp的非编码DNA序列。约3.0kbp或更大的转基因，如3.8kbp转基因MYBPC3导致载体基因组超过5.0kbp。例如，Mearini等人,《自然通讯(Nat Commun)》5:5515(2014)报告了编码MYBPC3的AAV载体，其载体基因组大小为5.4kbp。在没有ITR序列的情况下，这是约5.2kbp。
生成报告系统以测试AAV载体是否耐受缩短的非编码区。对具有CAG启动子、内含子、WPRE和标准polyA序列的常规AAV载体进行修饰，以去除WPRE(589bp)并且缩短polyA序列(去除170bp)(图1A)。克隆到多克隆位点(MCS)中的GFP报告基因的表达得以维持，但当这些载体元件缺失或缩短时略有下降(图1B)。通过缺失内含子和3'至5'ITR的序列的一部分进一步截短载体(图1C)。最终载体基因组为约1.1kpb(在没有ITR的情况下0.8kpb)。
实例2：MYBPC3转基因在体外诱导的心肌细胞中的表达
此研究的目的是使用基于AAV的载体系统在体外提供用于治疗性基因产物在诱导的心肌细胞中表达的改善的组织特异性启动子。如先前所描述的，使用中胚层诱导、心脏规格和代谢选择将人诱导的多能干细胞(iPSC)分化为心肌细胞(Tohyama等人《细胞干细胞(Cell Stem Cell)》.2013；12(1):127-37；Lian等人《美国国家科学院院刊》2012；109(27):E1848-57；Burridge PW、Holmstrom A、Wu JC.《当前人类遗传学方案(Curr Protoc HumGenet.)》2015；87:21 3 1-15)。iPSC-CM病毒转导是用AAV6在指定的感染复数下进行的。
图2A中描绘的基因表达盒是针对用于治疗心肌病的基于AAV的载体系统构建的。基于图1C中描述的载体，AAV载体包括若干顺式调节元件，所述顺式调节元件包含两个末端反向重复序列(ITR，每个260bp)、聚腺苷酸化信号(A，49bp)和全长(SEQ ID NO:1)或经修饰的心脏肌钙蛋白T(TNNT2)启动子(SEQ ID NO:2-4)。不包含WPRE，并且polyA信号和3'到5'ITR的序列都被缩短。经修饰的TNNT2启动子在野生型TNNT2启动子的5'(上游)端处含有100至200bp缺失。在iPSC衍生的心肌细胞中测试具有3.825kb的多核苷酸序列长度的人肌球蛋白结合蛋白C(MYBPC3，SEQ ID NO:86)作为治疗性基因产物。
为了确定野生型或经修饰的TNNT2启动子是否可以诱导MYBPC3蛋白的可检测的表达，MYBPC3-/-iPSC衍生的心肌细胞用AAV6颗粒以6×104MOI转导。在感染后5至15天通过免疫荧光或蛋白质印迹分析细胞的MYBPC3蛋白表达。
图2B示出了包括野生型TNNT2启动子(SEQ ID NO:1)的AAV载体驱动MYBPC3蛋白在MYBPC3-/-iPSC衍生的心肌细胞的肌节中的表达。
图3A至图3C示出了在转导的MYBPC3-/-iPSC衍生的心肌细胞中，包括400bp经修饰的TNNT2启动子(SEQ ID NO:3)的AAV载体驱动比600bp野生型TNNT2(SEQ ID NO:1)或500bp经修饰的TNNT2(SEQ ID NO:2)启动子更高的MYBPC3蛋白表达。相反，在600bp野生型TNNT2(SEQ ID NO:1)或400bp经修饰的TNNT2启动子(SEQ ID NO:3)的控制下，用编码MYBPC3的质粒(而不是用病毒转导)转染MYBPC3-/-iPSC衍生的心肌细胞示出类似的MYBPC3蛋白表达。
实例3：Mybpc3-/-小鼠模型肥厚型重症心肌病
通过CRISPR-Cas9配对的gRNA缺失外显子一和二，在C57Bl/6背景上生成纯合Mybpc3敲除小鼠(KO)(图4A)。KO小鼠在两周龄时展现出严重的心功能缺陷(图4C和图4D)和明显的心肌肥厚(图4E至4G)，但是孟德尔比率(Mendelian ratio)正常，并且体重与野生型同窝仔相当(图4B)。此模型比其它模型具有更严重的心脏肥大(Schlossarek等人《心脏病学基础研究(Basic Res.Cardiol.)》107:1-13(2012))。KO小鼠在幼年(两周大的小鼠)中展现出严重的早发性HCM，所述HCM模拟人类儿童HCM，以及成人的晚期HCM的发作。参见Lekanne Deprez等人,《医学遗传学杂志(J Med Genet)》43:829-832(2006)；Xin等人,《美国医学遗传学杂志A部分(AmJ Med Genet Part A)》143A:2662-2667(2007)；Zahka等人,《心脏(Heart)》94:1326-1330(2008)；Marziliano等人,《新生儿学(Neonatology)》102:254-258(2012)；Wessels等人,《欧洲人类遗传学杂志(Eur J Hum Genet)》23:922-928(2015)。
实例4：MYBPC3转基因在体内心脏组织中的表达
此研究的目的是使用包括经修饰的心脏特异性启动子的基于AAV的载体系统检查体内治疗性蛋白表达。
向成年小鼠眶后注射AAV9重组病毒，所述重组病毒包括与编码MYBPC3的多核苷酸操作性地连接的600bp野生型TNNT2(SEQ ID NO:1)或400bp经修饰的TNNT2(SEQ ID NO:3)启动子。感染后2周采集来自心脏、骨骼肌(胫骨前肌)、肝和全脑的组织样品。从所有组织中提取RNA，合成cDNA并且使用对人MYBPC3具有特异性的引物通过qRT-PCR进行分析。
如图5所示，与骨骼、脑或肝组织相比，注射了包括野生型或经修饰的TNNT2启动子的基于AAV9的载体的小鼠在心脏组织中示出高水平的MYBPC3 mRNA。与600bp野生型TNNT2启动子相比，400bp经修饰的TNNT2启动子示出心脏组织中MYBPC3 mRNA的表达增加。
如图6A至6B所示，通过尾静脉注射给成年小鼠静脉内注射带有400bp经修饰的TNNT2启动子盒的AAV9载体。注射后4周采集来自心脏和肝的组织样品。每微克基因组DNA的病毒基因组的绝对定量通过qPCR使用线性化标准进行评估。从所有组织中提取RNA，合成cDNA并且使用对人MYBPC3具有特异性的引物通过qRT-PCR进行分析。令人惊讶的是，400bpTNNT2启动子保留了对心脏的高选择性：尽管在成年给药动物中注射后4周，在肝中检测到的载体基因组是在心脏中检测到的载体基因组的100倍(图6A，对数标度)，转基因的肝表达小于转基因的心脏表达的1/10,000(图6B，对数标度)。
总之，这些结果表明野生型TNNT2启动子，即，400bp经修饰的TNNT2启动子(SEQ IDNO:3)的200bp缺失，以高选择性有效地驱动心肌细胞中MYBPC3蛋白的表达，尽管缺失了启动子序列的大部分。
实例5：Mybpc3缺失小鼠心脏功能的挽救
此实例使用实例1中描述的为大货物设计的载体和实例2和3中描述的400bp经修饰的hTNNT2启动子，证明了小鼠Mybpc3功能丧失的功能性挽救。
将400bp hTNNT2启动子和鼠Mybpc3基因克隆到图1C所示的载体中。使用AAV9衣壳包装该载体以生成测试载体。
在第一个实验中，纯合Mybpc3-/-小鼠在两周龄时被眶后注射编码Mybpc3的1E14vg·kg-1测试载体或媒剂HBSS。两周后(第四周)采集心脏组织以及野生型同窝仔的心脏组织。实验载体在注射后两周在Mybpc3-/-小鼠中达到野生型MYBPC3蛋白表达水平(图7)。得出结论，测试载体能够以低至1E14vg·kg-1的剂量在幼年动物中以生理水平表达MYBPC3。
在第二个实验中，第一个实验以较低的剂量3E13 vg·kg-1重复。纯合Mybpc3-/-小鼠在两周龄时被眶后注射编码Mybpc3的3E13 vg·kg-1和1E14vg·kg-1测试载体或媒剂HBSS。在注射后两周和六周，通过ELISA在Mybpc3-/-小鼠中检测到野生型心脏MYBPC3蛋白表达水平(图8)。得出结论，测试载体能够以低至3E13 vg·kg-1的剂量在幼年动物中以生理水平表达MYBPC3。
在第三个实验中，使用与肥厚型心肌病相关的测定来评估心脏功能。肥厚型心肌病在生理上表现为(1)心脏大小增加，测量为报告的左心室质量/总体重(LVM/BW)的比率，以mg·g-1为单位；并且(2)通过超声心动图测量的短缩分数(FAS)。
纯合Mybpc3-/-小鼠在两周龄时被眶后注射编码Mybpc3的1E13 vg·kg-1、3E13vg·kg-1和1E14 vg·kg-1测试载体或媒剂HBSS。在所有测试剂量(1E13vg·kg-1、3E13 vg·kg-1和1E14 vg·kg-1)下均观察到剂量依赖性心脏功能挽救。在注射后六周，在所有测试剂量下LVM/BM从媒剂对照中降低(图9A)。FAS(表示为收缩与舒张之间LV内部尺寸的百分比％变化，图9B)和射血分数(图9C)在注射后六周，在所有测试剂量下从媒剂对照增加。在注射后31周观察到LVM/BM(图9D)、FAS(图9E)和EF(图9F)甚至更大的改善。与在3E13 vg·kg-1和1E14 vg·kg-1剂量下观察到的相等水平的MYBPC3蛋白表达一致(参见图8)，用3E13 vg·kg-1或1E14 vg·kg-1治疗的动物在肥大、FAS或EF改善方面展现出类似的改善。即使仅在1E13 vg·kg-1剂量下，与媒剂对照相比，肥大、FAS和EF都得到了改善。
得出结论，测试载体能够以低至1E13 vg·kg-1的剂量在幼年动物中挽救心脏功能。
在肥厚型心肌病的情况下，挽救有症状的幼年小鼠的功能比预防婴儿功能下降更具挑战性，因为肥厚型心肌病是一种进行性病症。年长的动物比年轻的动物展现出更严重的疾病。据知，以前从未用AAV证明过在有症状的幼年动物中挽救MYBPC3功能丧失。模型也是Mybpc3基因缺失导致的功能完全丧失，而不是突变导致的部分功能丧失。
将结果与Mearini等人,《自然通讯》5:5515(2014)中报告的结果进行了比较，后者在内源性Mybpc3基因中具有单核苷酸多态性的小鼠中使用了编码Mybpc3的5.4kb表达盒。Mearni等人报告在注射了非常高剂量(1E12vg和3E12 vg，对应于7E14 vg·kg-1和2E15vg·kg-1，基于1.5g的平均新生儿质量)的编码相同Mybpc3基因的AAV9载体的新生儿(非有症状的少年)小鼠中预防两周龄时的高LVM/BW。Mearni等人使用550bp的hTNNT2启动子，而不是目前的400bp经修饰的hTNNT2启动子。载体Mearini等人不会显著防止FAS下降，即使在2E15 vg·kg-1下。相比之下，本发明载体在至少低至1E13 vg·kg-1至1E14 vg·kg-1的剂量下证明了幼年动物(不仅是新生儿)生理参数的改善。
载体和启动子修饰显著且令人惊讶地增加了载体的效力。
实例6：5.4kbp盒与4.7kbp盒的直接比较
此实例在患有晚期疾病的成熟(2.5个月龄)纯合小鼠中直接比较了编码Mybpc3基因的5.4kbp盒与编码Mybpc3基因的4.7kbp盒。
在5.4kbp或4.7kbp盒(图10A)的背景下，纯合Mybpc3-/-小鼠被眶后注射编码Mybpc3的3E13 vg·kg-1或1E14 vg·kg-1的AAV9载体或注射媒剂对照HBSS。即使在此心脏衰退的晚期阶段给药时，4.7kbp盒基于射血分数(EF)显著改善了心脏功能(图10B)，其中明显恢复了高于给药前基线的功能(图10C)，这与用媒剂(Veh)或5.4kbp盒治疗的动物不同。进一步地，注射后十八周，与5.4kbp盒相比，4.7kbp盒也能够显著减少肥大，如LVM/BM所指示的(图10D)。
此实例使用实例1至3中描述的载体骨架和启动子修饰，证明了小鼠Mybpc3功能丧失的功能性挽救。
此实例还证明，在具有挑战性的疾病模型中——成年纯合Mybpc3-/-小鼠——低剂量的5.4kbp载体(SEQ ID NO:201)不能产生任何生理改善；而根据本公开的4.7kbp载体在低至3E13 vg·kg-1的剂量下引起与心肌病相关的生理参数的统计学显著改善。
实例7：通过改善的AAV衣壳编码MYBPC3获得更大的功效
此实例证明了如何通过使用工程化AAV衣壳进一步改善基于挽救Mybpc3-/-小鼠(实例5)的大货物载体(实例1)和经修饰的启动子(实例2和3)的改善效力。
AAV9衣壳变体CR9-10在成年小鼠全身递送时展现出显著高于具有GFP编码盒的AAV9的心脏转导，如通过ELISA确定的(p<0.05，单向ANOVA；邓尼特多重比较测试)(图11A)。
在第二个实验中，编码鼠Mybpc3基因的表达盒被包装到AAV9或CR9-10中，并且比较了Mybpc3-/-小鼠的心脏挽救效力。纯合Mybpc3-/-小鼠在两周龄时被眶后注射1E13 vg·kg-1和3E13 vg·kg-1的AAV9载体、CR9-10载体或媒剂对照HBSS。基于射血分数(EF)，所有测试物品显著改善了心脏功能(图11B)，其中明显恢复了高于给药前基线(ΔEF)的功能(图11C)。与改善的心脏转导一致，CR9-10比AAV9导致更大的EF改善。
实例8：工程化AAV衣壳变体的非人类灵长类动物研究
在静脉内递送后，在雄性食蟹猴(食蟹猕猴(Macaca fascicularis))中评估了具有工程化衣壳的AAV载体的生物分布(描述于美国临时专利申请第63/012,703号，所述美国临时专利申请整体并入本文)。
将用十四种不同衣壳(包含AAV9)生成的AAV载体汇集并且在1E13vg·kg-1的剂量(n＝3)下注射到NHP中。全身递送后一个月从左心室和肝中提取病毒DNA。与小鼠结果一致，与AAV9相比，CR9-10展现出增加的心脏转导(图12A)。进一步地，相对于AAV9，许多变体降低了肝病毒负荷(图12B)，提高了左心室转导与肝感染的比率(图12C)。
实例10：用人MYBPC3基因挽救Mybpc3缺失小鼠的心脏功能
此实例证明了人MYBPC3基因挽救Mybpc3-/-小鼠的能力。
纯合Mybpc3-/-小鼠在两周龄时被眶后注射编码小鼠Mybpc3基因(mMybpc3)的AAV9(在1E14 vg·kg-1下)、编码人MYBPC3基因(hMYBPC3)的AAV9(在1E14 vg·kg-1下)或媒剂HBSS。注射后至多八个月通过超声心动图监测心脏大小和功能。结果表明，AAV9介导的心脏MYBPC3替代Mybpc3-/-小鼠中的mMybpc3和hMYBPC3导致心脏大小和功能的恢复。MYBPC3的人和小鼠直系同源物两者显著改善了射血分数(EF)，其中与hMYBPC3相比，mMybpc3在EF方面产生更大的改善(图13A)。重要的是，随着时间的推移，hMYBPC3在减少心脏肥大方面与mMybpc3一样有效，如相对于体重(LVM/BW)的左心室质量所证明的(图13B)。这通过舒张期间左心室后壁厚度(LVPW；d)的可比减少得到了进一步验证(图13C)。至关重要的是，在注射后8个月，所有改善展现出强大的稳定性。
在第二项研究中，在一系列病毒剂量下评估了hMYBPC3的功效。纯合Mybpc3-/-小鼠在两周龄时被眶后注射编码MYBPC3基因的1E13 vg·kg-1、1E14 vg·kg-1和3E14 vg·kg-1测试载体或媒剂HBSS。注射后十四周观察到所有测试剂量(1E13 vg·kg-1、1E14 vg·kg-1和3E14 vg·kg-1)的心脏功能的剂量依赖性改善，如EF所指示的(图14A)，其中1E14 vg·kg-1和3E14 vg·kg-1治疗的给药前基线显著改善(图14B)。基于LVM/BW，1E14 vg·kg-1和3E14 vg·kg-1治疗也观察到心脏肥大显著减少(图14C)。因此，得出结论，hMYBPC3测试载体能够以低至1E13 vg·kg-1的剂量在成年动物中保持心脏功能。
实例11：肥厚型心肌病(HCM)的治疗
心肌病是18岁以下儿童心脏骤停的第一大原因。肥厚型心肌病(HCM)影响50万美国人，可能导致心力衰竭或猝死。肌球蛋白结合蛋白C3、MYBPC3的功能丧失突变是HCM最常见的遗传原因。大多数引起HCM的MYBPC3突变会通过无义、移码或剪接位点突变导致截短。大多数具有MYBPC3突变的HCM患者的肌节病理生理学似乎是由于单倍体不足，因为掺入肌节的MYBPC3蛋白总量显著低于正常值。MYBPC3的肌节水平的降低导致肌球蛋白抑制降低，其中更多的肌球蛋白头与肌动蛋白丝接合，导致过度收缩。
治疗单倍体不足的最明确的途径是恢复不足的基因产物；在这种情况下，野生型MYBPC3。因此，成功地对具有优越的特性的AAV载体(TN-201)进行工程化，以在全身递送时选择性地将MYBPC3恢复到心肌细胞。至关重要的是，首次用AAV证明了小鼠替代物和TN-201在有症状的小鼠疾病模型中逆转心脏功能障碍和肥大的能力。
剂量范围功效研究展现了在临床相关剂量3E13 vg/kg下，野生型MYBPC3蛋白水平的恢复和心脏改善的饱和。进一步地，用>10X有效剂量注射的成年和婴儿小鼠中的初步安全性研究展现了没有临床观察，心脏功能没有改变，并且没有组织病理学发现。重要的是，已经确定，利用高度可扩展的Sf9平台产生的TN-201在Mybpc3-/-疾病模型中产生了同样有效的功效。最后，已经确定，观察到的功效对于注射后至多8个月的稳定益处以及即使在晚期纯合子疾病中心脏功能障碍的逆转具有足够的意义。
实例12：临床研究
如本文所描述的，包括编码MYBPC3的rAAV病毒粒子的药物组合物通过静脉内或逆行冠状窦(RCSI)施用。功能功效由以下确定：心脏功能状态评估(例如，纽约心脏学会功能分类，NYHA；心肺运动测试，CPET)、生活质量问卷(例如，堪萨斯城心肌病问卷临床质量评分，KCCQ-CSS)、心脏成像(例如，超声心动图)、心脏生物标志物(例如，肌钙蛋白和NT-proBNP)、心律和免疫评估、心脏功能状态评估(例如，机械辅助循环支持儿科机构间登记处，PEDIMACS；罗斯分类(Ross classifications))和/或主要不良心脏事件(MACE)(总死亡、心脏移植、启动强心药、启动通气或机械循环支持)。临床研究可以包含每年监测安全性和持续功效(例如，不良事件、严重不良事件、心电图、心肌酶、生物标志物、功能状态、左心室(LV)功能/质量、生活质量、血清化学、肝功能测试)，持续至多10年。

Claims (44)

1.一种经修饰的心肌肌钙蛋白T启动子，其包括具有介于300bp与500bp之间的多核苷酸。
2.根据权利要求1所述的启动子，其中所述多核苷酸包括与SEQ ID NO:1至85中的任何一个共有至少80％、至少90％或100％同一性的序列。
3.根据权利要求1所述的启动子，其中所述多核苷酸包括与SEQ ID NO:3共有至少80％、至少90％或100％同一性的序列。
4.根据权利要求1所述的启动子，其中所述多核苷酸与基因组多核苷酸序列共有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性：
(i)所述基因组多核苷酸序列位于肌钙蛋白T基因的转录起始位点上游并且包含所述转录起始位点；或
(ii)相对于肌钙蛋白T基因的所述转录起始位点，所述基因组多核苷酸序列为-450bp至+1bp、-350bp至+1bp、-250bp至+1bp、-450bp至+50bp、-350bp至+50bp或-250bp至+50bp；
任选地其中所述肌钙蛋白T基因是人肌钙蛋白T基因。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的启动子，其中所述启动子是：
(i)肌肉特异性启动子；和/或
(ii)心脏细胞特异性启动子；和/或
(iii)心肌细胞特异性启动子。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的启动子，其中所述启动子具有与以下相同的细胞型特异性：
(i)约600bp的天然肌钙蛋白T启动子；和/或
(ii)包括SEQ ID NO:1的参考启动子。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的启动子，其中相较于天然肌钙蛋白T启动子，所述启动子表达与其操作性地连接的基因产物高至少约10％、至少约20％、至少约30％；任选地其中所述天然肌钙蛋白T启动子是包括SEQ ID NO:1的参考启动子。
8.一种载体，其包括与编码基因产物的多核苷酸操作性地连接的根据权利要求1至7中任一项所述的启动子。
9.根据权利要求8所述的载体，其中所述载体是病毒载体；任选地其中：
所述病毒载体是腺相关病毒载体(AAV)和/或其中所述病毒载体具有至多约5.5kB的包装限制；
任选地其中所述AAV载体是AAV9或其变体。
10.根据权利要求8或权利要求9所述的载体，其中所述基因产物选自：
(i)MYBPC3、KCNH2、TRPM4、DSG2和ATP2A2蛋白；或
(ii)CACNA1C,DMD,DMPK,EPG5,EVC,EVC2,FBN1,NF1,SCN5A,SOS1,NPR1,ERBB4,VIP和MYH7蛋白。
11.根据权利要求8至10中任一项所述的载体，其中所述基因产物是Cas9，任选地选自SpCas9、St1Cas9和SaCas9。
12.根据权利要求8至11中任一项所述的载体，其中所述载体包括编码第二基因产物的多核苷酸；任选地其中所述第二基因产物是功能性RNA，任选地微RNA或向导RNA。
13.一种分离的细胞，其包括根据权利要求1至7中任一项所述的启动子。
14.根据权利要求13所述的分离的细胞，其中所述分离的细胞是诱导的多能干细胞或分离的心肌细胞。
15.一种药物组合物，其包括根据权利要求8至12中任一项所述的载体。
16.一种细胞疗法组合物，其包括根据权利要求13或权利要求14所述的细胞。
17.一种重组腺相关病毒(AAV)载体基因组，其包括编码MYBPC3蛋白或其功能变体的MYBPC3多核苷酸以及启动子，其中所述启动子是根据权利要求1至7中任一项所述的经修饰的心肌肌钙蛋白T启动子。
18.根据权利要求17所述的rAAV载体基因组，其中所述MYBPC3多核苷酸包括至少约3.5kB、包括约3.8kB、为全长MYBPC3或为截短的MYBPC3。
19.根据权利要求17或权利要求18所述的rAAV载体基因组，其中所述MYBPC3是人MYBPC3。
20.根据权利要求17至19中任一项所述的rAAV载体基因组，其中所述载体以与参考AAV载体约相同、比所述参考AAV载体大至少约10％或大至少约20％的水平表达MYBPC3，所述参考AAV载体包括约600bp的天然肌钙蛋白T启动子。
21.一种重组腺相关病毒(AAV)载体基因组，其包括表达盒，所述表达盒按5'至3'的顺序包括：包含启动子的5'区段；多核苷酸，其编码基因产物；以及3'区段，所述3'区段包括polyA信号，所述表达盒任选地侧接有5'末端反向重复序列(ITR)和3'ITR中的一者或两者，
其中所述编码所述基因产物的多核苷酸包括3kb到11kb、3kb到5kb、3.5kb到4.5kb或3.7kb到4kb；并且
其中：
a)所述5'区段和所述3'区段一起包括至多0.8kbp或至多0.9kbp；
b)所述5'ITR、5'区段、所述3'区段和3'ITR一起包括或为至多1.2kbp、至多1.3kbp；和/或
c)所述载体基因组包括至多4.7kbp、至多4.8kbp、至多4.9kbp、至多5.0kbp或至多5.2kbp。
22.根据权利要求21所述的rAAV载体基因组，其中所述5'区段包括至多500bp或至多480bp和/或其中3'区段包括至多200bp或至多150bp。
23.根据权利要求21或权利要求22所述的rAAV载体基因组，其中所述编码所述基因产物的多核苷酸包括3.7kbp至3.9kbp，任选地3.8kbp。
24.根据权利要求21至23中任一项所述的rAAV载体基因组，其中所述基因产物是MYBPC3或其功能变体；任选地其中
所述编码MYBPC3的多核苷酸与SEQ ID NO:86共有至少90％同一性，与SEQ ID NO:86共有至少95％同一性或者是SEQ ID NO:86；和/或
MYBPC与SEQ ID NO:103的多肽序列共有至少90％同一性，与SEQ ID NO:103的多肽序列共有至少95％同一性或者是SEQ ID NO:103的多肽序列。
25.根据权利要求21至24中任一项所述的rAAV载体基因组，其中所述启动子是根据权利要求1至8中任一项所述的经修饰的心肌肌钙蛋白T启动子。
26.根据权利要求25所述的rAAV载体基因组，其中：
(i)所述启动子包括与SEQ ID NO:91共有至少80％同一性、至少90％同一性或100％同一性的序列；和/或
(ii)所述polyA信号包括与SEQ ID NO:92共有至少90％同一性、至少95％同一性或者是SEQ ID NO:92的序列、基本上由其组成或由其组成。
(iii)所述5'区段与SEQ ID NO:93共有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性或者是SEQ ID NO:93；和/或
(iv)所述3'区段与SEQ ID NO:94共有至少80％同一性、至少90％同一性、共有至少95％同一性或者是SEQ ID NO:94。
27.根据权利要求21至26中任一项所述的rAAV载体基因组，其中所述表达盒与SEQ IDNO:95共有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性或者是SEQ ID NO:95；和/或其中所述rAAV载体基因组与SEQ ID NO:102共有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性或者是SEQ ID NO:102。
28.根据权利要求21至27中任一项所述的AAV载体基因组，其中所述5'ITR包括与SEQID NO:96共有95％同一性的序列，和/或所述3'ITR包括与SEQ ID NO:97共有至少95％同一性的序列。
29.一种重组AAV(rAAV)病毒粒子，其包括根据权利要求17至28中任一项所述的rAAV载体基因组和AAV衣壳蛋白，
任选地其中所述rAAV病毒粒子是血清型AAV9病毒粒子或其变体，和/或所述AAV衣壳蛋白是AAV9衣壳蛋白或其变体。
30.一种在细胞中表达MYBPC3蛋白的体外或离体方法，所述方法包括用根据权利要求29所述的rAAV病毒粒子或根据权利要求17至28中任一项所述的rAAV载体基因组转导所述细胞。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述细胞是MYBPC3-/-细胞。
32.根据权利要求30或权利要求31所述的方法，其中所述细胞包括在内源性MYBPC3基因的一个或两个拷贝中的失活突变。
33.根据权利要求29所述的rAAV病毒粒子或根据权利要求17至28中任一项所述的rAAV载体基因组，其用作药物。
34.根据权利要求29所述的rAAV病毒粒子或根据权利要求17至28中任一项所述的rAAV载体基因组，其用于治疗和/或预防受试者的心肌病的方法中；任选地其中所述心肌病是肥厚型心肌病。
35.根据权利要求29所述的rAAV病毒粒子或根据权利要求17至28中任一项所述的rAAV载体基因组，其用于治疗和/或预防受试者的由MYBPC3突变引起的疾病或病症的方法中。
36.根据权利要求34或权利要求35所述的供使用的rAAV病毒粒子或rAAV载体基因组，其中所述方法包括表达所述受试者的心脏中的MYBPC3蛋白和/或增加MYBPC3活性和/或增加心脏功能。
37.根据权利要求33至36中任一项所述的供使用的rAAV病毒粒子或rAAV载体基因组，其中所述rAAV病毒粒子或rAAV载体基因组的施用使MYBPC3在所述受试者的所述心脏中特异性表达。
38.根据权利要求33至37中任一项所述的供使用的rAAV病毒粒子或rAAV载体基因组，其中所述rAAV病毒粒子或rAAV载体基因组的施用导致在所述受试者的骨骼组织、脑和/或肝中MYBPC3的表达低或无法检测到。
39.根据权利要求34至38中任一项所述的供使用的rAAV病毒粒子或rAAV载体基因组，其中所述受试者包括MYBPC3突变。
40.根据权利要求34至39中任一项所述的供使用的rAAV病毒粒子或rAAV载体基因组，其中所述方法包括：
(i)向所述受试者静脉内施用所述rAAV病毒粒子或rAAV载体基因组；
(ii)向所述受试者心脏内施用所述rAAV病毒粒子或rAAV载体基因组；
(iii)向所述受试者直接注射所述rAAV病毒粒子或rAAV载体基因组。
41.根据权利要求34至40中任一项所述的供使用的rAAV病毒粒子或rAAV载体基因组，其中所述受试者是哺乳动物；任选地其中所述受试者是人。
42.根据权利要求34至41中任一项所述的供使用的rAAV病毒粒子或rAAV载体基因组，其中所述受试者是青少年。
43.根据权利要求34至41中任一项所述的供使用的rAAV病毒粒子或rAAV载体基因组，其中所述受试者是成人。
44.根据权利要求33至43中任一项所述的供使用的rAAV病毒粒子或rAAV载体基因组，其中所述rAAV病毒粒子或rAAV载体基因组以约1011vg/kg至约1014vg/kg的剂量施用。
CN202180028001.5A 2020-02-13 2021-02-11 用于治疗心脏病的基因疗法载体 Pending CN116096394A (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202062976160P 2020-02-13 2020-02-13
US62/976160 2020-02-13
US202063047633P 2020-07-02 2020-07-02
US63/047633 2020-07-02
PCT/US2021/017699 WO2021163357A2 (en) 2020-02-13 2021-02-11 Gene therapy vectors for treating heart disease

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116096394A true CN116096394A (zh) 2023-05-09

Family

ID=77273691

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202180028001.5A Pending CN116096394A (zh) 2020-02-13 2021-02-11 用于治疗心脏病的基因疗法载体

Country Status (11)

Country Link
US (5) US11129908B2 (zh)
EP (1) EP4103214A2 (zh)
JP (1) JP2023513749A (zh)
KR (1) KR20220139956A (zh)
CN (1) CN116096394A (zh)
AU (1) AU2021218411A1 (zh)
BR (1) BR112022015979A2 (zh)
CA (1) CA3171166A1 (zh)
CO (1) CO2022012917A2 (zh)
IL (1) IL295529A (zh)
MX (1) MX2022009883A (zh)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3171166A1 (en) 2020-02-13 2021-08-19 Tenaya Therapeutics, Inc. Gene therapy vectors for treating heart disease
AU2022408189A1 (en) * 2021-12-10 2024-06-20 Aavantibio, Inc. Methods and compositions for treating mybpc3 related hypertrophic cardiomyopathy with a viral vector
TW202404993A (zh) 2022-04-11 2024-02-01 美商特納亞治療股份有限公司 具經工程化蛋白殼之腺相關病毒
WO2024054864A1 (en) 2022-09-06 2024-03-14 Tenaya Therapeutics, Inc. Cardioprotective heart disease therapies
TW202417631A (zh) 2022-09-22 2024-05-01 美商拜奧馬林製藥公司 用ａａｖ基因治療載體治療心肌病
TW202421788A (zh) 2022-09-22 2024-06-01 美商拜奧馬林製藥公司 用ａａｖ基因療法載體治療致心律不整性心肌病
WO2024163571A1 (en) * 2023-02-01 2024-08-08 Board Of Regents, The University Of Texas System MESSENGER RNA ENGINEERED THERAPEUTICS FOR TREATING GENETIC DISORDERS (MeET)
WO2024215655A1 (en) 2023-04-10 2024-10-17 Tenaya Therapeutics, Inc. Cardioprotective bag3 therapies
WO2024215653A1 (en) 2023-04-10 2024-10-17 Tenaya Therapeutics, Inc. Guide rnas, vectors, and virions for targeting mutations in the pln gene

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101988071A (zh) * 2001-10-11 2011-03-23 默沙东公司 丙型肝炎病毒疫苗
CN105378089A (zh) * 2013-04-17 2016-03-02 汉堡-艾本德大学医学中心 治疗心肌病的基因治疗载体
CN107250364A (zh) * 2015-01-16 2017-10-13 华盛顿大学 新的微小肌养蛋白及相关使用方法
WO2019183630A2 (en) * 2018-03-23 2019-09-26 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Gene editing for autosomal dominant diseases

Family Cites Families (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5266488A (en) 1988-04-06 1993-11-30 The Regents Of The University Of California Troponin T gene promoter and derivatives thereof
US9441244B2 (en) 2003-06-30 2016-09-13 The Regents Of The University Of California Mutant adeno-associated virus virions and methods of use thereof
JP5136766B2 (ja) 2004-12-15 2013-02-06 ユニバーシティ オブ ノース カロライナ アット チャペル ヒル キメラベクター
US9725485B2 (en) 2012-05-15 2017-08-08 University Of Florida Research Foundation, Inc. AAV vectors with high transduction efficiency and uses thereof for gene therapy
EP3492596A1 (en) 2007-04-09 2019-06-05 University of Florida Research Foundation, Inc. Raav vector compositions having tyrosine-modified capsid proteins and methods for use
WO2009137006A2 (en) 2008-04-30 2009-11-12 The University Of North Carolina At Chapel Hill Directed evolution and in vivo panning of virus vectors
WO2010093784A2 (en) 2009-02-11 2010-08-19 The University Of North Carolina At Chapel Hill Modified virus vectors and methods of making and using the same
EP2714709B1 (en) 2011-05-26 2018-04-18 University of Washington Compositions for use in cell and gene based methods to improve cardiac function
CN111500665A (zh) 2011-07-21 2020-08-07 小利兰·斯坦福大学托管委员会 来自患者的诱导性多能干细胞的心肌细胞及其使用方法
US8933048B2 (en) 2011-09-21 2015-01-13 Case Western Reserve University Methods of treating cardiomyopathy
US20130136729A1 (en) 2011-11-11 2013-05-30 University of Virginia Patent Foundation, d/b/a University of Virginia Licensing & Ventures Group Compositions and methods for targeting and treating diseases and injuries using adeno-associated virus vectors
US9845465B2 (en) * 2012-08-15 2017-12-19 University Of Virginia Patent Foundation Compositions and methods for treating peripheral arterial disease
US10072251B2 (en) 2014-02-19 2018-09-11 University Of Massachusetts Recombinant AAVS having useful transcytosis properties
US10370432B2 (en) 2014-10-03 2019-08-06 University Of Massachusetts Heterologous targeting peptide grafted AAVS
CN107073051B (zh) 2014-10-21 2021-08-24 马萨诸塞大学 重组aav变体及其用途
ES2860712T3 (es) 2015-03-24 2021-10-05 Univ California Variantes de virus adenoasociados y métodos de uso de las mismas
CN108093639B (zh) 2015-04-16 2022-07-19 埃默里大学 用于肝脏中蛋白质表达的重组启动子和载体及其用途
KR102423442B1 (ko) 2015-12-11 2022-07-20 캘리포니아 인스티튜트 오브 테크놀로지 아데노-관련 바이러스를 지시하기 위한 타겟팅 펩타이드
BR112018011881A2 (pt) 2015-12-14 2018-12-04 The University Of North Carolina At Chapel Hill proteínas capsidiais modificadas para liberação aumentada de vetores de parvovírus
US11866462B2 (en) 2016-05-04 2024-01-09 Oregon Health & Science University Recombinant adeno-associated viral vectors
EP3469073B1 (en) 2016-06-09 2024-01-10 Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) Raav with chemically modified capsid
US11905312B2 (en) 2017-02-15 2024-02-20 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods and compositions for gene transfer across the vasculature
US10550405B2 (en) 2017-03-15 2020-02-04 The University Of North Carolina At Chapel Hill Rational polyploid adeno-associated virus vectors and methods of making and using the same
TWI722310B (zh) 2017-08-03 2021-03-21 美商航海家醫療公司 用於aav之遞送之組合物及方法
BR112020005436B1 (pt) 2017-09-20 2022-08-02 4D Molecular Therapeutics Inc Proteína do capsídeo de variante do vírus adenoassociado, virion do aav recombinante (raav) infeccioso, composições, composições farmacêuticas e usos de virion de raav ou de composições farmacêuticas
AU2019209002A1 (en) * 2018-01-19 2020-09-03 Agency For Science, Technology And Research Disrupting the LINC complex for treating laminopathy
CN112703198A (zh) 2018-07-11 2021-04-23 布里格姆妇女医院 用于跨血脑屏障递送试剂的方法和组合物
US11242368B2 (en) 2018-09-21 2022-02-08 Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona Methods and compositions for rapidly replacing cardiac myosin binding protein-C in sarcomeres
CN113423434A (zh) 2018-12-05 2021-09-21 阿贝奥纳治疗有限公司 用于基因递送的重组腺相关病毒载体
AR118465A1 (es) 2019-03-21 2021-10-06 Stridebio Inc Vectores de virus adenoasociados recombinantes
MX2021011701A (es) 2019-03-28 2021-12-10 Massachusetts Gen Hospital Vectores adenoasociados fabricados por ingenieria (aav) para expresion transgenica.
US20200405824A1 (en) 2019-06-26 2020-12-31 University Of Washington Use of ribonucleotide reductase alone or in combination with micro-dystrophin to treat duchenne muscular dystrophy striated muscle disease
KR20220119595A (ko) 2019-08-27 2022-08-30 디나코 아게 정지되지 않은 박동 심장에의 약물 관류
CA3171166A1 (en) 2020-02-13 2021-08-19 Tenaya Therapeutics, Inc. Gene therapy vectors for treating heart disease
JP2023533751A (ja) 2020-07-08 2023-08-04 ザ チルドレンズ メディカル センター コーポレーション Ｍｙｂｐｃ３ポリペプチドおよびその使用
MX2023007474A (es) 2020-12-23 2023-09-13 Boehringer Ingelheim Int Proteinas de la capside viral con especificidad para las celulas del tejido cardiaco.
EP4294494A1 (en) 2021-02-22 2023-12-27 Dinaqor AG Loco-regional perfusion of a liver
WO2022175547A1 (en) 2021-02-22 2022-08-25 Dinaqor Ag Loco-regional perfusion of an unarrested beating heart
BR112023016797A2 (pt) 2021-02-22 2024-01-16 Dinaqor Ag Perfusão loco-regional de um rim

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101988071A (zh) * 2001-10-11 2011-03-23 默沙东公司 丙型肝炎病毒疫苗
CN105378089A (zh) * 2013-04-17 2016-03-02 汉堡-艾本德大学医学中心 治疗心肌病的基因治疗载体
CN107250364A (zh) * 2015-01-16 2017-10-13 华盛顿大学 新的微小肌养蛋白及相关使用方法
WO2019183630A2 (en) * 2018-03-23 2019-09-26 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Gene editing for autosomal dominant diseases

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
STANISLAS WERFEL: "Rapid and highly efficient inducible cardiac gene knockout in adultmice using AAV-mediated expression of Cre recombinase", 《CARDIOVASCULAR RESEARCH》, vol. 104, no. 1, 31 July 2014 (2014-07-31), pages 3 *

Also Published As

Publication number Publication date
CA3171166A1 (en) 2021-08-19
US20210252165A1 (en) 2021-08-19
US20210346521A1 (en) 2021-11-11
JP2023513749A (ja) 2023-04-03
EP4103214A2 (en) 2022-12-21
US11759531B2 (en) 2023-09-19
AU2021218411A1 (en) 2022-10-06
US20220160896A1 (en) 2022-05-26
IL295529A (en) 2022-10-01
CO2022012917A2 (es) 2022-09-20
US11129908B2 (en) 2021-09-28
US20220031866A1 (en) 2022-02-03
BR112022015979A2 (pt) 2022-10-11
US11446397B2 (en) 2022-09-20
US20230372541A1 (en) 2023-11-23
MX2022009883A (es) 2022-10-03
KR20220139956A (ko) 2022-10-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11129908B2 (en) Gene therapy vectors for treating heart disease
WO2021163357A2 (en) Gene therapy vectors for treating heart disease
JP7415042B2 (ja) プラコフィリン２遺伝子治療の方法および組成物
US20230133924A1 (en) Optimized expression cassettes for gene therapy
KR20220066225A (ko) 선택적 유전자 조절을 위한 조성물 및 방법
JP2022522196A (ja) ラミノパシーを処置するための組成物および方法
KR20220164708A (ko) AAV 유전자 요법을 위한 무-CpG ITR
AU2022271265A1 (en) Compositions and methods for treating sensorineural hearing loss using stereocilin dual vector systems
US20160333071A1 (en) Biological Pacemakers Incorporating HCN2 and SkM1 Genes
WO2022226183A2 (en) Optimized ap4m1 polynucleotides and expression cassettes and their use
TW202129002A (zh) 用於myh7關聯之心肌病之基因療法組合物及治療
CN115605266A (zh) Dysferlin双载体的基因疗法
KR20220092489A (ko) 알파-사코글리칸의 아데노 관련 바이러스 벡터 전달 및 근위축증 치료
JP2004519222A (ja) Ｃａｒｐ遺伝子の上流配列、それらを含むベクターとその使用
WO2024215655A1 (en) Cardioprotective bag3 therapies
WO2023159190A1 (en) Gene therapy for arrhythmogenic cardiomyopathy
TW202421787A (zh) 保護心臟之心臟病療法
TW202337476A (zh) 用於與肌肉萎縮蛋白有關之心肌病之基因療法組合物及治療
WO2024069144A1 (en) Rna editing vector
WO2024215653A1 (en) Guide rnas, vectors, and virions for targeting mutations in the pln gene

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination