JP2023533751A

JP2023533751A - Ｍｙｂｐｃ３ポリペプチドおよびその使用

Info

Publication number: JP2023533751A
Application number: JP2023501498A
Authority: JP
Inventors: プー，ウィリアム，ティー．; ルー，フージャン; ベゼリデス，ヴァシリオス
Original assignee: Childrens Medical Center Corp
Current assignee: Childrens Medical Center Corp
Priority date: 2020-07-08
Filing date: 2021-07-08
Publication date: 2023-08-04
Also published as: CN115803042A; EP4178603A1; BR112022025123A2; WO2022011151A1; US20220023384A1; TW202208402A; AU2021305213A1; CL2023000024A1; IL298854A; KR20230038508A; CO2023000307A2; CA3186584A1; MX2023000453A

Abstract

本明細書において提供されるのは、異常なＲＹＲ２機能に関連する障害（例えば、不整脈または心不全）を処置するための組成物および方法である。いくつかの態様において、方法は、必要とする対象に、心筋ミオシン結合タンパク質Ｃ（ＭＹＢＰＣ３）のＣ末端ドメインを含むポリペプチド、またはかかるポリペプチドをコードする核酸またはｒＡＡＶの有効量を投与することを含む。

Description

関連出願
本願は、２０２０年７月８日に出願された米国仮出願番号６３／０４９，３９８の３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）下における利益を主張し、当該仮出願は、その全体において本明細書において参考として援用される。

政府の支援
本発明は、国立衛生研究所により付与された助成金番号Ｒ０１ＨＬ１４６６３４およびＵＧ３ＨＬ１４１７９８下における政府の支援によりなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。

EFS-WEBを介してテキストファイルとして提出された配列表への参照
本願は、配列表を含み、これは、ASCIIフォーマットにおいてEFS-Webを介して提出され、その全体において本明細書により参考として援用される。２０２１年７月６日に作成された前記ASCIIのコピーは、C123370191WO00-SEQ-REと命名され、２５７，３６７バイトのサイズである。

背景
心臓疾患および心臓不整脈の多くの形態は、直接的に、または間接的に、心臓の筋細胞におけるＣａ^２＋放出の不適切な制御により引き起こされる。心臓の筋細胞におけるＣａ^２＋放出は、dyadとして知られる特化した構造において起こる。Ｃａ^２＋放出の重要な調節因子は、ＲＹＲ２（リアノジン受容体２型）であり、これはＣａ^２＋チャネルであり、これを通して筋小胞体から細胞質中にＣａ^２＋が放出される。異常なＣａ^２＋放出により引き起こされる心臓不整脈の一例は、ＣＰＶＴ（カテコールアミン誘発性多形性心室性頻拍）であり、これは、患者が運動の間に致死的な不整脈についてのリスクを有する、悪性の遺伝性不整脈である。ＣＰＶＴは、１：１００００の推定有病率を有し、突然の不明な若年死の剖検陰性症例のうちの約１５％を引き起こす。ＣＰＶＴ症例の６０％は、ＲＹＲ２における変異により引き起こされる。ＲＹＲ２中で、コード配列の４つの「ホットスポット」領域中でクラスター化される１６０個を超える異なる変異が、ＣＰＶＴを引き起こす。現在、ＣＰＶＴは、利用可能な選択肢により適切に処置されておらず、患者は、突然死または中断された突然死、ならびに現在の治療から生じる病的状態に苦しみ続ける。心房細動などの不整脈の他の形態は、ＲＹＲ２からのＣａ^２＋放出の異常な調節に関連する。ＲＹＲ２からの異常なＣａ^２＋放出はまた、心不全の遺伝性および後天性の形態における収縮不全にも寄与し得る。

要旨
本開示は、少なくとも部分的に、内在性心臓タンパク質であるＭＹＢＰＣ３のＣ末端とＲＹＲ２との間の相互作用の驚くべき発見、およびこの相互作用するドメインの過剰発現が、異常なＲＹＲ２活性を抑制し不整脈を軽減したということに基づく。いくつかの側面において、本開示は、異常なＲＹＲ２機能に関連する障害（例えば、遺伝性または後天性のいずれかである不整脈または心不全）を処置するための組成物および方法を提供する。いくつかの態様において、本明細書において記載される方法を用いて処置される対象は、不整脈を有する対象であって、既存の医学的管理に対するその応答が、最適以下であるものである。

本開示のいくつかの側面は、異常なリアノジン受容体２型（ＲＹＲ２）機能に関連する障害を処置する方法を提供する。いくつかの態様において、方法は、必要とする対象に心筋ミオシン結合タンパク質Ｃ（ＭＹＢＰＣ３）のＣ末端ドメインを含むポリペプチドの有効量を投与することを含む。いくつかの態様において、方法は、必要とする対象に心筋ミオシン結合タンパク質Ｃ（ＭＹＢＰＣ３）のＣ末端ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸の有効量を投与することを含む。

いくつかの態様において、異常なＲＹＲ２機能は、ＲＹＲ２における１つ以上の変異により引き起こされる。いくつかの態様において、ＲＹＲ２における変異は、対象における心筋細胞における過剰な拡張期Ｃａ^２＋放出を引き起こす。
いくつかの態様において、ポリペプチドは、配列番号１～１６または５３～６４のうちのいずれか１つに対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ポリペプチドは、配列番号１～１６または５３～６４のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。

いくつかの態様において、ヌクレオチド配列は、プロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの態様において、核酸は、ベクターである。いくつかの態様において、ベクターは、発現ベクターである。いくつかの態様において、発現ベクターは、ウイルスベクターである。いくつかの態様において、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、または組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターから選択される。

いくつかの態様において、ウイルスベクターは、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列およびプロモーターに隣接する２つのＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲｓ）をさらに含む、ｒＡＡＶベクターである。いくつかの態様において、ここで、ｒＡＡＶベクターは、ｒＡＡＶ粒子中にパッケージングされる。いくつかの態様において、ｒＡＡＶ粒子は、キャプシドタンパク質をさらに含む。いくつかの態様において、キャプシドタンパク質は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．４３、ＡＡＶ２／２－６６、ＡＡＶ２／２－８４、およびＡＡＶ２／２－１２５、またはそれらのバリアントから選択される血清型のものである。いくつかの態様において、キャプシドタンパク質は、血清型ＡＡＶ９のものである。いくつかの態様において、ｒＡＡＶは、自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）である。いくつかの態様において、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、コドン最適化されている。いくつかの態様において、核酸は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。いくつかの態様において、ｍＲＮＡは、修飾されたｍＲＮＡである。

いくつかの態様において、ポリペプチドまたは核酸は、対象における心筋細胞に送達される。
いくつかの態様において、障害は、不整脈である。いくつかの態様において、不整脈は、遺伝性または後天性である。いくつかの態様において、遺伝性不整脈は、カテコールアミン誘発性多形性心室性頻拍（ＣＰＶＴ）である。いくつかの態様において、後天性不整脈は、心室性不整脈または上室性不整脈である。いくつかの態様において、心室性不整脈は、心室頻拍、心室細動、または心室性期外収縮である。いくつかの態様において、上室性不整脈は、心房細動、心房粗動、心房頻拍、心房性期外収縮、または発作性上室性頻拍である。いくつかの態様において、障害は、心不全である。

いくつかの態様において、ポリペプチドまたは核酸を投与することが、対象における心筋細胞における過剰な拡張期Ｃａ^２＋放出を減少させる。
いくつかの態様において、対象は、ヒトである。いくつかの態様において、投与することは、注射を介するものである。

本開示のいくつかの側面は、不整脈を処置する方法を提供し、該方法は、必要とする対象に組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の有効量を投与することを含み、ここで、ｒＡＡＶは、血清型ＡＡＶ９のキャプシドタンパク質、および心筋ミオシン結合タンパク質Ｃ（ＭＹＢＰＣ３）のＣ末端ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。

本開示の他の側面は、キャプシドタンパク質および心筋ミオシン結合タンパク質Ｃ（ＭＹＢＰＣ３）のＣ末端ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を提供する。
いくつかの態様において、ポリペプチドは、配列番号１～１６または５３～６４のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。

本明細書においてさらに提供されるのは、異常なリアノジン受容体２型（ＲＹＲ２）機能に関連する障害を処置することにおける、本明細書において記載されるｒＡＡＶの使用である。いくつかの態様において、障害は、不整脈である。いくつかの態様において、不整脈は、遺伝性または後天性である。いくつかの態様において、遺伝性不整脈は、カテコールアミン誘発性多形性心室性頻拍（ＣＰＶＴ）である。いくつかの態様において、後天性不整脈は、心室性不整脈または上室性不整脈である。いくつかの態様において、心室性不整脈は、心室頻拍、心室細動、または心室性期外収縮である。いくつかの態様において、上室性不整脈は、心房細動、心房粗動、心房頻拍、心房性期外収縮、または発作性上室性頻拍である。いくつかの態様において、障害は、心不全である。

上の要旨は、本明細書において開示される技術の態様、利点、特徴、および用途のうちのいくつかを、非限定的な様式において説明することを意図する。本明細書において開示される技術の他の態様、利点、特徴、および用途は、詳細な説明、図面、例、および請求の範囲から明らかであろう。

添付の図面は、実寸において描画されることを意図されていない。図面において、各々の同一またはほぼ同一の構成成分であって、多様な図において図示されるものは、類似の数字により表される。明確性のために、全ての構成成分が全ての図面においてラベルされているわけではない。特許または出願のファイルは、カラーにおいて実行された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面を含む本特許または特許出願の公報のコピーは、請求および必要な料金の支払いに応じて庁により提供されるであろう。図面において：

図１Ａ～１Ｆは、ＭＹＢＰＣ３がdyad中に存在することを示す。図１Ａ．dyad中のタンパク質を同定するための近接プロテオミクス戦略を描画する模式図。ＡＡＶ９は、ジャンクチン（Junctin）（Ｊ）またはトリアディン（Triadin）（Ｔ）のいずれかと、短命なビオチンフリーラジカルの形成を触媒するＢｉｒＡ*との間の融合タンパク質の心筋細胞発現を指揮した。ジャンクチンおよびトリアディンは、心筋細胞のdyadにおいてＲＹＲ２と緊密に関連するタンパク質である。dyadは、これらの細胞の特化したＣａ^２＋放出構造である。図１Ａ～１Ｆは、ＭＹＢＰＣ３がdyad中に存在することを示す。図１Ｂ．実験のタイムライン。ＡＡＶを新生仔マウスに送達した。生後３週間目において、ビオチンの注射によりビオチン近接標識を誘導した。試料をＰ２８において回収した。ビオチン標識されたタンパク質を固定されたストレプトアビジン上で単離して、質量分析により分析した。図１Ｃ．心臓の切片中の、心筋細胞におけるｍｙｃタグ付けされた融合タンパク質の局在。図１Ａ～１Ｆは、ＭＹＢＰＣ３がdyad中に存在することを示す。図１Ｄ．より高い倍率は、融合タンパク質が、解離された心筋細胞において、Ｔ細管においてＣＡＶ３と共局在することを示す。図１Ａ～１Ｆは、ＭＹＢＰＣ３がdyad中に存在することを示す。図１Ｅ．インプットおよびストレプトアビジンに結合したタンパク質を、ストレプトアビジン－ＨＲＰ（ビオチン化タンパク質、左）または引き落とされた総タンパク質（右）を用いて可視化した。ＮＣ、陰性対照ＡＡＶ（ＡＡＶ－ｃＴＮＴ－ＧＦＰ）。図１Ａ～１Ｆは、ＭＹＢＰＣ３がdyad中に存在することを示す。図１Ｆ．質量分析による分析は、ＮＣ心筋細胞、およびＢｉｒＡ*－トリアディンまたはＢｉｒＡ*－ジャンクチンを発現する心筋細胞におけるタンパク質を同定した。トリアディンおよびジャンクチンの両方の融合タンパク質試料において濃縮され、対照試料においては濃縮されないタンパク質のセットに焦点を当てた（輪郭を描いた領域）。ＭＹＢＰＣ３は、このタンパク質のセットの中にあった。ジーンオントロジー用語は、１７７個の目的のタンパク質の中で濃縮された（これらを右に示す）。これらの機能的注解は、心筋細胞関連用語について、高度に濃縮された。

図２Ａ～２Ｆは、心筋細胞におけるＭｙｂｐｃ３およびＭｙｂｐｃ３由来のペプチドの細胞内局在を示す。図２Ａ．全長ＭＹＢＰＣ３のドメイン構造。ドメインを、Ｃ０～Ｃ１０とラベルする。図２Ｂ．野生型心筋細胞におけるＲＹＲ２（左）と比較した、ＭＹＢＰＣ３の内在性Ｃ末端ドメインの局在。ＭＹＢＰＣ３タンパク質は、Ｃ１０ドメイン（アミノ酸１２１３－１２２９）に対して特異的なモノクローナル抗体を用いて検出した。この抗体は、ＭＹＢＰＣ３欠損の心筋細胞に対して免疫反応性を示さなかった（右）。Ｃ１０免疫反応性は、dyadにおいてＲＹＲ２と共局在した。図２Ａ～２Ｆは、心筋細胞におけるＭｙｂｐｃ３およびＭｙｂｐｃ３由来のペプチドの細胞内局在を示す。図２Ｃ．近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）によるＭＹＢＰＣ３とＲＹＲ２との共局在。ＭＹＢＰＣ３－Ｃ１０およびＲＹＲ２の抗体で標識されたタンパク質はin situで共局在することが、ＰＬＡシグナル（ドット）により決定された。バー＝１０μｍ。図２Ａ～２Ｆは、心筋細胞におけるＭｙｂｐｃ３およびＭｙｂｐｃ３由来のペプチドの細胞内局在を示す。図２Ｄ．ＲＹＲ２抗体のみで、またはＭＹＢＰＣ３－Ｃ１０抗体と組み合わせて染色された試料における、ＰＬＡシグナルの定量。図２Ａ～２Ｆは、心筋細胞におけるＭｙｂｐｃ３およびＭｙｂｐｃ３由来のペプチドの細胞内局在を示す。図２Ｅ～２Ｆ．ＡＡＶにより発現された、ＨＡタグ付けされたタンパク質の局在。ＨＡタグ付けされた全長およびＭＹＢＰＣ３のＣ末端ペプチドは、２つの区別し得る染色パターンを示し、これを赤色および青色で色分けした。全長およびドメインＣ６－Ｃ１０を包含するフラグメント（赤色、上）は、二分された免疫染色パターンの蛍光シグナルプロフィールを有し（図２Ｆ）、これは、サルコメアＡ帯への優勢な局在と一致した。しかし、このパターンは、タンパク質のサブセットがdyadに局在することを除外しない。Ｃ６－Ｃ８およびＣ６－Ｃ９、ならびにＣ１０ドメインのみを包含するペプチドは、区別し得る染色パターンおよびシグナルプロフィール（青色、下）を有し、これは、dyadへの局在と一致した。バー＝１０μｍ。図２Ａ～２Ｆは、心筋細胞におけるＭｙｂｐｃ３およびＭｙｂｐｃ３由来のペプチドの細胞内局在を示す。図２Ｅ～２Ｆ．ＡＡＶにより発現された、ＨＡタグ付けされたタンパク質の局在。ＨＡタグ付けされた全長およびＭＹＢＰＣ３のＣ末端ペプチドは、２つの区別し得る染色パターンを示し、これを赤色および青色で色分けした。全長およびドメインＣ６－Ｃ１０を包含するフラグメント（赤色、上）は、二分された免疫染色パターンの蛍光シグナルプロフィールを有し（図２Ｆ）、これは、サルコメアＡ帯への優勢な局在と一致した。しかし、このパターンは、タンパク質のサブセットがdyadに局在することを除外しない。Ｃ６－Ｃ８およびＣ６－Ｃ９、ならびにＣ１０ドメインのみを包含するペプチドは、区別し得る染色パターンおよびシグナルプロフィール（青色、下）を有し、これは、dyadへの局在と一致した。バー＝１０μｍ。

図３Ａ～３Ｄは、ＣＰＶＴｈｉＰＳＣ－ＣＭにおけるＭＹＢＰＣ３の過剰発現が、Ｃａ^２＋ハンドリングを正常化したことを示す。ヘテロ接合性ＲＹＲ２Ｒ４６５１Ｉ変異に起因するＣＰＶＴを有する患者からのヒトｉＰＳＣを、心筋細胞（ｉＰＳＣ－ＣＭ）に分化させ、次いで、ＭＹＢＰＣ３または対照を発現するアデノウイルスで形質導入した。図３Ａ～３Ｂ．ｉＰＳＣ－ＣＭにおけるＡｄ－ＨＡ－Ｍｙｂｐｃ３により媒介されるタンパク質発現の検証。ウェスタンブロッティング（図３Ａ）は、Ａｄ－ＨＡ－Ｍｙｂｐｃ３が、約２．８倍の全長ＭＹＢＰＣ３の過剰発現を誘導することを示した。ＧＡＰＤＨを、内部対照として用いた。対照ｉＰＳＣ－ＣＭと比較したＭＹＢＰＣ３の相対的レベルを、各々のレーンの上の数により示す。ＨＡ抗体を用いてｉＰＳＣ－ＣＭを免疫染色することにより、タンパク質発現をさらに確認した。図３Ａ～３Ｄは、ＣＰＶＴｈｉＰＳＣ－ＣＭにおけるＭＹＢＰＣ３の過剰発現が、Ｃａ^２＋ハンドリングを正常化したことを示す。ヘテロ接合性ＲＹＲ２Ｒ４６５１Ｉ変異に起因するＣＰＶＴを有する患者からのヒトｉＰＳＣを、心筋細胞（ｉＰＳＣ－ＣＭ）に分化させ、次いで、ＭＹＢＰＣ３または対照を発現するアデノウイルスで形質導入した。図３Ｃ．正常またはイソプロテレノール刺激下における、対照またはＡｄ－ｈＭＹＢＰＣ３アデノウイルスで処置されたＣＰＶＴｉＰＳＣ－ＣＭからのＣａ^２＋シグナルの共焦点ラインスキャン画像。図３Ａ～３Ｄは、ＣＰＶＴｈｉＰＳＣ－ＣＭにおけるＭＹＢＰＣ３の過剰発現が、Ｃａ^２＋ハンドリングを正常化したことを示す。ヘテロ接合性ＲＹＲ２Ｒ４６５１Ｉ変異に起因するＣＰＶＴを有する患者からのヒトｉＰＳＣを、心筋細胞（ｉＰＳＣ－ＣＭ）に分化させ、次いで、ＭＹＢＰＣ３または対照を発現するアデノウイルスで形質導入した。図３Ｄ．Ｃａ^２＋放出イベントの頻度、振幅、ＦＷＨＭ（半値全幅）およびＦＤＨＭ（半値全期間：full duration at half maximum）の比較。マン・ホイットニー検定：***、Ｐ＜０．００１。

図４Ａ～４Ｈは、ＦＬ－ＭＹＢＰＣ３の過剰発現が、成体ＣＰＶＴ（ＲＹＲ２Ｒ１７６Ｑ／＋）心筋細胞およびマウスにおいて、Ｃａ^２＋ハンドリングを正常化したことを示す。図４Ａ．ＡＡＶベクターの構造。ＧＦＰは、形質導入された細胞をマークする。図４Ａ～４Ｈは、ＦＬ－ＭＹＢＰＣ３の過剰発現が、成体ＣＰＶＴ（ＲＹＲ２Ｒ１７６Ｑ／＋）心筋細胞およびマウスにおいて、Ｃａ^２＋ハンドリングを正常化したことを示す。図４Ｂ．ＡＡＶ形質導入細胞の心臓切片。図４Ａ～４Ｈは、ＦＬ－ＭＹＢＰＣ３の過剰発現が、成体ＣＰＶＴ（ＲＹＲ２Ｒ１７６Ｑ／＋）心筋細胞およびマウスにおいて、Ｃａ^２＋ハンドリングを正常化したことを示す。図４Ｃ～４Ｄ．ＭＹＢＰＣ３の過剰発現（ＯＥ）を示すウェスタンブロットおよびその定量（図４Ｄ）。図４Ａ～４Ｈは、ＦＬ－ＭＹＢＰＣ３の過剰発現が、成体ＣＰＶＴ（ＲＹＲ２Ｒ１７６Ｑ／＋）心筋細胞およびマウスにおいて、Ｃａ^２＋ハンドリングを正常化したことを示す。図４Ｃ～４Ｄ．ＭＹＢＰＣ３の過剰発現（ＯＥ）を示すウェスタンブロットおよびその定量（図４Ｄ）。図４Ａ～４Ｈは、ＦＬ－ＭＹＢＰＣ３の過剰発現が、成体ＣＰＶＴ（ＲＹＲ２Ｒ１７６Ｑ／＋）心筋細胞およびマウスにおいて、Ｃａ^２＋ハンドリングを正常化したことを示す。図４Ｅ～４Ｆ．単離されたＣＰＶＴ（ＲＹＲ２Ｒ１７６Ｑ／＋）成体心筋細胞における、異常なペーシング後Ｃａ^２＋波の、ＭＹＢＰＣ３過剰発現による抑制。ＷＴまたはＣＰＶＴマウスを、示されたＡＡＶで処置した。成体の心臓から心筋細胞を単離し、Ｃａ^２＋感受性色素をロードした。心筋細胞をペーシングし（太い点線）、次いでペーシングを突然停止した。共焦点ラインスキャニングにより、ペーシング後活性を記録した。代表的なトレースを示す。ＲＹＲ２－Ｒ１７６Ｑ／＋心筋細胞のペーシング後イベント頻度の比較（図４Ｆ）は、これらのイベントが、ＭＹＢＰＣ３処置の後でより低頻度であることを示した。ｔ検定：Ｐ＜０．００１。図４Ａ～４Ｈは、ＦＬ－ＭＹＢＰＣ３の過剰発現が、成体ＣＰＶＴ（ＲＹＲ２Ｒ１７６Ｑ／＋）心筋細胞およびマウスにおいて、Ｃａ^２＋ハンドリングを正常化したことを示す。図４Ｅ－４Ｆ．単離されたＣＰＶＴ（ＲＹＲ２Ｒ１７６Ｑ／＋）成体心筋細胞における、異常なペーシング後Ｃａ^２＋波の、ＭＹＢＰＣ３過剰発現による抑制。ＷＴまたはＣＰＶＴマウスを、示されたＡＡＶで処置した。成体の心臓から心筋細胞を単離し、Ｃａ^２＋感受性色素をロードした。心筋細胞をペーシングし（太い点線）、次いでペーシングを突然停止した。共焦点ラインスキャニングにより、ペーシング後活性を記録した。代表的なトレースを示す。ＲＹＲ２－Ｒ１７６Ｑ／＋心筋細胞のペーシング後イベント頻度の比較（図４Ｆ）は、これらのイベントが、ＭＹＢＰＣ３処置の後でより低頻度であることを示した。ｔ検定：Ｐ＜０．００１。図４Ａ～４Ｈは、ＦＬ－ＭＹＢＰＣ３の過剰発現が、成体ＣＰＶＴ（ＲＹＲ２Ｒ１７６Ｑ／＋）心筋細胞およびマウスにおいて、Ｃａ^２＋ハンドリングを正常化したことを示す。図４Ｇ～４Ｈ．ＭＹＢＰＣ３過剰発現は、ＣＰＶＴマウスにおけるＶＴ脆弱性を軽減した。ＡＡＶ－ＧＦＰ（対照）およびＡＡＶ－ＭＹＢＰＣ３処置されたＣＰＶＴマウスからの代表的なＥＫＧトレースを示す。早期刺激によるペーシング（太い点線）は、ＧＦＰで処置されたマウスにおいてＶＴを開始させた。ＲＹＲ２－Ｒ１７６Ｑ／＋マウスにおいて誘導されたＶＴの頻度は、全長ＭＹＢＰＣ３の過剰発現により減少し（フィッシャー直接検定：Ｐ＝０．００１２；図４Ｈ）、ＷＴマウスと区別できなくなった。数字は、誘導性ＶＴを有するマウスおよび全マウスの数を示す。図４Ａ～４Ｈは、ＦＬ－ＭＹＢＰＣ３の過剰発現が、成体ＣＰＶＴ（ＲＹＲ２Ｒ１７６Ｑ／＋）心筋細胞およびマウスにおいて、Ｃａ^２＋ハンドリングを正常化したことを示す。図４Ｇ～４Ｈ．ＭＹＢＰＣ３過剰発現は、ＣＰＶＴマウスにおけるＶＴ脆弱性を軽減した。ＡＡＶ－ＧＦＰ（対照）およびＡＡＶ－ＭＹＢＰＣ３処置されたＣＰＶＴマウスからの代表的なＥＫＧトレースを示す。早期刺激によるペーシング（太い点線）は、ＧＦＰで処置されたマウスにおいてＶＴを開始させた。ＲＹＲ２－Ｒ１７６Ｑ／＋マウスにおいて誘導されたＶＴの頻度は、全長ＭＹＢＰＣ３の過剰発現により減少し（フィッシャー直接検定：Ｐ＝０．００１２；図４Ｈ）、ＷＴマウスと区別できなくなった。数字は、誘導性ＶＴを有するマウスおよび全マウスの数を示す。

図５Ａ～５Ｅは、ＣＰＶＴマウスにおいてＶＴを抑制することにおけるＭＹＢＰＣ３フラグメントの有効性を示す。図５Ａ～５Ｂは、複数の異なるＭＹＢＰＣ３Ｃ末端フラグメントの、ＣＰＶＴマウスにおいてＶＴを抑制することにおけるそれらの活性についての、in vivoでの試験を示す。新生仔マウスを、示されたタンパク質を発現する５．５×１０^１０ｖｇ／ｇのＡＡＶで処置した。成体マウス（８～１６週齢）を、収縮機能（図５Ａにおいて示されるとおり）およびＶＴ脆弱性（図５Ｂにおいて示されるとおり）について試験した．図５Ａは、ＲＹＲ２Ｒ１７６Ｑ／＋マウスの心臓機能に対するＭＹＢＰＣ３ペプチドの効果を、心エコー図検査により決定されるものとして示す。ほとんどのフラグメントは、心臓機能に対して顕著に影響を及ぼさなかったが、Ｃ６Ｃ９およびＣ６Ｃ７ペプチドは、心臓収縮を低下させた。ダネット事後検定による一方向ＡＮＯＶＡにより、ＧＦＰ対照処置と比較した。調整されたｐ値を示す。バーの中の数字は、群あたりのマウスの数を示す。図５Ａ～５Ｅは、ＣＰＶＴマウスにおいてＶＴを抑制することにおけるＭＹＢＰＣ３フラグメントの有効性を示す。図５Ａ～５Ｂは、複数の異なるＭＹＢＰＣ３Ｃ末端フラグメントの、ＣＰＶＴマウスにおいてＶＴを抑制することにおけるそれらの活性についての、in vivoでの試験を示す。新生仔マウスを、示されたタンパク質を発現する５．５×１０^１０ｖｇ／ｇのＡＡＶで処置した。成体マウス（８～１６週齢）を、収縮機能（図５Ａにおいて示されるとおり）およびＶＴ脆弱性（図５Ｂにおいて示されるとおり）について試験した．図５Ａは、ＲＹＲ２Ｒ１７６Ｑ／＋マウスの心臓機能に対するＭＹＢＰＣ３ペプチドの効果を、心エコー図検査により決定されるものとして示す。ほとんどのフラグメントは、心臓機能に対して顕著に影響を及ぼさなかったが、Ｃ６Ｃ９およびＣ６Ｃ７ペプチドは、心臓収縮を低下させた。ダネット事後検定による一方向ＡＮＯＶＡにより、ＧＦＰ対照処置と比較した。調整されたｐ値を示す。バーの中の数字は、群あたりのマウスの数を示す。図５Ｂは、ＲＹＲ２Ｒ１７６Ｑ／＋マウスのＶＴ脆弱性に対するＭＹＢＰＣ３ペプチドの効果を示す。マウスに、プログラムされたβ－アゴニストなしでの心室刺激と、その後のイソプロテレノールによる刺激、および次いでエピネフリン＋カフェインの、階的なプロトコルを経験させた。ＥＰ研究は、処置群に対して盲検で行った。試料サイズは、バーに伴う数字で示す。フィッシャー直接検定により、ＧＦＰ対照群と比較した統計学的有意性を評価した。名目上ｐ値を、バーの上に示す。ボンフェローニ補正されたｐ値の閾値（０．０５／８＝０．００６５）より高いものを、アスタリスクによりマークする。図５Ａ～５Ｅは、ＣＰＶＴマウスにおいてＶＴを抑制することにおけるＭＹＢＰＣ３フラグメントの有効性を示す。図５Ｃは、ＡＡＶ－ＧＦＰまたはＡＡＶ－Ｃ６Ｃ１０で処置されたＲＹＲ２Ｒ１７６Ｑ／＋マウスの代表的なプログラムされた心室刺激を示す。アスタリスクを付した線は、プログラムされた心室刺激を示す。図５Ａ～５Ｅは、ＣＰＶＴマウスにおいてＶＴを抑制することにおけるＭＹＢＰＣ３フラグメントの有効性を示す。図５Ｄは、Ａｄ－ＬａｃＺ（対照）またはＡｄ－Ｃ６Ｃ１０で処置されたＲＹＲ２Ｓ４０４Ｒ／ＷＴヒトｉＰＳＣ－ＣＭの代表的なＣａ^２＋トレースを示す。矢印は、異常なＣａ^２＋放出イベント（ａＣＲＥ）を強調する。図５Ｅは、ａＣＲＥの頻度の定量を示す。*、Ｐ＜０．０５。

図６は、ＲＹＲ２と相互作用するＭＹＢＰＣ３の最小フラグメントをマッピングするために用いられる二分子蛍光補完アッセイ（bimolecular fluorescence complementation assay：ＢｉＦＣ）の模式図を示す。ＭＹＢＰＣ３フラグメントおよびＲＹＲ２領域は、各々、Venus 蛍光タンパク質の半分に融合する。ＭＹＢＰＣ３とＲＹＲ２とが結合すると、半分ずつが近接し、蛍光シグナルを生じる。

図７は、ＢｉＦＣ実験のための陰性（ＲＹＲ２）対照を示す。ＲＹＲ２およびＳＥＲＣＡ２は、各々、VenusのＮ末端およびＣ末端の半分（それぞれ、ＶＮ１５５およびＶＣ１５５）に融合する。検出可能なVenus蛍光シグナルは存在せず、このことは、ＲＹＲ２－ＳＥＲＣＡ２相互作用の不在と一致する。

図８は、ＢｉＦＣ実験のための陽性（ＰＬＮ）対照を示す。ＰＬＮおよびＳＥＲＣＡ２は、各々、VenusのＮ末端およびＣ末端の半分（それぞれ、ＶＮ１５５およびＶＣ１５５）に融合する。明るいVenus蛍光シグナルが存在し、このことは、既知のＰＬＮ－ＳＥＲＣＡ２相互作用と一致する。

図９Ａ～９Ｆは、ＢｉＦＣを用いてＲＹＲ２への結合について試験されたＭＹＢＰＣ３タンパク質の領域、および試験からの結果を示す。図９Ａは、ＲＹＲ２への結合について試験されたＭＹＢＰＣ３タンパク質の領域を示す。図９Ｂは、ＢｉＦＣ実験の設計を示す。ＭＹＢＰＣ３フラグメントは、VenusのＣ末端フラグメント（ＶＣ１５５）に融合し、ＲＹＲ２は、VenusのＮ末端フラグメント（ＶＮ１５５）に融合する。図９Ａ～９Ｆは、ＢｉＦＣを用いてＲＹＲ２への結合について試験されたＭＹＢＰＣ３タンパク質の領域、および試験からの結果を示す。図９Ｃおよび９Ｄは、ＭＹＢＰＣ３のＣ６－Ｃ８領域がＲＹＲ２との相互作用を促進するという証左を提供する。図９Ａ～９Ｆは、ＢｉＦＣを用いてＲＹＲ２への結合について試験されたＭＹＢＰＣ３タンパク質の領域、および試験からの結果を示す。図９Ｃおよび９Ｄは、ＭＹＢＰＣ３のＣ６－Ｃ８領域がＲＹＲ２との相互作用を促進するという証左を提供する。図９Ａ～９Ｆは、ＢｉＦＣを用いてＲＹＲ２への結合について試験されたＭＹＢＰＣ３タンパク質の領域、および試験からの結果を示す。図９Ｅは、Ｃ６－Ｃ８フラグメントのＣ末端からＮ末端へのタイリング欠失（tiling deletion）により、Ｃ７－Ｃ８がＲＹＲ２と相互作用する主要なドメインであることを示す。図９Ａ～９Ｆは、ＢｉＦＣを用いてＲＹＲ２への結合について試験されたＭＹＢＰＣ３タンパク質の領域、および試験からの結果を示す。図９Ｆは、Ｃ７ドメインまたはＣ８ドメインのいずれかの欠失は、ＲＹＲ２との結合を完全には消失させないことを示し、このことは、Ｃ７－Ｃ８がＲＹＲ２と強力に相互作用することを示している。

図１０は、免疫染色により、ＭＹＢＣＰ３およびＲＹＲ２の相互作用しないフラグメントが強力に発現されることを示し、このことは、低いVenusシグナルについての理由として、発現の技術的失敗を除外する。

図１１は、Ｃ７－Ｃ８フラグメントを含むＭＹＰＢＣ３フラグメントがＲＹＲ２に結合すること、およびＣ７－Ｃ８がＭＹＰＢＣ３とＲＹＲ２との間の相互作用のために決定的な領域であることを示す。

図１２は、試験された異なるＭＹＰＢＣ３フラグメントの要約的な模式図、およびＲＹＲ２に対する結合アフィニティーを示す。

図１３Ａ～１３Ｂは、ヒト（図１３Ａ）およびマウス（図１３Ｂ）において、Ｃ７フラグメントは、ＲＹＲ２結合のために十分であり、ＲＹＲ２と相互作用する優勢なドメインであることを示す。

図１４Ａ～１４Ｅは、in vivoで、ＭＹＢＰＣ３が切断されること、およびＭＹＢＰＣ３の２つのフラグメントがＺ線またはＡ帯に優勢に結合することを示す。図１４Ａは、図１４Ａ～１４Ｅにおいて用いられるＭＹＢＰＣ３コンストラクトを示す。コンストラクトは、Ｃ末端ＭｙｃタグおよびＮ末端ＨＡタグを有するＭＹＢＰＣ３である。図１４Ｂは、同一視野中の異なる心筋細胞が、どのようにして異なる染色パターン、Ｚ線パターンまたはＡ帯パターンを有するかを示す。図１４Ａ～１４Ｅは、in vivoで、ＭＹＢＰＣ３が切断されること、およびＭＹＢＰＣ３の２つのフラグメントがＺ線またはＡ帯に優勢に結合することを示す。図１４Ｃは、Ｃ末端Ｍｙｃタグは、Ｚ線パターンを優勢に有し、一方、Ｎ末端ＨＡタグは、Ａ帯パターンを優勢に有することを示す。図１４Ａ～１４Ｅは、in vivoで、ＭＹＢＰＣ３が切断されること、およびＭＹＢＰＣ３の２つのフラグメントがＺ線またはＡ帯に優勢に結合することを示す。図１４Ａ～１４Ｅは、in vivoで、ＭＹＢＰＣ３が切断されること、およびＭＹＢＰＣ３の２つのフラグメントがＺ線またはＡ帯に優勢に結合することを示す。図１４Ｄ～１４Ｅは、Ｎ末端ＨＡおよびＣ末端Ｍｙｃは、異なる細胞内局在パターンを有することを、電子顕微鏡法により決定されたものとして示す。

図１５は、ＭＹＰＢＣ３の画分が、内部で切断されて、そのＣ末端ドメインを含むより小さなタンパク質を生じることを示唆する。野生型、野生型＋ＨＡ－ＭＹＢＰＣ３－ＭＹＣ、およびＭＹＢＰＣ３ＫＯの心臓からの心筋細胞ライセートを、ＨＡまたはＣ１０（ＭＹＢＰＣ３のＣ末端の大部分のドメインを認識するモノクローナルＡｂ）抗体を用いて探索した。

図１６Ａ～１６Ｂは、Ｃ７－Ｃ８フラグメントが心筋細胞においてＺ線パターンにおいて局在することを示す。図１６Ａ．マウスを、ＡＡＶ－ｃＴｎＴ－ＨＡ－Ｃ７Ｃ８－Ｐ２Ａ－ＧＦＰで処置した。心臓切片を、ＨＡおよびＡＣＴＮ２（Ｚ線マーカー）で染色した。枠で囲んだ領域を、右に拡大する。図１６Ａ～１６Ｂは、Ｃ７－Ｃ８フラグメントが心筋細胞においてＺ線パターンにおいて局在することを示す。図１６Ｂは、Ｃ７－Ｃ８ドメインの結合とサルコメアアルファアクチニン（ＳＡＡまたはＡＣＴＮ２）との間で、存在が相関していることを示す。

図１７は、ＭＹＢＰＣ３Ｃ６－Ｃ１０が、ＣＰＶＴＲＹＲ２－Ｓ４０４Ｒ変異体細胞において、心筋細胞に分化させたヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ－ＣＭｓ）から誘導された異常なＣａ^２＋放出イベントを抑制することを示す。

ある態様の詳細な説明
ＣＰＶＴ（カテコールアミン誘発性多形性心室性頻拍）は、患者が運動の間に致死的な心室性不整脈についてのリスクを有する、悪性の遺伝性不整脈である。ＣＰＶＴは、心筋細胞のＣａ^２＋ハンドリング遺伝子における変異により引き起こされる。症例のうちの６０％を超えるものが、主要な細胞内Ｃａ^２＋放出チャネルをコードする遺伝子ＲＹＲ２（リアノジン受容体２型）における変異により引き起こされる。本発明者らは、内在性心臓タンパク質のＣ末端とＲＹＲ２との間の新規の相互作用を発見した。この相互作用するドメインの過剰発現は、ＣＰＶＴにおける不整脈の根本原因である異常なＲＹＲ２活性を抑制した。この過剰発現戦略は、ヒトｉＰＳＣ由来の心筋細胞においてＣａ^２＋ハンドリングを正常化し、ＣＰＶＴのマウスモデルにおいて不整脈を抑制した。重要なことに、ＲＹＲ２の機能不全は、多様な心不整脈の根底にある最終的な共通の経路である。ＣＰＶＴについての本発明者らの知見は、概念実証として役立つ。本発明者らは、本発明者らの治療概念は、他の遺伝性および後天性不整脈に適用可能である可能性があると考える。

本開示は、いくつかの側面において、異常なＲＹＲ２機能に関連する障害のための、組成物および方法（例えば、遺伝子治療またはタンパク質治療）を提供する。本明細書において、心筋ミオシン結合タンパク質Ｃ（ＭＹＢＰＣ３）のＣ末端ドメインを含むポリペプチド、またはかかるポリペプチドをコードする核酸は、不整脈を処置することにおいて有効であることが示された。いくつかの態様において、本明細書において記載される組成物および方法は、遺伝性または後天性のいずれかである、動脈性の細動を含む、不整脈または心不全を処置するために用いることができる。

したがって、本開示のいくつかの側面は、不整脈を処置する方法を提供する。いくつかの態様において、方法は、必要とする対象に、心筋ミオシン結合タンパク質Ｃ（ＭＹＢＰＣ３）のＣ末端ドメインを含むポリペプチドの有効量を投与することを含む。いくつかの態様において、方法は、必要とする対象に、ＭＹＢＰＣ３のＣ末端ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸の有効量を投与することを含む。

「心筋ミオシン結合タンパク質Ｃ（ＭＹＢＰＣ３）」は、心筋細胞において見出される。これらの細胞において、ＭＹＢＰＣ３は、筋収縮の基本単位であるサルコメアと称される構造に関連することが知られている。サルコメアは、太いフィラメントおよび細いフィラメントから作られている。本明細書において、驚くべきことに、ＭＹＢＰＣ３タンパク質のＣ末端ドメインフラグメントは、ＲＹＲ２タンパク質が局在するサルコメア中のdyadに局在し、一方で、全長ＭＹＢＰＣ３は、サルコメアの異なる部分に局在することが見出された。ヒトＭＹＢＰＣ３タンパク質配列は、GenBankアクセッション番号NP_000247のもとにおいて提供される。マウスＭＹＢＰＣ３タンパク質配列は、GenBankアクセッション番号NP_032679.2のもとにおいて提供される。ＭＹＢＰＣ３のドメイン構造は、Sadayappanら（本明細書において参考として援用されるBiophys Rev. 2012 Jun; 4(2): 93-106）において記載され、また図２Ａにおいて図示される。

いくつかの態様において、本明細書において記載される方法において用いられるポリペプチドは、ＭＹＢＰＣ３のＣ末端ドメイン（例えば、図２Ａにおいて示されるようなＣ７－Ｃ８ドメイン）を含む。いくつかの態様において、本明細書において記載される方法において用いられるポリペプチドは、ＭＹＢＰＣ３のＣ７およびＣ８ドメインを含む。いくつかの態様において、本明細書において記載される方法において用いられるポリペプチドは、ＭＹＢＰＣ３のＣ７およびＣ８ドメインからなる。いくつかの態様において、本明細書において記載される方法において用いられるポリペプチドは、ＭＹＢＰＣ３のＣ７ドメインを含む。いくつかの態様において、本明細書において記載される方法において用いられるポリペプチドは、ＭＹＢＰＣ３のＣ７ドメインからなる。いくつかの態様において、本明細書において記載される方法において用いられるポリペプチドは、ＭＹＢＰＣ３のＣ８ドメインを含む。いくつかの態様において、本明細書において記載される方法において用いられるポリペプチドは、ＭＹＢＰＣ３のＣ８ドメインからなる。いくつかの態様において、本明細書において記載される方法において用いられるポリペプチドは、ＭＹＢＰＣ３のＣ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、およびＣ１０ドメインを含む。いくつかの態様において、本明細書において記載される方法において用いられるポリペプチドは、ＭＹＢＰＣ３のＣ６、Ｃ７、Ｃ８およびＣ９ドメインを含む。いくつかの態様において、本明細書において記載される方法において用いられるポリペプチドは、ＭＹＢＰＣ３のＣ６、Ｃ７、およびＣ８ドメインを含む。いくつかの態様において、本明細書において記載される方法において用いられるポリペプチドは、ＭＹＢＰＣ３のＣ６およびＣ７ドメインを含む。いくつかの態様において、記載される方法において用いられるポリペプチドは、全長ＭＹＢＰＣ３を含む。本明細書において記載される方法において用いることができるポリペプチドのアミノ酸配列またはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の例は、表１において提供される。

いくつかの態様において、本明細書において記載される方法において用いられるポリペプチドは、配列番号１の全長マウスＭＹＢＰＣ３を含むか、配列番号１の全長マウスＭＹＢＰＣ３から本質的になるか、または配列番号１の全長マウスＭＹＢＰＣ３からなる。いくつかの態様において、本明細書において記載される方法において用いられるポリペプチドは、マウスＭＹＢＰＣ３Ｃ６－Ｃ７（配列番号２）を含むか、マウスＭＹＢＰＣ３Ｃ６－Ｃ７（配列番号２）から本質的になるか、またはマウスＭＹＢＰＣ３Ｃ６－Ｃ７（配列番号２）からなる。いくつかの態様において、本明細書において記載される方法において用いられるポリペプチドは、マウスＭＹＢＰＣ３Ｃ６－Ｃ８（配列番号３）を含むか、マウスＭＹＢＰＣ３Ｃ６－Ｃ８（配列番号３）から本質的になるか、またはマウスＭＹＢＰＣ３Ｃ６－Ｃ８（配列番号３）からなる。いくつかの態様において、本明細書において記載される方法において用いられるポリペプチドは、マウスＭＹＢＰＣ３Ｃ６－Ｃ９（配列番号４）を含むか、マウスＭＹＢＰＣ３Ｃ６－Ｃ９（配列番号４）から本質的になるか、またはマウスＭＹＢＰＣ３Ｃ６－Ｃ９（配列番号４）からなる。いくつかの態様において、本明細書において記載される方法において用いられるポリペプチドは、マウスＭＹＢＰＣ３Ｃ６－Ｃ１０（配列番号５）を含むか、マウスＭＹＢＰＣ３Ｃ６－Ｃ１０（配列番号５）から本質的になるか、またはマウスＭＹＢＰＣ３Ｃ６－Ｃ１０（配列番号５）からなる。いくつかの態様において、本明細書において記載される方法において用いられるポリペプチドは、マウスＭＹＢＰＣ３Ｃ８－Ｃ１０（配列番号６）を含むか、マウスＭＹＢＰＣ３Ｃ８－Ｃ１０（配列番号６）から本質的になるか、またはマウスＭＹＢＰＣ３Ｃ８－Ｃ１０（配列番号６）からなる。いくつかの態様において、本明細書において記載される方法において用いられるポリペプチドは、マウスＭＹＢＰＣ３Ｃ９－Ｃ１０（配列番号７）を含むか、マウスＭＹＢＰＣ３Ｃ６－Ｃ７（配列番号７）から本質的になるか、またはマウスＭＹＢＰＣ３Ｃ６－Ｃ７（配列番号７）からなる。いくつかの態様において、本明細書において記載される方法において用いられるポリペプチドは、マウスＭＹＢＰＣ３Ｃ１０（配列番号８）を含むか、マウスＭＹＢＰＣ３Ｃ１０（配列番号８）から本質的になるか、またはマウスＭＹＢＰＣ３Ｃ１０（配列番号８）からなる。いくつかの態様において、本明細書において記載される方法において用いられるポリペプチドは、マウスＭＹＢＰＣ３Ｃ７－Ｃ８（配列番号５９）を含むか、マウスＭＹＢＰＣ３Ｃ７－Ｃ８（配列番号５９）から本質的になるか、またはマウスＭＹＢＰＣ３Ｃ７－Ｃ８（配列番号５９）からなる。いくつかの態様において、本明細書において記載される方法において用いられるポリペプチドは、マウスＭＹＢＰＣ３Ｃ７（配列番号６０）を含むか、マウスＭＹＢＰＣ３Ｃ７（配列番号６０）から本質的になるか、またはマウスＭＹＢＰＣ３Ｃ７（配列番号６０）からなる。いくつかの態様において、本明細書において記載される方法において用いられるポリペプチドは、マウスＭＹＢＰＣ３Ｃ８（配列番号６１）を含むか、マウスＭＹＢＰＣ３Ｃ８（配列番号６１）から本質的になるか、またはマウスＭＹＢＰＣ３Ｃ８（配列番号６１）からなる。いくつかの態様において、本明細書において記載される方法において用いられるポリペプチドは、マウスＭＹＢＰＣ３Ｃ７－Ｃ１０（配列番号６２）を含むか、マウスＭＹＢＰＣ３Ｃ７－Ｃ１０（配列番号６２）から本質的になるか、またはマウスＭＹＢＰＣ３Ｃ７－Ｃ１０（配列番号６２）からなる。いくつかの態様において、本明細書において記載される方法において用いられるポリペプチドは、マウスＭＹＢＰＣ３Ｃ６、Ｃ８－Ｃ１０（配列番号６３）を含むか、マウスＭＹＢＰＣ３Ｃ６、Ｃ８－Ｃ１０（配列番号６３）から本質的になるか、またはマウスＭＹＢＰＣ３Ｃ６、Ｃ８－Ｃ１０（配列番号６３）からなる。いくつかの態様において、本明細書において記載される方法において用いられるポリペプチドは、マウスＭＹＢＰＣ３Ｃ６－Ｃ７、Ｃ９－Ｃ１０（配列番号６４）を含むか、マウスＭＹＢＰＣ３Ｃ６－Ｃ７、Ｃ９－Ｃ１０（配列番号６４）から本質的になるか、またはマウスＭＹＢＰＣ３Ｃ６－Ｃ７、Ｃ９－Ｃ１０（配列番号６４）からなる。

いくつかの態様において、本明細書において記載される方法において用いられるポリペプチドは、配列番号９の全長ヒトＭＹＢＰＣ３を含むか、配列番号９の全長ヒトＭＹＢＰＣ３から本質的になるか、または配列番号９の全長ヒトＭＹＢＰＣ３からなる。いくつかの態様において、本明細書において記載される方法において用いられるポリペプチドは、ヒトＭＹＢＰＣ３Ｃ６－Ｃ７（配列番号１０）を含むか、ヒトＭＹＢＰＣ３Ｃ６－Ｃ７（配列番号１０）から本質的になるか、またはヒトＭＹＢＰＣ３Ｃ６－Ｃ７（配列番号１０）からなる。いくつかの態様において、本明細書において記載される方法において用いられるポリペプチドは、ヒトＭＹＢＰＣ３Ｃ６－Ｃ８（配列番号１１）を含むか、ヒトＭＹＢＰＣ３Ｃ６－Ｃ８（配列番号１１）から本質的になるか、またはヒトＭＹＢＰＣ３Ｃ６－Ｃ８（配列番号１１）からなる。いくつかの態様において、本明細書において記載される方法において用いられるポリペプチドは、ヒトＭＹＢＰＣ３Ｃ６－Ｃ９（配列番号１２）を含むか、ヒトＭＹＢＰＣ３Ｃ６－Ｃ９（配列番号１２）から本質的になるか、またはヒトＭＹＢＰＣ３Ｃ６－Ｃ９（配列番号１２）からなる。いくつかの態様において、本明細書において記載される方法において用いられるポリペプチドは、ヒトＭＹＢＰＣ３Ｃ６－Ｃ１０（配列番号１３）を含むか、ヒトＭＹＢＰＣ３Ｃ６－Ｃ１０（配列番号１３）から本質的になるか、またはヒトＭＹＢＰＣ３Ｃ６－Ｃ１０（配列番号１３）からなる。いくつかの態様において、本明細書において記載される方法において用いられるポリペプチドは、ヒトＭＹＢＰＣ３Ｃ８－Ｃ１０（配列番号１４）を含むか、ヒトＭＹＢＰＣ３Ｃ８－Ｃ１０（配列番号１４）から本質的になるか、またはヒトＭＹＢＰＣ３Ｃ８－Ｃ１０（配列番号１４）からなる。いくつかの態様において、本明細書において記載される方法において用いられるポリペプチドは、ヒトＭＹＢＰＣ３Ｃ９－Ｃ１０（配列番号１５）を含むか、ヒトＭＹＢＰＣ３Ｃ６－Ｃ７（配列番号１５）から本質的になるか、またはヒトＭＹＢＰＣ３Ｃ６－Ｃ７（配列番号１５）からなる。いくつかの態様において、本明細書において記載される方法において用いられるポリペプチドは、ヒトＭＹＢＰＣ３Ｃ１０（配列番号１６）を含むか、ヒトＭＹＢＰＣ３Ｃ１０（配列番号１６）から本質的になるか、またはヒトＭＹＢＰＣ３Ｃ１０（配列番号１６）からなる。いくつかの態様において、本明細書において記載される方法において用いられるポリペプチドは、ヒトＭＹＢＰＣ３Ｃ７－Ｃ８（配列番号５３）を含むか、ヒトＭＹＢＰＣ３Ｃ７－Ｃ８（配列番号５３）から本質的になるか、またはヒトＭＹＢＰＣ３Ｃ７－Ｃ８（配列番号５３）からなる。いくつかの態様において、本明細書において記載される方法において用いられるポリペプチドは、ヒトＭＹＢＰＣ３Ｃ７（配列番号５４）を含むか、ヒトＭＹＢＰＣ３Ｃ７（配列番号５４）から本質的になるか、またはヒトＭＹＢＰＣ３Ｃ７（配列番号５４）からなる。いくつかの態様において、本明細書において記載される方法において用いられるポリペプチドは、ヒトＭＹＢＰＣ３Ｃ８（配列番号５５）を含むか、ヒトＭＹＢＰＣ３Ｃ８（配列番号５５）から本質的になるか、またはヒトＭＹＢＰＣ３Ｃ８（配列番号５５）からなる。いくつかの態様において、本明細書において記載される方法において用いられるポリペプチドは、ヒトＭＹＢＰＣ３Ｃ７－Ｃ１０（配列番号５６）を含むか、ヒトＭＹＢＰＣ３Ｃ７－Ｃ１０（配列番号５６）から本質的になるか、またはヒトＭＹＢＰＣ３Ｃ７－Ｃ１０（配列番号５６）からなる。いくつかの態様において、本明細書において記載される方法において用いられるポリペプチドは、ヒトＭＹＢＰＣ３Ｃ６、Ｃ８－Ｃ１０（配列番号５７）を含むか。ヒトＭＹＢＰＣ３Ｃ６、Ｃ８－Ｃ１０（配列番号５７）から本質的になるか、またはヒトＭＹＢＰＣ３Ｃ６、Ｃ８－Ｃ１０（配列番号５７）からなる。いくつかの態様において、本明細書において記載される方法において用いられるポリペプチドは、ヒトＭＹＰＢＣ３Ｃ６－Ｃ７、Ｃ９－Ｃ１０（配列番号５８）を含むか、ヒトＭＹＢＰＣ３Ｃ６－Ｃ７、Ｃ９－Ｃ１０（配列番号５８）から本質的になるか、またはヒトＭＹＢＰＣ３Ｃ６－Ｃ７、Ｃ９－Ｃ１０（配列番号５８）からなる。いくつかの態様において、本明細書において記載される方法において用いられるポリヌクレオチドは、全長マウスＭＹＢＰＣ３（配列番号１７）を含むか、全長マウスＭＹＢＰＣ３（配列番号１７）から本質的になるか、または全長マウスＭＹＢＰＣ３（配列番号１７）からなる。いくつかの態様において、本明細書において記載される方法において用いられるポリヌクレオチドは、マウスＭＹＢＰＣ３Ｃ６－Ｃ７（配列番号１８）を含むか、マウスＭＹＢＰＣ３Ｃ６－Ｃ７（配列番号１８）から本質的になるか、またはマウスＭＹＢＰＣ３Ｃ６－Ｃ７（配列番号１８）からなる。いくつかの態様において、本明細書において記載される方法において用いられるポリヌクレオチドは、マウスＭＹＢＰＣ３Ｃ６－Ｃ８（配列番号１９）を含むか、マウスＭＹＢＰＣ３Ｃ６－Ｃ８（配列番号１９）から本質的になるか、またはマウスＭＹＢＰＣ３Ｃ６－Ｃ８（配列番号１９）からなる。いくつかの態様において、本明細書において記載される方法において用いられるポリヌクレオチドは、マウスＭＹＢＰＣ３Ｃ６－Ｃ９（配列番号２０）を含むか、マウスＭＹＢＰＣ３Ｃ６－Ｃ９（配列番号２０）から本質的になるか、またはマウスＭＹＢＰＣ３Ｃ６－Ｃ９（配列番号２０）からなる。いくつかの態様において、本明細書において記載される方法において用いられるポリヌクレオチドは、マウスＭＹＢＰＣ３Ｃ６－Ｃ１０（配列番号２１）を含むか、マウスＭＹＢＰＣ３Ｃ６－Ｃ１０（配列番号２１）から本質的になるか、またはマウスＭＹＢＰＣ３Ｃ６－Ｃ１０（配列番号２１）からなる。いくつかの態様において、本明細書において記載される方法において用いられるポリヌクレオチドは、マウスＭＹＢＰＣ３Ｃ８－Ｃ１０（配列番号２２）を含むか、マウスＭＹＢＰＣ３Ｃ８－Ｃ１０（配列番号２２）から本質的になるか、またはマウスＭＹＢＰＣ３Ｃ８－Ｃ１０（配列番号２２）からなる。いくつかの態様において、本明細書において記載される方法において用いられるポリヌクレオチドは、マウスＭＹＢＰＣ３Ｃ９－Ｃ１０（配列番号２３）を含むか、マウスＭＹＢＰＣ３Ｃ６－Ｃ７（配列番号２３）から本質的になるか、またはマウスＭＹＢＰＣ３Ｃ６－Ｃ７（配列番号２３）からなる。いくつかの態様において、本明細書において記載される方法において用いられるポリヌクレオチドは、マウスＭＹＢＰＣ３Ｃ１０（配列番号２４）を含むか、マウスＭＹＢＰＣ３Ｃ１０（配列番号２４）から本質的になるか、またはマウスＭＹＢＰＣ３Ｃ１０（配列番号２４）からなる。いくつかの態様において、本明細書において記載される方法において用いられるポリヌクレオチドは、マウスＭＹＢＰＣ３Ｃ７－Ｃ８（配列番号７１）を含むか、マウスＭＹＢＰＣ３Ｃ７－Ｃ８（配列番号７１）から本質的になるか、またはマウスＭＹＢＰＣ３Ｃ７－Ｃ８（配列番号７１）からなる。いくつかの態様において、本明細書において記載される方法において用いられるポリヌクレオチドは、マウスＭＹＢＰＣ３Ｃ７（配列番号７２）を含むか、マウスＭＹＢＰＣ３Ｃ７（配列番号７２）から本質的になるか、またはマウスＭＹＢＰＣ３Ｃ７（配列番号７２）からなる。いくつかの態様において、本明細書において記載される方法において用いられるポリヌクレオチドは、マウスＭＹＢＰＣ３Ｃ８（配列番号７３）を含むか、マウスＭＹＢＰＣ３Ｃ８（配列番号７３）から本質的になるか、またはマウスＭＹＢＰＣ３Ｃ８（配列番号７３）からなる。いくつかの態様において、本明細書において記載される方法において用いられるポリヌクレオチドは、マウスＭＹＢＰＣ３Ｃ７－Ｃ１０（配列番号７４）を含むか、マウスＭＹＢＰＣ３Ｃ７－Ｃ１０（配列番号７４）から本質的になるか、またはマウスＭＹＢＰＣ３Ｃ７－Ｃ１０（配列番号７４）からなる。いくつかの態様において、本明細書において記載される方法において用いられるポリヌクレオチドは、マウスＭＹＢＰＣ３Ｃ６，Ｃ８－Ｃ１０（配列番号７５）を含むか、マウスＭＹＢＰＣ３Ｃ６，Ｃ８－Ｃ１０（配列番号７５）から本質的になるか、またはマウスＭＹＢＰＣ３Ｃ６，Ｃ８－Ｃ１０（配列番号７５）からなる。いくつかの態様において、本明細書において記載される方法において用いられるポリヌクレオチドは、マウスＭＹＢＰＣ３Ｃ６－Ｃ７，Ｃ９－Ｃ１０（配列番号７６）を含むか、マウスＭＹＢＰＣ３Ｃ６－Ｃ７，Ｃ９－Ｃ１０（配列番号７６）から本質的になるか、またはマウスＭＹＢＰＣ３Ｃ６－Ｃ７，Ｃ９－Ｃ１０（配列番号７６）からなる。

いくつかの態様において、本明細書において記載される方法において用いられるポリヌクレオチドは、全長ヒトＭＹＢＰＣ３（配列番号２５）を含むか、全長ヒトＭＹＢＰＣ３（配列番号２５）から本質的になるか、または全長ヒトＭＹＢＰＣ３（配列番号２５）からなる。いくつかの態様において、本明細書において記載される方法において用いられるポリヌクレオチドは、ヒトＭＹＢＰＣ３Ｃ６－Ｃ７（配列番号２６）を含むか、ヒトＭＹＢＰＣ３Ｃ６－Ｃ７（配列番号２６）から本質的になるか、またはヒトＭＹＢＰＣ３Ｃ６－Ｃ７（配列番号２６）からなる。いくつかの態様において、本明細書において記載される方法において用いられるポリヌクレオチドは、ヒトＭＹＢＰＣ３Ｃ６－Ｃ８（配列番号２７）を含むか、ヒトＭＹＢＰＣ３Ｃ６－Ｃ８（配列番号２７）から本質的になるか、またはヒトＭＹＢＰＣ３Ｃ６－Ｃ８（配列番号２７）からなる。いくつかの態様において、本明細書において記載される方法において用いられるポリヌクレオチドは、ヒトＭＹＢＰＣ３Ｃ６－Ｃ９（配列番号２８）を含むか、ヒトＭＹＢＰＣ３Ｃ６－Ｃ９（配列番号２８）から本質的になるか、またはヒトＭＹＢＰＣ３Ｃ６－Ｃ９（配列番号２８）からなる。いくつかの態様において、本明細書において記載される方法において用いられるポリヌクレオチドは、ヒトＭＹＢＰＣ３Ｃ６－Ｃ１０（配列番号２９）を含むか、ヒトＭＹＢＰＣ３Ｃ６－Ｃ１０（配列番号２９）から本質的になるか、またはヒトＭＹＢＰＣ３Ｃ６－Ｃ１０（配列番号２９）からなる。いくつかの態様において、本明細書において記載される方法において用いられるポリヌクレオチドは、ヒトＭＹＢＰＣ３Ｃ８－Ｃ１０（配列番号３０）を含むか、ヒトＭＹＢＰＣ３Ｃ８－Ｃ１０（配列番号３０）から本質的になるか、またはヒトＭＹＢＰＣ３Ｃ８－Ｃ１０（配列番号３０）からなる。いくつかの態様において、本明細書において記載される方法において用いられるポリヌクレオチドは、ヒトＭＹＢＰＣ３Ｃ９－Ｃ１０（配列番号３１）を含むか、ヒトＭＹＢＰＣ３Ｃ６－Ｃ７（配列番号３１）から本質的になるか、またはヒトＭＹＢＰＣ３Ｃ６－Ｃ７（配列番号３１）からなる。いくつかの態様において、本明細書において記載される方法において用いられるポリヌクレオチドは、ヒトＭＹＢＰＣ３Ｃ１０（配列番号３２）を含むか、ヒトＭＹＢＰＣ３Ｃ１０（配列番号３２）から本質的になるか、またはヒトＭＹＢＰＣ３Ｃ１０（配列番号３２）からなる。いくつかの態様において、本明細書において記載される方法において用いられるポリヌクレオチドは、ヒトＭＹＢＰＣ３Ｃ７－Ｃ８（配列番号６５）を含むか、ヒトＭＹＢＰＣ３Ｃ７－Ｃ８（配列番号６５）から本質的になるか、またはヒトＭＹＢＰＣ３Ｃ７－Ｃ８（配列番号６５）からなる。いくつかの態様において、本明細書において記載される方法において用いられるポリヌクレオチドは、ヒトＭＹＢＰＣ３Ｃ７（配列番号６６）を含むか、ヒトＭＹＢＰＣ３Ｃ７（配列番号６６）から本質的になるか、またはヒトＭＹＢＰＣ３Ｃ７（配列番号６６）からなる。いくつかの態様において、本明細書において記載される方法において用いられるポリヌクレオチドは、ヒトＭＹＢＰＣ３Ｃ８（配列番号６７）を含むか、ヒトＭＹＢＰＣ３Ｃ８（配列番号６７）から本質的になるか、またはヒトＭＹＢＰＣ３Ｃ８（配列番号６７）からなる。いくつかの態様において、本明細書において記載される方法において用いられるポリヌクレオチドは、ヒトＭＹＢＰＣ３Ｃ７－Ｃ１０（配列番号６８）を含むか、ヒトＭＹＢＰＣ３Ｃ７－Ｃ１０（配列番号６８）から本質的になるか、またはヒトＭＹＢＰＣ３Ｃ７－Ｃ１０（配列番号６８）からなる。いくつかの態様において、本明細書において記載される方法において用いられるポリヌクレオチドは、ヒトＭＹＢＰＣ３Ｃ６，Ｃ８－Ｃ１０（配列番号６９）を含むか、ヒトＭＹＢＰＣ３Ｃ６，Ｃ８－Ｃ１０（配列番号６９）から本質的になるか、またはヒトＭＹＢＰＣ３Ｃ６，Ｃ８－Ｃ１０（配列番号６９）からなる。いくつかの態様において、本明細書において記載される方法において用いられるポリヌクレオチドは、ヒトＭＹＰＢＣ３Ｃ６－Ｃ７，Ｃ９－Ｃ１０（配列番号７０）を含むか、ヒトＭＹＢＰＣ３Ｃ６－Ｃ７，Ｃ９－Ｃ１０（配列番号７０）から本質的になるか、またはヒトＭＹＢＰＣ３Ｃ６－Ｃ７，Ｃ９－Ｃ１０（配列番号７０）からなる。

表１．ＭＹＢＰＣ３ポリペプチド

いくつかの態様において、本明細書において記載される方法において用いられるポリペプチドは、配列番号１～１６または５３～６４のうちのいずれか１つに対して、少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％）同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、本明細書において記載される方法において用いられるポリペプチドは、配列番号１～１６または５３～６４のうちのいずれか１つに対して、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、本明細書において記載される方法において用いられるポリペプチドは、配列番号１～１６または５３～６４のアミノ酸配列を含む。

いくつかの態様において、本明細書において記載される方法において用いられる核酸は、ポリペプチド（例えば、本明細書において記載されるＭＹＢＰＣ３のＣ末端ドメインを含むポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、本明細書において記載される方法において用いられる核酸は、配列番号１７～３２または６５～７６のうちのいずれか１つに対して、少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％）同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、本明細書において記載される方法において用いられる核酸は、配列番号１７～３２または６５～７６のうちのいずれか１つに対して、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、本明細書において記載される方法において用いられる核酸は、配列番号１７～３２または６５～７６のヌクレオチド配列を含む。

本明細書において用いられる場合、「核酸」は、例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（β－Ｄ－リボ立体配置を有するＬＮＡ、α－Ｌ－リボ立体配置を有するα－ＬＮＡ（ＬＮＡのジアステレオマー）、２’－アミノ官能化を有する２’－アミノ－ＬＮＡ、および２’－アミノ官能化を有する２’－アミノ－α－ＬＮＡを含むＬＮＡ）、エチレン核酸（ＥＮＡ）、シクロヘキセニル核酸（ＣｅＮＡ）、またはそれらのキメラもしくは組み合わせであっても、またはこれを含んでもよい。本開示の核酸分子は、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。当業者は、別段に記述される場合を除いて、本開示において記載される核酸配列は、代表的なＤＮＡ配列においては「Ｔ」を列記するであろうが、配列がＲＮＡを表す場合には、「Ｔ」は「Ｕ」に置き換えられるであろうことを、理解するであろう。

いくつかの態様において、ポリペプチド（例えば、本明細書において記載されるＭＹＢＰＣ３のＣ末端ドメインを含むポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列は、プロモーターに作動可能に連結されている。

「プロモーター」は、核酸の残りの転写の開始および速度がそこで制御される、核酸の制御領域である。プロモーターはまた、転写因子などの調節性のタンパク質および分子がそこで結合する、部分領域を含んでもよい。本開示のプロモーターは、構成的、誘導性、活性化可能、抑制可能、組織特異的、またはそれらの任意の組み合わせであってよい。プロモーターは、それが制御する核酸の発現を駆動するか、または核酸の転写を駆動する。プロモーターは、それが、それがその核酸転写開始および／または発現を制御するように調節する（「駆動する」）核酸に対して、正確な機能的位置および配向にある場合に、「作動可能に連結されている」とみなされる。いくつかの態様において、プロモーターは、構成的プロモーターである。いくつかの態様において、プロモーターは、誘導性プロモーター（また、調節可能プロモーターとしても言及される）である。

構成的プロモーターの例として、限定することなく、以下が挙げられる：レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（任意にＲＳＶエンハンサーと共に）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（任意にＣＭＶエンハンサーと共に）［例えば、Boshart et al., Cell, 41:521-530 (1985)を参照］、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、β－アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、およびＥＦ１αプロモーター［Invitrogen］。いくつかの態様において、プロモーターは、エンハンストニワトリβ－アクチンプロモーターである。いくつかの態様において、プロモーターは、Ｕ６プロモーターである。いくつかの態様において、本開示において用いられるプロモーターは、ＣＡＧプロモーターである（例えば、本明細書において参考として援用されるOkabe et al., FEBS Lett. 1997 May 5;407(3):313-9；およびAlexopoulou et al., BMC Cell Biology 9: 2, 2008において記載されるような、ＣＭＶエンハンサー、ニワトリベータ－アクチン遺伝子からのプロモーターならびに第１エクソンおよび第１イントロン、ならびにウサギベータ-グロビン遺伝子のスプライスアクセプターを含むもの）。

誘導性プロモーターは、遺伝子発現の調節を可能にし、外因的に供給される化合物、温度などの環境因子、または特定の生理学的状態の存在、例えば、急性期、細胞の特定の分化状態により、または複製中の細胞においてのみ、調節することができる。誘導性プロモーターおよび誘導性の系は、限定することなくInvitrogen、ClontechおよびAriadを含む多様な商業的ソースから入手可能である。多くの他の系が記載されており、当業者により容易に選択することができる。外因的に供給されるプロモーターにより調節される誘導性プロモーターの例として、亜鉛誘導性ヒツジメタロチオネイン（ＭＴ）プロモーター、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）－誘導性マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター系（WO 98/10088）；エクジソン昆虫プロモーター（No et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:3346-3351 (1996)）、テトラサイクリンにより抑制可能な系（Gossen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992)）、テトラサイクリン誘導性の系（Gossen et al., Science, 268:1766-1769 (1995)、またHarvey et al., Curr. Opin. Chem. Biol., 2:512-518 (1998)を参照）、RU486誘導性の系（Wang et al., Nat. Biotech., 15:239-243 (1997)およびWang et al., Gene Ther., 4:432-441 (1997)）ならびにラパマイシン誘導性の系（Magari et al., J. Clin. Invest., 100:2865-2872 (1997)）が挙げられる。この文脈において有用であり得るなお他の型の誘導性プロモーターは、特定の生理学的状態、例えば、温度、急性期、細胞の特定の分化状態により、または複製中の細胞においてのみ、調節されるものである。

いくつかの態様において、オペロンと共にリプレッサーを含む誘導性プロモーターを用いてもよい。一態様において、Escherichia coliからのｌａｃリプレッサーは、ｌａｃオペレーターを保有する哺乳動物細胞プロモーターから転写を調節するための転写修飾因子として機能し得［M. Brown et al., Cell, 49:603-612 (1987)］；Gossen and Bujard (1992)；［M. Gossen et al., Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992)］、テトラサイクリンリプレッサー（ｔｅｔＲ）を、転写アクチベーター（ＶＰ１６）と組み合わせてｔｅｔＲ哺乳動物細胞転写アクチベーター融合タンパク質を作製し、ｔＴａ（ｔｅｔＲ－ＶＰ１６）を、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）主要最初期プロモーターに由来するｔｅｔＯ保有最小プロモーターと組み合わせて、哺乳動物細胞において遺伝子発現を制御するためのｔｅｔＲ－ｔｅｔオペレーター系を作製する。一態様において、テトラサイクリン誘導性スイッチが用いられる（Yao et al., Human Gene Therapy; Gossen et al., Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992)；Shockett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:6522-6526 (1995)）。

いくつかの態様においては、ＭＹＢＰＣ３についてのネイティブのプロモーターが用いられる。ネイティブのプロモーターは、導入遺伝子の発現がネイティブな発現を模倣すべきであることが所望される場合に、好ましい場合がある。導入遺伝子の発現を、時間的にもしくは発生的に、または組織特異的な様式において、または特定の転写刺激に応答して、調節しなくてはならない場合には、ネイティブなプロモーターを用いてもよい。さらなる態様において、エンハンサーエレメント、ポリアデニル化部位またはKozakコンセンサス配列などの他のネイティブな発現制御エレメントもまた、ネイティブな発現を模倣するために用いてよい。

いくつかの態様において、プロモーターは、組織特異的な遺伝子発現能力を付与する調節配列を含む組織特異的プロモーターである。いくつかの場合において、組織特異的な調節配列は、組織特異的な様式において転写を誘導する組織特異的な転写因子に結合する。かかる組織特異的な調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）、当該分野において周知である。例示的な組織特異的な調節配列として、これらに限定されないが、以下の組織特異的なプロモーターが挙げられる：肝臓特異的チロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーター、インスリンプロモーター、グルカゴンプロモーター、ソマトスタチンプロモーター、膵臓ポリペプチド（ＰＰＹ）プロモーター、シナプシン－１（Ｓｙｎ）プロモーター、クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、哺乳動物デスミン（ＤＥＳ）プロモーター、α－ミオシン重鎖（ａ－ＭＨＣ）プロモーター、または心臓トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）プロモーター。他の例示的なプロモーターとして、ベータ－アクチンプロモーター、肝炎Ｂウイルスコアプロモーター（Sandig et al., Gene Ther., 3:1002-9 (1996)）；アルファ－フェトプロテイン（ＡＦＰ）プロモーター（Arbuthnot et al., Hum. Gene Ther., 7:1503-14 (1996)）、骨オステオカルシンプロモーター（Stein et al., Mol. Biol. Rep., 24:185-96 (1997)）；骨シアロタンパク質プロモーター（Chen et al., J. Bone Miner. Res., 11:654-64 (1996)）、ＣＤ２プロモーター（Hansal et al., J. Immunol., 161:1063-8 (1998)）；免疫グロブリン重鎖プロモーター；Ｔ細胞受容体α－鎖プロモーター、神経性のもの、例えば、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター（Andersen et al., Cell. Mol. Neurobiol., 13:503-15 (1993)）、神経フィラメント軽鎖遺伝子プロモーター（Piccioli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:5611-5 (1991)）、およびニューロン特異的ｖｇｆ遺伝子プロモーター（Piccioli et al., Neuron, 15:373-84 (1995)）が挙げられ、その他のものは当業者には明らかであろう。

いくつかの態様において、本明細書において記載される方法において用いられる核酸は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。「メッセンジャーＲＮＡ」（ｍＲＮＡ）とは、（少なくとも１つの）ポリペプチド（天然に存在する、天然に存在しない、または修飾されたアミノ酸のポリマー）をコードし、翻訳されて、コードされたポリペプチドをin vitro、in vivo、in situまたはex vivoで生成することができる、任意のポリヌクレオチドを指す。いくつかの好ましい態様において、ｍＲＮＡは、in vivoで翻訳される。当業者は、別段に記述される場合を除いて、本願において記載されるポリヌクレオチド配列は、代表的なＤＮＡ配列においては「Ｔ」を列記するが、配列がＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）を表す場合には、「Ｔ」は「Ｕ」で置き換えられるであろうことを理解するであろう。したがって、特定の配列アイデンティティー番号により同定されるＤＮＡによりコードされるＲＮＡポリヌクレオチドのうちのいずれかはまた、当該ＤＮＡによりコードされる対応するＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）配列を含んでもよく、ここで、当該ＤＮＡ配列の各々の「Ｔ」は、「Ｕ」で置き換えられる。当業者は、対応するＤＮＡ配列に基づいてｍＲＮＡ配列を同定する方法を理解するであろう。

ｍＲＮＡ分子の基本的な構成成分は、典型的には、少なくとも１つのコード領域、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、３’ＵＴＲ、５’ｃａｐおよびポリＡテイルを含む。本開示のポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡとして機能してもよいが、核酸ベースの治療を用いる効果的なポリペプチド発現の既存の課題を克服するために役立つそれらの機能および／または構造的設計の特徴において、野生型ｍＲＮＡと区別することができる。

いくつかの態様において、本明細書において記載されるｍＲＮＡは、１つ以上の化学修飾を含む（例えば、１つ以上の修飾されたヌクレオチドを含む）。用語「化学修飾」および「化学修飾された」とは、アデノシン（Ａ）、グアノシン（Ｇ）、ウリジン（Ｕ）、チミジン（Ｔ）またはシチジン（Ｃ）リボヌクレオシドまたはデオキシリボヌクレオシドに関して、それらの位置、パターン、パーセントまたは集団のうちの少なくとも１つにおける修飾を指す。一般に、これらの用語は、天然に存在する５’末端ｍＲＮＡｃａｐ部分におけるリボヌクレオチド修飾のことは指さない。

本明細書において記載されるｍＲＮＡは、いくつかの態様において、多様な（１つより多くの）異なる修飾を含む。いくつかの態様において、ｍＲＮＡの特定の領域は、１つ、２つまたはそれより多くの（任意に異なる）ヌクレオシドまたはヌクレオチド修飾を含む。いくつかの態様において、細胞または生物に導入された修飾されたｍＲＮＡは、それぞれ当該細胞または生物において、未修飾のｍＲＮＡと比較して低下した分解を示す。いくつかの態様において、細胞または生物に導入された修飾されたｍＲＮＡは、それぞれ当該細胞または生物において、低下した免疫原性を示す場合がある（例えば、低下した自然免疫応答）。

ポリヌクレオチドの修飾として、限定することなく、本明細書において記載されるものが挙げられる。本開示の修飾されたｍＲＮＡは、天然に存在する、天然に存在しない修飾を含んでもよく、または、ポリヌクレオチドは、天然に存在する修飾と天然に存在しない修飾との組み合わせを含んでもよい。ｍＲＮＡは、例えば糖の、ヌクレオベースの、またはヌクレオシド間の連結の（例えば、連結するリン酸に対しての、ホスホジエステル連結に対しての、またはホスホジエステル骨格に対しての）任意の有用な修飾を含んでもよい。

本明細書において記載されるｍＲＮＡは、いくつかの態様において、所望される機能または特性を達成するためにポリヌクレオチドの合成の間に、または合成後に導入される、非天然の修飾されたヌクレオチドを含む。修飾は、ヌクレオチド間の連結、プリンもしくはピリミジン塩基、または糖の上に存在してもよい。修飾は、化学合成により、またはポリメラーゼ酵素により、鎖の末端に、または鎖のどこかほかの場所に導入することができる。ポリヌクレオチドの領域のうちの任意ものを、化学修飾することができる。

いくつかの態様において、修飾されたｍＲＮＡは、１つ以上の修飾されたヌクレオシドおよびヌクレオチドを含む。「ヌクレオシド」とは、糖分子（例えば、ペントースもしくはリボース）またはその誘導体を、有機塩基（例えば、プリンもしくはピリミジン）またはその誘導体（本明細書においてまた「ヌクレオベース」としても言及される）と組み合わせて含む化合物を指す。「ヌクレオチド」とは、リン酸基を含むヌクレオシドを指す。修飾されたヌクレオチドは、任意の有用な方法により、例えば化学的に、酵素により、または組み換えなどにより、１つ以上の修飾されたまたは非天然のヌクレオシドを含むように合成してもよい。ポリヌクレオチドは、連結されたヌクレオシドの領域を含んでもよい。かかる領域は、可変性の骨格の連結を有していてもよい。連結は、標準的なホスホジエステル連結であってもよく、この場合、ポリヌクレオチドは、ヌクレオチドの領域を含むであろう。

いくつかの態様において、本明細書において記載される修飾されたｍＲＮＡにおける修飾されたヌクレオベースは、シュードウリジン（ψ）、Ｎ１－メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）、Ｎ１－エチルシュードウリジン、２－チオウリジン、４’－チオウリジン、５－メチルシトシン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル－シュードウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオ－ジヒドロシュードウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－シュードウリジン、４－メトキシ－２－チオ－シュードウリジン、４－メトキシ－シュードウリジン、４－チオ－１－メチル－シュードウリジン、４－チオ－シュードウリジン、５－アザ－ウリジン、ジヒドロシュードウリジン、５－メトキシウリジンおよび２’－Ｏ－メチルウリジンからなる群より選択される。

いくつかの態様において、本明細書において記載される方法において用いられる核酸は、ベクター（例えば、クローニングベクターまたは発現ベクター）である。ベクターは、例えば、以下のうちのいくつかまたは全てを含んでもよい：選択可能なマーカー遺伝子、例えば、哺乳動物細胞における安定または一過性の遺伝子導入体の選択のためのネオマイシン遺伝子；高レベルの転写のためのヒトＣＭＶの最初期遺伝子からのエンハンサー／プロモーター配列；ｍＲＮＡ安定性のためのＳＶ４０からの転写終結およびＲＮＡプロセッシングシグナル；適切なエピソーム複製のためのＳＶ４０ポリオーマ複製起点およびＣｏｌＥ１；内部リボソーム結合部位（internal ribosome binding site：ＩＲＥＳ）、多用途なマルチクローニング部位；ならびにin vitroでのセンスおよびアンチセンスＲＮＡの転写のためのＴ７およびＳＰ６ＲＮＡプロモーター。好適なベクターおよび導入遺伝子を含むベクターを生成するための方法は、周知であり、当該分野において利用可能である。

核酸を含む発現ベクターは、従来の技術（例えば、エレクトロポレーション、リポソームトランスフェクション、およびリン酸カルシウム沈殿）により宿主細胞にトランスファーすることができ、遺伝子導入された細胞を、次いで、従来の技術により培養して、本明細書において記載されるポリペプチドを産生させる。いくつかの態様において、本明細書において記載されるポリペプチドの発現は、構成的、誘導性または組織特異的プロモーターにより調節される。

本開示により、多様な宿主－発現ベクター系を利用することができる。かかる宿主－発現系の代表は、本明細書において記載されるヌクレオチド配列を生成することができ、その後精製することができるビヒクルであるが、また、適切なヌクレオチド配列で形質転換されるかまたはこれを遺伝子導入された場合に、ポリペプチド（例えば、本明細書において記載されるＭＹＢＰＣ３のＣ末端ドメインを含むポリペプチド）をin situで発現することができる細胞も、代表的なものである。これらは、これらに限定されないが、ポリペプチド（例えば、本明細書において記載されるＭＹＢＰＣ３のＣ末端ドメインを含むポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列を含む組み換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡもしくはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌などの微生物（例えば、E. coliおよびB. subtilis）；ポリペプチド（例えば、本明細書において記載されるＭＹＢＰＣ３のＣ末端ドメインを含むポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列を含む組み換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えば、Saccharomyces pichia）；ポリペプチド（例えば、本明細書において記載されるＭＹＢＰＣ３のＣ末端ドメインを含むポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列を含む組み換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染させた昆虫細胞系；ポリペプチド（例えば、本明細書において記載されるＭＹＢＰＣ３のＣ末端ドメインを含むポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列を含む組み換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）およびタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）に感染させたか、またはポリペプチド（例えば、本明細書において記載されるＭＹＢＰＣ３のＣ末端ドメインを含むポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列を含む組み換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換した植物細胞系；または、哺乳動物細胞のゲノムから（例えば、メタロチオネインプロモーター）もしくは哺乳動物ウイルスから誘導されたプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含む組み換え発現コンストラクトを保有する哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、２９３Ｔ、３Ｔ３細胞、リンパ管細胞（lymphotic cells）（米国特許第５，８０７，７１５号を参照）、Per C.6細胞（Crucellにより開発されたヒト網膜細胞）を含む。

いくつかの態様において、本開示のベクターは、ウイルスベクターである。いくつかの態様において、ウイルスベクターは、ポリペプチド（例えば、本明細書において記載されるＭＹＢＰＣ３のＣ末端ドメインを含むポリペプチド）の哺乳動物発現のために好適である。好適なウイルスベクターとして、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、または組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターが挙げられる。

「レンチウイルスベクター」とは、レンチウイルスゲノム（例えばＨＩＶ）から誘導されたベクターを指す。レンチウイルスベクターは、例えば、有益な遺伝子を宿主細胞または生物中に挿入するために、または宿主細胞または生物における遺伝子を削除または修飾するために、遺伝子治療において一般的に用いられてきた。レンチウイルスベクターは、非分裂中および分裂中の細胞において目的の遺伝子を安定に発現するそれらの能力に起因して、哺乳動物細胞における遺伝子導入のための有効なビヒクルである。

「レトロウイルスベクター」とは、レトロウイルスゲノムから誘導されたベクターを指す。レトロウイルスベクターは、目的の遺伝子を収容して標的細胞中への両方の組み込みを可能にすることができるプロウイルス配列からなる。ベクターはまた、標的細胞における目的の遺伝子の発現を増強するために、ＣＭＶプロモーターなどのウイルスおよび細胞の遺伝子プロモーターを含む。レトロウイルスベクターもまた、遺伝子治療において一般的に用いられてきた。

「組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター」は、典型的には、最小限、導入遺伝子およびその調節配列（例えばプロモーター）、および５’および３’ＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）を含んでなる。導入遺伝子は、本明細書においてどこか他の場所で開示されるように、例えば、本開示においてどこか他の場所で記載されるようなＭＹＢＰＣ３のＣ末端ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでもよい。

一般的に、ＩＴＲ配列は、約１４５ｂｐの長さである。好ましくは、実質的にＩＴＲをコードする配列全体が、分子中で用いられるが、これらの配列のある程度のマイナーな修飾が許容可能である。これらのITR配列を修飾する能力は、当該分野における技術の範囲内である（例えば、Sambrookら、「Molecular Cloning. A Laboratory Manual」、第２版、Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989)；およびK. Fisher et al., J Virol., 70:520 532 (1996)などの教科書を参照）。本発明において使用されるかかる分子の一例は、導入遺伝子を含む「シス-作動性」プラスミドであり、ここで、選択された導入遺伝子配列および関連する調節性エレメントは、５’および３’ＡＡＶＩＴＲ配列に隣接する。ＡＡＶＩＴＲ配列は、現在同定されている哺乳動物ＡＡＶ型を含む任意の既知のＡＡＶから得ることができる。いくつかの態様において、本明細書において記載されるｒＡＡＶベクターは、ポリペプチド（例えば、本明細書において記載されるＭＹＢＰＣ３のＣ末端ドメインを含むポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列に隣接する２つのＩＴＲを含む（隣接する配列の各々の末端において１つのＩＴＲ）。いくつかの態様において、ポリペプチド（例えば、本明細書において記載されるＭＹＢＰＣ３のＣ末端ドメインを含むポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列は、プロモーターに作動可能に連結されており、本明細書において記載されるｒＡＡＶベクターは、ポリペプチド（例えば、本明細書において記載されるＭＹＢＰＣ３のＣ末端ドメインを含むポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列およびプロモーターに隣接する２つのＩＴＲを含む（隣接する配列の各々の末端において１つのＩＴＲ）。

いくつかの態様において、ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ２ｉ８、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３９、ＡＡＶｒｈ４３、ＡＡＶ２／２－６６、ＡＡＶ２／２－８４、ＡＡＶ２／２－１２５、およびこれらのバリアントから選択される血清型のものである。いくつかの態様において、ｒＡＡＶベクターは、血清型ＡＡＶ２のＩＴＲを含む。いくつかの態様において、本明細書において記載されるｒＡＡＶベクターにおいて用いられるＩＴＲは：
CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTTGTAGTTAATGATTAACCCGCCATGCTACTTATCTACG（配列番号３３）
のヌクレオチド配列を含む。

いくつかの態様において、本開示のｒＡＡＶベクターは、自己相補的ＡＡＶベクター（ｓｃＡＡＶ）である。「自己相補的ＡＡＶベクター」（ｓｃＡＡＶ）とは、ＡＡＶのＩＴＲのうちの１つからの末端分離部位（terminal resolution site：ＴＲ）の不在下において作製された二本鎖ベクターゲノムを含むベクターを指す（例えば、本明細書において参考として援用されるMcCarthy (2008) Molecular Therapy 16(10):1648-1656において記載されるように）。ＴＲの不在は、ベクターのＴＲが存在しない末端における複製の開始を防止する。一般的に、ｓｃＡＡＶベクターは、一本鎖の、野生型（ｗｔ）ＡＡＶＴＲを両端に、および変異したＴＲ（ｍＴＲ）を中央に有する逆方向反復ゲノムを生じる。本発明は、部分的に、ＲＮＡヘアピン構造（例えばｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびＡｍｉＲＮＡ）をコードするＤＮＡフラグメントが、ウイルスゲノム複製の間に、変異した逆方向末端反復（ｍＴＲ）と類似の機能を果たし、自己相補的ＡＡＶベクターゲノムを生じ得るという認識に基づく。いくつかの態様において、本明細書において記載されるｓｃＡＡＶベクターにおいて用いられるＩＴＲは：
CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGG（配列番号３４）
のヌクレオチド配列を含む。

本明細書においてさらに提供されるのは、いくつかの側面において、キャプシドタンパク質および本明細書において記載される核酸分子のうちのいずれか１つを含む、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）である。いくつかの態様において、「キャプシドタンパク質」とは、ＡＡＶのＣＡＰ遺伝子によりコードされる構造タンパク質を指す。ＡＡＶは、３つのキャプシドタンパク質、ビリオンタンパク質１～３（ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３と命名される）を含み、これらの全てが、選択的スプライシングを介して単一のｃａｐ遺伝子から転写される。いくつかの態様において、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の分子量は、それぞれ、約８７ｋＤａ、約７２ｋＤａおよび約６２ｋＤａである。いくつかの態様において、翻訳後に、キャプシドタンパク質は、ウイルスゲノムの周囲に球状の６０マーのタンパク質のシェルを形成する。いくつかの態様において、キャプシドタンパク質の機能は、ウイルスゲノムを保護し、ゲノムを送達し、宿主と相互作用することである。

いくつかの態様において、ＡＡＶキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ２ｉ８、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３９、ＡＡＶｒｈ４３、ＡＡＶ２／２－６６、ＡＡＶ２／２－８４、ＡＡＶ２／２－１２５からなる群より選択されるＡＡＶ血清型のものである。いくつかの態様において、ＡＡＶキャプシドタンパク質は、非ヒト霊長類に由来する血清型、例えばｓｃＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ３９、またはＡＡＶ．ｒｈ４３血清型のものである。いくつかの態様において、ＡＡＶキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ９血清型のものである。いくつかの態様において、ＡＡＶキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２ｉ８血清型のものである。キャプシドタンパク質のアミノ酸配列の非限定的な例は、配列番号３５～５２として提供される。

配列番号３５：ＡＡＶ－キャプシド１
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDDGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEGAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSSGIGKTGQQPAKKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPATPAAVGPTTMASGGGAPMADNNEGADGVGNASGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSASTGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTTNDGVTTIANNLTSTVQVFSDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEEVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLNRTQNQSGSAQNKDLLFSRGSPAGMSVQPKNWLPGPCYRQQRVSKTKTDNNNSNFTWTGASKYNLNGRESIINPGTAMASHKDDEDKFFPMSGVMIFGKESAGASNTALDNVMITDEEEIKATNPVATERFGTVAVNFQSSSTDPATGDVHAMGALPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKNPPPQILIKNTPVPANPPAEFSATKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEVQYTSNYAKSANVDFTVDNNGLYTEPRPIGTRYLTRPL

配列番号３６：ＡＡＶ－キャプシド２
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNRQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL

配列番号３７：ＡＡＶ－キャプシド３Ｂ
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGVPQPKANQQHQDNRRGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRILEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVDQSPQEPDSSSGVGKSGKQPARKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPAAPTSLGSNTMASGGGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKKLSFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLNRTQGTTSGTTNQSRLLFSQAGPQSMSLQARNWLPGPCYRQQRLSKTANDNNNSNFPWTAASKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPMHGNLIFGKEGTTASNAELDNVMITDEEEIRTTNPVATEQYGTVANNLQSSNTAPTTRTVNDQGALPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQIMIKNTPVPANPPTTFSPAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL

配列番号３８：ＡＡＶ－キャプシド４
MTDGYLPDWLEDNLSEGVREWWALQPGAPKPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQQRLQGDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEQAGETAPGKKRPLIESPQQPDSSTGIGKKGKQPAKKKLVFEDETGAGDGPPEGSTSGAMSDDSEMRAAAGGAAVEGGQGADGVGNASGDWHCDSTWSEGHVTTTSTRTWVLPTYNNHLYKRLGESLQSNTYNGFSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGMRPKAMRVKIFNIQVKEVTTSNGETTVANNLTSTVQIFADSSYELPYVMDAGQEGSLPPFPNDVFMVPQYGYCGLVTGNTSQQQTDRNAFYCLEYFPSQMLRTGNNFEITYSFEKVPFHSMYAHSQSLDRLMNPLIDQYLWGLQSTTTGTTLNAGTATTNFTKLRPTNFSNFKKNWLPGPSIKQQGFSKTANQNYKIPATGSDSLIKYETHSTLDGRWSALTPGPPMATAGPADSKFSNSQLIFAGPKQNGNTATVPGTLIFTSEEELAATNATDTDMWGNLPGGDQSNSNLPTVDRLTALGAVPGMVWQNRDIYYQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLIGGFGLKHPPPQIFIKNTPVPANPATTFSSTPVNSFITQYSTGQVSVQIDWEIQKERSKRWNPEVQFTSNYGQQNSLLWAPDAAGKYTEPRAIGTRYLTHHL

配列番号３９：ＡＡＶ－キャプシド５
MSFVDHPPDWLEEVGEGLREFLGLEAGPPKPKPNQQHQDQARGLVLPGYNYLGPGNGLDRGEPVNRADEVAREHDISYNEQLEAGDNPYLKYNHADAEFQEKLADDTSFGGNLGKAVFQAKKRVLEPFGLVEEGAKTAPTGKRIDDHFPKRKKARTEEDSKPSTSSDAEAGPSGSQQLQIPAQPASSLGADTMSAGGGGPLGDNNQGADGVGNASGDWHCDSTWMGDRVVTKSTRTWVLPSYNNHQYREIKSGSVDGSNANAYFGYSTPWGYFDFNRFHSHWSPRDWQRLINNYWGFRPRSLRVKIFNIQVKEVTVQDSTTTIANNLTSTVQVFTDDDYQLPYVVGNGTEGCLPAFPPQVFTLPQYGYATLNRDNTENPTERSSFFCLEYFPSKMLRTGNNFEFTYNFEEVPFHSSFAPSQNLFKLANPLVDQYLYRFVSTNNTGGVQFNKNLAGRYANTYKNWFPGPMGRTQGWNLGSGVNRASVSAFATTNRMELEGASYQVPPQPNGMTNNLQGSNTYALENTMIFNSQPANPGTTATYLEGNMLITSESETQPVNRVAYNVGGQMATNNQSSTTAPATGTYNLQEIVPGSVWMERDVYLQGPIWAKIPETGAHFHPSPAMGGFGLKHPPPMMLIKNTPVPGNITSFSDVPVSSFITQYSTGQVTVEMEWELKKENSKRWNPEIQYTNNYNDPQFVDFAPDSTGEYRTTRPIGTRYLTRPL

配列番号４０：ＡＡＶ－キャプシド６
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDDGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPFGLVEEGAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSSGIGKTGQQPAKKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPATPAAVGPTTMASGGGAPMADNNEGADGVGNASGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSASTGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTTNDGVTTIANNLTSTVQVFSDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLNRTQNQSGSAQNKDLLFSRGSPAGMSVQPKNWLPGPCYRQQRVSKTKTDNNNSNFTWTGASKYNLNGRESIINPGTAMASHKDDKDKFFPMSGVMIFGKESAGASNTALDNVMITDEEEIKATNPVATERFGTVAVNLQSSSTDPATGDVHVMGALPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPPAEFSATKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEVQYTSNYAKSANVDFTVDNNGLYTEPRPIGTRYLTRPL

配列番号４１：ＡＡＶ－キャプシド６．２
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDDGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEGAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSSGIGKTGQQPAKKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPATPAAVGPTTMASGGGAPMADNNEGADGVGNASGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSASTGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTTNDGVTTIANNLTSTVQVFSDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLNRTQNQSGSAQNKDLLFSRGSPAGMSVQPKNWLPGPCYRQQRVSKTKTDNNNSNFTWTGASKYNLNGRESIINPGTAMASHKDDKDKFFPMSGVMIFGKESAGASNTALDNVMITDEEEIKATNPVATERFGTVAVNLQSSSTDPATGDVHVMGALPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPPAEFSATKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEVQYTSNYAKSANVDFTVDNNGLYTEPRPIGTRYLTRPL

配列番号４２：ＡＡＶ－キャプシド７
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDNGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEGAKTAPAKKRPVEPSPQRSPDSSTGIGKKGQQPARKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPAAPSSVGSGTVAAGGGAPMADNNEGADGVGNASGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSETAGSTNDNTYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKKLRFKLFNIQVKEVTTNDGVTTIANNLTSTIQVFSDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQSVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFEFSYSFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLARTQSNPGGTAGNRELQFYQGGPSTMAEQAKNWLPGPCFRQQRVSKTLDQNNNSNFAWTGATKYHLNGRNSLVNPGVAMATHKDDEDRFFPSSGVLIFGKTGATNKTTLENVLMTNEEEIRPTNPVATEEYGIVSSNLQAANTAAQTQVVNNQGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPPEVFTPAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNFEKQTGVDFAVDSQGVYSEPRPIGTRYLTRNL

配列番号４３：ＡＡＶ－キャプシド８
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPKPKANQQKQDDGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLQAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEGAKTAPGKKRPVEPSPQRSPDSSTGIGKKGQQPARKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPAAPSGVGPNTMAAGGGAPMADNNEGADGVGSSSGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNGTSGGATNDNTYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLSFKLFNIQVKEVTQNEGTKTIANNLTSTIQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFTYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTQTTGGTANTQTLGFSQGGPNTMANQAKNWLPGPCYRQQRVSTTTGQNNNSNFAWTAGTKYHLNGRNSLANPGIAMATHKDDEERFFPSNGILIFGKQNAARDNADYSDVMLTSEEEIKTTNPVATEEYGIVADNLQQQNTAPQIGTVNSQGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPADPPTTFNQSKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSTSVDFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL

配列番号４４：ＡＡＶ－キャプシド９
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPQPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSAGIGKSGAQPAKKRLNFGQTGDTESVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTMASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYEFENVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSKTINGSGQNQQTLKFSVAGPSNMAVQGRNYIPGPSYRQQRVSTTVTQNNNSEFAWPGASSWALNGRNSLMNPGPAMASHKEGEDRFFPLSGSLIFGKQGTGRDNVDADKVMITNEEEIKTTNPVATESYGQVATNHQSAQAQAQTGWVQNQGILPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGMKHPPPQILIKNTPVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL

配列番号４５：ＡＡＶ－キャプシドｒｈ８
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDDGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEGAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSSGIGKTGQQPAKKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPAAPSGLGPNTMASGGGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNGTSGGSTNDNTYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTTNEGTKTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQALGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLVRTQTTGTGGTQTLAFSQAGPSSMANQARNWVPGPCYRQQRVSTTTNQNNNSNFAWTGAAKFKLNGRDSLMNPGVAMASHKDDDDRFFPSSGVLIFGKQGAGNDGVDYSQVLITDEEEIKATNPVATEEYGAVAINNQAANTQAQTGLVHNQGVIPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPADPPLTFNQAKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSTNVDFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL

配列番号４６：ＡＡＶ－キャプシドｒｈ１０
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDDGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEGAKTAPGKKRPVEPSPQRSPDSSTGIGKKGQQPAKKRLNFGQTGDSESVPDPQPIGEPPAGPSGLGSGTMAAGGGAPMADNNEGADGVGSSSGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNGTSGGSTNDNTYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNEGTKTIANNLTSTIQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFEFSYQFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTQSTGGTAGTQQLLFSQAGPNNMSAQAKNWLPGPCYRQQRVSTTLSQNNNSNFAWTGATKYHLNGRDSLVNPGVAMATHKDDEERFFPSSGVLMFGKQGAGKDNVDYSSVMLTSEEEIKTTNPVATEQYGVVADNLQQQNAAPIVGAVNSQGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPADPPTTFSQAKLASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSTNVDFAVNTDGTYSEPRPIGTRYLTRNL

配列番号４７：ＡＡＶ－キャプシドｒｈ３９
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPKPKANQQKQDDGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVEPSPQRSPDSSTGIGKKGQQPAKKRLNFGQTGDSESVPDPQPIGEPPAGPSGLGSGTMAAGGGAPMADNNEGADGVGSSSGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNGTSGGSTNDNTYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLSFKLFNIQVKEVTQNEGTKTIANNLTSTIQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFEFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTQSTGGTQGTQQLLFSQAGPANMSAQAKNWLPGPCYRQQRVSTTLSQNNNSNFAWTGATKYHLNGRDSLVNPGVAMATHKDDEERFFPSSGVLMFGKQGAGRDNVDYSSVMLTSEEEIKTTNPVATEQYGVVADNLQQTNTGPIVGNVNSQGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPADPPTTFSQAKLASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSTNVDFAVNTEGTYSEPRPIGTRYLTRNL

配列番号４８：ＡＡＶ－キャプシドｒｈ４３
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDDGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLEAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEGAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSSGIGKKGQQPARKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPAAPSGVGPNTMAAGGGAPMADNNEGADGVGSSSGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNGTSGGATNDNTYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLSFKLFNIQVKEVTQNEGTKTIANNLTSTIQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFTYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTQTTGGTANTQTLGFSQGGPNTMANQAKNWLPGPCYRQQRVSTTTGQNNNSNFAWTAGTKYHLNGRNSLANPGIAMATHKDDEERFFPSNGILIFGKQNAARDNADYSDVMLTSEEEIKTTNPVATEEYGIVADNLQQQNTAPQIGTVNSQGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPADPPTTFNQSKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSTSVDFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL

配列番号４９：ＡＡＶ－キャプシド２／２－６６
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHQDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPAEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSKTNAPSGTTTMSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTAADNNNSDYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKYFPQSGVLIFGKQDSGKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQSGNTQAATTDVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL

配列番号５０：ＡＡＶ－キャプシド２／２－８４
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHQDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPAEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSKTNAPSGTTTMSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTAADNNNSDYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKYFPQSGVLIFGKQDSGKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQSGNTQAATTDVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKLASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL

配列番号５１：ＡＡＶ－キャプシド２／２－１２５
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLARAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPAEPDSSSGTGKSGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMASGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQTVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLRFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTAADNNNSDYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGTAMASHKDDEEKYFPQSGVLIFGKQDSGKTNVDIERVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQSGNTQAATSDVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL

配列番号５２：ＡＡＶ－キャプシド２ｉ８（ＡＡＶ２－キャプシドのＲＧＮＲＱＡ（アミノ酸５８５－５９０）のＱＱＮＴＡＰによる置換）
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQQQNTAPATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL

配列番号７７：ＡＡＶ－ｃＴｎＴ－ＨＡ－ｈＣ７Ｃ８－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ
CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTTGTAGTTAATGATTAACCCGCCATGCTACTTATCTACCAGGGTAATGGGGATCCTCTAGAACTATAGCTAGAATTCGCCCTTACGGGCCCCCCCTCGAGGTCGGGATAAAAGCAGTCTGGGCTTTCACATGACAGCATCTGGGGCTGCGGCAGAGGGTCGGGTCCGAAGCGCTGCCTTATCAGCGTCCCCAGCCCTGGGAGGTGACAGCTGGCTGGCTTGTGTCAGCCCCTCGGGCACTCACGTATCTCCGTCCGACGGGTTTAAAATAGCAAAACTCTGAGGCCACACAATAGCTTGGGCTTATATGGGCTCCTGTGGGGGAAGGGGGAGCACGGAGGGGGCCGGGGCCGCTGCTGCCAAAATAGCAGCTCACAAGTGTTGCATTCCTCTCTGGGCGCCGGGCACATTCCTGCTGGCTCTGCCCGCCCCGGGGTGGGCGCCGGGGGGACCTTAAAGCCTCTGCCCCCCAAGGAGCCCTTCCCAGACAGCCGCCGGCACCCACCGCTCCGTGGGACGATCCCCGAAGCTCTAGAGCTTTATTGCGGTAGTTTATCACAGTTAAATTGCTAACGCAGTCAGTGCTTCTGACACAACAGTCTCGAACTTAAGCTGCAGAAGTTGGTCGTGAGGCACTGGGCAGGTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCTGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGTGTCCACTCCCAGTTCAATTACAGCTCTTAAGGCTAGAGTACTTAATACGACTCACTATAGGCTAGCCTCGAGAAGcggccgcactactccgcggactactactagtATGGCCGTTTACCCATACGATGTTCCTGACTATGCGGGCTATCCCTATGACGTCCCGGACTATGCAGGATCCTATCCATATGACGTTCCAGATTACGCTaccggtCCCCCCAGCGAACCCACCCACCTGGCAGTAGAGGACGTCTCTGACACCACGGTCTCCCTCAAGTGGCGGCCCCCAGAGCGCGTGGGAGCAGGAGGCCTGGATGGCTACAGCGTGGAGTACTGCCCAGAGGGCTGCTCAGAGTGGGTGGCTGCCCTGCAGGGGCTGACAGAGCACACATCGATACTGGTGAAGGACCTGCCCACGGGGGCCCGGCTGCTTTTCCGAGTGCGGGCACACAATATGGCAGGGCCTGGAGCCCCTGTTACCACCACGGAGCCGGTGACAGTGCAGGAGATCCTGCAACGGCCACGGCTTCAGCTGCCCAGGCACCTGCGCCAGACCATTCAGAAGAAGGTCGGGGAGCCTGTGAACCTTCTCATCCCTTTCCAGGGCAAGCCCCGGCCTCAGGTGACCTGGACCAAAGAGGGGCAGCCCCTGGCAGGCGAGGAGGTGAGCATCCGCAACAGCCCCACAGACACCATCCTGTTCATCCGGGCCGCTCGCCGCGTGCATTCAGGCACTTACCAGGTGACGGTGCGCATTGAGAACATGGAGGACAAGGCCACGCTGGTGCTGCAGGTTGTTGACAAGCCAAGTCCTaagcttGGAcaattgGGAgagctcGGATCCGGAGCCACGAACTTCTCTCTGTTAAAGCAAGCAGGAGACGTGGAAGAAAACCCCGGTCCTGCCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAATAAGCTCGCGTGGTACCTCTAGAGTCGACCCGGGCGGCCTCGAGGACGGGGTGAACTACGCCTGAGGATCCGATCTTTTTCCCTCTGCCAAAAATTATGGGGACATCATGAAGCCCCTTGAGCATCTGACTTCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTTGGAATTTTTTGTGTCTCTCACTCGGAAGCAATTCGTTGATCTGAATTTCGACCACCCATAATACCCATTACCCTGGTAGATAAGTAGCATGGCGGGTTAATCATTAACTACAAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCCTTAATTAACCTAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGCTTACAATTTAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAGATTTAATTAAGGCCTTAATTAGG

配列番号７８：ＡＡＶ－ｃＴｎＴ－ＨＡ－ｍＣ７Ｃ８－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ
CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTTGTAGTTAATGATTAACCCGCCATGCTACTTATCTACCAGGGTAATGGGGATCCTCTAGAACTATAGCTAGAATTCGCCCTTACGGGCCCCCCCTCGAGGTCGGGATAAAAGCAGTCTGGGCTTTCACATGACAGCATCTGGGGCTGCGGCAGAGGGTCGGGTCCGAAGCGCTGCCTTATCAGCGTCCCCAGCCCTGGGAGGTGACAGCTGGCTGGCTTGTGTCAGCCCCTCGGGCACTCACGTATCTCCGTCCGACGGGTTTAAAATAGCAAAACTCTGAGGCCACACAATAGCTTGGGCTTATATGGGCTCCTGTGGGGGAAGGGGGAGCACGGAGGGGGCCGGGGCCGCTGCTGCCAAAATAGCAGCTCACAAGTGTTGCATTCCTCTCTGGGCGCCGGGCACATTCCTGCTGGCTCTGCCCGCCCCGGGGTGGGCGCCGGGGGGACCTTAAAGCCTCTGCCCCCCAAGGAGCCCTTCCCAGACAGCCGCCGGCACCCACCGCTCCGTGGGACGATCCCCGAAGCTCTAGAGCTTTATTGCGGTAGTTTATCACAGTTAAATTGCTAACGCAGTCAGTGCTTCTGACACAACAGTCTCGAACTTAAGCTGCAGAAGTTGGTCGTGAGGCACTGGGCAGGTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCTGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGTGTCCACTCCCAGTTCAATTACAGCTCTTAAGGCTAGAGTACTTAATACGACTCACTATAGGCTAGCCTCGAGAAGcggccgcactactccgcggactactactagtATGGCCGTTTACCCATACGATGTTCCTGACTATGCGGGCTATCCCTATGACGTCCCGGACTATGCAGGATCCTATCCATATGACGTTCCAGATTACGCTaccggtTTCATGCCTATTGGGCCCCCTGGCGAACCAACCCACTTGGCTGTGGAGGATGTGTCAGACACCACTGTCTCACTCAAGTGGCGGCCCCCAGAGCGCGTGGGGGCCGGTGGCCTGGACGGATACAGCGTGGAGTACTGCCAGGAGGGATGCTCCGAGTGGACACCTGCTCTGCAGGGGCTGACAGAGCGCACATCGATGCTGGTGAAGGACCTACCCACTGGGGCACGGCTGCTGTTCCGAGTACGGGCACACAATGTGGCAGGTCCTGGAGGCCCTATCGTCACCAAGGAGCCTGTGACAGTGCAGGAGATACTGCAACGACCACGGCTCCAACTGCCCAGACACCTGCGCCAGACCATCCAGAAGAAAGTTGGGGAGCCTGTGAACCTCCTCATCCCTTTCCAGGGCAAACCCCGGCCTCAGGTGACCTGGACCAAAGAGGGGCAGCCCCTGGCAGGTGAGGAGGTGAGCATCCGGAACAGCCCCACAGACACGATCTTGTTCATCCGAGCTGCCCGCCGCACCCACTCGGGCACCTACCAGGTGACAGTTCGCATTGAGAACATGGAGGACAAGGCAACGaagcttGGAcaattgGGAgagctcGGATCCGGAGCCACGAACTTCTCTCTGTTAAAGCAAGCAGGAGACGTGGAAGAAAACCCCGGTCCTGCCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAATAAGCTCGCGTGGTACCTCTAGAGTCGACCCGGGCGGCCTCGAGGACGGGGTGAACTACGCCTGAGGATCCGATCTTTTTCCCTCTGCCAAAAATTATGGGGACATCATGAAGCCCCTTGAGCATCTGACTTCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTTGGAATTTTTTGTGTCTCTCACTCGGAAGCAATTCGTTGATCTGAATTTCGACCACCCATAATACCCATTACCCTGGTAGATAAGTAGCATGGCGGGTTAATCATTAACTACAAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCCTTAATTAACCTAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGCTTACAATTTAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTC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所望されるキャプシドタンパク質を有する組み換えＡＡＶを得るための方法は、当該分野において周知である（例えば、ＵＳ２００３／０１３８７７２を参照；その内容は、その全体において本明細書において参考として援用される）。典型的には、方法は、ＡＡＶキャプシドタンパク質をコードする核酸配列；機能的なｒｅｐ遺伝子；ＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲｓ）および導入遺伝子を含んでなる組み換えＡＡＶベクター；ならびに組み換えＡＡＶベクターのＡＡＶキャプシドタンパク質中へのパッケージングを可能にするために十分なヘルパー機能を含む、宿主細胞を培養することを含む。

ｒＡＡＶベクターをＡＡＶキャプシド中にパッケージングするために宿主細胞において培養されるべき構成成分は、宿主細胞にトランスで（in trans）提供されてもよい。あるいは、必要とされる構成成分（例えば、組み換えＡＡＶベクター、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列、および／またはヘルパー機能）のうちのいずれか１つ以上は、当業者に公知の方法を用いて必要とされる構成成分のうちの１つ以上を含むように操作された安定な宿主細胞により提供されてもよい。最も好適には、かかる安定な宿主細胞は、必要とされる構成成分を誘導性プロモーターの制御下において含むであろう。しかし、必要とされる構成成分は、構成的プロモーターの制御下にあってもよい。好適な誘導性および構成的プロモーターの例は、本明細書において、導入遺伝子と共に使用するために好適な調節性エレメントの議論において提供される。なお別の選択肢において、選択された安定な宿主細胞は、構成的プロモーターの制御下において選択された構成成分を、および１つ以上の誘導性プロモーターの制御下において他の選択された構成成分を含んでもよい。例えば、２９３細胞から誘導された安定な宿主細胞（これは、構成的プロモーターの制御下においてＥ１ヘルパー機能を含む）を、作製してもよいが、これは、誘導性プロモーターの制御下においてｒｅｐおよび／またはｃａｐタンパク質を含む。なお他の安定な宿主細胞が、当業者ににより作製され得る。

組み換えＡＡＶベクター、本開示のｒＡＡＶを生成するために要求されるｒｅｐ配列、ｃａｐ配列、およびヘルパー機能は、任意の適切な遺伝子エレメント（ベクター）を用いてパッケージング宿主細胞に送達することができる。選択された遺伝子エレメントは、本明細書において記載されるものを含む任意の好適な方法により送達することができる。本開示の任意の態様を構築するために用いられる方法は、核酸操作の分野における当業者に公知であり、遺伝子工学、組み換え工学、および合成技術を含む。例えば、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Press、Cold Spring Harbor, N.Y.を参照。同様に、ｒＡＡＶビリオンを作製する方法は、周知であり、好適な方法の選択は、本開示に対する限定ではない。例えば、K. Fisher et al., J. Virol., 70:520-532 (1993)および米国特許第５，４７８，７４５号を参照。

いくつかの態様において、組み換えＡＡＶは、トリプルトランスフェクション法（米国特許第６，００１，６５０号において詳細に記載される）を用いて生成してもよい。典型的には、組み換えＡＡＶは、宿主細胞に、ＡＡＶ粒子中にパッケージングされるべき組み換えＡＡＶベクター（導入遺伝子を含む）、ＡＡＶヘルパー機能ベクター、およびアクセサリー機能ベクターで遺伝子導入することにより生成される。ＡＡＶヘルパー機能ベクターは、「ＡＡＶヘルパー機能」配列（すなわち、ｒｅｐおよびｃａｐ）をコードし、これらは、トランスで、生産的なＡＡＶ複製およびキャプシド形成のために機能する。好ましくは、ＡＡＶヘルパー機能ベクターは、任意の検出可能な野生型ＡＡＶビリオン（すなわち、機能的なｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を含むＡＡＶビリオン）を生じることなく、効率的なＡＡＶベクター生成を支援する。本開示と共に使用するために好適なベクターの非限定的な例として、米国特許第６，００１，６５０号において記載されるｐＨＬＰ１９、および米国特許第６，１５６，３０３号において記載されるｐＲｅｐ６ｃａｐ６ベクターが挙げられ、両方の全体は、本明細書において参考として援用される。アクセサリー機能ベクターは、ＡＡＶが複製のために依存する非ＡＡＶ由来のウイルスおよび／または細胞の機能（すなわち、「アクセサリー機能」）のためのヌクレオチド配列をコードする。アクセサリー機能は、ＡＡＶ複製のために要求される機能を含み、これは、限定することなく、ＡＡＶ遺伝子転写の活性化、ステージ特異的なＡＡＶのｍＲＮＡスプライシング、ＡＡＶのＤＮＡ複製、ｃａｐ発現生成物の合成、およびＡＡＶキャプシドアセンブリーに関与する部分を含む。ウイルスに基づくアクセサリー機能は、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルス１型以外のもの）、およびワクシニアウイルスなどの既知のヘルパーウイルスのうちのいずれかに由来するものであってよい。

いくつかの側面において、本開示は、ｒＡＡＶベクターにより遺伝子導入された宿主細胞を提供する。用語「遺伝子導入」は、細胞による外来ＤＮＡの取り込みを指すように用いられ、外来ＤＮＡが細胞膜の内側に導入された場合に、細胞は「遺伝子導入されて」いる。多数の遺伝子導入技術が、当該分野において一般に公知である。例えば、Graham et al. (1973) Virology, 52:456、Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York、Davis et al. (1986) Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier、およびChu et al. (1981) Gene 13:197を参照。かかる技術は、ヌクレオチド組み込みベクターなどの１つ以上の外来核酸、および他の核酸分子を、好適な宿主細胞中に導入するために用いることができる。

「宿主細胞」とは、目的の物質を収容するか、またはこれを収容することができる、任意の細胞を指す。しばしば、宿主細胞は、哺乳動物細胞である。いくつかの態様において、宿主細胞は、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞（Ｓｆ９）、または哺乳動物（例えば、ヒト、げっ歯類、非ヒト霊長類など）の細胞である。宿主細胞は、ＡＡＶヘルパーコンストラクト、ＡＡＶミニ遺伝子プラスミド、アクセサリー機能ベクター、または組み換えＡＡＶの生成に関連する他のトランスファーＤＮＡのレシピエントして用いてもよい。用語は、遺伝子導入された元の細胞の子孫を含む。したがって、本明細書において用いられる「宿主細胞」は、外来ＤＮＡ配列で遺伝子導入された細胞を指してもよい。単一の親細胞の子孫は、天然の、偶発的な、または計画的な変異に起因して、形態学においてまたはゲノムもしくは総ＤＮＡの相補性において、元の親と必ずしも完全に同一でない場合があることが理解される。いくつかの態様において、本開示による宿主細胞は、心筋細胞である。

いくつかの態様において、ポリペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ウイルスベクター、またはｒＡＡＶ）は、不整脈を処置するための対象への投与のために、組成物（例えば、医薬組成物）中に処方される。いくつかの態様において、組成物は、薬学的に受入可能な担体をさらに含む。

句「薬学的に受入可能な」とは、本明細書において、健全な医学的判断の範囲内において、過剰な毒性、刺激、アレルギー性応答、または他の問題もしくは合併症を伴わない、ヒトのおよび動物の組織と接触しての使用のために好適な化合物、材料、組成物、および／または投与形態であって、妥当な利益／リスク比により釣り合うものを指すように使用される。句「薬学的に受入可能な担体」とは、液体もしくは固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒またはカプセル化材料などの薬学的に受入可能な材料、組成物またはビヒクルであって、対象の剤を、身体の１つの臓器または部分から、身体の別の臓器または部分に運搬または輸送することに関与するものを意味する。各々の担体は、処方物の他の成分と適合性であり、患者の組織に対して傷害性でない（例えば、生理学的に適合性、無菌、生理学的ｐＨなど）という意味において、「受入可能」でなければならない。用語「担体」は、活性成分が組み合わされて適用を促進する、天然または合成の、有機または無機の成分を表す。医薬組成物の構成成分はまた、所望される薬学的有効性を実質的に損なうであろう相互作用が存在しない様式において、本開示の分子と共に混合されるか、または互いに混合されることができる。薬学的に受入可能な担体として役立ち得る材料のいくつかの例として、以下が挙げられる：（１）ラクトース、グルコースおよびスクロースなどの糖；（２）コーンスターチおよびバレイショデンプンなどのデンプン；（３）セルロースおよびその誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、エチルセルロース、微結晶性セルロースおよび酢酸セルロース；（４）粉末トラガカント；（５）モルト；（６）ゼラチン；（７）ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、およびタルクなどの潤滑剤；（８）カカオバターおよび坐剤用ワックスなどの賦形剤；（９）ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油およびダイズ油などの油脂；（１０）ポリエチレングリコールなどのグリコール；（１１）グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのポリオール；（１２）オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル；（１３）寒天；（１４）水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝化剤；（１５）アルギン酸；（１６）パイロジェンフリー水；（１７）等張生理食塩水；（１８）リンガー溶液；（１９）エチルアルコール；（２０）ｐＨ緩衝化溶液；（２１）ポリエステル、ポリカーボネートおよび／またはポリ無水物；（２２）ポリペプチドおよびアミノ酸などの嵩高剤；（２３）血清アルブミン、ＨＤＬおよびＬＤＬなどの血清構成成分；（２２）エタノールなどのＣ２－Ｃ１２アルコール；ならびに（２３）医薬処方物中で使用される他の非毒性の適合性の物質。湿潤剤、着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤、芳香剤、保存剤および抗酸化剤もまた、処方物中に存在することができる。

好適な担体は、組成物（例えば、医薬組成物）が向けられる適応症を考慮して、当業者により容易に選択され得る。例えば、１つの好適な担体として、生理食塩水が挙げられ、これは、多様な緩衝化溶液（例えばリン酸緩衝化生理食塩水）と共に処方することができる。他の例示的な担体として、無菌の生理食塩水、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチン、ピーナツ油、ゴマ油、および水が挙げられる。担体の選択は、本開示の限定ではない。

典型的には、組成物（例えば、医薬組成物）は、活性化合物の少なくとも約０．１％、またはそれより多くを含んでもよいが、活性成分のパーセンテージは、勿論、変化してもよく、便利に、処方物全体の重量または容積の約１または２％～約７０％または８０％、またはそれより多くであってもよい。当然、各々の治療上有用な組成物中の活性化合物の量は、当該化合物の任意の所与の単位用量において好適な投与量が得られるであろう方法において調製することができる。可溶性、バイオアベイラビリティー、生物学的半減期、投与の経路、製品の有効期間などの要因、ならびに他の薬理学的考慮点は、かかる医薬処方物を調製する分野の当業者により企図され、したがって、多様な投与量および処置レジメンが望ましい場合がある。

いくつかの態様において、組成物は、本明細書において記載されるｒＡＡＶのうちのいずれか１つを含む。いくつかの態様において、これらの組成物は、高いｒＡＡＶ濃度が存在する場合（例えば、約１０^１３ＧＣ／ｍｌ以上）は特に、組成物中でのＡＡＶ粒子の凝集を軽減するために処方される。ｒＡＡＶの凝集を軽減するための方法は、当該分野において周知であり、例えば、界面活性剤の添加、ｐＨ調整、塩濃度の調整などを含む（例えば、Wright FR, et al., Molecular Therapy (2005) 12, 171-178を参照；この内容は、本明細書において参考として援用される）。

医薬組成物は、単位投与形態において便利に提示されてもよく、製薬の分野において周知の方法のうちのいずれかにより調製してもよい。用語「単位用量」とは、本開示の医薬組成物に関して用いられる場合、対象のための単位投与量として好適な物理的に別々の単位を指し、各々の単位が、必要とされる希釈剤；すなわち、担体またはビヒクルと関連して所望される治療効果をもたらすために計算された、予め決定された量の活性材料を含む。

医薬組成物の処方は、投与の経路に依存してもよい。非経口投与または腫瘍内、腫瘍周囲、病変内または病変周囲投与のために好適な注射可能な調製物は、例えば、無菌の注射可能な水性または油性の懸濁液を含み、好適な分散剤または湿潤剤および懸濁剤を用いて、既知の技術に従って処方することができる。無菌の注射可能な調製物はまた、非毒性の非経口で受入可能な希釈剤または溶媒中の、例えば、１，３プロパンジオールまたは１，３ブタンジオール中の溶液としての、無菌の注射可能な溶液、懸濁液または乳液であってよい。使用してもよい受入可能なビヒクルおよび溶媒の中には、水、リンガー溶液、Ｕ．Ｓ．Ｐ．および等張塩化ナトリウム溶液がある。加えて、無菌の硬化油は、溶媒または懸濁媒として、便利に使用される。この目的のために、合成のモノ－またはジ－グリセリドを含む任意の無刺激性（bland）の硬化油を用いてもよい。加えて、オレイン酸などの脂肪酸も、注射可能物の調製において有用である。注射可能な処方物は、例えば、除菌フィルターを通してのろ過により、または使用前に無菌の水もしくは他の無菌の注射可能な媒体中に溶解もしくは分散することができる無菌の固体組成物の形態において無菌化剤を組み込むことにより、無菌化することができる。

局所投与のために、医薬組成物は、当該分野において一般に公知であるように、軟膏（ointment）、軟膏（salve）、ゲル、またはクリームに処方することができる。局所投与は、当該分野において周知の経皮送達系を利用することができる。一例は、経皮貼付剤である。

経口投与のために好適な組成物は、各々が予め決定された量の抗炎症剤を含む、カプセル、錠剤、ロゼンジなどの別々の単位として提示することができる。他の組成物は、シロップ、エリキシル、またはエマルジョンなどの、水性の液体または非水性の液体中の懸濁液を含む。

他の送達系として、時間放出型、遅延放出型または持続放出型の送達系を挙げることができる。かかる系は、抗炎症剤の繰り返しの投与を回避し、対象および医師の利便性を増大させることができる。多くの型の放出送達系が利用可能であり、当業者に公知である。それらは、ポリ（ラクチド－グリコリド）、コポリオキサレート（copolyoxalate）、ポリカプロラクトン、ポリエステルアミド、ポリオルトエステル、ポリヒドロキシ酪酸、およびポリ無水物などのポリマーベースの系を含む。薬物を含む前述のポリマーのマイクロカプセルは、例えば、米国特許第５，０７５，１０９号において記載される。送達系はまた、非ポリマーの系を含み、これは：コレステロールなどのステロール、コレステロールエステルおよび脂肪酸、またはモノ－、ジ－、およびトリ－グリセリドなどの中性脂肪を含む脂質；ハイドロゲル放出系；シラスティック（sylastic）系；ペプチドベースの系；ワックスコーティング剤；従来の結合剤および賦形剤を用いた加圧錠剤；部分的に融合したインプラントなどである。具体例として、これらに限定されないが、以下が挙げられる：（ａ）マトリックス中の形態において抗炎症剤が含まれる浸食系、例えば、米国特許第４，４５２，７７５号、同第４，６６７，０１４号、同第４，７４８，０３４号、および同第５，２３９，６６０号において記載されるもの、ならびに（ｂ）活性な構成成分が、制御された速度でポリマーから浸透する拡散系、例えば、米国特許第３，８３２，２５３号および同第３，８５４，４８０号において記載されるもの。加えて、ポンプベースのハードウェア送達系を用いてもよく、その一部は、移植のために適応させられる。

長期持続放出インプラントの使用は、慢性の状態の処置のために特に好適である場合がある。長期放出は、本明細書において用いられる場合、インプラントが、治療レベルの活性成分を、少なくとも３０日間、好ましくは６０日間にわたり送達するように構築および配置されることを意味する。長期持続放出放出インプラントは、当業者に周知であり、上記の放出系のうちのいくつかを含む。

いくつかの態様において、治療的投与のために用いられる医薬組成物は、無菌でなければならない。無菌性は、無菌のろ過膜（例えば、０．２マイクロンの膜）を通したろ過により容易に達成される。あるいは、微生物の増殖または活動を防止するために、保存剤を用いることができる。多様な保存剤が周知であり、これらは、例えば、フェノールおよびアスコルビン酸を含む。ポリペプチド、核酸、ｒＡＡＶ、または医薬組成物は、通常、凍結乾燥形態において、またはそれが温度および酸化による変性に対して高度に安定である場合には水溶液として、貯蔵されるであろう。調製物のｐＨは、典型的には、約６～８であろうが、より高い、またはより低いｐＨ値もまた、特定の場合には適切であり得る。

注射可能用途のために好適な医薬形態として、無菌の水溶液または分散、および無菌の注射可能な溶液または分散の即時調製のための無菌の粉末が挙げられる。分散はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびこれらの組み合わせ中で、ならびに油脂中で調製してもよい。通常の貯蔵および使用の条件下において、これらの調製物は、微生物の増殖を防止するために保存剤を含む。多くの場合において、形態は、無菌であり、容易な通針性（syringability）が存在する程度まで液体である。それは、製造および貯蔵の条件下において安定でなければならず、細菌または真菌の微生物の汚染作用に対して保存されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）、これらの好適な混合物、および／または植物油を含む、溶媒または分散媒であってよい。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用により、分散の場合には必要とされる粒子サイズの維持により、および界面活性剤の使用により、維持することができる。微生物の作用の防止は、多様な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどにより、もたらすことができる。多くの場合において、等張化剤、例えば糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。注射可能な組成物の長期の吸収は、組成物における吸収を遅延させる剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によりもたらすことができる。

注射可能な水溶液の投与のために、例えば、溶液は、必要な場合には、好適に緩衝化することができ、液体の希釈剤は、初めに十分な生理食塩水またはグルコースにより等張にされる。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内投与のために特に好適である。このことに関して、使用することができる無菌の水性媒体は、当業者に公知でああろう。例えば、１つの投与量を、１ｍｌの等張ＮａＣｌ溶液中で溶解し、１０００ｍｌの皮下点滴液に添加するか、または提案される点滴の部位に注射してもよい（例えば、「Remington's Pharmaceutical Sciences」、第１５版、１０３５－１０３８頁および１５７０－１５８０頁を参照）。投与量におけるいくつかのバリエーションが、宿主の状態に依存して、必然的に生じるであろう。投与の責任者は、いかなる場合であっても、個々の宿主のために適切な用量を決定するであろう。

無菌の注射可能な溶液は、活性剤を、必要とされる量において、適切な溶媒中に、必要に応じて本明細書において列記される多様な他の材料と共に組み込み、その後無菌ろ過することにより、調製される。一般的に、分散は、多様な無菌の活性成分を、基本の分散媒、および上に列記されるものからの必要とされる他の材料を含む無菌のビヒクル中に組み込むことにより、調製される。無菌の注射可能な溶液の調製のための無菌の粉末の場合、好ましい調製の方法は、真空乾燥および凍結乾燥技術であり、これらは、活性成分プラス任意の追加の所望される材料の粉末を、事前に無菌ろ過されたその溶液から生じる。

リポソーム、ナノカプセル、微粒子、マイクロスフェア、脂質粒子、小胞などの送達ビヒクルを、好適な宿主細胞中への本開示の組成物の導入のために用いてもよい。特に、核酸、タンパク質、またはｒＡＡＶを、送達のために、脂質粒子、リポソーム、小胞、ナノスフェア、またはナノ粒子などのいずれかの中にカプセル化して処方してもよい。

かかる処方物は、本明細書において開示される核酸、タンパク質、またはｒＡＡＶの薬学的に受入可能な処方物の導入のために、好ましい場合がある。リポソームの形成および使用は、当業者に一般的に公知である。最近、血清安定性および循環半減時間が改善されたリポソームが開発された（米国特許第５，７４１，５１６号）。さらに、潜在的な薬物担体としてのリポソームおよびリポソーム様調製物の多様な方法が記載されている（米国特許第５，５６７，４３４号；同第５，５５２，１５７号；同第５，５６５，２１３号；同第５，７３８，８６８号および同第５，７９５，５８７号）。

リポソームは、他の手段によっては通常では遺伝子導入に対して耐性である多数の細胞型と共に、首尾よく用いられてきた。加えて、リポソームは、ウイルスベースの送達系の典型であるＤＮＡの長さの制約から自由である。リポソームは、遺伝子、薬物、放射線治療剤、ウイルス、転写因子およびアロステリックなエフェクターを多様な培養細胞株および動物に導入するために、効果的に用いられてきた。加えて、リポソームにより媒介される薬物送達の有効性を試験するいくつかの首尾よい臨床治験が完了している。

リポソームは、水性の媒体中に分散したリン脂質から形成され、自発的に多重層の同心円状の二分子膜小胞（また多重層小胞（ＭＬＶ）とも称される）を形成する。ＭＬＶは、一般に、２５ｎｍ～４μｍの直径を有する。ＭＬＶの超音波処理は、２００～５００Åの範囲の直径を有し、コア中に水溶液を含む、小さな単層小胞（ＳＵＶ）の形成をもたらす。

あるいは、活性剤のナノカプセル処方物を用いてもよい。ナノカプセルは、一般に、物質を安定かつ再現可能な方法において捕捉することができる。細胞内のポリマー過負荷に起因する副作用を回避するために、かかる超微細粒子（約０．１μｍのサイズ）は、in vivoで分解されることができるポリマーを用いて設計すべきである。これらの要件を満たす生分解性ポリアルキル－シアノアクリレートナノ粒子が、使用のために企図される。

上記の送達の方法に加えて、以下の技術もまた、組成物を宿主に送達する代替的な方法として企図される。ソノフォレーシス（すなわち超音波）が用いられており、米国特許第５，６５６，０１６号において、循環系中への、またはこれを通しての薬物の浸透の速度および有効性を増強するためのデバイスとして記載されている。企図される他の薬物送達の選択肢は、骨内注射（米国特許第５，７７９，７０８号）、マイクロチップデバイス（米国特許第５，７９７，８９８号）、眼用処方物（Bourlais et al., 1998）、経皮マトリックス（米国特許第５，７７０，２１９号および同第５，７８３，２０８号）、ならびにフィードバック制御された送達（米国特許第５，６９７，８９９号）である。

本明細書において開示される組成物はまた、中性または塩の形態において処方してもよい。薬学的に受入可能な塩は、酸付加塩（タンパク質の遊離のアミノ基により形成される）を含み、これは、例えば塩酸もしくはリン酸などの無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸、その他などの有機酸により形成される。遊離のカルボキシル基により形成される塩もまた、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムもしくは水酸化第二鉄などの無機塩基、またはイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカイン、その他などの有機塩基から誘導することができる。処方の後で、溶液は、投与処方物に適合性の様式において、および治療的に有効な量において、投与されるであろう。処方物は、注射可能な溶液、薬物放出カプセル、その他などの多様な投与形態において、容易に投与される。

本開示の他の側面は、本明細書において記載されるポリペプチド、核酸、ｒＡＡＶ、または組成物のうちのいずれか１つの、不整脈を処置することにおける使用のための使用を提供する。いくつかの態様において、不整脈を処置する方法は、必要とする対象に組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の有効量を投与することを含み、ここで、ｒＡＡＶは、キャプシドタンパク質（例えば、血清型ＡＡＶ９のキャプシドタンパク質）およびＭＹＢＰＣ３のＣ末端ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、配列番号１～１６のうちのいずれか１つのポリペプチド）を含む。

その最も広義において、用語「処置」または「処置すること」とは、治療的および予防的処置の両方を指す。対象が疾患（例えば不整脈）の処置を必要とする場合、「状態を処置すること」とは、当該疾患（例えば不整脈）に関連する１つ以上の症状を寛解させるか、軽減するか、もしくはこれを取り除く、または当該疾患の任意のさらなる進行を予防することを指す。処置を必要とする対象が不整脈を有するリスクがあるものである場合は、対象を処置することとは、対象が不整脈を有するリスクを減少させること、または対象が不整脈を発症することを予防することを指す。

対象は、ヒトまたは脊椎動物または哺乳動物を意味するべきであり、これは、これらに限定されないが、げっ歯類、例えばラットまたはマウス、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、シチメンチョウ、ニワトリ、および霊長類、例えばサルを含む。本開示の方法は、必要とする対象を処置するために有用である。

本開示の「治療有効量」という用語は、所望される生物学的効果を実現するために必要または十分な量を指す。例えば、本開示に関連するポリペプチドまたはこれをコードする核酸の治療有効量は、不整脈の１つ以上の症状を寛解させるために十分な量であってよい。本明細書において提供される教示と組み合わせて、多様な活性化合物、ならびに効力、相対的バイオアベイラビリティー、患者の体重、有害副作用の重篤度および好ましい投与の様式などの重みづけ因子の中から選択することにより、実質的な毒性を引き起こさず、しかし特定の対象を処置するために全体的に有効である、有効な予防または治療処置レジメンを計画することができる。任意の特定の適用のための有効量は、処置されている疾患もしくは状態、投与されている特定の治療用化合物、対象のサイズ、または疾患もしくは状態の重篤度などの因子に依存して変化し得る。当業者は、過度の実験を必要とすることなく、本開示に関連する特定の治療用化合物の有効量を経験的に決定することができる。

いくつかの態様において、ｒＡＡＶの「有効量」は、動物を標的として感染させる、所望される組織（例えば心臓組織）を標的とするために十分な量である。有効量は、対象の種、年齢、体重、健康、および標的とされるべき組織などの要因に主に依存し、したがって、動物および組織の間で異なり得る。例えば、ｒＡＡＶの有効量は、一般に、約１０^９～１０^１６個のゲノムコピーを含む約１ｍｌ～約１００ｍｌの溶液の範囲である。いくつかの態様において、約１０^１３～１０^１５個のｒＡＡＶゲノムコピーの投与量が適切である。

ｒＡＡＶは、過度の有害効果を伴うことなく、所望される組織の細胞に遺伝子導入するために、および十分なレベルの遺伝子の導入および発現を提供するために、十分な量において投与される。従来のおよび薬学的に受入可能な投与の経路として、これらに限定されないが、選択された臓器への直接送達（例えば、心臓への送達）、経口、吸入（鼻内および気管内送達を含む）、眼内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、腫瘍内、および他の非経口の投与の経路が挙げられる。投与の経路は、所望される場合、組み合わせてもよい。

本開示のポリペプチド、核酸、ｒＡＡＶ、およびこれらを含む組成物は、当該分野において公知の任意の適切な方法に従って、組成物中で対象に送達してもよい。例えば、ｒＡＡＶは、好ましくは生理学的に適合性の担体中で懸濁され（例えば、組成物中で）、対象、例えば、ヒト、マウス、ラット、ネコ、イヌ、ヒツジ、ウサギ、ウマ、ウシ、ヤギ、ブタ、モルモット、ハムスター、ニワトリ、シチメンチョウ、または非ヒト霊長類（例えば、マカク）などの宿主動物に投与してもよい。いくつかの態様において、宿主動物は、ヒトを含まない。

ポリペプチド、核酸、ｒＡＡＶ、および組成物の哺乳動物対象への送達は、例えば、筋肉内注射によるもの、または哺乳動物対象の血流中への投与によるものであってよい。血流中への投与は、静脈、動脈、または任意の他の導血管（vascular conduit）中への注射によるものであってよい。いくつかの態様において、本開示において記載されるようなポリペプチド、核酸、ｒＡＡＶ、および組成物は、静脈内注射により投与される。いくつかの態様において、ポリペプチド、核酸、ｒＡＡＶ、および組成物は、筋肉内注射により投与される。いくつかの態様において、ポリペプチド、核酸、ｒＡＡＶ、および組成物は、心臓中への注射により投与される。いくつかの態様において、ポリペプチド、核酸、ｒＡＡＶ、および組成物は、対象における心筋細胞へ送達される。

いくつかの態様において、ポリペプチド、核酸、ｒＡＡＶ、または組成物の用量は、１暦日（例えば、２４時間の期間）あたり１回以下で、筋肉内注射により対象に投与される。いくつかの態様において、ポリペプチド、核酸、ｒＡＡＶ、または組成物の用量は、２、３、４、５、６、または７暦日あたり１回以下で、筋肉内注射により対象に投与される。いくつかの態様において、ポリペプチド、核酸、ｒＡＡＶ、または組成物の用量は、１暦週（例えば、７暦日）あたり１回以下で、対象に投与される。いくつかの態様において、ポリペプチド、核酸、ｒＡＡＶ、または組成物の用量は、２週間毎（例えば、２暦週の期間において１回）以下で、対象に投与される。いくつかの態様において、ｒＡＡＶの用量は、１暦月あたり１回以下（例えば、３０暦日において１回）で、対象に投与される。いくつかの態様において、ポリペプチド、核酸、ｒＡＡＶ、または組成物の用量は、６暦月あたり１回以下で、対象に投与される。いくつかの態様において、ポリペプチド、核酸、ｒＡＡＶ、または組成物の用量は、１暦年（例えば、３６５日またはうるう年においては３６６日）あたり１回以下で、対象に投与される。いくつかの態様において、ポリペプチド、核酸、ｒＡＡＶ、または組成物の用量は、単一用量の治療として、対象に投与される。

本明細書において記載される方法を用いて処置することができる障害は、異常なリアノジン受容体２型（ＲＹＲ２）機能に関連する。いくつかの態様において、異常なＲＹＲ２機能は、ＲＹＲ２における１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、またはそれより多く）の変異により引き起こされる。いくつかの態様において、異常なＲＹＲ２機能（例えば、ＲＹＲ２における変異により引き起こされるもの）は、対象における心筋細胞における過剰な（例えば、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも１００％、少なくとも２倍、少なくとも１０倍、少なくとも１００倍、またはそれより多い）拡張期Ｃａ^２＋放出に関連する。心筋細胞において過剰な拡張期Ｃａ^２＋放出を引き起こすＲＹＲ２における変異は、例えば、本明細書において参考として援用されるJiang et al., PNAS August 31, 2004 101 (35) 13062-13067；Liu et al., PLoS One. 2017; 12(9): e0184177；およびPostma et al., J Med Genet. Nov;42(11):863-70において記載されるように、当該分野において公知である。

いくつかの態様において、異常なＲＹＲ２機能に関連する障害は、不整脈である。いくつかの態様において、不整脈は、遺伝性または後天性である。いくつかの態様において、遺伝性不整脈は、カテコールアミン誘発性多形性心室性頻拍（ＣＰＶＴ）である。いくつかの態様において、ＣＰＶＴは、ＲＹＲ２における変異と関連する。いくつかの態様において、後天性不整脈は、心室性不整脈または上室性不整脈である。いくつかの態様において、心室性不整脈は、心室頻拍、心室細動、または心室性期外収縮である。いくつかの態様において、上室性不整脈は、心房細動、心房粗動、心房頻拍、心房性期外収縮、または発作性上室性頻拍である。いくつかの態様において、異常なＲＹＲ２機能に関連する障害は、心不全である。

いくつかの態様において、ポリペプチド、核酸、またはｒＡＡＶを投与することは、対象における心筋細胞における過剰な拡張期Ｃａ^２＋放出を（例えば、少なくとも２０％、少なくとも５０％、または少なくとも９０％）減少させる。いくつかの態様において、ポリペプチド、核酸、またはｒＡＡＶを投与することは、対象における心筋細胞における拡張期Ｃａ^２＋放出を正常なレベルに回復させる。いくつかの態様において、正常なレベルとは、健康な対象における拡張期Ｃａ^２＋放出のレベルである。

例
例１
ＣＰＶＴ（カテコールアミン誘発性多形性心室性頻拍）は、患者が運動の間に致死的な不整脈についてのリスクを有する悪性の遺伝性不整脈である^１。ＣＰＶＴは、１：１００００の推定有病率を有し、突然の不明な若年死の剖検陰性症例のうちの約１５％を引き起こす^２。ＣＰＶＴ症例の６０％は、心筋細胞の主要な細胞内Ｃａ^２＋放出チャネルであるリアノジン受容体２型（ＲＹＲ２）における変異により引き起こされる^１，３。ＲＹＲ２内において、コード配列の４つの「ホットスポット」領域中でクラスター化される１６０個を超える異なる変異^４が、ＣＰＶＴを引き起こすことが知られている。現在、ＣＰＶＴは、利用可能な選択肢により適切に処置されておらず、患者は、突然死または中断された突然死、ならびに現在の治療から生じる病的状態に苦しみ続ける^５。したがって、即時の概念実証の市場空間は、ＣＰＶＴを有する患者であって、医学的管理に対するその応答が最適以下であるものである。最終的には、遺伝子治療アプローチが、ＣＰＶＴのための標準的な処置となり得ることが見込まれる。

ＣＰＶＴにおける変異は、正常な心筋細胞のＣａ^２＋ハンドリングを妨げる。各々の心拍により、Ｃａ^２＋レベルは収縮期において上昇し、サルコメアに収縮するようにシグナル伝達し、拡張期において低下して、サルコメアを弛緩させる。細胞質Ｃａ^２＋濃度におけるこれらの変化は、細胞膜の脱分極により開始され、これは、Ｌ型Ｃａ^２＋チャネルを開いて、少量の細胞外Ｃａ^２＋が細胞に入ることを可能にする。このＣａ^２＋の流入が筋小胞体上に位置するＲＹＲ２を刺激して開かせ、はるかにより多くのＣａ^２＋を放出させる。このＣａ^２＋により誘導されるＣａ^２＋の放出は、サイトゾルのＣａ^２＋を迅速に増大させ、これは、サルコメア収縮を協調させる。時間依存的なＬ型Ｃａ^２＋チャネルおよびＲＹＲ２の閉鎖は、ＡＴＰ依存性ポンプ（ＳＥＲＣＡ２Ａ）によるサイトゾルのＣａ^２＋の筋小胞体への能動的な回帰と共に、Ｃａ^２＋濃度を拡張期における低レベルへと戻す。少量のＣａ^２＋は、Ｎａ^＋／Ｃａ^２＋交換体であるＮＣＸを介して細胞外空間に戻る。ＣＰＶＴの変異は、ＲＹＲ２を通して過剰な拡張期Ｃａ^２＋放出を引き起こす。上昇した拡張期Ｃａ^２＋は、より大きなＮａ^＋／Ｃａ^２＋交換を駆動する。この交換は起電性であるので、増加した交換は、膜の脱分極をもたらし（脱分極後の）、これは、別の活動電位をもたらし得る（「撃発活動」）か、または再分極の不均一性を作り出し得、これは、不整脈性のインパルスの伝播（「リエントリー」）を引き起こし得る^６，７。

本明細書において記載される治療剤の作用機序は、ＣＰＶＴの病態形成の中心であるＲＹＲ２の過剰な活性を限定することである。重要なことに、ＲＹＲ２の機能不全は、多くの型の心疾患の最終的な共通の経路であり、したがって、この抗不整脈治療についての適応症は、心房細動を含む他の型の遺伝性または後天性の心筋症に拡大することができる可能性がある^８（有病率、人口の１％、および患者の９％が８０歳を超える）。
ＣＰＶＴを有する患者は、現在の医学的および外科的選択肢によっては、不完全に処置される^{５，９，１０}。現在の医学的選択肢は、実質的な副作用を有し、不完全な保護を提供する。

我々の現在の医学的選択肢は、運動制限である。運動制限は、小児および青年においては困難であり、運動を限定することは、生涯の心理社会的および医学的な影響を有する。運動の長期的利益は、ますます認識されており、心血管、代謝、および炎症性の障害ならびに乳房、子宮内膜および結腸の悪性病変の生涯のリスクに関連付けられている。^{１１-１３}

別の現在の選択肢は、高用量ベータ－ブロッカーを利用することである。高用量のベータ－遮断は、全体的なエネルギーレベルおよび気分に対する効果に起因して、しばしば耐容することが困難である。結果として、ベータ－ブロッカーについての不履行、または治療用量以下となることが一般的である。最近の研究において、処置の失敗（失神（syncope）または心停止）は、主にベータ－ブロッカーにより管理された患者の２５％～３３％において発生した^５，１４。最適以下の投薬およびおよび所望された治療に対するノンアドヒアランスは、これらの処置の失敗のうちのそれぞれ４１％および４８％において発生した^５。

別の現在の医学的選択肢は、フレカイニドである。ベータ－ブロッカーに、ナトリウムチャネルブロッカーであるフレカイニドとの組み合わせは、ＣＰＶＴを有する患者にとって有効であることが見出されている^１５。成人心疾患の治験において、フレカイニドは、実質的な不整脈誘発効果を有し、死亡率を増加させた^１６。フレカイニドがＣＰＶＴにおける長期生存率を増大させるか否かは、知られていない。急性の運動試験において、患者の７６％はフレカイニドに応答し、２４％はこれに応答しなかった^１７。限定された経過観察による後向き研究において（中央値１．７年）、フレカイニドは、有望であると考えられるが、患者の３８％は、持続性の症状を有した^５。

さらに別の現在の医学的選択肢は、左心臓交感除神経術（left cardiac sympathetic denervation：ＬＣＳＤ）である。左頸部交感神経鎖の外科的中断は、心臓に対するアドレナリン作動性刺激を低下させ、医学的管理上で破綻的な（breakthrough）不整脈を有する一部のＣＰＶＴ患者にとって有益であった。ＬＣＳＤは、専門のセンターにおいて行われるべきであり、ホルネル症候群などの手術合併症は珍しくない。ＬＣＳＤは、心臓イベントの頻度を低下させるが、中央値が３７か月の追跡調査において、患者の２４％は、少なくとも１回の再発性心臓イベントを有した^１８。

なお別の現在の医学的選択肢は、移植心臓除細動器（ＩＣＤ）である。ＣＰＶＴを有する小児および青年において、ＩＣＤの合併症は一般的であり、ショックの高い負荷を伴う^１０。ＩＣＤは、心室細動を終わらせることにおいては有効であったが、心室頻拍においては有効ではなかった⁹。さらに、覚醒中の患者におけるＩＣＤの放電は、カテコールアミン放出をもたらし、これは、さらなる不整脈を誘発させ得、潜在的に致死性の「電気的嵐（electrical storm）」をもたらし得る。最近のエビデンスは、ＣＰＶＴに続発的な心停止を示す患者について、ＩＣＤからの延命効果は存在しないことを示す。これらの理由のために、ＣＰＶＴのためのＩＣＤの留置は、可能である場合は避けるべきであるが、これは、患者を、薬物療法に依存的にし、関連するコンプライアンスおよび破綻的なイベントの問題を残す^１９。

ＣＰＶＴは、疾患の相対的な希少性にもかかわらず、非常に顕著な社会的および経済的コストにより、他では健康で機能的な小児における病的状態および死亡の主要な原因であり続ける。臨床的な評価および手順のための繰り返しの来院は、患者および施設を顕著なコストに曝す。

本開示は、ＣＰＶＴを処置するための組成物および方法を提案する。組成物は、ＡＡＶ－ＣＴＤＰを含み、ここで、心筋細胞選択的なプロモーターを有するアデノ随伴ウイルスは、ＣＰＶＴおよび多くの他の遺伝性および後天性不整脈における不整脈の根底にある原因であるＲＹＲ２の異常な活性を低下させるペプチドである、ＣＴＤＰ（ＭＹＢＰＣ３のＣ末端由来のペプチド）を発現する。

標的集団は、ＣＰＶＴを有する全ての患者であるが、医学的管理を失敗した患者（ベータ－ブロッカーおよびフレカイニドに対する破綻的な不整脈）から始める。遺伝子治療ベクターは、静脈内注入により、単一用量処置として送達される。本明細書において記載される遺伝子治療方法は、死亡率および破綻的不整脈を減少させ、ＬＣＳＤおよびＩＣＤについての必要性を減少させ、高用量ベータ－ブロッカーについての必要性を減少させるかまたはこれを取り除き、何らかのレベルの運動を可能にする。これらの変化は、ＣＰＶＴ患者のクオリティ・オブ・ライフを大いに改善するであろう。首尾よい遺伝子治療は、これらの１０代および若年成人の患者における生存または死亡の結果を伴う困難な問題である、患者の医学的コンプライアンスの治療成績に対する影響を軽減するであろう。これらの利点は、ＣＰＶＴマウスモデルにおける、およびＣＰＶＴ変異を有するヒトｉＰＳＣ由来の心筋細胞における効力の予備的な決定に基づいて期待される。

本明細書において記載される組成物および方法は、ＲＹＲ２からの異常なＣａ^２＋放出が疾患の病態形成に対する中心である、ＣＰＶＴよりも一般的な他の不整脈に拡大し得ることが予測される^２０。１つの可能性が高い拡大適応症は、心房細動であり、これは、８０歳以上の患者の９％で発症する。

ＣＴＤＰのＡＡＶ媒介性送達に対する１つの潜在的な代替物は、細胞浸透性ペプチドとしての送達である。ＡＡＶ遺伝子治療と比較して、ペプチド治療は、従来の医薬品により類似する特製およびコストを有する。しかし、ペプチドのレベルおよび心臓特異性は、ＡＡＶ遺伝子治療よりも低い可能性が高いであろう。加えて、臨床的に有効であるために、製品は、経口で利用可能である必要があり、これは、ペプチド治療のための課題であり得る。これらの理由のために、一次戦略はＡＡＶ遺伝子治療であり、ペプチドベースの治療は、細胞浸透性ペプチド技術における改善に随伴性の潜在的な代替物である。

結果
ＲＹＲ２が局在するdyadに局在するタンパク質を同定するために、近接プロテオミクスを行った。これは、サルコメアタンパク質であるＭＹＢＰＣ３のＣ末端から誘導されるペプチドを同定した（図１Ａ～１Ｆ）。全長ＭＹＢＰＣ３は、サルコメアの異なる部分（「Ａ帯」）に局在する。この知見の一致して、ＭＹＢＰＣ３－ＲＹＲ２相互作用は、酵母ツーハイブリッドスクリーニングにおいて先に記述された^２２。タンパク質の最もＣ末端のドメインであるＣ１０ドメインに特異的なモノクローナル抗体を用いる免疫染色は、内在性Ｃ１０がＲＹＲ２と共局在することを示した（図２Ｂ）。対照実験において、このモノクローナル抗体が、ＭＹＢＰＣ３ＫＯマウスにおいて顕著な免疫蛍光シグナルを生じないことを示した。ＭＹＢＰＣ３－Ｃ１０とＲＹＲ２との近接性を、２つのタンパク質の間の相互作用についてのin situアッセイである近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）を用いて、さらに確認した（図２Ｃおよび２Ｄ）。

この相互作用の機能的な重要性を決定するために、ＭＹＢＰＣ３Ｃ末端の部分をマウスの心臓に送達するためのＡＡＶを開発した。ＭＹＢＰＣ３は、Ｃ１－Ｃ１０とラベルされるいくつかの免疫グロブリン様およびフィブロネクチン様ドメインを含んでなる（図２Ａ）。Ｃ１０の分布を、いずれもＡＡＶにより送達された全長ＭＹＢＰＣ３と比較し、これらのタンパク質が異なる部位に局在することを確認した：Ｃ１０は、ＲＹＲ２と一致するパターンにおいてサルコメアＺ線付近（dyadが位置する場所）に局在し、一方、全長タンパク質は、サルコメアＡ帯内のＭＹＢＰＣ３のよく確立された位置に局在した（図２Ｅ）。

ヒト遺伝子治療の実現可能性についての重要な考察は、有効性を達成するために形質導入される必要がある心筋細胞のパーセントである。並行する問題は、部分的な心筋形質導入および結果として生じる心筋の不均一性が、不整脈誘発性であるか否かである。これらの質問に対する解答は、特にＡＡＶ－ＭＹＢＰＣ３に関して、まだ決定されておらず、ＣＰＶＴについての他の遺伝子治療研究からの結果は情報的に有益である。ＣＡＳＱ２欠損（ＣＰＶＴの常染色体劣勢形態）により引き起こされるＣＰＶＴのためのＡＡＶの遺伝子置き換え治療において、Prioriおよび同僚らは、約４０％の心筋細胞が形質導入されたマウスにおける治療有効性および不整脈誘発の不在を報告した^{２４，２５}。同様に、ＲＹＲ２変異により引き起こされるＣＰＶＴを処置するためのＡＡＶにより媒介されるＣａＭＫＩＩ阻害の報告において、５０％の心筋細胞が形質導入されたマウスにおいて、不整脈誘発を伴わない治療有効性が観察された^２１。有効性のために必要とされる最小形質導入効率を決定するための、公式の用量－応答実験が進行中である；少数の複製によるパイロット実験に基づいて、それは、約２０％であると考えられる。機序は、「ソース・シンク・ミスマッチ（source-sink mis-match）」として知られる概念に基づく可能性がある。心筋細胞は、それらの近接細胞（neighbor）に電気的に連結され、１つの心筋細胞の活性は、隣接する細胞とのその相互作用により安定化される。異常に脱分極する心筋細胞について、隣接する細胞をも脱分極させるためには、十分な電流を発生させることが必要である。この方法において、異常な活性に対して抵抗性である低い割合の心筋細胞が、細胞のネットワークを安定化することができる。

ヒトＣＰＶＴ患者由来のｉＰＳＣ－ＣＭのＣａ^２＋ハンドリングに対するＭＹＢＰＣ３の効果を評価した。ＭＹＢＰＣ３の発現は、ベータ－アドレナリン作動剤であるイソプロテレノールで刺激されたＣＰＶＴｉＰＳＣ－ＣＭにおけるＣａ^２＋スパークの頻度を低下させた（図３Ｄ）。このことは、ヒト細胞における有効性およびヒトｉＰＳＣ－ＣＭ培養物における専門的意見、ならびにこれらの細胞におけるＣａ^２＋ハンドリングの特徴づけを示す。

レポーター遺伝子なしで治療剤候補ベクターによる用量応答実験を行うことは、形質導入効率の測定を困難にする。しかし、これは、種の間で投与量を調整するための重要なパラメーターである。この困難を克服するために、研究室においてRNA in situハイブリダイゼーション法を確立した。例えば、バース症候群のマウスモデルを処置するためのＡＡＶ－ＴＡＺを用いる別々のプロジェクトについて、RNAscope RNA in situハイブリダイゼーションを用いて、形質導入された心筋細胞の割合を測定した。この同じ技術を、ここで、治療剤候補ベクター中に埋め込まれたレポーター遺伝子に依存することなく形質導入効率を測定するために用いる。

現在のケアの標準は、ＣＰＶＴ患者について、心停止および死亡のリスクを低下させることにおいて有効となっている。しかし、保護は不完全であり、心停止および死亡は、脅威であり続ける。現在のＳＯＣからの不完全な保護は、（１）現在の管理の耐えられない副作用が不履行をもたらすこと；および（２）ＣＰＶＴの根本原因であるＲＹＲ２の機能不全を標的とすることの失敗に起因する。運動制限、ベータ－ブロッカー、および心臓交感除神経術は、ＣＰＶＴ患者において不整脈を引き起こすベータ－アドレナリン作動性シグナル伝達の不整脈誘発性効果を最小限にするように設計される。しかし、最近の後向き研究は、ＣＰＶＴにおける心臓イベントのうちの約５分の１は、同定可能な興奮性刺激^５によって誘発されないことを示し、このことは、アドレナリン作動性シグナル伝達それ自体の除去は、完全には保護的でない場合があることを示唆する。運動制限、ベータ－ブロッカー^５，１４、およびさらには外科的な交感除神経術による、多くの患者の不完全な保護は、このシグナル伝達経路のみを標的とすることは不十分であることを示す^１８。同様に、フレカイニドは、不完全に保護的である－急性試験において、患者の２４％は応答せず、短期の経過観察において、患者の３８％はフレカイニドを投与されている間に重要なイベントを有し続けた^１７。

本明細書において、ＡＡＶ－ＣＴＤＰは、現在のケアの標準によるこれらの問題の両方に取り組むことにより、治療成績を改善したことを示す。ＲＹＲ２およびＭＹＢＰＣ３はいずれも、心臓特異的なタンパク質であり、ＡＡＶは、発現を心臓に選択的に向かわせるであろう。したがって、心筋細胞の外側では最小限の効果が予測される。ＣＴＤＰは、ＲＹＲ２と直接的に相互作用し、変異体ＲＹＲ２チャネルを通して自発的なＣａ^２＋放出を減少させる。影響を受けたチャネルに対するこの作用機序は、ベータ－遮断またはフレカイニドの現在の戦略よりも直接的である。重要なことに、これらの戦略は、相補的である可能性が高く、それにより、副作用を最小限にしつつ最大の保護を得るための、多層式の戦略を想起することができる。例えば、ＡＡＶ－ＣＴＤＰの投与は、異常なＲＹＲ２活性を直接的に低下させることができる。さらなる保護は、（おそらくはより容易に耐容されるより低い用量における）ベータ－ブロッカーにより、またはフレカイニドにより、得ることができる。治療が高度に有効である場合、一部の患者は、装着型心拍モニタによりガイドされて、いくらかのレベルの身体活動性まで戻ることができる。

まとめると、本明細書において記載されるＡＡＶ－ＣＴＤＰは、現在のケアの標準にとって代わることができ、単独療法として十分であり得る。少なくとも、ＡＡＶ－ＣＴＤＰは、現在のケアの標準と協同することができ、より低いレベルのベータ－遮断およびより厳密性の低い運動制限を可能にし、それにより、副作用を軽減してそれによりコンプライアンスを増強しつつ、患者を、突然死のリスクから、より良好に保護することができる。

例２．
次に、治療剤候補ベクターの設計を最適化する。これらの最適化実験は、ヒトｉＰＳＣ－ＣＭおよびＣＰＶＴマウス（ＲＹＲ２－Ｒ１７６Ｑ／＋およびＲＹＲ２－Ｒ４６５０Ｉ／＋）成体ＣＭにおいて行う。考慮すべき２つのパラメーターが存在する。

考慮すべき第１のパラメーターは、ＲＹＲ２阻害性ペプチドである。予備的データは、ＭＹＢＰＣ３のＣ末端は、ＣＰＶＴ変異を含むＲＹＲ２の異常な活性を低下させることにおいて有効であることを示唆する。異なるＣ末端ペプチド（Ｃ６－Ｃ１０、Ｃ６－Ｃ８、Ｃ８－１０、Ｃ９－Ｃ１０、Ｃ１０、Ｃ６－Ｃ９、Ｃ７－Ｃ９、Ｃ８－Ｃ９、Ｃ９）を発現するＡＡＶを構築した。最初のin vitroデータは、Ｃ６－Ｃ８およびＣ６－Ｃ９、およびＣ１０ドメインを含むペプチドは、ＲＹＲ２と同じ細胞内の位置に結合することを示した（図２Ａ～２Ｆ）。Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９および／またはＣ１０ドメインを含むペプチドフラグメントは、ＲＹＲ２^{Ｓ４０４Ｒ／ＷＴ}マウスにおけるＶＴを減少させる能力についてのさらなる試験であった。データは、Ｃ６－Ｃ８およびＣ６－Ｃ１０が、ＶＴを減少させることにおいて最も有効であり（図５Ｂ～５Ｃ）、心臓の収縮を損なわないことを示した（図５Ａ～５Ｃ）。Ｃ６－Ｃ１０フラグメントはまた、ＥＫＧを用いるＣＴを低下させ（図５Ｃ）、異常なカルシウムシグナルを減少させることが示された（図５Ｄ～５Ｅ）。

最小有効ＭＹＢＰＣ３フラグメントのマッピング
ＲＹＲ２と相互作用するＭＹＰＢＣ３のフラグメントを、図６において概説されるような二分子蛍光補完アッセイ（ＢｉＦＣ）を用いて同定した。ＢｉＦＣアッセイにおいて、ＭＹＢＰＣ３フラグメントおよびＲＹＲ２を、各々、Venus蛍光タンパク質の半分に融合させた。所与のＭＹＢＰＣ３フラグメントがＲＹＲ２と相互作用した場合、Venusの半分ずつが一緒になって、蛍光シグナルが同定される。ＭＹＢＰＣ３フラグメントは、既知のドメイン構造に基づき（図９Ａ）、表２において概説した。ＢｉＦＣにおける相互作用について、ＰＬＮ－Serca2の相互作用を陽性対照として用い、Serca－ＲＹＲ２の相互作用を陰性対照として用いた（図７～８）。

表２：ＢｉＰＣアッセイにおいて用いられたタンパク質およびタンパク質フラグメント．

ＢｉＦＣからの結果は、ＭＹＢＰＣ３のＣ７およびＣ８領域が、ＭＹＢＰＣ３とＲＹＲ２との間の相互作用についての主要な貢献者であることを示した。ＭＣＢＰＣ３の様々なフラグメントは、ＲＹＲ２への結合のための試験であった。Ｃ９－Ｃ１０、Ｃ１０、Ｃ６－Ｃ１０、Ｃ７－Ｃ１０、およびＣ８－Ｃ１０からの結果は、Ｃ７およびＣ８領域はいずれも結合に寄与することを、強く示唆した（図９Ｃ～９Ｄ）。ＭＹＢＰＣ３のＣ６－Ｃ８領域を、次いで、ＲＹＲ２への結合について試験し、Ｃ６フラグメントのみでは、ＲＹＲ２に結合しないが、Ｃ６－Ｃ７およびＣ６－Ｃ８フラグメントはＲＹＲ２に結合することが見出された（図９Ｅ）。さららなる実験は、Ｃ７－Ｃ８が、ＲＹＲ２への結合のために十分であること、およびＣ７またはＣ８を欠失するＭＹＢＰＣ３フラグメントは、より低いアフィニティーによってではあるが、ＲＹＲ２に結合することができることを決定した（図９Ｆ）。図９Ａ～９Ｆにおける蛍光画像を、図１１において定量し、Ｃ７および／またはＣ８を含むフラグメントが、Ｃ７およびＣ８を有しないフラグメントと比較して、ＲＹＲ２に結合することをさらに示した。さらなる実験は、ＭＹＢＰＣ３とＲＹＲ２との間の相互作用が、Ｃ７フラグメントを通して主に生じることを示した（図１３Ａ～１３Ｂ）。各々のＭＹＢＰＣ３のＲＹＲ２に対する結合の有効性を、図１２においてグラフによりまとめ、より大きな数の「＋＋＋」は、より高い相互作用アフィニティーを示す。また、相互作用しないＭＹＰＢＣ３ドメインは、ＲＹＲ２と共発現し、強力に発現することを示し、このことは、低いVenusシグナルについての理由として発現の技術的失敗を除外する（図１０）。

心筋細胞におけるＡＡＶにより発現されるＭＹＢＰＣ３フラグメントの局在
心筋細胞におけるＭＹＢＰＣ３の確立された局在は、サルコメアのＡ帯である。しかし、ＲＹＲ２は、サルコメアＺ線の近傍である接合部のＳＲ／daysにおいて位置する。ＭＹＢＣＰ３フラグメントが、Ｚ線の近傍、したがってＲＹＲ２と同じ領域において位置するか否かを決定するために、実験を行った。これを行うために、Ｎ末端においてＨＡタグ、およびＣ末端においてＭｙｃタグを有する、ＭＹＢＰＣ３コンストラクトを作製した（図１４Ａ）。このコンストラクトを、ＡＡＶにより心筋細胞に送達した。同じ視野中の異なる心筋細胞は、ＨＡ－ＭＹＢＰＣ３－Ｍｙｃタンパク質について、異なる染色パターンを有することが観察された。いくつかの細胞はＺ線染色パターンを有し、一方、他の細胞は、Ａ帯染色パターンを有した（図１４Ｂ）。さらなる分析は、ＨＡを含むフラグメントは、主にＡ帯に結合し、一方、Ｍｙｃを含有するフラグメントは、主にＺ線に結合することを示す（図１４Ｃ～１４Ｅ）。このことは、ＭＹＢＣＰ３が、細胞への投与の後で切断されていることを示唆する。

このことを試験するために、野生型、野生型＋ＨＡ－ＭＹＢＰＣ３－ＭＹＣ、およびＭＹＢＰＣ３ＫＯの心臓からの心筋細胞ライセートを、ＨＡまたはＣ１０（ＭＹＢＰＣ３の最Ｃ末端ドメインを認識するモノクローナルＡｂ）抗体を用いて探索した（図１５）。ＫＯ試料は、これらの抗体が、ライセート中の他のタンパク質を認識しないことを示す。Ｃ１０抗体は、全長（矢印）およびより小さなタンパク質（矢頭）を認識し、一方、ＨＡ抗体は、全長タンパク質のみを認識する。より小さなタンパク質が、ＷＴおよびＷＴ＋ＨＡ－ＭＹＢＰＣ３－ＭＹＣの両方において存在し、このことは、外来および内在性ＭＹＢＰＣ３の両方の画分が、内部で切断されて、そのＣ末端ドメインを含むより小さなタンパク質を生じることを示唆している。

Ｃ７－Ｃ８フラグメントが、in vivoで心筋細胞においてＺ線パターンに局在するか否かを決定するために、マウスを、ＡＡＶ－ｃＴｎＴ－ＨＡ－Ｃ７Ｃ８－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ（配列番号７８）で処置した。心臓切片を、ＨＡおよびＡＣＴＮ２（Ｚ線マーカー）で染色した。共焦点画像および心筋細胞の長軸に平行な線に沿ったシグナル強度は、ＨＡ染色が、Ｚ線と共局在する染色されたパターンを有することを示し、このことは、Ｃ７－Ｃ８フラグメントが、in vivoでＲＹＲ２タンパク質と同じ位置に局在することを示している（図１６Ａ～１６Ｂ）。

ＭＹＢＰＣ３の過剰発現に対するヒトＣＰＶＴｉＰＳＣ－ＣＭの応答
Ｃ６－Ｃ１０ＭＹＢＣ３フラグメントは、ＲＹＲ２－Ｓ４０４変異により引き起こされたＣＰＶＴを有するヒトｉＰＳＣ－ＣＭにおいて異常なカルシウム放出を抑制することをさらに示した（図１７）。細胞に、Ｃａ^２＋感受性色素をロードし、１Ｈｚで電気的にペーシングした。２０秒間あたりの異常なＣａ^２＋放出イベントの数を定量した。ＭＹＢＰＣ３は、ＣＰＶＴ変異体細胞において異常なＣａ^２＋放出イベントを抑制した。

例３
ＲＹＲ２は、正常なＣａ^２＋により誘導されるＣａ^２＋放出のために重要である、高次のクラスター化を有する四量体である。この構造組織は、ＭＹＢＰＣ３由来の相互作用するタンパク質を多量体化することにより、効力および有効性を増大し得るという可能性を示唆する。上で同定されたin vivoで抗不整脈効果のために要求される最小領域（例えば、Ｃ７－Ｃ８またはＣ７）を用いて、２または３コピーが可撓性のリンカーにより分離されているコンカテマーを作製する。これらのコンストラクトの有効性を、in vitroおよびin vivoアッセイを用いて比較する。心臓機能に対する効果はまた、心エコー図検査により試験する。最適化された治療用コンストラクトを、末端由来ペプチド、「ＣＴＤＰ」と命名する。治療剤候補ベクターを最適化する際に考慮すべき第２のパラメーターは、心筋細胞発現を駆動するために用いられるプロモーターである。プロモーターおよびエンハンサーを、最大レベルの発現および心筋細胞選択性を有する組み合わせを同定するために試験する。超並列（massively parallel）レポーターアッセイは、数千の候補エンハンサーを並行して試験するために先に開発され^３４、このアッセイは、現在、ＡＡＶからの発現を駆動するための最も強力かつ心臓特異的なエンハンサーおよびプロモーターを見出すために用いられている。

これらの実験は、ＡＡＶ９キャプシドにより行う。なぜならば、ＡＡＶ９キャプシドは、マウスにおいて効率的な遺伝子治療ベクターとして確立されており、ＦＤＡにより承認されたヒト製品において先に用いられているからである。
次に、治療の機序を評価する。ＭＹＢＰＣ３のＣ末端領域は、ＲＹＲ２と相互作用して、拡張期Ｃａ^２＋フラックスを減少させると考えられる。ＲＹＲ２ＷＴおよびＲＹＲ２Ｒ１７６Ｑ／＋拡張期Ｃａ^２＋フラックスに対するＣＴＤＰの効果を測定する。ＲＹＲ２－Ｒ１７６Ｑ／＋および同腹仔対照マウスを、対照ＡＡＶ（ＡＡＶ－ＧＦＰ）またはＡＡＶ－ＧＦＰ－ＣＴＤＰで処置する。確立されたプロトコルを用いて、６週齢の心筋細胞を単離し、拡張期筋小胞体Ｃａ^２＋リークを測定する^３３。

ＭＹＢＰＣ３がＲＹＲ２と直接的に相互作用するか否かをさらに試験するために、異種性の発現系および平面状の脂質二重層を用いる。ＲＹＲ２野生型またはＲＹＲ２Ｒ１７６Ｑ発現プラスミドを、ＨＥＫ２９３細胞中に遺伝子導入し、小胞体の小胞を精製する。小胞を用いて平面状の脂質二重層に播種する。漸増する濃度の組み換えＣＴＤＰによる処置の後で、二重層を通したＣａ^２＋電流を測定する。ＣＴＤＰは、ＲＹＲ２Ｒ１７６ＱによるＣａ^２＋放出を正常化する。

次に、マウスＣＰＶＴモデルにおける用量－応答および毒性の研究を行う。最適化された治療剤候補を用いて、ＣＰＶＴマウスにおいて用量－応答実験を行い、不整脈を抑制するために形質導入されなければならない心筋細胞の最小のパーセントを決定する。予備実験において、ＡＡＶ－ＣＴＤＰによる用量を見出す、および体内分布の研究を行う。４週齢のマウスに、ＡＡＶ－ＣＴＤＰまたは対照（ＡＡＶ－ＧＦＰ）を静脈内注射する。８週目において、マウスを安楽死させ、組織（心臓、肺、脾臓、肝臓、腎臓、精巣／卵巣、骨格筋、および脳）を、組織学的および分子研究のために回収するであろう。凍結切片を、ＧＦＰ発現について分析する。心臓の試料を、RNAscope in situハイブリダイゼーションにより分析し、ＡＡＶ－ＣＴＤＰにより形質導入された心筋細胞の割合を直接的に測定する。分子研究は、ＧＦＰまたはＣＴＤＰのＲＮＡ発現、および宿主ゲノムあたりのウイルスゲノムコピーを測定する。

１０％、３０％、および５０％の心筋細胞形質導入を生じるウイルス用量を確立し、次に用量－応答研究を行う。２つの異なるマウスＣＰＶＴモデル、ＲＹＲ２－Ｒ１７６Ｑ／＋およびＲＹＲ２－Ｒ４６５０Ｉ／＋を用いる。これらのＣＰＶＴ変異は、タンパク質の反対の末端における異なる変異ホットスポット領域において生じる。両方の遺伝子型の使用は、複数の異なるＣＰＶＴにより引き起こされるＲＹＲ２変異に対する処置が有効であることを示すために役立つ。ＣＰＶＴモデルおよび同腹仔対照マウスの両方を研究する。マウスを、４週齢において、これら３つの用量のＡＡＶ－ＣＴＤＰで、または心筋細胞のうちの５０％を形質導入する用量におけるＡＡＶ－ＧＦＰで処置する。４週間後、マウスに、心エコー図検査、次いで電気生理学研究を行う。電気生理学研究は、右経動脈を通して右心室中への８極ペーシング／記録カテーテルの挿入を含む。マウスは、アドレナリン作動性刺激（イソプロテレノールに加えてエピネフリン）で、および最近記載されたようなプログラムされた心室刺激で^２１処置する。電気生理学研究の後で、マウスを安楽死させ、組織を組織学的および分子アッセイのために保存する。これらの研究は、遺伝子型および処置群に対して盲検化で行う。３つの遺伝子型、および３つの用量に加えて、１つの用量の対照ベクターについて、１群あたり１０個体の動物が存在する。本研究は、１２０個体のマウスの投薬および電気生理学研究を要求する。

次に、ウサギＣＰＶＴモデルにおける有効性を試験する。マウスの心臓生理学は、ヒトとは著しく異なる。例えば、マウスの心拍はヒトよりも１０倍速く、心臓の質量は２０００倍小さい。対照的に、ウサギの心臓生理学は、ヒトとより類似する－ウサギの心拍はヒトよりも２倍速く、質量は約１０倍低い。心拍およびサイズは、心臓のイオンチャネルの発現について、および不整脈に対する感受性について、重要な意味を有する。ウサギとヒトとの心臓の電気生理学の間のより近いアラインメントは、ウサギモデルにおける有効性および安全性の実証が、治療戦略のリスクを著しく低下させるであろうことを示す。ウサギモデルは、ウサギの飼育および収容、ならびに十分なＡＡＶの生成の両方に関して高価である。したがって、最初の用量を見出す研究は、記載されるようにマウスモデルにおいて行い、次いで、ウサギモデルにおいて検証する。

ウサギＣＰＶＴモデル（Ｒ４６５０Ｉ／＋）は、開発中である。対照の、および処置されたＣＰＶＴウサギを、カテコールアミン刺激に対する、またはプログラムされた心室刺激に対する不整脈応答について比較する。
ＡＡＶ－ＧＦＰを用いての、最初の用量を見出す、および体内分布の研究において、マウスのための上のタスク２において記載されるように、治療用ベクターのいくつかの用量を試験し、心臓および他の組織の形質導入を測定する。若齢のウサギ（８週齢）を、静脈内でＡＡＶ－ＧＦＰで処置する。４週間後に、心臓、肺、脾臓、肝臓、腎臓、精巣/卵巣、骨格筋、および脳における形質導入および発現を測定する。RNAscope in situハイブリダイゼーションを用いて同等の心臓の形質導入効率を確認するために、ウサギを、比較可能な用量においてＡＡＶ－ＣＴＤＰで処置する。

ＣＰＶＴおよび同腹仔対照ウサギを、タスク２において記載されるようにマウスにおいて有効であると見出されるレベルまでの、心筋細胞を形質導入するウイルスの用量で処置する。ＣＰＶＴラビットの第３のコホートは、処置内。処置の４週間後、ウサギに、心エコー図検査、次いで電気生理学研究を行う。電気生理学研究は、アドレナリン作動性ストレス（イソプロテレノールに加えてエピネフリン）およびプログラムされた心室刺激の間の表面ＥＫＧおよび心臓内記録からなる。１群あたり合計で１０個体のウサギが存在し、３群において合計３０個体のウサギが存在する。

次いで、ある範囲のＣＰＶＴの遺伝子型にわたるヒトｉＰＳＣ－ＣＭにおける有効性を試験する。４つのＣＰＶＴ変異ホットスポット領域のうちの各々にマッピングするいくつかの異なるＣＰＶＴ遺伝子型を有する患者からのｉＰＳＣ－ＣＭに対して、ＡＡＶ－ＣＴＤＰを試験する。ＡＡＶ２キャプシドは、培養細胞に遺伝子導入するために用いることができる。Ｃａ^２＋スパーク頻度を一次読み出しとして用いて、治療剤候補の有効性を、遺伝子型の間で測定する。

参考文献

均等物および範囲
当業者は、本明細書において記載される態様の多くの均等物を認識するか、または慣用的な実験のみをもちいてこれを確認することができるであろう。本開示の範囲は、上の記載に対して限定されることを意図されず、むしろ、添付の請求の範囲において記載されるとおりである。

「a」、「an」、および「the」などの冠詞は、文脈から逆であることが示されるか別段に明白でない限り、１つまたは１つより多くを意味し得る。群の２つ以上のメンバーの間に「または（or）」を含む請求項または記載は、文脈から逆であることが示されるか別段に明白でない限り、群のメンバーのうちの１つ、１つより多く、または全てが存在する場合に、満たされると考えられる。２つ以上の群のメンバーの間に「または」を含む群の開示は、群のうちの正確に１つのメンバーが存在する態様、群のうちの１つより多くのメンバーが存在する態様、および群のメンバーの全てが存在する態様を提供する。簡潔さの目的のために、これらの態様は、本明細書においては個々にはっきりと詳細に説明はされていないが、これらの態様の各々は、本明細書において提供され、特に請求されても、または放棄されてもよいことが、理解されるであろう。

本開示は、請求項のうちの１つ以上から、または説明の１つ以上の関連する部分からの、１つ以上の限定、要素、節、または説明的用語が、別の請求項中に導入される、全てのバリエーション、組み合わせおよび順列を包含することが、理解されるべきである。例えば、別の請求項に従属する請求項は、同じ基礎請求項に従属する任意の他の請求項において見いだされる限定のうちの１つ以上を含むように改変することができる。さらに、別段に示されない限り、または矛盾もしくは不一致が生じるであろうことが当業者に明らかでない限り、請求項が組成物を記述する場合、本明細書において開示される製造または使用する方法のうちのいずれかにより、または存在する場合には当該分野において公知の方法により、組成物を製造または使用する方法が含まれることが、理解されるべきである。

要素がリストとして、例えばマーカッシュ群形式において存在する場合、要素の全ての可能なサブグループもまた開示されること、および任意の要素または要素のサブグループを、群から取り除くことができることが、理解されるべきである。用語「含むこと（comprising）」は、オープンであることを意図され、追加の要素またはステップの包含を許容することもまた、記述される。一般に、態様、生成物、または方法が、特定の要素、特徴、またはステップを含むものとして言及される場合、かかる要素、特徴、またはステップからなるか、またはこれらから本質的になる態様、生成物、または方法もまた提供されることが、理解されるべきである。簡潔さの目的のために、これらの態様は、これらの態様の各々は、本明細書において提供され、特に請求されても、または放棄されてもよいことが、理解されるであろう。

範囲が示される場合、エンドポイントが含まれる。さらに、別段に示されるか、文脈および／または当業者の理解から別段に明らかでない限り、範囲として表される値は、文脈が明らかに異なることを指示しない限り、いくつかの態様において記述された値の中の任意の特定の値を、当該範囲の下限の単位の１０分の１まで、想定することができることが、理解されるべきである。簡潔さの目的のために、各々の範囲の中の値は、本明細書においては個々にはっきりと詳細に説明はされていないが、これらの値の各々は、本明細書において提供され、特に請求されても、または放棄されてもよいことが、理解されるであろう。また、別段に示されるか、文脈および／または当業者の理解から別段に明らかでない限り、範囲として表される値は、示される範囲の中の任意の部分範囲を想定することができ、ここで、部分範囲のエンドポイントは、当該範囲の下限の単位の１０分の１と同じ程度の正確さまで、表されることが、理解されるべきである。

ウェブサイトが提供される場合、ＵＲＬアドレスは、対応するウェブアドレスの区切りを丸括弧内に入れて、非ブラウザ実行可能コード（non-browser-executable code）として提供される。実際のウェブアドレスは、丸括弧を含まない。

加えて、本開示の任意の特定の態様は、請求項のうちのいずれか１つ以上から明示的に除外することができることが、理解されるべきである。範囲が示される場合、当該範囲内の任意の値は、請求項のうちのいずれか１つ以上から明示的に除外することができる。本開示の組成物および／または方法の任意の態様、要素、特徴、適用、または側面は、任意の１つ以上の請求項から除外することができる。簡潔さの目的のために、１つ以上の要素、特徴、目的、または側面が除外される態様の全ては、本明細書において明示的に記載されない。

Claims

異常なリアノジン受容体２型（ＲＹＲ２）機能に関連する障害を処置する方法であって、必要とする対象に心筋ミオシン結合タンパク質Ｃ（ＭＹＢＰＣ３）のＣ末端ドメインを含むポリペプチドの有効量を投与することを含む、前記方法。
異常なリアノジン受容体２型（ＲＹＲ２）機能に関連する障害を処置する方法であって、必要とする対象に心筋ミオシン結合タンパク質Ｃ（ＭＹＢＰＣ３）のＣ末端ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸の有効量を投与することを含む、前記方法。
異常なＲＹＲ２機能が、ＲＹＲ２における１つ以上の変異により引き起こされる、請求項１または請求項２に記載の方法。
ＲＹＲ２における変異が、対象における心筋細胞において過剰な拡張期Ｃａ^２＋放出を引き起こす、請求項３に記載の方法。
ポリペプチドが、配列番号１～１６または５３～６４のうちのいずれか１つに対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
ポリペプチドが、配列番号１～１６または５３～６４のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の方法。
ヌクレオチド配列が、プロモーターに作動可能に連結されている、請求項２～６のいずれか一項に記載の方法。
核酸が、ベクターである、請求項２～７のいずれか一項に記載の方法。
ベクターが、発現ベクターである、請求項８に記載の方法。
発現ベクターが、ウイルスベクターである、請求項９に記載の方法。
ウイルスベクターが、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、または組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターから選択される、請求項１０に記載の方法。
ウイルスベクターが、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列およびプロモーターに隣接する２つのＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲｓ）をさらに含む、ｒＡＡＶベクターである、請求項１１に記載の方法。
ｒＡＡＶベクターが、ｒＡＡＶ粒子中にパッケージングされる、請求項１１に記載の方法。
ｒＡＡＶ粒子が、キャプシドタンパク質をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
キャプシドタンパク質が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．４３、ＡＡＶ２／２－６６、ＡＡＶ２／２－８４、およびＡＡＶ２／２－１２５、またはそれらのバリアントから選択される血清型のものである、請求項１４に記載の方法。
キャプシドタンパク質が、血清型ＡＡＶ９のものである、請求項１５に記載の方法。
ｒＡＡＶが、自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）である、請求項１１～１６のいずれか一項に記載の方法。
ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、コドン最適化されている、請求項２～１２のいずれか一項に記載の方法。
核酸が、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である、請求項２～６のいずれか一項に記載の方法。
ｍＲＮＡが、修飾されたｍＲＮＡである、請求項１９に記載の方法。
ポリペプチドまたは核酸が、対象における心筋細胞に送達される、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
障害が、不整脈である、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。
不整脈が、遺伝性または後天性である、請求項２２に記載の方法。
遺伝性不整脈が、カテコールアミン誘発性多形性心室性頻拍（ＣＰＶＴ）である、請求項２３に記載の方法。
不整脈が、心室性不整脈または上室性不整脈である、請求項２３に記載の方法。
心室性不整脈が、心室頻拍、心室細動、または心室性期外収縮である、請求項２５に記載の方法。
上室性不整脈が、心房細動、心房粗動、心房頻拍、心房性期外収縮、または発作性上室性頻拍である、請求項２５に記載の方法。
障害が、心不全である、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。
ポリペプチドまたは核酸を投与することが、対象における心筋細胞における過剰な拡張期Ｃａ^２＋放出を減少させる、請求項２５に記載の方法。
対象が、ヒトである、請求項１～２９のいずれか一項に記載の方法。
投与することが、注射を介するものである、請求項１～３０のいずれか一項に記載の方法。
不整脈を処置する方法であって、必要とする対象に組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の有効量を投与することを含み、ここで、ｒＡＡＶが、血清型ＡＡＶ９のキャプシドタンパク質および心筋ミオシン結合タンパク質Ｃ（ＭＹＢＰＣ３）のＣ末端ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、前記方法。
ポリペプチドが、配列番号１～１６または５３～６４のうちのいずれか１つに対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項３２に記載の方法。
ポリペプチドが、配列番号１～１６または５３～６４のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項３２または請求項３３に記載の方法。
ポリペプチドが、配列番号１～１６または５３～６４のうちのいずれか１つのアミノ酸配列からなる、請求項３２に記載の方法。
キャプシドタンパク質および心筋ミオシン結合タンパク質Ｃ（ＭＹＢＰＣ３）のＣ末端ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）。
ポリペプチドが、配列番号１～１６または５３～６４のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項３３に記載のｒＡＡＶ。
ポリペプチドが、配列番号１～１６または５３～６４のうちのいずれか１つのアミノ酸配列からなる、請求項３３に記載のｒＡＡＶ。
異常なリアノジン受容体２型（ＲＹＲ２）機能に関連する障害を処置することにおける、請求項３３または請求項３４に記載のｒＡＡＶの使用。