IT201800004253A1 - Composizioni e metodi per il trattamento della tachicardia ventricolare polimorfa catecolaminergica dominante ereditaria. - Google Patents

Composizioni e metodi per il trattamento della tachicardia ventricolare polimorfa catecolaminergica dominante ereditaria. Download PDF

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Description

DESCRIZIONE dell’invenzione industriale dal titolo:
“Composizioni e metodi per il trattamento della tachicardia ventricolare polimorfa catecolaminergica dominante ereditaria”
DESCRIZIONE
Campo dell’Invenzione
L’invenzione riguarda il settore della biotecnologia degli acidi nucleici e mette a disposizione composizioni e metodi per il trattamento delle malattie genetiche ereditarie. Sfondo dell’invenzione
La tachicardia ventricolare polimorfa catecolaminergica (CPVT) è caratterizzata dalla disregolazione del segnale del calcio nelle cellule cardiache. Sovente i pazienti affetti da CPVT dominante manifestano un rilascio eccessivo o disregolato di calcio dal reticolo sarcoplasmatico dei miociti cardiaci, in particolare durante la diastole. Tale rilascio di calcio può innescare una serie di eventi di segnalazione che terminano con un potenziale di azione che può dar luogo a un battito cardiaco extrasistolico. Questo, a sua volta, può condurre ad aritmia, che, se non trattata, può mettere in pericolo di vita. Le strategie disponibili per migliorare con successo i sintomi della CPVT sono scarse, e si pone la necessità di terapie curative per questa malattia.
Riassunto dell’Invenzione
Sono qui descritte composizioni e metodi per il trattamento di una forma a trasmissione ereditaria dominante di tachicardia ventricolare polimorfa catecolaminergica (CPVT) in un paziente, quale un paziente umano. Le composizioni e i metodi della descrizione riguardano la somministrazione di un gene codificante una proteina calsequestrina 2 (CASQ2) funzionale a un paziente affetto da CPVT dominante. Ad esempio, utilizzando le composizioni e i metodi qui descritti, un transgene che codifica una proteina CASQ2 funzionale può essere somministrato a un paziente mediante terapia genica virale.
Il transgene può essere somministrato in modo tale da facilitare l'espressione di CASQ2 in una cellula del paziente, quale una cellula cardiaca (ad esempio un miocita cardiaco). La descrizione si basa, in parte, sulla scoperta che la somministrazione di un gene codificante per CASQ2 può migliorare la CPVT in un paziente che esprime già una proteina funzionale CASQ2, ed è affetto piuttosto da una o più mutazioni dannose in un'altra proteina regolatrice del calcio. Ad esempio, il paziente può presentare una o più di una molteplicità di mutazioni che danno origine alla CPVT dominante, quali una mutazione con guadagno di funzione in un gene che codifica per il recettore della rianodina di tipo 2 (RYR2) e/o una mutazione in un gene che codifica una calmodulina, quale la calmodulina 1 (CALM1) o la calmodulina 3 (CALM3). Mediante l’impiego delle composizioni e dei metodi qui descritti, la regolazione cardiaca del calcio può essere ripristinata nei pazienti affetti da CPVT dominante, nonostante la presenza di mutazioni in diverse proteine modulatrici del calcio e senza la necessità di fornire versioni funzionali dei geni endogeni mutati.
In un primo aspetto, l'invenzione riguarda un metodo per trattare la CPVT dominante in un paziente (ad esempio un paziente umano che ne ha necessità) somministrando al paziente una quantità terapeuticamente efficace di una composizione contenente un transgene codificante per CASQ2.
In alcune forme di realizzazione, il paziente presenta una mutazione con guadagno di funzione in un gene endogeno che codifica per RYR2. Ad esempio, la mutazione in RYR2 può determinare un incremento nel rilascio del calcio citosolico in un miocita cardiaco che è posto a contatto con un agonista di RYR2 rispetto a un miocita cardiaco che non è posto a contatto con l'agonista di RYR2. In particolare, la mutazione in RYR2 può essere R4497C, N4104K, N4895D, R176Q, G178A, R420W, L433P, P1067S, S2246L, G2273R, F2307L, E2311D, L2344P, R2474S, T2504M, K3717R, L3778F, G3926D, G3946S, Q4159P, V4319-K4324dup, R4651I, V4771I, F4851L, A4860G, I4867M, P4902S, e/o R4959Q.
Ad esempio, il paziente può avere una combinazione di due o più delle mutazioni in RYR2 sopra esposte. In alcune forme di realizzazione, il paziente ha la mutazione R4497C ed una mutazione N4104K, N4895D, R176Q, G178A, R420W, L433P, P1067S, S2246L, G2273R, F2307L, E2311D, L2344P, R2474S, T2504M, K3717R, L3778F, G3926D, G3946S, Q4159P, V4319-K4324dup, R4651I, V4771I, F4851L, A4860G, I4867M, P4902S, o R4959Q.
In alcune forme di realizzazione, il paziente ha la mutazione N4104K e una o più delle mutazioni R4497C, N4895D, R176Q, G178A, R420W, L433P, P1067S, S2246L, G2273R, F2307L, E2311D, L2344P, R2474S, T2504M, K3717R, L3778F, G3926D, G3946S, Q4159P, V4319-K4324dup, R4651I, V4771I, F4851L, A4860G, I4867M, P4902S, e R4959Q.
In alcune forme di realizzazione, il paziente ha la mutazione N4895D e una o più delle mutazioni R4497C, N4104K, R176Q, G178A, R420W, L433P, P1067S, S2246L, G2273R, F2307L, E2311D, L2344P, R2474S, T2504M, K3717R, L3778F, G3926D, G3946S, Q4159P, V4319-K4324dup, R4651I, V4771I, F4851L, A4860G, I4867M, P4902S, e R4959Q.
In alcune forme di realizzazione, il paziente ha la mutazione R176Q e una o più delle mutazioni R4497C, N4104K, N4895D, G178A, R420W, L433P, P1067S, S2246L, G2273R, F2307L, E2311D, L2344P, R2474S, T2504M, K3717R, L3778F, G3926D, G3946S, Q4159P, V4319-K4324dup, R4651I, V4771I, F4851L, A4860G, I4867M, P4902S, e R4959Q.
In alcune forme di realizzazione, il paziente ha la mutazione G178A e una o più delle mutazioni R4497C, N4104K, N4895D, R176Q, R420W, L433P, P1067S, S2246L, G2273R, F2307L, E2311D, L2344P, R2474S, T2504M, K3717R, L3778F, G3926D, G3946S, Q4159P, V4319-K4324dup, R4651I, V4771I, F4851L, A4860G, I4867M, P4902S, e R4959Q.
In alcune forme di realizzazione, il paziente ha la mutazione R420W e una o più delle mutazioni R4497C, N4104K, N4895D, R176Q, G178A, L433P, P1067S, S2246L, G2273R, F2307L, E2311D, L2344P, R2474S, T2504M, K3717R, L3778F, G3926D, G3946S, Q4159P, V4319-K4324dup, R4651I, V4771I, F4851L, A4860G, I4867M, P4902S, e R4959Q.
In alcune forme di realizzazione, il paziente ha la mutazione G178A e una o più delle mutazioni R4497C, N4104K, N4895D, R176Q, R420W, L433P, P1067S, S2246L, G2273R, F2307L, E2311D, L2344P, R2474S, T2504M, K3717R, L3778F, G3926D, G3946S, Q4159P, V4319-K4324dup, R4651I, V4771I, F4851L, A4860G, I4867M, P4902S, e R4959Q.
In alcune forme di realizzazione, il paziente ha la mutazione L433P e una o più delle mutazioni R4497C, N4104K, N4895D, R176Q, R420W, G178A, P1067S, S2246L, G2273R, F2307L, E2311D, L2344P, R2474S, T2504M, K3717R, L3778F, G3926D, G3946S, Q4159P, V4319-K4324dup, R4651I, V4771I, F4851L, A4860G, I4867M, P4902S, e R4959Q.
In alcune forme di realizzazione, il paziente ha la mutazione P1067S e una o più delle mutazioni R4497C, N4104K, N4895D, R176Q, R420W, G178A, L433P, S2246L, G2273R, F2307L, E2311D, L2344P, R2474S, T2504M, K3717R, L3778F, G3926D, G3946S, Q4159P, V4319-K4324dup, R4651I, V4771I, F4851L, A4860G, I4867M, P4902S, e R4959Q.
In alcune forme di realizzazione, il paziente ha la mutazione S2246L e una o più delle mutazioni R4497C, N4104K, N4895D, R176Q, R420W, G178A, L433P, P1067S, G2273R, F2307L, E2311D, L2344P, R2474S, T2504M, K3717R, L3778F, G3926D, G3946S, Q4159P, V4319-K4324dup, R4651I, V4771I, F4851L, A4860G, I4867M, P4902S, e R4959Q.
In alcune forme di realizzazione, il paziente ha la mutazione G2273R e una o più delle mutazioni R4497C, N4104K, N4895D, R176Q, R420W, G178A, L433P, P1067S, S2246L, F2307L, E2311D, L2344P, R2474S, T2504M, K3717R, L3778F, G3926D, G3946S, Q4159P, V4319-K4324dup, R4651I, V4771I, F4851L, A4860G, I4867M, P4902S, e R4959Q.
In alcune forme di realizzazione, il paziente ha la mutazione F2307L e una o più delle mutazioni R4497C, N4104K, N4895D, R176Q, R420W, G178A, L433P, P1067S, S2246L, G2273R, E2311D, L2344P, R2474S, T2504M, K3717R, L3778F, G3926D, G3946S, Q4159P, V4319-K4324dup, R4651I, V4771I, F4851L, A4860G, I4867M, P4902S, e R4959Q.
In alcune forme di realizzazione, il paziente ha la mutazione E2311D e una o più delle mutazioni R4497C, N4104K, N4895D, R176Q, R420W, G178A, L433P, P1067S, S2246L, G2273R, F2307L, L2344P, R2474S, T2504M, K3717R, L3778F, G3926D, G3946S, Q4159P, V4319-K4324dup, R4651I, V4771I, F4851L, A4860G, I4867M, P4902S, e R4959Q.
In alcune forme di realizzazione, il paziente ha la mutazione L2344P e una o più delle mutazioni R4497C, N4104K, N4895D, R176Q, R420W, G178A, L433P, P1067S, S2246L, G2273R, F2307L, E2311D, R2474S, T2504M, K3717R, L3778F, G3926D, G3946S, Q4159P, V4319-K4324dup, R4651I, V4771I, F4851L, A4860G, I4867M, P4902S, e R4959Q.
In alcune forme di realizzazione, il paziente ha la mutazione R2474S e una o più delle mutazioni R4497C, N4104K, N4895D, R176Q, R420W, G178A, L433P, P1067S, S2246L, G2273R, F2307L, E2311D, L2344P, T2504M, K3717R, L3778F, G3926D, G3946S, Q4159P, V4319-K4324dup, R4651I, V4771I, F4851L, A4860G, I4867M, P4902S, e R4959Q.
In alcune forme di realizzazione, il paziente ha la mutazione T2504M e una o più delle mutazioni R4497C, N4104K, N4895D, R176Q, R420W, G178A, L433P, P1067S, S2246L, G2273R, F2307L, E2311D, L2344P, R2474S, K3717R, L3778F, G3926D, G3946S, Q4159P, V4319-K4324dup, R4651I, V4771I, F4851L, A4860G, I4867M, P4902S, e R4959Q.
In alcune forme di realizzazione, il paziente ha la mutazione K3717R e una o più delle mutazioni R4497C, N4104K, N4895D, R176Q, R420W, G178A, L433P, P1067S, S2246L, G2273R, F2307L, E2311D, L2344P, R2474S, T2504M, L3778F, G3926D, G3946S, Q4159P, V4319-K4324dup, R4651I, V4771I, F4851L, A4860G, I4867M, P4902S, e R4959Q.
In alcune forme di realizzazione, il paziente ha la mutazione L3778F e una o più delle mutazioni R4497C, N4104K, N4895D, R176Q, R420W, G178A, L433P, P1067S, S2246L, G2273R, F2307L, E2311D, L2344P, R2474S, T2504M, K3717R, G3926D, G3946S, Q4159P, V4319-K4324dup, R4651I, V4771I, F4851L, A4860G, I4867M, P4902S, e R4959Q.
In alcune forme di realizzazione, il paziente ha la mutazione G3926D e una o più delle mutazioni R4497C, N4104K, N4895D, R176Q, R420W, G178A, L433P, P1067S, S2246L, G2273R, F2307L, E2311D, L2344P, R2474S, T2504M, K3717R, L3778F, G3946S, Q4159P, V4319-K4324dup, R4651I, V4771I, F4851L, A4860G, I4867M, P4902S, e R4959Q.
In alcune forme di realizzazione, il paziente ha la mutazione G3946S e una o più delle mutazioni R4497C, N4104K, N4895D, R176Q, R420W, G178A, L433P, P1067S, S2246L, G2273R, F2307L, E2311D, L2344P, R2474S, T2504M, K3717R, L3778F, G3926D, Q4159P, V4319-K4324dup, R4651I, V4771I, F4851L, A4860G, I4867M, P4902S, e R4959Q.
In alcune forme di realizzazione, il paziente ha la mutazione Q4159P e una o più delle mutazioni R4497C, N4104K, N4895D, R176Q, R420W, G178A, L433P, P1067S, S2246L, G2273R, F2307L, E2311D, L2344P, R2474S, T2504M, K3717R, L3778F, G3926D, G3946S, V4319-K4324dup, R4651I, V4771I, F4851L, A4860G, I4867M, P4902S, e R4959Q.
In alcune forme di realizzazione, il paziente ha la mutazione V4319-K4324dup e una o più delle mutazioni R4497C, N4104K, N4895D, R176Q, R420W, G178A, L433P, P1067S, S2246L, G2273R, F2307L, E2311D, L2344P, R2474S, T2504M, K3717R, L3778F, G3926D, G3946S, Q4159P, R4651I, V4771I, F4851L, A4860G, I4867M, P4902S, e R4959Q.
In alcune forme di realizzazione, il paziente ha la mutazione R4651I e una o più delle mutazioni R4497C, N4104K, N4895D, R176Q, R420W, G178A, L433P, P1067S, S2246L, G2273R, F2307L, E2311D, L2344P, R2474S, T2504M, K3717R, L3778F, G3926D, G3946S, Q4159P, V4319-K4324dup, V4771I, F4851L, A4860G, I4867M, P4902S, e R4959Q.
In alcune forme di realizzazione, il paziente ha la mutazione V4771I e una o più delle mutazioni R4497C, N4104K, N4895D, R176Q, R420W, G178A, L433P, P1067S, S2246L, G2273R, F2307L, E2311D, L2344P, R2474S, T2504M, K3717R, L3778F, G3926D, G3946S, Q4159P, V4319-K4324dup, R4651I, F4851L, A4860G, I4867M, P4902S, e R4959Q.
In alcune forme di realizzazione, il paziente ha la mutazione F4851L e una o più delle mutazioni R4497C, N4104K, N4895D, R176Q, R420W, G178A, L433P, P1067S, S2246L, G2273R, F2307L, E2311D, L2344P, R2474S, T2504M, K3717R, L3778F, G3926D, G3946S, Q4159P, V4319-K4324dup, R4651I, V4771I, A4860G, I4867M, P4902S, e R4959Q.
In alcune forme di realizzazione, il paziente ha la mutazione A4860G e una o più delle mutazioni R4497C, N4104K, N4895D, R176Q, R420W, G178A, L433P, P1067S, S2246L, G2273R, F2307L, E2311D, L2344P, R2474S, T2504M, K3717R, L3778F, G3926D, G3946S, Q4159P, V4319-K4324dup, R4651I, V4771I, F4851L, I4867M, P4902S, e R4959Q.
In alcune forme di realizzazione, il paziente ha la mutazione I4867M e una o più delle mutazioni R4497C, N4104K, N4895D, R176Q, R420W, G178A, L433P, P1067S, S2246L, G2273R, F2307L, E2311D, L2344P, R2474S, T2504M, K3717R, L3778F, G3926D, G3946S, Q4159P, V4319-K4324dup, R4651I, V4771I, F4851L, A4860G, P4902S, e R4959Q.
In alcune forme di realizzazione, il paziente ha la mutazione P4902S e una o più delle mutazioni R4497C, N4104K, N4895D, R176Q, R420W, G178A, L433P, P1067S, S2246L, G2273R, F2307L, E2311D, L2344P, R2474S, T2504M, K3717R, L3778F, G3926D, G3946S, Q4159P, V4319-K4324dup, R4651I, V4771I, F4851L, A4860G, I4867M, e R4959Q.
In alcune forme di realizzazione, il paziente ha la mutazione R4959Q e una o più delle mutazioni R4497C, N4104K, N4895D, R176Q, R420W, G178A, L433P, P1067S, S2246L, G2273R, F2307L, E2311D, L2344P, R2474S, T2504M, K3717R, L3778F, G3926D, G3946S, Q4159P, V4319-K4324dup, R4651I, V4771I, F4851L, A4860G, I4867M, e P4902S.
In alcune forme di realizzazione, il paziente presenta una mutazione in un gene endogeno che codifica per una calmodulina. Ad esempio, il paziente può presentare una mutazione in CALM1, come per esempio una mutazione che riduce l'inibizione di CALM1 del rilascio di calcio dal reticolo sarcoplasmatico di un miocita cardiaco. In alcune forme di realizzazione, il CALM1 che porta la mutazione attiva direttamente il rilascio di calcio dal reticolo sarcoplasmatico di un miocita cardiaco. Ad esempio, la mutazione può aumentare la stabilità di una conformazione aperta di RYR2 in un complesso CALM1-RYR2 presente in una soluzione acquosa avente una concentrazione di Ca<2+ >da circa 50 nM a circa 5 μM (per esempio una concentrazione di Ca<2+ >di circa 50 nM, 100 nM, 150 nM, 200 nM, 250 nM, 300 nM, 350 nM, 400 nM, 450 nM, 500 nM, 550 nM, 600 nM, 650 nM, 700 nM, 750 nM, 800 nM, 850 nM, 900 nM, 950 nM, 1 μM, 2 μM, 3 μM, 4 μM, or 5 μM). In alcune forme di realizzazione, la mutazione in CALM1 è N97S o N53I.
In alcune forme di realizzazione, il paziente presenta una mutazione in CALM3, come per esempio una mutazione che comporta l’attivazione diretta del rilascio di calcio dal reticolo sarcoplasmatico in un miocita cardiaco. In alcune forme di realizzazione, la mutazione in CALM3 è A103V.
In alcune forme di realizzazione, la mutazione in RYR2 o una calmodulina (per esempio, CALM1 e/o CALM3) è eterozigote.
In alcune forme di realizzazione (nelle quali, per esempio, un paziente umano è sottoposto a trattamento), il transgene CASQ2 codifica una proteina avente una sequenza amminoacidica che è identica almeno per l’85% alla sequenza amminoacidica di SEQ ID NO: 1 (per esempio, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9%, o 100% identica alla sequenza amminoacidica di SEQ ID NO: 1). Il transgene CASQ2 può codificare una proteina avente una o più sostituzioni amminoacidiche conservative rispetto alla sequenza amminoacidica di SEQ ID NO: 1. Per esempio, il transgene CASQ2 può codificare una proteina avente sino a 50 sostituzioni amminoacidiche conservative (per esempio, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, o 50 sostituzioni amminoacidiche conservative) rispetto alla sequenza amminoacidica di SEQ ID NO: 1. In alcune forme di realizzazione, il transgene CASQ2 codifica una proteina avente sino a 25 sostituzioni amminoacidiche conservative (per esempio, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, o 25 sostituzioni amminoacidiche conservative) rispetto alla sequenza amminoacidica di SEQ ID NO: 1. In alcune forme di realizzazione, il transgene CASQ2 codifica una proteina avente sino a 10 sostituzioni amminoacidiche conservative (per esempio, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 sostituzioni amminoacidiche conservative) rispetto alla sequenza amminoacidica di SEQ ID NO: 1. In alcune forme di realizzazione, il transgene CASQ2 codifica una proteina avente una sequenza amminoacidica che differisce da quella di SEQ ID NO: 1 soltanto per sostituzioni amminoacidiche conservative.
In alcune forme di realizzazione (nelle quali, per esempio, un paziente umano è sottoposto a trattamento), il transgene CASQ2 codifica una proteina avente una o più sostituzioni amminoacidiche non conservative rispetto alla sequenza amminoacidica di SEQ ID NO: 1. Per esempio, il transgene CASQ2 può codificare una proteina avente sino a 50 sostituzioni amminoacidiche non conservative (per esempio, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, o 50 sostituzioni amminoacidiche non conservative) rispetto alla sequenza amminoacidica di SEQ ID NO: 1. In alcune forme di realizzazione, il transgene CASQ2 codifica una proteina avente sino a 25 sostituzioni amminoacidiche non conservative (per esempio, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, o 25 sostituzioni amminoacidiche non conservative) rispetto alla sequenza amminoacidica di SEQ ID NO: 1. In alcune forme di realizzazione, il transgene CASQ2 codifica una proteina avente sino a 10 sostituzioni amminoacidiche non conservative (per esempio, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 sostituzioni amminoacidiche non conservative) rispetto alla sequenza amminoacidica di SEQ ID NO: 1.
In alcune forme di realizzazione, il transgene CASQ2 codifica una proteina avente una sequenza amminoacidica che è identica almeno per l’85% alla sequenza amminoacidica di SEQ ID NO: 3 (per esempio, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9%, o 100% identica alla sequenza amminoacidica di SEQ ID NO: 3). Il transgene CASQ2 può codificare una proteina avente una o più sostituzioni amminoacidiche conservative rispetto alla sequenza amminoacidica di SEQ ID NO: 3. Per esempio, il transgene CASQ2 può codificare una proteina avente sino a 50 sostituzioni amminoacidiche conservative (per esempio., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, o 50 sostituzioni amminoacidiche conservative) rispetto alla sequenza amminoacidica di SEQ ID NO: 3. In alcune forme di realizzazione, il transgene CASQ2 codifica una proteina avente sino a 25 sostituzioni amminoacidiche conservative (per esempio, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, o 25 sostituzioni amminoacidiche conservative) rispetto alla sequenza amminoacidica di SEQ ID NO: 3. In alcune forme di realizzazione, il transgene CASQ2 codifica una proteina avente sino a 10 sostituzioni amminoacidiche conservative (per esempio, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 sostituzioni amminoacidiche conservative) rispetto alla sequenza amminoacidica di SEQ ID NO: 3. In alcune forme di realizzazione, il transgene CASQ2 codifica una proteina avente una sequenza amminoacidica che differisce da quella di SEQ ID NO: 3 soltanto per sostituzioni amminoacidiche conservative.
In alcune forme di realizzazione, il transgene CASQ2 codifica una proteina avente una o più sostituzioni amminoacidiche non conservative rispetto alla sequenza amminoacidica di SEQ ID NO: 3. Per esempio, il transgene CASQ2 può codificare una proteina avente sino a 50 sostituzioni amminoacidiche non conservative (per esempio, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, o 50 sostituzioni amminoacidiche non conservative) rispetto alla sequenza amminoacidica di SEQ ID NO: 3. In alcune forme di realizzazione, il transgene CASQ2 codifica una proteina avente sino a 25 sostituzioni amminoacidiche non conservative (per esempio, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, o 25 sostituzioni amminoacidiche non conservative) rispetto alla sequenza amminoacidica di SEQ ID NO: 3. In alcune forme di realizzazione, il transgene CASQ2 codifica una proteina avente sino a 10 sostituzioni amminoacidiche non conservative (per esempio, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 sostituzioni amminoacidiche non conservative) rispetto alla sequenza amminoacidica di SEQ ID NO: 3.
In alcune forme di realizzazione (nelle quali, per esempio, un paziente umano è sottoposto a trattamento), il transgene CASQ2 ha una sequenza di acido nucleico che è identica almeno per l’85% alla sequenza di acido nucleico di SEQ ID NO: 2 (per esempio, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9%, o 100% identica alla sequenza di acido nucleico di SEQ ID NO: 2).
In alcune forme di realizzazione, il transgene CASQ2 ha una sequenza di acido nucleico che è identica almeno per l’85% alla sequenza di acido nucleico di SEQ ID NO: 4 (per esempio, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9%, or 100% identica alla sequenza di acido nucleico di SEQ ID NO: 4).
In alcune forme di realizzazione, la composizione contenente il transgene CASQ2 è un vettore, quale ad esempio un vettore virale. Il vettore virale può essere, per esempio, un virus adeno-associato (AAV), adenovirus, lentivirus, retrovirus, poxvirus, baculovirus, virus herpes simplex, virus del vaccino, o un virus sintetico (per esempio, un virus chimerico, un virus mosaico, o virus pseudotipizzato, e/o un virus contenente una proteina estranea, polimero sintetico, nanoparticella, e/o piccola molecola). In alcune forme di realizzazione, il vettore virale è un vettore AAV, quale vettore del sierotipo AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, o AAVrh74. Il vettore AAV può essere pseudotipizzato. In alcune forme di realizzazione, il vettore AAV pseudotipizzato è AAV2/8 o AV2/9.
In alcune forme di realizzazione, la composizione è un vettore (per esempio, un vettore virale, quale un vettore AAV sopra descritto, per esempio un vettore AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh74, AAV2/8, o AV2/9), e il vettore è somministrato al paziente ad una dose da circa 1 x 10<6 >copie genomiche (GC)/kg a circa 1 x 10<18 >GC/kg (per esempio, a una dose di circa 1 x 10<6 >GC/kg, 2 x 10<6 >GC/kg, 3 x 10<6 >GC/kg, 4 x 10<6 >GC/kg, 5 x 10<6 >GC/kg, 6 x 10<6 >GC/kg, 7 x 10<6 >GC/kg, 8 x 10<6 >GC/kg, 9 x 10<6 >GC/kg, 1 x 10<7 >GC/kg, 2 x 10<7 >GC/kg, 3 x 10<7 >GC/kg, 4 x 10<7 >GC/kg, 5 x 10<7 >GC/kg, 6 x 10<7 >GC/kg, 7 x 10<7 >GC/kg, 8 x 10<7 >GC/kg, 9 x 10<7 >GC/kg, 1 x 10<8 >GC/kg, 2 x 10<8 >GC/kg, 3 x 10<8 >GC/kg, 4 x 10<8 >GC/kg, 5 x 10<8 >GC/kg, 6 x 10<8 >GC/kg, 7 x 10<8 >GC/kg, 8 x 10<8 >GC/kg, 9 x 10<8 >GC/kg, 1 x 10<9 >GC/kg, 2 x 10<9 >GC/kg, 3 x 10<9 >GC/kg, 4 x 10<9 >GC/kg, 5 x 10<9 >GC/kg, 6 x 10<9 >GC/kg, 7 x 10<9 >GC/kg, 8 x 10<9 >GC/kg, 9 x 10<9 >GC/kg, 1 x 10<10 >GC/kg, 2 x 10<10 >GC/kg, 3 x 10<10 >GC/kg, 4 x 10<10 >GC/kg, 5 x 10<10 >GC/kg, 6 x 10<10 >GC/kg, 7 x 10<10 >GC/kg, 8 x 10<10 >GC/kg, 9 x 10<10 >GC/kg, 1 x 10<11 >GC/kg, 2 x 10<11 >GC/kg, 3 x 10<11 >GC/kg, 4 x 10<11 >GC/kg, 5 x 10<11 >GC/kg, 6 x 10<11 >GC/kg, 7 x 10<11 >GC/kg, 8 x 10<11 >GC/kg, 9 x 10<11 >GC/kg, 1 x 10<12 >GC/kg, 2 x 10<12 >GC/kg, 3 x 10<12 >GC/kg, 4 x 10<12 >GC/kg, 5 x 10<12 >GC/kg, 6 x 10<12 >GC/kg, 7 x 10<12 >GC/kg, 8 x 10<12 >GC/kg, 9 x 10<12 >GC/kg, 1 x 10<13 >GC/kg, 2 x 10<13 >GC/kg, 3 x 10<13 >GC/kg, 4 x 10<13 >GC/kg, 5 x 10<13 >GC/kg, 6 x 10<13 >GC/kg, 7 x 10<13 >GC/kg, 8 x 10<13 >GC/kg, 9 x 10<13 >GC/kg, 1 x 10<14 >GC/kg, 2 x 10<14 >GC/kg, 3 x 10<14 >GC/kg, 4 x 10<14 >GC/kg, 5 x 10<14 >GC/kg, 6 x 10<14 >GC/kg, 7 x 10<14 >GC/kg, 8 x 10<14 >GC/kg, 9 x 10<14 >GC/kg, 1 x 10<15 >GC/kg, 2 x 10<15 >GC/kg, 3 x 10<15 >GC/kg, 4 x 10<15 >GC/kg, 5 x 10<15 >GC/kg, 6 x 10<15 >GC/kg, 7 x 10<15 >GC/kg, 8 x 10<15 >GC/kg, 9 x 10<15 >GC/kg, 1 x 10<16 >GC/kg, 2 x 10<16 >GC/kg, 3 x 10<16 >GC/kg, 4 x 10<16 >GC/kg, 5 x 10<16 >GC/kg, 6 x 10<16 >GC/kg, 7 x 10<16 >GC/kg, 8 x 10<16 >GC/kg, 9 x 10<16 >GC/kg, 1 x 10<17 >GC/kg, 2 x 10<17 >GC/kg, 3 x 10<17 >GC/kg, 4 x 10<17 >GC/kg, 5 x 10<17 >GC/kg, 6 x 10<17 >GC/kg, 7 x 10<17 >GC/kg, 8 x 10<17 >GC/kg, 9 x 10<17 >GC/kg, or 1 x 10<18 >GC/kg). In alcune forme di realizzazione, il vettore è somministrato al paziente ad una dose da circa 1 x 10<8 >GC/kg a circa 1 x 10<16 >GC/kg (per esempio, ad una dose di circa 1 x 10<8 >GC/kg, 2 x 10<8 >GC/kg, 3 x 10<8 >GC/kg, 4 x 10<8 >GC/kg, 5 x 10<8 >GC/kg, 6 x 10<8 >GC/kg, 7 x 10<8 >GC/kg, 8 x 10<8 >GC/kg, 9 x 10<8 >GC/kg, 1 x 10<9 >GC/kg, 2 x 10<9 >GC/kg, 3 x 10<9 >GC/kg, 4 x 10<9 >GC/kg, 5 x 10<9 >GC/kg, 6 x 10<9 >GC/kg, 7 x 10<9 >GC/kg, 8 x 10<9 >GC/kg, 9 x 10<9 >GC/kg, 1 x 10<10 >GC/kg, 2 x 10<10 >GC/kg, 3 x 10<10 >GC/kg, 4 x 10<10 >GC/kg, 5 x 10<10 >GC/kg, 6 x 10<10 >GC/kg, 7 x 10<10 >GC/kg, 8 x 10<10 >GC/kg, 9 x 10<10 >GC/kg, 1 x 10<11 >GC/kg, 2 x 10<11 >GC/kg, 3 x 10<11 >GC/kg, 4 x 10<11 >GC/kg, 5 x 10<11 >GC/kg, 6 x 10<11 >GC/kg, 7 x 10<11 >GC/kg, 8 x 10<11 >GC/kg, 9 x 10<11 >GC/kg, 1 x 10<12 >GC/kg, 2 x 10<12 >GC/kg, 3 x 10<12 >GC/kg, 4 x 10<12 >GC/kg, 5 x 10<12 >GC/kg, 6 x 10<12 >GC/kg, 7 x 10<12 >GC/kg, 8 x 10<12 >GC/kg, 9 x 10<12 >GC/kg, 1 x 10<13 >GC/kg, 2 x 10<13 >GC/kg, 3 x 10<13 >GC/kg, 4 x 10<13 >GC/kg, 5 x 10<13 >GC/kg, 6 x 10<13 >GC/kg, 7 x 10<13 >GC/kg, 8 x 10<13 >GC/kg, 9 x 10<13 >GC/kg, 1 x 10<14 >GC/kg, 2 x 10<14 >GC/kg, 3 x 10<14 >GC/kg, 4 x 10<14 >GC/kg, 5 x 10<14 >GC/kg, 6 x 10<14 >GC/kg, 7 x 10<14 >GC/kg, 8 x 10<14 >GC/kg, 9 x 10<14 >GC/kg, 1 x 10<15 >GC/kg, 2 x 10<15 >GC/kg, 3 x 10<15 >GC/kg, 4 x 10<15 >GC/kg, 5 x 10<15 >GC/kg, 6 x 10<15 >GC/kg, 7 x 10<15 >GC/kg, 8 x 10<15 >GC/kg, 9 x 10<15 >GC/kg, or 1 x 10<16 >GC/kg). In alcune forme di realizzazione, il vettore è somministrato al paziente ad una dose da circa 1 x 10<10 >GC/kg a circa 1 x 10<14 >GC/kg (ad esempio, ad una dose di circa 1 x 10<10 >GC/kg, 2 x 10<10 >GC/kg, 3 x 10<10 >GC/kg, 4 x 10<10 >GC/kg, 5 x 10<10 >GC/kg, 6 x 10<10 >GC/kg, 7 x 10<10 >GC/kg, 8 x 10<10 >GC/kg, 9 x 10<10 >GC/kg, 1 x 10<11 >GC/kg, 2 x 10<11 >GC/kg, 3 x 10<11 >GC/kg, 4 x 10<11 >GC/kg, 5 x 10<11 >GC/kg, 6 x 10<11 >GC/kg, 7 x 10<11 >GC/kg, 8 x 10<11 >GC/kg, 9 x 10<11 >GC/kg, 1 x 10<12 >GC/kg, 2 x 10<12 >GC/kg, 3 x 10<12 >GC/kg, 4 x 10<12 >GC/kg, 5 x 10<12 >GC/kg, 6 x 10<12 >GC/kg, 7 x 10<12 >GC/kg, 8 x 10<12 >GC/kg, 9 x 10<12 >GC/kg, 1 x 10<13 >GC/kg, 2 x 10<13 >GC/kg, 3 x 10<13 >GC/kg, 4 x 10<13 >GC/kg, 5 x 10<13 >GC/kg, 6 x 10<13 >GC/kg, 7 x 10<13 >GC/kg, 8 x 10<13 >GC/kg, 9 x 10<13 >GC/kg, o 1 x 10<14 >GC/kg).
In alcune forme di realizzazione, la composizione è un liposoma, vescicola, vescicola sintetica, esosoma, esosoma sintetico, dendrimero, o nanoparticella.
In alcune forme di realizzazione, il transgene che codifica CASQ2 è collegato operativamente ad un promotore che induce l’espressione di CASQ2 in un miocita cardiaco. Per esempio, il promotore può essere un promotore di citomegalovirus, promotore della catena leggera della miosina 2, il promotore dell’alfa actina, il promotore della troponina 1, il promotore dello scambiatore Na<+>/Ca<2+>, il promotore della distrofina, il promotore della creatina chinasi, il promotore della integrina alfa 7, il promotore del peptide natriuretico cerebrale, il promotore della alfa B-cristallina/piccola proteina da shock termico, il promotore della catena pesante della miosina alfa, il promotore del fattore natriuretico atriale, o il promotore della desmina.
In alcune forme di realizzazione, subito dopo la somministrazione della composizione al paziente, l'espressione di CASQ2 aumenta in una cellula cardiaca (per esempio, un miocita cardiaco) nel paziente. L’espressione di CASQ2 può essere valutata, per esempio, stimando la proteina CASQ2 o l’mRNA CASQ2 impiegando saggi di espressione genica della tecnica nota e qui descritti. Dopo somministrazione della composizione al paziente, l’espressione di CASQ2 nella cellula cardiaca può subire un incremento, per esempio, da circa 1,1 volte a circa 10 volte, o più (per esempio, circa 1,1 volte, 1,2 volte, 1,3 volte, 1,4 volte, 1,5 volte, 1,6 volte, 1,7 volte, 1,8 volte, 1,9 volte, 2 volte, 2,1 volte, 2,2 volte, 2,3 volte, 2,4 volte, 2,5 volte, 2,6 volte, 2,7 volte, 2,8 volte, 2,9 volte, 3 volte, 3,1 volte, 3,2 volte, 3,3 volte, 3,4 volte, 3,5 volte, 3,6 volte, 3,7 volte, 3,8 volte, 3,9 volte, 4 volte, 4,1 volte, 4,2 volte, 4,3 volte, 4,4 volte, 4,5 volte, 4,6 volte, 4,7 volte, 4,8 volte, 4,9 volte, 5 volte, 5,1 volte, 5,2 volte, 5,3 volte, 5,4 volte, 5,5 volte, 5,6 volte, 5,7 volte, 5,8 volte, 5,9 volte, 6 volte, 6,1 volte, 6,2 volte, 6,3 volte, 6,4 volte, 6,5 volte, 6,6 volte, 6,7 volte, 6,8 volte, 6,9 volte, 7 volte, 7,1 volte, 7,2 volte, 7,3 volte, 7,4 volte, 7,5 volte, 7,6 volte, 7,7 volte, 7,8 volte, 7,9 volte, 8 volte, 8,1 volte, 8,2 volte, 8,3 volte, 8,4 volte, 8,5 volte, 8,6 volte, 8,7 volte, 8,8 volte, 8,9 volte, 9 volte, 9,1 volte, 9,2 volte, 9,3 volte, 9,4 volte, 9,5 volte, 9,6 volte, 9,7 volte, 9,8 volte, 9,8 volte, 10 volte, o più). Per esempio, l’espressione di CASQ2 può subire un incremento da circa 1,5 volte a circa 3,5 volte nella cellula cardiaca (per esempio, circa 1,5 volte, 1,6 volte, 1,7 volte, 1,8 volte, 1,9 volte, 2 volte, 2,1 volte, 2,2 volte, 2,3 volte, 2,4 volte, 2,5 volte, 2,6 volte, 2,7 volte, 2,8 volte, 2,9 volte, 3 volte, 3,1 volte, 3,2 volte, 3,3 volte, 3,4 volte, o 3,5 volte). In alcune forme di realizzazione, l’espressione di CASQ2 subisce un incremento da circa 2 volte a circa 3 volte nella cellula (per esempio, circa 2 volte, 2,1 volte, 2,2 volte, 2,3 volte, 2,4 volte, 2,5 volte, 2,6 volte, 2,7 volte, 2,8 volte, 2,9 volte, o 3 volte). In alcune forme di realizzazione, l’espressione di CASQ2 subisce un incremento da circa 2,5 volte a circa 3 volte nella cellula (per esempio, circa 2,5 volte, 2,6 volte, 2,7 volte, 2,8 volte, 2,9 volte, o 3 volte).
In alcune forme di realizzazione, dopo somministrazione della composizione al paziente, l’espressione di RYR2, triadina, e/o giuntina non viene sostanzialmente alterata in una cellula cardiaca per esempio, un miocita cardiaco) nel paziente, come determinato, per esempio, stimando l’espressione della proteina e/o dell’mRNA. Per esempio, dopo somministrazione della composizione al paziente, l’espressione di RYR2, triadina, e/o giuntina subisce un incremento e/o riduzione inferiore al 10% (per esempio, 9,9%, 9,8%, 9,7%, 9,6%, 9,5%, 9,4%, 9,3%, 9,2%, 9,1%, 9%, 8,9%, 8,8%, 8,7%, 8,6%, 8,5%, 8,4%, 8,3%, 8,2%, 8,1%, 8%, 7,9%, 7,8%, 7,7%, 7,6%, 7,5%, 7,4%, 7,3%, 7,2%, 7,1%, 7%, 6,9%, 6,8%, 6,7%, 6,6%, 6,5%, 6,4%, 6,3%, 6,2%, 6,1%, 6%, 5,9%, 5,8%, 5,7%, 5,6%, 5,5%, 5,4%, 5,3%, 5,2%, 5,1%, 5%, 4,9%, 4,8%, 4,7%, 4,6%, 4,5%, 4,4%, 4,3%, 4,2%, 4,1%, 4%, 3,9%, 3,8%, 3,7%, 3,6%, 3,5%, 3,4%, 3,3%, 3,2%, 3,1%, 3%, 2,9%, 2,8%, 2,7%, 2,6%, 2,5%, 2,4%, 2,3%, 2,2%, 2,1%, 2%, 1,9%, 1,8%, 1,7%, 1,6%, 1,5%, 1,4%, 1,3%, 1,2%, 1,1%, 1%, 0,9%, 0,8%, 0,7%, 0,6%, 0,5%, 0,4%, 0,3%, 0,2%, 0,1%, 0,01%, 0,001%, o meno).
In alcune forme di realizzazione, la composizione viene somministrata al paziente per via intradermica, transdermica, parenterale, endovenosa, intramuscolare, intranasale, sottocutanea, percutanea, intratracheale, intraperitoneale, intraarteriosa, intravascolare, inalatoria, perfusione, lavaggio, o somministrazione orale.
In un altro aspetto, l'invenzione riguarda un kit che include una composizione contenente un transgene codificante per CASQ2. Il kit può inoltre includere un foglietto illustrativo che fornisce istruzioni ad un utente del kit di somministrare la composizione a un paziente (ad esempio, un paziente umano) per trattare la CPVT dominante nel paziente secondo il suddetto metodo dell'invenzione e/o una qualsiasi delle sopramenzionate sue forme di realizzazione.
In alcune forme di realizzazione del precedente aspetto, il transgene CASQ2 codifica una proteina avente una sequenza amminoacidica che è identica almeno per l’85% alla sequenza amminoacidica di SEQ ID NO: 1 (ad esempio, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,9%, o 100% identica alla sequenza amminoacidica di SEQ ID NO: 1).
In alcune forme di realizzazione del precedente aspetto dell’invenzione, il transgene CASQ2 codifica ha una sequenza di acido nucleico che è identica almeno per l’85% alla sequenza di acido nucleico di SEQ ID NO: 2 (ad esempio, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,9%, o 100% identica alla sequenza di acido nucleico di SEQ ID NO: 2).
In alcune forme di realizzazione del precedente aspetto dell’invenzione, la composizione contenente il transgene CASQ2 è un vettore, quale ad esempio un vettore virale. Il vettore virale può essere, per esempio, un virus adeno-associato (AAV), adenovirus, lentivirus, retrovirus, poxvirus, baculovirus, virus herpes simplex, o un virus del vaccino. In alcune forme di realizzazione, il vettore virale è un vettore AAV, quale vettore del sierotipo AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, o AAVrh74. Il vettore AAV può essere pseudotipizzato. In alcune forme di realizzazione, il vettore AAV pseudotipizzato è AAV2/8 o AV2/9.
In alcune forme di realizzazione del precedente aspetto dell’invenzione, la composizione è un liposoma, vescicola, vescicola sintetica, esosoma, esosoma sintetico, dendrimero, o nanoparticella.
In alcune forme di realizzazione del precedente aspetto dell’invenzione, il transgene che codifica CASQ2 è collegato operativamente ad un promotore che induce l’espressione di CASQ2 in un miocita cardiaco. Ad esempio, il promotore può essere un promotore della catena leggera della miosina 2, il promotore dell’alfa actina, il promotore della troponina 1, il promotore dello scambiatore Na<+>/Ca<2+>, il promotore della distrofina, il promotore della creatina chinasi, il promotore della integrina alfa 7, il promotore del peptide natriuretico cerebrale, il promotore della alfa B-cristallina/piccola proteina da shock termico, il promotore della catena pesante della miosina alfa, il promotore del fattore natriuretico atriale, o il promotore della desmina.
Definizioni
Come qui utilizzato, il termine “circa” si riferisce ad un valore che è entro il 10% al di sopra o al di sotto del valore che è stato descritto.
Come qui utilizzati, i termini “calmodulina 1” (“CALM1”) e “calmodulina 3” (“CALM3”) si riferiscono alla proteina calmodulina legante il calcio espressa come messaggeri secondari, ad esempio, nelle cellule muscolari (ad esempio, miociti cardiaci). CALM1 e CALM3 aiutano a regolare la concentrazione citosolica di ioni calcio bivalenti. Una sequenza amminoacidica illustrativa di CALM1 wild-type si trova nella Sequenza di Riferimento NCBI No. NP_008819.1. Analogamente, una sequenza amminoacidica illustrativa di CALM3 wild-type si trova nella Sequenza di Riferimento NCBI No. NP_001316851.1.
Come qui utilizzati, i termini “calsequestrina 2” and “CASQ2” si riferiscono alla proteina legante il calcio responsabile della regolazione delle concentrazioni citosoliche del calcio bivalente, ad esempio nel tessuto muscolare, come nei miociti cardiaci. Nell'uomo, il gene presente in natura che codifica CASQ2 si trova sul cromosoma 1 ed è anche noto come "PDIB2". I termini "calsequestrina 2", "CASQ2" e "PDIB2" sono qui impiegati in modo intercambiabile e si riferiscono non solo a forme wild-type di CASQ2, ma anche a varianti di proteine CASQ2 wild-type e acidi nucleici che codificano le stesse. La sequenza amminoacidica di CASQ2 umana wild-type è qui fornita come SEQ ID NO: 1, ed è descritta nello stato dell’arte come Sequenza di Riferimento NCBI No. NP_001223.2. In aggiunta, la sequenza di acido nucleico di CASQ2 umana wild-type è qui fornita come SEQ ID NO: 2, ed è descritta nello stato dell’arte come Sequenza di Riferimento NCBI No. NM_001232.3. I transgeni CASQ2 che possono essere impiegati in congiunzione con le composizioni e i metodi qui descritti includono quelli che codificano una proteina avente una sequenza amminoacidica che è identica almeno per l'85% alla sequenza amminoacidica di SEQ ID NO: 1 (ad esempio, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,9%, o 100% identica alla sequenza amminoacidica di SEQ ID NO: 1), così come i transgeni che codificano una proteina avente una o più sostituzioni conservative di amminoacidi (ad esempio, sino a 5, sino a 10, sino a 15, sino a 20, sino a 25, sino a 30, sino a 35, sino a 40, sino a 45, o sino a 50 sostituzioni conservative di amminoacidi) e/o una o più sostituzioni non conservative di amino acidi (ad esempio, 5, sino a 10, sino a 15, sino a 20, sino a 25, sino a 30, sino a 35, sino a 40, sino a 45, o sino a 50 sostituzioni non conservative di amino acidi) rispetto alla sequenza amminoacidica di SEQ ID NO: 1. Transgeni CASQ2 illustrativi che possono essere impiegati in congiunzione con le composizioni e i metodi qui descritti includono quelli che hanno una sequenza di acido nucleico amminoacidica che è identica almeno per l'85% alla sequenza di acido nucleico di SEQ ID NO: 2 (ad esempio, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,9%, o 100% identica alla sequenza di acido nucleico di SEQ ID NO: 2). I transgeni CASQ2 qui descritti includono, inoltre, quelli che codificano per frammenti delle proteine sopra menzionate che mantengono la capacità di polimerizzare e legare il calcio bivalente, per esempio, con un’affinità che arriva sino al 25% (ad esempio con un’affinità che è entro 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, o 25%) dell’affinità di CASQ2 wild-type e/o con una stechiometria che si discosta da quella di CASQ2 wild-type di non più del 25% (ad esempio, non più del 25%, 24%, 23%, 22%, 21%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, o meno). Esempi di saggi che possono essere impiegati per valutare l'affinità del legame del calcio e la stechiometria fanno parte della tecnica nota e illustrati, per esempio, in Johnson et al. Metodi Biol. 173: 89-102 (2002), il cui contenuto è qui incorporato come citazione nella sua interezza.
Come qui utilizzati, i termini “tachicardia ventricolare polimorfa catecolaminergica” e “CPVT” si riferiscono a una canalopatia ereditaria caratterizzata da un'alta suscettibilità del paziente a aritmie potenzialmente letali. Sono state descritte due forme della malattia: varianti autosomiche dominanti e autosomiche recessive. La forma autosomica dominante della malattia è associata a mutazioni nel gene del recettore cardiaco della rianodina di tipo 2 (RYR2), mentre la variante autosomica recessiva è associata a mutazioni nel gene CASQ2 (si veda, a titolo esemplificativo, Priori et al., Circulation 104 (Supplement II):335 (2001), e Lahat et al., Am. J. Hum. Genet. 69:1378-1384 (2001), i cui contenuti sono qui incorporati come citazione nella loro interezza). I pazienti affetti dalla forma ereditaria dominante della malattia, menzionata qui in modo intercambiabile come "CPVT dominante" e "CPVT autosomica dominante", tipicamente si presentano con tachicardia ventricolare bidirezionale e polimorfa in risposta all'attivazione simpatica. I profili elettrocardiografici a riposo dei pazienti affetti da CPVT dominante sono normali e la struttura del cuore è preservata. Le aritmie nella CPVT sono provocate da eventi di rilascio di calcio che non sono innescati da un potenziale d'azione, definiti qui come "rilascio spontaneo di calcio" o "SCR". Un SCR ha inizio come un evento localizzato che coinvolge una singola unità di rilascio del calcio (CRU), ma può anche diffondersi alle CRU vicine, innescando così un maggior rilascio di calcio, che dà origine ad un'onda di calcio in tutta la cellula. Quando si verifica un'anomala liberazione di calcio dal reticolo sarcoplasmatico, il potenziale d'azione che ne deriva può propagarsi all'intero cuore, dando origine ad un battito extrasistolico. Quando questa catena di eventi diventa ripetitiva, insorge l'attività aritmica provocata. La CPVT dominante è causata frequentemente da mutazioni nel recettore della rianodina di tipo 2 (RYR2), che è stato dimostrato facilitare l'insorgenza di SCR durante la stimolazione β adrenergica. Le aritmie generate come risultato di queste alterazioni nella regolazione dell'attività del calcio possono condurre ad aritmie potenzialmente letali (si veda, per esempio, Liu et al., Circulation Research 99: 292-298 (2006), il cui contenuto è qui incorporato come citazione nella sua interezza). Mutazioni in RYR2 che sono associate con la CPVT dominante includono iR4497C, N4104K, N4895D, R176Q, G178A, R420W, L433P, P1067S, S2246L, G2273R, F2307L, E2311D, L2344P, R2474S, T2504M, K3717R, L3778F, G3926D, G3946S, Q4159P, V4319-K4324dup, R4651I, V4771I, F4851L, A4860G, I4867M, P4902S, e R4959Q.
Come qui utilizzate, mutazioni nelle proteine sono rappresentate usando la forma “AA1-N-AA2,” in cui AA1 rappresenta l'amminoacido che è presente nella posizione N della forma wild-type della proteina di interesse e AA2 rappresenta l'amminoacido che è presente nella posizione N della forma mutata della proteina. Ad esempio, mutante “R4497C” di RYR2 si riferisce ad una forma variante di RYR2 in cui il residuo di arginina nella posizione 4497 della proteina RYR2 wil-type è sostituito con un residuo di cisteina. Il mutante “V4319-K4324dup” di RYR2 si riferisce ad una forma variante del gene RYR2 in cui i nucleotidi codificanti i residui aminoacidici V4319 a K4324 di RYR2 wild-type sono duplicati, dando luogo ad un’inserzione di un instance aggiuntiva dei 18 nucleotidi codificanti questi amino acidi (ad esempio un’inserzione dei residui GTCGAAGGTGCTAAAAAG (SEQ ID NO: 7) tra i nucleotidi 12955 e 12956 di un gene RYR2 wild-type).
Come qui utilizzati, i termini "mutazione conservativa", "sostituzione conservativa" o "sostituzione amminoacidica conservativa" si riferiscono alla sostituzione di uno o più amminoacidi con uno o più amminoacidi diversi che presentano proprietà fisico-chimiche simili, quali la polarità, carica elettrostatica e volume sterico. Tali proprietà sono riassunte per ciascuno dei venti aminoacidi presenti in natura nella Tabella 1 qui sotto.
Tabella 1. Proprietà fisico-chimiche rappresentative degli amminoacidi presenti in natura
<†>basato sul volume in A<3>: 50-100 è piccolo, 100-150 è intermedio, 150-200 è grande, e >200 è ingombrante.
Da questa tabella si evince che le famiglie di amminoacidi conservative includono, ad esempio, (i)
G, A, V, L, I, P, e M; (ii) D ed E; (iii) C, S e T;
(iv) H, K e R; (v) N e Q; e (vi) F, Y e W. Pertanto,
una mutazione o sostituzione conservativa è quella
mutazione che sostituisce un amminoacido con un
membro della stessa famiglia di amminoacidi (ad
esempio, una sostituzione di Ser con Thr o Lys con
Arg).
Come qui utilizzato nel contesto di una
mutazione, il termine "eterozigote" si riferisce ad
un caso in cui un paziente ha un allele mutante di un particolare gene: un allele materno mutante o un allele paterno mutante.
Come qui utilizzato nel contesto di una mutazione, il termine "omozigote" si riferisce ad un caso in cui un paziente ha due alleli mutanti di un particolare gene: un allele materno mutante e un allele paterno mutante.
Come qui utilizzato, il termine "mutazione con guadagno di funzione" si riferisce a una mutazione in cui la funzione di una proteina viene aumentata in virtù della sostituzione, inserzione e o delezione di uno o più amminoacidi all'interno della proteina. Ad esempio, la proteina recettore della rianodina di tipo 2 (RYR2) è una proteina canale che media il rilascio di ioni calcio bivalenti dal reticolo sarcoplasmatico dei miociti cardiaci nel citosol. Esempi di mutazioni con guadagno di funzione nel contesto di RYR2 sono quelle che si traducono in un’elevata esportazione di calcio dal reticolo sarcoplasmatico mediata da RYR2. Mutazioni di guadagno di funzione in RYR2 includono, tra l’altro, R4497C, N4104K, N4895D, R176Q, G178A, R420W, L433P, P1067S, S2246L, G2273R, F2307L, E2311D, L2344P, R2474S, T2504M, K3717R, L3778F, G3926D, G3946S, Q4159P, V4319-K4324dup, R4651I, V4771I, F4851L, A4860G, I4867M, P4902S, e/o R4959Q.
Come qui utilizzato, il termine "collegato operativamente" si riferisce ad una prima molecola (ad esempio, un primo acido nucleico) connessa ad una seconda molecola (ad esempio un secondo acido nucleico), in cui le molecole sono disposte in modo tale che la prima molecola influenzi la funzione della seconda molecola. Le due molecole possono o non possono far parte di una singola molecola contigua e possono o meno essere adiacenti l'una all'altra. Ad esempio, un promotore è operativamente collegato a una molecola polinucleotidica trascrivibile se il promotore modula la trascrizione della molecola polinucleotidica trascrivibile di interesse in una cellula. Inoltre, due porzioni di un elemento regolatore della trascrizione sono collegate operativamente l'una all'altra se sono connesse in modo tale che la funzionalità di attivazione della trascrizione di una porzione non sia influenzata negativamente dalla presenza dell'altra porzione. Due elementi regolatori di trascrizione possono essere collegati operativamente l'uno all'altro mediante un acido nucleico di congiunzione (ad esempio un acido nucleico intermedio non codificante) o possono essere collegati operativamente l'uno all'altro senza che siano presenti nucleotidi intermedi.
"La percentuale (%) di identità di sequenza " rispetto a una sequenza polinucleotidica o polipeptidica di riferimento è definita come la percentuale di acidi nucleici o amminoacidi in una sequenza candidato che sono identici agli acidi nucleici o agli amminoacidi nella sequenza polinucleotidica o polipeptidica di riferimento, dopo aver allineato le sequenze e introdotto spazi vuoti, se necessario, per ottenere la percentuale massima di identità di sequenza. L'allineamento ai fini della determinazione della percentuale di identità di una sequenza di acido nucleico o amminoacidica può essere realizzato in vari modi, che rientrano nelle capacità dell’esperto dell'arte, ad esempio utilizzando programmi per computer pubblicamente accessibili come BLAST, BLAST-2, o Megalign Software. Gli esperti del settore sono in grado di determinare i parametri appropriati per l’allineamento delle sequenze, ivi incluso qualsiasi algoritmo necessario ad ottenere il massimo allineamento su tutta la lunghezza delle sequenze poste a confronto. Ad esempio, i valori percentuali della identità di sequenza possono essere generati impiegando il programma per computer BLAST di confronto di sequenze. A titolo illustrativo, la percentuale di identità di sequenza di una data sequenza di acido nucleico o amminoacidica, A, con, o contro una data sequenza di acido nucleico o amminoacidica, B, (che, in alternativa, può essere formulata come una data sequenza di acido nucleico o amminoacidica, A, che ha una certa percentuale d’identità di sequenza con, o contro una data sequenza di acido nucleico o amminoacidica, B) è calcolata come segue:
100 moltiplicato per (rapporto X/Y)
dove X è il numero di nucleotidi o amminoacidi conteggiati come appaiamenti identici da un programma di allineamento di sequenza (es. BLAST) nell'allineamento di A e B generato da quel programma, e dove Y è il numero totale di acidi nucleici in B. Sarà apprezzato che laddove la lunghezza della sequenza di acido nucleico o amminoacidica A non è uguale alla lunghezza della sequenza di acido nucleico o amminoacidica B, la percentuale di identità di sequenza tra A e B non sarà uguale alla percentuale di identità di sequenza tra B e A.
Come utilizzato qui, il termine "composizione farmaceutica" si riferisce a una miscela contenente un agente terapeutico, opzionalmente in combinazione con uno o più eccipienti, diluenti e/o vettori farmaceuticamente accettabili, da somministrare a un soggetto, quale un mammifero, ad esempio, un essere umano, al fine di prevenire, trattare o controllare una particolare malattia o condizione che colpisce o che può colpire il soggetto.
Come utilizzato qui, il termine "farmaceuticamente accettabile" si riferisce a quei composti, materiali, composizioni e/o forme di dosaggio, che sono idonei al contatto con i tessuti di un soggetto, quale un mammifero (ad esempio un essere umano) senza eccessiva tossicità, irritazione, risposta allergica e altre complicazioni problematiche commisurate ad un ragionevole rapporto rischio/beneficio.
Come qui utilizzati, i termini "recettore della rianodina di tipo 2 " e "RYR2" si riferiscono alla proteina canale del calcio localizzata sull'esterno del reticolo sarcoplasmatico, ad esempio, nei miociti cardiaci. RYR2 media il rilascio di calcio bivalente dal reticolo sarcoplasmatico, che a sua volta stimola i potenziali d'azione che portano alle contrazioni cardiache. Una sequenza amminoacidica illustrativa di RYR2 umano wild-type si trova si trova nella Sequenza di Riferimento NCBI No. NP_001026.2.
Come qui utilizzati, i termini "agonista del recettore della rianodina di tipo 2 " e "agonista del RYR2" si riferiscono ad agenti che stimolano le proprietà di rilascio del calcio della proteina canale RYR2. A titolo esemplificativo ma non limitativo, agonisti di RYR2 includono, tra gli altri, caffeina, epinefrina, trifluoroperazina e maurocalcina.
Come qui utilizzato, il termine "campione" si riferisce a un campione (ad esempio, sangue, componente ematico (es. siero o plasma), urina, saliva, liquido amniotico, fluido cerebrospinale, tessuto (ad es. placentare o dermico), fluido pancreatico, campione di villi coriali, o cellule) isolato da un soggetto. Il soggetto può essere, per esempio, un paziente affetto da una malattia qui descritta, quale un disturbo cardiaco ereditabile (ad esempio una tachicardia, come la tachicardia ventricolare polimorfa catecolaminergica dominante).
Come qui utilizzate, le frasi "si lega specificamente" e "si lega" si riferiscono a una reazione di legame che è determinativa della presenza di una particolare molecola o ione, come uno ione calcio divalente, in una popolazione eterogenea di ioni, sali, piccole molecole e/o proteine che sono riconosciute, ad esempio, da un ligando o recettore, quale ad esempio una proteina legante il calcio, con particolarità. Un ligando (ad esempio una proteina legante il calcio) che si lega specificamente ad una specie (ad esempio uno ione bivalente) può legarsi alla specie, per esempio con un KD inferiore a 1 mM. Ad esempio, un ligando che si lega specificamente a una specie può legarsi alla specie con un KD sino a 100 μM (ad es. tra 1 pM e 100 μM). Un ligando che non esibisce un legame specifico con un'altra molecola o ione può presentare un KD maggiore di 1 mM (ad es. 1 μM, 100 μM, 500 μM, 1 mM, o superiore) per quella particolare molecola o ione. Al fine di determinare l'affinità di un ligando per una proteina specifica possono essere impiegati una varietà di formati di saggi. Ad esempio, i saggi ELISA su fase solida vengono abitualmente utilizzati per identificare ligandi che legano in modo specifico una proteina bersaglio. Si veda, ad esempio, Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York (1988) e Harlow & Lane, Using Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York (1999), per una descrizione dei formati di saggio e delle condizioni che possono essere impiegate per determinare il legame specifico di una proteina. Esempi di saggi che possono essere impiegati per determinare l’affinità di un ligando per uno ione bersaglio (ad esempio uno ione di calcio divalente) sono descritti, ad esempio, in Johnson et al. Methods Mol. Biol. 173:89-102 (2002), il cui contenuto è qui incorporato come citazione nella sua interezza.
Come qui utilizzati, i termini "soggetto" e "paziente" si riferiscono a un organismo che riceve un trattamento per una particolare malattia o condizione come qui descritta (quale un disturbo cardiaco ereditabile, per esempio, la tachicardia ventricolare polimorfa catecolaminergica dominante autosomica). A titolo esemplificativo, soggetti e pazienti includono mammiferi, come gli esseri umani, che ricevono un trattamento per una malattia o una condizione qui descritta.
Come qui utilizzato, il termine "tachicardia" si riferisce a una frequenza cardiaca presentata da un paziente (ad esempio, un paziente umano affetto da CPVT dominante) che supera la frequenza cardiaca normale a riposo per una data specie. Nel caso del trattamento di un paziente umano, la tachicardia include casi in cui la frequenza cardiaca del paziente supera i 100 battiti al minuto. Metodi per monitorare la tachicardia fanno parte della tecnica nota e sono descritti, ad esempio, nell'Esempio 1, di seguito.
Come qui utilizzato, il termine "elemento regolatorio della trascrizione" si riferisce ad un acido nucleico che controlla, almeno in parte, la trascrizione di un gene di interesse. Gli elementi regolatori trascrizionali possono includere promotori, potenziatori e altri acidi nucleici (per esempio segnali di poliadenilazione) che controllano o aiutano a controllare la trascrizione genica. Esempi di elementi regolatori trascrizionali sono descritti, ad esempio, in Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185 (Academic Press, San Diego, CA, 1990).
Come qui utilizzati, i termini "trattare" o "trattamento" si riferiscono al trattamento terapeutico, il cui oggetto è prevenire o rallentare (attenuare) un cambiamento fisiologico indesiderato o disturbo, come la progressione di un disturbo cardiaco ereditabile, quale ad esempio la CPVT, e in particolare, la CPVT dominante. Nell’ambito del trattamento della CPVT, i risultati clinici benefici o desiderati includono, ma non sono limitati a, attenuazione dei sintomi, diminuzione dell'entità della malattia, stato di malattia stabilizzato (cioè non peggiorato), ritardo o rallentamento della progressione della malattia, miglioramento o alleviamento dello stato di malattia e remissione (parziale o totale), rilevabile o non rilevabile. Il trattamento di un paziente affetto da CPVT (ad esempio CPVT dominante) può manifestarsi in uno o più cambiamenti rilevabili, quali una diminuzione nella quantità o nella frequenza di eventi di aritmia (ad esempio eventi di tachicardia) presentati dal paziente in un periodo di tempo determinato dopo la somministrazione di un agente terapeutico qui descritto (ad esempio, una diminuzione nella quantità o nella frequenza di eventi di aritmia (ad esempio eventi di tachicardia) mostrati dal paziente dopo la somministrazione di un vettore, quale un vettore virale, codificante per un transgene CASQ2 qui descritto). Ad esempio, indicazioni di un trattamento di successo di un paziente affetto da CPVT dominante impiegando le composizioni e i metodi qui descritti comprendono la constatazione che il numero e/o la frequenza di eventi di aritmia (ad esempio eventi di tachicardia) mostrati dal paziente sono diminuiti, ad esempio, dell'1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, o 100%, in un periodo di tempo determinato a seguito della somministrazione dell'agente terapeutico rispetto al numero e/o frequenza di eventi di aritmia (ad esempio, eventi di tachicardia) manifestati dal paziente in un periodo di tempo (ad esempio, un periodo di tempo della stessa lunghezza) verificatisi precedentemente alla somministrazione dell'agente terapeutico. Ulteriori indicazioni cliniche di trattamento di successo di un paziente affetto da CPVT comprendono la constatazione che la concentrazione diastolica media del calcio citosolico ([Ca2 ]) in una cellula cardiaca (ad esempio in un cardiomiocita) del paziente è diminuita, ad esempio, dell'1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, o più, a seguito della somministrazione di un agente terapeutico al paziente. Ancora un’altra indicazione di trattamento di successo è trovare che l’espressione di CASQ2 nel paziente ad esempio in una cellula cardiaca del paziente quale un cardiomiocita) è aumentata dopo la somministrazione di una agente terapeutico. L’espressione di CASQ2 può aumentare, per esempio, dell’1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 1 volta, 2 volte, 3 volte, 4 volte, 5 volte, 6 volte, 7 volte, 8 volte, 9 volte, 10 volte, o più. La concentrazione della proteina CASQ2 può essere determinata ex vivo, per esempio, usando saggi di rilevazione delle proteine noti nello stato dell’arte, ivi inclusi i saggi ELISA qui descritti. La concentrazione di acidi nucleici codificanti per CASQ2 può essere determinata ex vivo, per esempio, usando saggi di rivelazione di acido nucleico (per esempio, saggi di RNA Seq) qui descritti.
Come qui utilizzato, il termine "vettore" si riferisce ad un acido nucleico, ad esempio DNA o RNA, che può funzionare quale veicolo per il trasferimento di un gene di interesse in una cellula (ad esempio, una cellula di mammifero, come una cellula umana), per scopi quali la replicazione e/o l’espressione. Esempi di vettori utili in congiunzione alle composizioni e i metodi qui descritti sono plasmidi, vettori di DNA, vettori di RNA, virioni o altro replicone idoneo (ad esempio, vettore virale). Sono stati sviluppati una varietà di vettori idonei al trasferimento di polinucleotidi codificanti proteine esogene in una cellula procariotica o eucariotica. Esempi di tali vettori di espressione sono descritti, ad esempio, in WO 1994/11026, il cui contenuto è qui incorporato come citazione. Vettori di espressione qui descritti contengono una sequenza polinucleotidica nonché, per esempio, elementi addizionali di sequenza impiegati per l'espressione di proteine e/o l'integrazione di tali sequenze di polinucleotidi nel genoma di una cellula di mammifero. Alcuni vettori che possono essere utilizzati per l'espressione dei transgeni qui descritti includono plasmidi che contengono sequenze regolatrici, come regioni promotore e enhancer, che dirigono la trascrizione genica. Altri vettori utili per l'espressione di transgeni contengono sequenze polinucleotidiche che accrescono il tasso di traduzione di questi geni o migliorano la stabilità o l'esportazione nucleare dell'mRNA che deriva dalla trascrizione genica. Questi elementi di sequenza includono, per esempio, regioni 5 'e 3' non tradotte, un sito interno di entrata del ribosoma (IRES) e un sito di segnale di poliadenilazione allo scopo di dirigere un’efficiente trascrizione del gene trasportato sul vettore di espressione. I vettori di espressione qui descritti possono anche contenere un polinucleotide che codifica un marcatore per selezionare le cellule che contengono tale vettore. Esempi di marcatori idonei includono geni che codificano la resistenza agli antibiotici, come ampicillina, cloramfenicolo, kanamicina o nourseothricin.
Breve Descrizione delle Figure
FIG. 1 è un diagramma del costrutto pAAV2.1-CMV-CASQ2-IRES-eGP usato negli esperimenti murini di terapia genica CASQ2 illustrati nell'Esempio 1, di seguito. Il vettore contiene, nella direzione 5'-3 ', al 5’ una ripetizione terminale invertita (ITR) AAV2, promotore del citomegalovirus (CMV), introne del virus delle scimmie 40 (SV40), transgene della calsequestrina 2 (CASQ2) murina wild-type, sito interno di entrata del ribosoma (IRES), transgene della proteina fluorescente verde potenziata (eFFP), elemento regolatorio post-trascrizionale del woodchuck (WPRE), sequenza di poliadenilazione dell'ormone della crescita bovino (BGH), e al 3 ' ITR AAV2. Il costrutto pAAV2.1-CMV-CASQ2-IRES-eGFP impiegato nell'esempio 1, di seguito, è stato impacchettato in un capside AAV9, generando in tal modo un vettore AAV2/9 ricombinante.
FIG. 2 è un grafico che illustra l'effetto del vettore pAAV2.1-CMV-CASQ2-IRES-eGFP sulla percentuale di eventi aritmici nei topi knock-in eterozigoti R4496C/+ (Ryr2-Het) dopo esposizione a epinefrina (2 mg/kg) e caffeina (120 mg kg). La barra nera (a sinistra) indica che tutti i topi RyR2-Het non trattati (n = 5) presentavano aritmie dopo somministrazione di adrenalina e caffeina. I risultati riportati sulla destra del grafico dimostrano che nessuno dei topi RyR2-Het infettati con il vettore pAAV2.1-CMV-CASQ2-IRES-eGFP (n = 4) ha sviluppato aritmie.
FIG. 3 è un grafico che mostra l'espressione dell’mRNA di CASQ2, RYR2 cardiaco, triadina e giuntina nel tessuto miocardico di topi wild-type e topi RYR2 R4496C/+ che non sono stati sottoposti a trattamento o sono stati trattati con il vettore pAAV2.1-CMV-CASQ2-IRES-eGFP. I risultati sono riportati come espressione relativa dell’mRNA normalizzato rispetto all'espressione dell’mRNA nei topi wild type (WT, barre bianche). Le barre nere mostrano l'espressione relativa dei trascritti di mRNA nei topi knock-in eterozigoti RyR2 R4496C/+ (Ryr2-Het) non sottoposti a trattamento rispetto i topi wild type (WT); le barre grigie mostrano l'espressione relativa dei trascritti di mRNA nei topi knock-in eterozigoti RyR2 R4496C/+ sottoposti a trattamento con il vettore pAAV2.1-CMV-CASQ2-IRES-eGFP (Ryr2-Het AAV9-CASQ2) rispetto ai topi wild type (WT).
Descrizione dettagliata
Sono qui descritte composizioni e metodi che trattano la tachicardia ventricolare polimorfa catecolaminergica (CPVT), e in particolare la CPVT autosomica dominante, in un paziente, come un paziente umano. La CPVT dominante è causata da mutazioni in una o più proteine che regolano la concentrazione di ioni calcio divalenti nei miociti cardiaci. Ad esempio, la CPVT dominante è associata a mutazioni diverse nella proteina del recettore della rianodina di tipo 2 (RYR2), in particolare mutazioni con guadagno di funzione che sovrainducono il rilascio mediato da RYR2 di ioni calcio bivalenti dal reticolo sarcoplasmatico. Come illustrato di seguito, questo conduce ad una cascata di eventi di segnale e eventi di contrazione muscolare che culminano in un battito cardiaco. La CPVT dominante è anche associata a mutazioni con perdita di funzione nelle proteine calmodulina, quali la calmodulina 1 (CALM1) e CALM3. Tali proteine aiutano a regolare il calcio citosolico legando e sequestrando ioni calcio bivalenti, impedendo così la propagazione di un potenziale d'azione. L'eccesso di rilascio di calcio dal reticolo sarcoplasmatico durante la diastole - un periodo di rilassamento cardiaco - genera un battito cardiaco extrasistolico, che può scatenare un'aritmia.
La presente descrizione si basa, in parte, sulla scoperta che la CPVT dominante può essere trattata senza la necessità di fornire al paziente una proteina funzionale RYR2, CALM1 o CALM3 o un transgene che codifichi gli stessi. Impiegando le composizioni e i procedimenti qui descritti, un paziente, come ad esempio un paziente umano, che è affetto da CPVT dominante può essere trattato mediante somministrazione di un transgene codificante per una proteina calsequestrina 2 (CASQ2) funzionale. La somministrazione del CASQ2, a sua volta, ripristina l'omeostasi del calcio nel cuore, portando a una riduzione degli eventi di aritmia e al ritorno di un normale battito del cuore.
Impiegando le composizioni e i procedimenti qui descritti, un transgene codificante una proteina CASQ2 funzionale può essere somministrato a un paziente mediante terapia genica virale, tra gli altri approcci descritti di seguito, come l'uso di un liposoma, vescicola, esosoma, dendrimero o nanoparticella. Le sezioni che seguono forniscono una sintesi della fisiopatologia che sta alla base della CPVT dominante, nonché una descrizione di esempi di vettori e di altri veicoli di trasferimento di geni che possono essere utilizzati per somministrare ai pazienti un transgene CASQ2 funzionale.
CPVT Dominante
La CPVT è una canalopatia ereditaria caratterizzata da un'alta suscettibilità ad aritmie potenzialmente letali. Sono state descritte due forme della malattia: la variante autosomica dominante e le varianti autosomiche recessive. La prima è associata a mutazioni nel gene cardiaco RYR2, mentre la variante autosomica recessiva è associata a mutazioni nel gene cardiaco CASQ2 (Priori et al., Circulation 104 (Supplemento II): 335 (2001), e Lahat et al., Am. J. Hum. Genet. 69: 1378-1384 (2001)). Osservazioni cliniche hanno dimostrato che i pazienti affetti dalla forma dominante della CPVT sviluppano una tachicardia ventricolare bidirezionale e polimorfa in risposta all'attivazione simpatica, mentre i loro profili elettrocardiografici a riposo sono normali e la struttura del cuore è preservata
La patologia sottostante alla CPVT dominante è legata ad un anomalo funzionamento del meccanismo fisiologico definito come rilascio di calcio indotto dal calcio (CICR), che è fondamentale per mantenere l'accoppiamento eccitazione-contrazione nel cuore. L'apertura e la chiusura altamente coordinata dei canali ionici voltaggio-dipendenti situati nella membrana dei miociti cardiaci genera un potenziale di azione cardiaca. Durante la fase di plateau del potenziale d'azione, l'apertura dei canali del Ca<2+ >di tipo L voltaggio-dipendenti consente l'afflusso di Ca<2+ >nel plasmalemma. Questo processo innesca il calcio transitorio e induce l'apertura del canale di rilascio del Ca<2+ >del reticolo sarcoplasmatico: RYR2 (Bers, Nature 415: 198-205 (2002)). Questi rilasci locali si verificano in strutture specializzate denominate unità di rilascio del calcio (CRU). Le CRU sono preferenzialmente localizzate a livello dei tubuli trasversi (tubuli T), dove la membrana del reticolo sarcoplasmatico è giustapposta alla membrana cellulare. Un CRU è formato da gruppi di RYR2, che attraversano la membrana del reticolo sarcoplasmatico, che sono in stretta prossimità dei canali del Ca<2+ >di tipo L sulla membrana cellulare (Franzini-Armstrong, et l., Ann. NY Acad. Sci. 1047: 76- 85 (2005)). Il Ca<2+ >rilasciato dal reticolo sarcoplasmatico si lega alla troponina C e induce una serie di cambiamenti allosterici nei filamenti della miosina che portano alla contrazione delle fibre muscolari. La successiva rimozione del Ca<2+ >è mediata dalla concomitante chiusura del RYR2 e dall'azione della Ca<2+ >ATPasi del reticolo sarcoplasmatico che pompa il Ca<2+ >indietro nelle riserve del reticolo sarcoplasmatico.
Un altro componente della riduzione transitoria del Ca<2+ >è lo scambiatore Na<+>-Ca<2+ >(NCX). L'NCX estrude uno ione Ca<2+ >(due cariche positive) ogni tre ioni Na<+ >(tre cariche positive) immessi nella cellula. Pertanto, l'NCX rimuove il Ca<2+ >generando una corrente netta di depolarizzazione verso l’interno: la corrente transitoria in ingresso (Iti) (Pieske, et al., Circ. Res. 85: 38-46 (1999)). L'NCX diventa molto importante per la rimozione del Ca<2+ >in condizioni caratterizzate da sovraccarico di calcio, ad esempio nell’evenienza di mutazioni genetiche nel RYR2.
Nella CPVT le aritmie sono provocate da eventi di rilascio del Ca<2+ >che non sono innescati da un potenziale d'azione e sono, pertanto, indicati come "rilascio spontaneo di calcio" (SCRs). Un SCR inizia come un evento localizzato che coinvolge un singolo CRU, ma può anche diffondersi ai CRU adiacenti inducendo maggiore rilascio di Ca<2+ >sino a generare un'onda di calcio per tutta la cellula. La probabilità che l'SCR porti ad un'onda di calcio è influenzata dall'equilibrio tra il contenuto di Ca<2+ >del reticolo sarcoplasmatico e la concentrazione di Ca<2+ >che induce il rilascio di Ca<2+>, la cosiddetta soglia del calcio del reticolo sarcoplasmatico. La funzione di RYR2 ha un ruolo chiave nel controllo di questo livello soglia. ‘E stato suggerito che diverse mutazioni di RYR2 associate alla CPVT agiscano diminuendo la soglia del calcio del reticolo sarcoplasmatico in modo che l'SCR possa essere facilmente indotto (Venetucci et al., Nat. Rev. Cardiol. 9: 561-75 (2012)).
Quando si verifica una perdita anomala di Ca<2+>, aumenta la concentrazione citosolica del Ca<2+ >e la cellula deve attivare meccanismi per prevenire l'alterazione dell'omeostasi del Ca<2+ >e ristabilire il livello diastolico fisiologico del Ca<2+>. La corrente Iti produce depolarizzazioni transitorie della membrana dopo il completamento del potenziale d'azione, note come post-depolarizzazioni ritardate (DAD). Quando l'ampiezza di un DAD raggiunge il valore soglia di voltaggio per l'attivazione del canale del Na<+>, viene generato un potenziale d'azione indotto. La propagazione di un potenziale di azione in tutto il cuore genera un battito extrasistolico. Quando questa catena di eventi diventa ripetitiva e diversi DAD raggiungono la soglia per la generazione di potenziali d'azione che si propagano, viene suscitata attività aritmica innescata. In diversi studi, è stato dimostrato che le mutazioni di RYR2 facilitano l'insorgenza di SCR durante la stimolazione β-adrenergica e, a loro volta, provocano DADs e attività scatenate che portano ad aritmie potenzialmente letali (Liu et al., Circulation Research 99: 292-298 (2006)).
La generazione e caratterizzazione del modello murino knock-in RYR2 <R4496C/+ >per la CPVT autosomica dominante (si veda, per esempio, Cerrone et al., M, Circulation Research 96: e77-e82 (2005), e il brevetto US 7,741,529) ha consentito una maggiore comprensione dei meccanismi patologici di questa malattia. I topi eterozigoti RyR2<R4496C / >replicano la CPVT umana e sviluppano aritmie ventricolari bidirezionali e polimorfe indotte da stimolazione adrenergica. Nei topi la mutazione R4496C, che corrisponde alla mutazione R4497C nell'uomo, provoca un aumento della sensibilità del canale RYR2 al calcio luminale, facilitando così il rilascio spontaneo di calcio dal reticolo sarcoplasmatico.
Esempi di mutazioni che possono causare la CPVT sono R4497C, N4104K, N4895D, R176Q, G178A, R420W, L433P, P1067S, S2246L, G2273R, F2307L, E2311D, L2344P, R2474S, T2504M, K3717R, L3778F, G3926D, G3946S, Q4159P, V4319-K4324dup, R4651I, V4771I, F4851L, A4860G, I4867M, P4902S, e R4959Q. Le mutazioni di CALM1 che possono condurre alla CPVT dominante includono N97S e N53I, e un esempio di mutazione di CALM3 che può portare alla CPVT dominante è A103V.
È stato ora scoperto che la CPVT causata, per esempio, da mutazioni di RYR2, CALM1 e/o CALM3 che portano ad aritmia, come R4997C nell'uomo, può essere trattata senza la necessità di fornire al paziente transgeni funzionanti che codificano per queste proteine. Piuttosto, usando le composizioni e i procedimenti qui descritti, i pazienti affetti da CPVT dominante possono essere trattati mediante la somministrazione di veicoli di trasferimento contenenti un transgene CASQ2. Esempi di veicoli per il trasferimento di CASQ2 utili in congiunzione con le composizioni e i procedimenti qui descritti sono descritti in dettaglio in seguito.
Trattamento della CPVT mediante Terapia Genica con CASQ2
Transgeni CASQ2
Usando le composizioni e i procedimenti qui descritti, un transgene codificante CASQ2 può essere fornito ad un paziente, come ad esempio un paziente umano affetto da CPVT dominante, in modo da trattare la patologia. Il transgene CASQ2 può essere trasferito al paziente mediante vettori diversi (per esempio, i vettori virali), tra le altre composizioni per la terapia genica qui descritte.
In alcune forme di realizzazione (nelle quali, per esempio, un paziente umano è sottoposto a trattamento), il transgene CASQ2 codifica una proteina abete una sequenza amminoacidica che è identica almeno per l’85% (ad esempio, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,9%, or 100% identica) alla sequenza amminoacidica di CASQ2 umana wild-type, che è fornita come SEQ ID NO: 1, illustrata di seguito. I transgeni di CASQ2 per l'impiego in combinazione con le composizioni e i metodi qui descritti includono quelli che codificano una proteina avente una o più sostituzioni conservative di amminoacidi rispetto alla sequenza amminoacidica di SEQ ID NO: 1. Per esempio, il transgene CASQ2 può codificare una proteina avente il transgene CASQ2 può codificare una proteina avente sino a 50 sostituzioni amminoacidiche conservative (per esempio, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, o 50 sostituzioni amminoacidiche conservative) rispetto alla sequenza amminoacidica di SEQ ID NO: 1. Il transgene CASQ2, in aggiunta o in alternativa, può avere una o più sostituzioni amminoacidiche non conservative rispetto alla sequenza amminoacidica di SEQ ID NO: 1. Ad esempio, il transgene CASQ2 può codificare una proteina avente fino a 50 sostituzioni amminoacidiche non conservative (ad esempio, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, o 50 sostituzioni amminoacidiche non conservative) rispetto alla sequenza amminoacidica di SEQ ID NO: 1.
In alcune forme di realizzazione (nelle quali, per esempio, un paziente umano è sottoposto a trattamento), il transgene CASQ2 ha una sequenza di acido nucleico che è identica almeno per l’85% (ad esempio, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,9%, o 100% identica) alla sequenza di acido nucleico di CASQ2 umano wild-type, che è fornita come SEQ ID NO: 2, illustrata di seguito.
Esempi di sequenze amminoacidiche e di acidi nucleici di CASQ2 wild-type utili in combinazione con le composizioni e i metodi qui descritti sono illustrati nella Tabella 2, di seguito.
Tabella 2. Esempi di sequenze amminoacidiche e di acidi nucleici di CASQ2
SEQ ID
Descrizione Sequenza di Amino Acidi/ Acidi Nucleici NO.
CCTCAAGCAGATGTTGAAGAGATATGATTTGCTCTG TCTCTATTACCACGAACCTGTGTCTTCAGACAAGGTC TCACAAAAACAGTTCCAGCTGAAGGAGATTGTACTG GAGCTTGTGGCCCAGGTCCTGGAACATAAAAACATA GGCTTTGTGATGGTGGATTCGAGGAAAGAGGCCAA GCTTGCTAAGAGGCTGGGATTCAGTGAAGAAGGAA GCCTGTATGTTCTGAAGGGTGACCGCACGATTGAGT TTGACGGGGAGTTCGCAGCAGATGTCTTAGTGGAAT TTCTCTTGGATCTCATTGAAGACCCAGTGGAGATCGT GAATAACAAGCTGGAGGTCCAGGCCTTTGAGCGCAT CGAGGACCAGACCAAGCTCCTTGGCTTCTTCAAGAA TGAGGACTCAGAATATTACAAAGCATTCCAAGAGGC AGCTGAACACTTCCAGCCTTACATCAAGTTCTTTGCC ACCTTTGACAAGGCGGTGGCAAAGAAGTTATCCTTG AAGATGAACGAAGTTGGCTTCTATGAGCCATTTATG GATGAGCCCAACGTCATCCCTAACAAACCGTACACA GAAGAGGAGCTTGTGGAGTTTGTGAAGGAACATCA AAGACCCACCCTACGTCGCTTGCGCCCAGAGGACAT GTTTGAAACATGGGAAGACGACTTGAATGGGATCCA CATCGTGGCCTTTGCGGAGAAGAGTGACCCAGATG GCTATGAGTTCCTAG AGATCCTGAAACAGGTTGCCCGGGACAACACTGACA ATCCTGACTTGAGCATCTTGTGGATTGACCCAGATG ACTTTCCACTGCTTGTTGCTTACTGGGAGAAGACTTT CAAGATTGACCTGTTCAAGCCACAGATTGGGGTGGT GAATGTAACCGATGCTGACAGTATCTGGATGGAGAT CCCAGATGATGACGACCTGCCCACAGCTGAGGAGCT GGAAGACTGGATTGAAGATGTGCTTTCTGGAAAGAT CAACACTGAAGATGATGACAATGAAGATGAAGATG ATGATGGTGATGACAACGATGACGATGATGATGAC
I transgeni CASQ2 qui descritti includono, inoltre, quelli che codificano per frammenti delle proteine sopra menzionate che mantengono la capacità di polimerizzare e legare il calcio bivalente, per esempio, con un’affinità che arriva sino al 25% (ad esempio con un’affinità che è entro 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, o 25%) dell’affinità di CASQ2 wild-type e/o con una stechiometria che si discosta da quella di CASQ2 wild-type di non più del 25% (ad esempio, non più del 25%, 24%, 23%, 22%, 21%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, o meno). Esempi di saggi che possono essere impiegati per determinare l’affinità di legame del calcio e la stechiometria fanno parte della tecnica nota e sono descritti, per esempio, in Johnson et al. Methods Mol. Biol. 173:89-102 (2002), il cui contenuto è qui incorporato come citazione nella sua interezza
Elementi regolatori della trascrizione
I transgeni CASQ2 come qui descritti possono essere incorporati in un veicolo di trasferimento, quale un vettore, un plasmide o un altro veicolo di trasferimento di acido nucleico qui descritto, in modo tale che il transgene sia collegato operativamente ad un promotore. Esempi di promotori utili in congiunzione con le composizioni e i metodi qui descritti sono quelli che inducono l’espressione di un transgene in una cellula cardiaca in un paziente (ad esempio un paziente umano), quale un miocita cardiaco. Ad esempio, i promotori che possono essere impiegati allo scopo di indurre l'espressione di CASQ2 nei veicoli di trasferimento del gene qui descritti includono, senza essere limitati, il promotore del citomegalovirus, promotore della catena leggera della miosina 2, il promotore dell’alfa actina, il promotore della troponina 1, il promotore dello scambiatore Na<+>/Ca<2+>, il promotore della distrofina, il promotore della creatina chinasi, il promotore della integrina alfa 7, il promotore del peptide natriuretico cerebrale, il promotore della alfa B-cristallina/piccola proteina da shock termico, il promotore della catena pesante della miosina alfa, il promotore del fattore natriuretico atriale, e il promotore della desmina Vettori per il Trasferimento di Acidi Nucleici Esogeni a Cellule Bersaglio
Vettori virali per il trasferimento di acido nucleico
I genomi virali forniscono una ricca fonte di vettori che possono essere impiegati per il trasferimento efficiente di un gene di interesse nel genoma di una cellula bersaglio in un paziente (ad esempio una cellula di mammifero, quale una cellula umana). I genomi virali sono vettori particolarmente utili per il trasferimento genico poiché i polinucleotidi contenuti all'interno di tali genomi sono generalmente incorporati nel genoma di una cellula bersaglio mediante trasduzione generalizzata o specializzata. Questi processi si verificano come parte del naturale ciclo di replicazione virale e non richiedono l'aggiunta di proteine o reagenti per indurre l'integrazione genica. Esempi di vettori virali che possono essere impiegati in congiunzione con le composizioni e i metodi qui descritti sono AAV, retrovirus, adenovirus (ad esempio Ad5, Ad26, Ad34, Ad35, e Ad48), parvovirus (ad esempio virus adeno-associati), coronavirus, virus a RNA a filamento negativo quali ad esempio orthomyxovirus (per esempio il virus dell’influenza), rhabdovirus (ad esempio il virus della rabbia e il virus della stomatite vescicolare), paramyxovirus (ad esempio morbillo e Sendai), virus a RNA a filamento positivo, quali ad esempio picornavirus e alphavirus, e virus a DNA a doppio filamento tra i quali adenovirus, herpesvirus (ad esempio Herpes Simplex virus tipo 1 e 2, virus Epstein-Barr, citomegalovirus), e poxvirus (ad esempio il virus del vaccino, virus vaccinico Ankara modificato (MVA), fowlpox and canarypox). Altri virus che possono essere impiegati in congiunzione con le composizioni e i metodi qui descritti includono il virus Norwalk, togavirus, flavivirus, reovirus, papovavirus, hepadnavirus, e virus dell’epatite, per esempio. Esempi di retrovirus includono: virus della leucosi/sarcoma aviare, virus tipo C, tipo B e tipo D dei mammiferi, gruppo HTLV-BLV, lentivirus, spumavirus (Coffin, J. M., Retroviridae: The viruses and their replication, In Fundamental Virology, Third Edition, B. N. Fields, et al., Eds., Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996). Ulteriori esempi includono virus della leucemia murina, virus del sarcoma murino, virus del tumore mammario murino, virus della leucemia bovina, virus della leucemia felina, virus del sarcoma felino, virus della leucemia aviaria, virus della leucemia umana a cellule T, virus endogeni dei babbuini, virus Gibbon ape leukemia, virus della scimmia Mason Pfizer, virus dell’immunodeficienza delle scimmie, virus del sarcome delle scimmie, virus del sarcoma di Rous e lentiviruses. Altri esempi di vettori sono descritti, per esempio, nel brevetto US No.
5,801,030, il cui contenuto è qui incorporato come citazione per quanto attiene vettori virali da utilizzare nella terapia genica.
Vettori AAV per il trasferimento di acido nucleico In alcune forme di realizzazione, gli acidi nucleici delle composizioni e dei metodi qui descritti sono incorporati in vettori rAAV e/o virioni allo scopo di facilitare la loro introduzione in una cellula, quale ad esempi una cellula bersaglio cardiaca (ad esempio, un miocita cardiaco) in un paziente. I vettori rAAV utili in congiunzione con le composizioni e i metodi qui descritti includono costrutti ricombinanti di acido nucleico che contengono (1) un transgene CASQ2 e (2) acidi nucleici virali che facilitano l'integrazione e l'espressione dei geni eterologhi. Gli acidi nucleici virali possono includere quelle sequenze di AAV che sono necessarie in cis per la replicazione e l’impacchettamento del DNA in un virione (ad esempio, ITR funzionali). Tali vettori rAAV possono altresì contenere marcatori o geni reporter. Vettori rAAV utili includono quelli che hanno uno o più dei geni AAV presenti in natura deleti in tutto o in parte, ma mantengono sequenze ITR funzionali fiancheggianti. Gli ITR di AAV possono essere di qualsiasi sierotipo (ad esempio derivati dal sierotipo 2) idoneo per una particolare applicazione. Metodi per l’utilizzo di vettori rAAV sono descritti, per esempio, in Tal et al., J. Biomed. Sci. 7: 279-291 (2000), e Monahan e Samulski, Gene Delivery 7: 24-30 (2000), il contenuto di ciascuno dei quali è qui incorporato come citazione per quanto attiene vettori AAV per il trasferimento genico.
Gli acidi nucleici e i vettori qui descritti possono essere incorporati in un virione rAAV al fine di facilitare l'introduzione dell'acido nucleico o del vettore in una cellula. Le proteine del capside di AAV compongono la porzione esterna, non di acido nucleico del virione e sono codificate dal gene cap di AAV. Il gene cap codifica tre proteine del rivestimento virale, VP1, VP2 e VP3, che sono necessarie per l'assemblaggio del virione. La costruzione di virioni rAAV è stata descritta, per esempio, nei brevetti US No. 5.173.414; 5.139.941; 5.863.541; 5.869.305; 6.057.152; e 6.376.237; nonché in Rabinowitz et al., J. Virol.
76: 791-801 (2002) e Bowles et al., J. Virol. 77: 423-432 (2003)), il contenuto di ciascuno dei quali è qui incorporato come citazione per quanto attiene vettori AAV per il trasferimento genico.
I virioni rAAV utili in combinazione con le composizioni e i metodi qui descritti includono quelli derivati da una varietà di sierotipi AAV tra cui AAV 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 e 9. La costruzione e l’impiego di vettori AAV e proteine AAV di diversi sierotipi sono descritti, ad esempio, in Chao et al., Mol. Ther. 2: 619-623 (2000); Davidson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 3428-3432 (2000); Xiao et al., J. Virol. 72: 2224-2232 (1998); Halbert et al., J. Virol. 74: 1524-1532 (2000); Halbert et al., J. Virol. 75: 6615-6624 (2001); e Auricchio et al., Hum. Molec. Genet. 10: 3075-3081 (2001), il contenuto di ciascuno dei quali è qui incorporato come citazione per quanto attiene vettori AAV per il trasferimento genico.
Sono inoltre utili i vettori rAAV pseudotipizzati in combinazione con le composizioni e i metodi qui descritti. I vettori pseudotipizzati includono i vettori AAV di un certo sierotipo (ad esempio AAV2) pseudotipizzato con un gene del capside derivato da un sierotipo diverso dal sierotipo indicato (ad esempio AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 o AAV9, tra gli altri). Ad esempio, un vettore pseudotipizzato rappresentativo è un vettore AAV2 che codifica una proteina terapeutica pseudotipizzato con un gene capsidico che deriva da AAV sierotipo 8 o dal AAV sierotipo 9. Le tecniche che comportano la costruzione e l’impiego di virioni rAAV pseudotipizzati sono note nello stato dell’arte e sono descritte, per esempio, in Duan et al., J. Virol. 75: 7662-7671 (2001); Halbert et al., J. Virol. 74: 1524-1532 (2000); Zolotukhin et al., Methods, 28: 158-167 (2002); e Auricchio et al., Hum. Molec. Genet., 10: 3075-3081 (2001).
I virioni AAV che hanno mutazioni all'interno del capside virionico possono essere utilizzati per infettare particolari tipi cellulari in modo più efficace dei virioni con capsidi non mutati. Ad esempio, mutanti AAV idonei possono presentare mutazioni di inserimento del ligando per facilitare l’indirizzamento di AAV verso specifici tipi cellulari. La costruzione e la caratterizzazione di mutanti capsidici AAV, tra i quali i mutanti di inserimento, i mutanti di screening di alanina e i mutanti di epitopi etichettati sono descritti in Wu et al., J. Virol. 74: 8635-45 (2000). Altri virioni rAAV che possono essere impiegati nei metodi dell'invenzione includono quegli ibridi capsidici che sono generati mediante accoppiamento molecolare virale nonché mediante mescolamento di esoni. Vedi, ad esempio, Soong et al., Nat. Genet., 25: 436-439 (2000) e Kolman e Stemmer, Nat. Biotechnol. 19: 423-428 (2001).
Altri Metodi per il Trasferimento di Transgeni a Cellule Bersaglio
Tecniche di transfezione
Tecniche che possono essere impiegate per introdurre in una cellula bersaglio un transgene CASQ2, come ad esempio un transgene CASQ2 operativamente collegato ad un elemento regolatorio trascrizionale qui descritto, sono note nello stato dell’arte. Ad esempio, può essere impiegata l'elettroporazione allo scopo di permeabilizzare le cellule di mammifero (ad esempio cellule bersaglio umane) mediante l'applicazione di un potenziale elettrostatico alla cellula di interesse. Le cellule di mammifero, quali le cellule umane, sottoposte in questo modo a un campo elettrico esterno, sono successivamente predisposte all'assorbimento di acidi nucleici esogeni. L'elettroporazione di cellule di mammifero è descritta in dettaglio, ad esempio in Chu et al., Nucleic Acids Research 15: 1311 (1987), il cui contenuto è qui incorporato come citazione. Una tecnica simile, NucleofectionTM, utilizza un campo elettrico applicato al fine di stimolare l'assorbimento di polinucleotidi esogeni nel nucleo di una cellula eucariotica. NucleofectionTM e i protocolli utili per l'esecuzione di questa tecnica sono descritti in dettaglio, ad esempio in Distler et al., Experimental Dermatology 14: 315 (2005), così come in US 2010/0317114, il contenuto di ciascuno dei quali è qui incorporato come citazione.
Ulteriori tecniche utili per la trasfezione di cellule bersaglio includono la metodologia di squeeze-poration. Questa tecnica provoca la rapida deformazione meccanica delle cellule al fine di stimolare l'assorbimento del DNA esogeno attraverso i pori della membrana che si formano in risposta allo stress applicato. Questa tecnologia è vantaggiosa in quanto non è richiesto un vettore per il trasferimento degli acidi nucleici in una cellula, quale una cellula bersaglio umana. La squeeze-poration. è descritta in dettaglio, ad es. In Sharei et al., Journal of Visualized Experiments 81: e50980 (2013) il cui contenuto è qui incorporato come citazione.
La lipofezione rappresenta un'altra tecnica utile per la trasfezione di cellule bersaglio. Questa metodica prevede l’inserimento di acidi nucleici in un liposoma, che spesso presenta verso il suo esterno gruppi funzionali cationici, come ammine quaternarie o protonate. Ciò promuove le interazioni elettrostatiche tra il liposoma e una cellula a causa della natura anionica della membrana cellulare, che alla fine porta all'assorbimento degli acidi nucleici esogeni, per esempio, mediante fusione diretta del liposoma con la membrana cellulare o per endocitosi del complesso. La lipofezione è descritta dettagliatamente, per esempio, nel brevetto US n. 7,442,386, il cui contenuto è qui incorporato come citazione. Tecniche simili che sfruttano le interazioni ioniche con la membrana cellulare per provocare l'assorbimento di acidi nucleici esogeni includono porre a contatto una cellula con un complesso acido nucleicopolimerico cationico. Esempi di molecole cationiche che si associano con i polinucleotidi in modo da impartire una carica positiva che favorisce l’interazione con la membrana cellulare sono dendrimeri attivati (descritti ad esempio in Dennig, Topics in Current Chemistry 228: 227 (2003), il cui contenuto è qui incorporato come citazione) e dietilamminoetil (DEAE)-destrano, il cui uso come agente di trasfezione è descritto in dettaglio, ad esempio in Gulick et al., Current Protocols in Molecular Biology 40: I: 9.2: 9.2.1 (1997), il cui contenuto è qui incorporato come citazione. Le microsfere magnetiche rappresentano un altro strumento che può essere impiegato per trasfettare le cellule bersaglio in modo delicato ed efficiente, poiché questa metodologia utilizza un campo magnetico applicato al fine di indirizzare l'assorbimento degli acidi nucleici. Questa tecnologia è descritta in dettaglio, ad esempio, in US 2010/0227406, il cui contenuto è qui incorporato come citazione.
Un altro strumento utile per indurre l'assorbimento di acidi nucleici esogeni da parte di cellule bersaglio è la laserfection, una tecnica che prevede esporre una cellula alla radiazione elettromagnetica di una particolare lunghezza d'onda allo scopo di permeabilizzare le cellule in modo delicato e consentire ai polinucleotidi di penetrare attraverso la membrana cellulare. Questa tecnica è descritta in dettaglio, ad es. In Rhodes et al., Methods in Cell Biology 82: 309 (2007), il cui contenuto è qui incorporato come citazione.
Le microvescicole rappresentano un altro potenziale veicolo che può essere impiegato per modificare il genoma di una cellula bersaglio secondo i metodi qui descritti. Ad esempio, microvescicole che sono state indotte dalla sovraespressione in contemporanea della glicoproteina VSV-G con, ad esempio, una proteina che modifica il genoma, quale una nucleasi, possono essere utilizzate per trasferire in maniera efficiente proteine all’interno di una cellula che, successivamente, catalizzano il taglio sitospecifico di una sequenza polinucleotidica endogena in modo da preparare il genoma della cellula per l'incorporazione covalente di un polinucleotide di interesse, quale un gene o una sequenza regolatoria. L’impiego di tali vescicole, indicato anche come Gesicle, per la modificazione genetica delle cellule eucariotiche è descritto in dettaglio, ad esempio in Quinn et al., in Quinn et al., Genetic Modification of Target Cells by Direct Delivery of Active Protein [abstract]. In: Methylation changes in early embryonic genes in cancer [abstract], in: Proceedings of the 18th Annual Meeting of the American Society of Gene and Cell Therapy; 2015 May 13, Abstract No. 122.
Incorporazione di geni bersaglio mediante tecniche di modificazione genica
In aggiunta a quanto sopra, è stata sviluppata una varietà di strumenti che possono essere impiegati per incorporare un gene di interesse in una cellula bersaglio, quale una cellula umana. Uno di tali metodi che può essere utilizzato per incorporare polinucleotidi che codificano geni bersaglio in cellule bersaglio comporta l'uso di trasposoni. I trasposoni sono polinucleotidi che codificano gli enzimi trasposasi e contengono una sequenza polinucleotidica o un gene di interesse fiancheggiato da siti di escissione al 5 'e 3'. Una volta che un trasposone è stato trasferito in una cellula, ha inizio l'espressione del gene della trasposasi e si traduce in enzimi attivi che tagliano il gene di interesse dal trasposone. Questa attività è mediata dal riconoscimento sito-specifico dei siti di escissione del trasposone da parte della trasposasi. In alcuni casi, questi siti di escissione possono essere ripetizioni terminali o ripetizioni terminali invertite. Una volta escisso dal trasposone, il gene di interesse può integrarsi nel genoma di una cellula di mammifero mediante taglio catalizzato da trasposasi di siti di escissione simili che esistono all'interno del genoma nucleare della cellula. Ciò consente al gene di interesse di venir inserito nel DNA nucleare tagliato nei siti di escissione complementari, e la successiva ligazione covalente dei legami fosfodiestere che congiungono il gene di interesse al DNA del genoma delle cellule di mammifero completa il processo di incorporazione. In alcuni casi, il trasposone può essere un retrotrasposone, in modo tale che il gene che codifica per il gene bersaglio sia dapprima trascritto in un prodotto a RNA e successivamente retrotrascritto in DNA prima dell'incorporazione nel genoma delle cellule di mammifero. Esempi di sistemi di trasposoni sono il trasposone piggybac (descritto ad esempio in dettaglio in WO 2010/085699) e il trasposone sleeping beauty (ad esempio descritto in dettaglio in US 2005/0112764), il contenuto di ciascuno dei quali è qui incorporato come riferimento per quanto attengono trasposoni per l’impiego nel trasferimento genico ad una cellula di interesse.
Un altro strumento per operare l'integrazione di geni bersaglio nel genoma di una cellula bersaglio è il sistema delle brevi ripetizioni palindrome raggruppate e separate a intervalli regolari (CRISPR) / Cas, un sistema che si è originariamente evoluto nei batteri e negli archaea come un meccanismo di difesa adattativo contro l'infezione virale. Il sistema CRISPR/Cas comprende sequenze palindrome ripetute all'interno del DNA plasmidico e una nucleasi Cas9 associata. Questo complesso di DNA e proteine dirige il taglio sito-specifico del DNA di una sequenza bersaglio incorporando prima il DNA estraneo nei loci CRISPR. I polinucleotidi contenenti queste sequenze estranee e gli elementi sequenze ripetute-spaziatori del locus CRISPR sono a loro volta trascritti in una cellula ospite per generare un RNA guida, il quale può successivamente ibridarsi ad una sequenza bersaglio e indirizzare la nucleasi Cas9 verso questo sito. In tal modo, può essere generato in un polinucleotide estraneo un taglio del DNA mediato da cas9 altamente sitospecifico poiché l'interazione che conduce cas9 in stretta prossimità della molecola di DNA bersaglio è governata dall’ibridazione RNA: DNA. Di conseguenza, possono essere progettati sistemi CRISPR/Cas per tagliare qualsiasi molecola bersaglio di DNA di interesse. Questa tecnica è stata sfruttata per modificare genomi eucariotici (Hwang et al., Nature Biotechnology 31:227 (2013)) e può essere impiegata quale mezzo efficace per modificare in maniera sito-specifica i genomi di cellule bersaglio al fine di tagliare il DNA prima dell'incorporazione di un gene codificante per un gene bersaglio. L'impiego di CRISPR/Cas allo scopo di modulare l'espressione genica è stato descritto, ad esempio, nel brevetto US No. 8,697,359, il cui contenuto è qui incorporato come citazione per quanto attiene l'uso del sistema CRISPR/Cas per modifiche genomiche. Metodi alternativi per tagliare in maniera sito-specifica il DNA genomico prima dell'incorporazione di un gene di interesse in una cellula bersaglio includono l'uso di nucleasi a dita di zinco (ZFN) e di nucleasi effettori simili agli attivatori della trascrizione (TALEN). A differenza del sistema CRISPR/Cas, questi enzimi non contengono un polinucleotide guida per indirizzare verso una specifica sequenza bersaglio. La specificità del bersaglio è invece controllata dai domini di legame del DNA all'interno di questi enzimi. L’impiego di ZFN e TALEN in applicazioni per modificare il genoma è descritto, ad esempio, in Urnov et al., Nature Reviews Genetics 11:636 (2010); e in Joung et al., Nature Reviews Molecular Cell Biology 14:49 (2013), il contenuto di ciascuno dei quali è qui incorporato come citazione per quanto attiene composizioni e metodi per modificare il genoma.
Ulteriori tecniche per modificare il genoma che possono essere impiegata allo scopo di incorporare polinucleotidi che codificano geni bersaglio nel genoma di una cellula bersaglio includono l'uso di meganucleasi ARCUS<TM>, le quali possono essere progettate razionalmente in modo da tagliare il DNA genomico in maniera sito-specifica. L'impiego di questi enzimi per incorporare nel genoma di una cellula di mammifero geni che codificano geni bersaglio è vantaggioso in vista della relazione definita struttura-attività stabilita per tali enzimi. Le meganucleasi a catena singola possono essere modificate in certe posizioni di amminoacidi al fine di creare nucleasi che tagliano selettivamente il DNA nelle posizioni desiderate, consentendo l'incorporazione sito-specifica di un gene bersaglio nel DNA nucleare di una cellula bersaglio. Queste nucleasi a catena singola sono state ampiamente descritte, per esempio, nei brevetti US No. 8,021,867 e US 8,445,251, il contenuto di ciascuno dei quali è qui incorporato come citazione per quanto attiene composizioni e metodi per modificare il genoma.
Metodi per Misurare l’Espressione di Transgeni Il livello di espressione di un transgene CASQ2 espresso in una cellula bersaglio in un paziente (ad esempio un miocita cardiaco) può essere determinato valutando, ad esempio, la concentrazione o la quantità relativa dei trascritti di mRNA derivati dalla trascrizione del transgene CASQ2. In aggiunta o in alternativa, l'espressione genica può essere determinata valutando la concentrazione o la quantità relativa della proteina CASQ2 prodotta mediante trascrizione e traduzione di un transgene CASQ2. Le concentrazioni delle proteine possono anche essere stimate impiegando saggi funzionali, quali i saggi di abbondanza di calcio. Le sezioni che seguono descrivono esempi illustrativi di tecniche che possono essere utilizzate per misurare il livello di espressione di un transgene CASQ2 dopo somministrazione ad un paziente, come ad esempio un paziente con CPVT dominante come qui descritto. L'espressione di un transgene può essere misurata mediante numerose metodologie note nello stato dell’arte, che includono, ma non sono limitate a, sequenziamento degli acidi nucleici, analisi di microarray, proteomica, ibridazione in situ (ad esempio ibridazione in situ fluorescente (FISH)), saggi basati sull’amplificazione, ibridazione in situ, separazione cellulare attivata da fluorescenza (FACS), analisi degli mRNA mediante Northern e/o PCR.
Rilevamento degli acidi nucleici
Metodi basati sugli acidi nucleici per determinare l’espressione transgenica i set di dati metodi di rilevazione idonei per l'analisi congiuntamente alle composizioni e ai metodi qui descritti comprendono tecniche basate sull'immagine (ad esempio, Northern blotting o Southern blotting), che possono essere utilizzati in congiunzione con cellule ottenute da un paziente successivamente alla somministrazione del transgene. L'analisi Northern blot è una tecnica convenzionale ben nota nello stato dell’arte ed è descritta, per esempio, in Molecular Cloning, a Laboratory Manual, seconda edizione, 1989, Sambrook, Fritch, Maniatis, Cold Spring Harbor Press, 10 Skyline Drive, Plainview, NY 11803-2500. Protocolli classici per determinare lo stato di geni e prodotti genici si trovano ad esempio in Ausubel et al., eds., 1995, Current Protocols In Molecular Biology, Units 2 (Northern Blotting), 4 (Southern Blotting), 15 (Immunoblotting) and 18 (PCR Analysis).
Tecniche di rilevazione di transgeni che possono essere usate congiuntamente alle composizioni e metodi qui descritti per stimare l'espressione di CASQ2 comprendono inoltre esperimenti di sequenziamento microarray (ad esempio sequenziamento con il metodo Sanger e metodi di sequenziamento di nuova generazione, noti anche come sequenziamento ad elevata portata o sequenziamento profondo). Esempi di tecnologie di sequenziamento di nuova generazione includono, ma non sono limitati a, sequenziamento Illumina, sequenziamento Ion Torrent, sequenziamento 454, sequenziamento SOLiD e piattaforme di sequenziamento con i nanopori. Possono anche essere impiegati ulteriori metodi di sequenziamento noti nello stato dell’arte. Ad esempio, l'espressione transgenica a livello dell’mRNA può essere determinata usando RNA-Seq (come descritto per esempio in Mortazavi et al., Nat. Methods 5: 621-628 (2008) il cui contenuto è qui incorporato come citazione nella sua interezza). RNA-Seq è una tecnologia robusta per il monitoraggio dell'espressione mediante sequenziamento diretto delle molecole di RNA in un campione. In breve, questa metodologia può comportare la frammentazione dell'RNA a una lunghezza media di 200 nucleotidi, la conversione a cDNA mediante innesco casuale, e la sintesi del cDNA a doppio filamento (ad esempio, utilizzando il kit Just cDNA DoubleStranded cDNA Synthesis Kit di Agilent Technology). Successivamente, il cDNA viene convertito in una libreria molecolare per il sequenziamento mediante aggiunta di sequenze adattatori per ciascuna libreria (ad esempio, da Illumina®/Solexa), e le risultanti letture di 50-100 nucleotidi vengono mappate sul genoma.
I livelli di espressione transgenica possono essere determinati utilizzando piattaforme basate sui microarray (ad esempio, array di polimorfismi a singolo nucleotide), dal momento che la tecnologia dei microarray offre un'alta risoluzione. I dettagli relativi ai vari metodi microarray possono essere rinvenuti in letteratura. Si veda, per esempio, il brevetto U.S. No. 6,232,068 e Pollack et al., Nat. Genet. 23: 41-46 (1999), il contenuto di ciascuno dei quali è qui incorporato come citazione nella sua interezza. Quando si impiegano microarray di acido nucleico, i campioni di mRNA vengono retrotrascritti e marcati per generare il cDNA. Le sonde possono quindi ibridarsi con uno o più acidi nucleici complementari disposti in serie e immobilizzati su un supporto solido. L’array può essere configurato in modo tale che, ad esempio, sia nota la sequenza e la posizione di ciascun membro dell'array. L'ibridazione di una sonda marcata con un particolare elemento dell’array indica che il campione da cui è derivata la sonda esprime quel gene. Il livello di espressione può essere quantificato in base alla quantità di segnale rilevato dai complessi di ibridazione sondacampione. Un tipico esperimento con microarray prevede i seguenti passaggi: 1) preparazione di un bersaglio marcato con fluorescenza a partire dall'RNA isolato dal campione, 2) ibridazione del bersaglio marcato con il microarray, 3) lavaggio, colorazione e scansione dell'array, 4) analisi dell'immagine scansionata e 5) generazione dei profili di espressione genica. Un esempio di un processore microarray è il sistema Affymetrix GENECHIP®, che è disponibile in commercio e comprende array fabbricati mediante sintesi diretta di oligonucleotidi su una superficie di vetro. Altri sistemi possono essere usati come noto all’esperto dell'arte.
Allo scopo di misurare il livello di espressione di un transgene in una cellula bersaglio dopo il trasferimento a un paziente, possono essere usati anche saggi basati sull’amplificazione. In tali saggi, le sequenze di acido nucleico del gene agiscono come templato in una reazione di amplificazione (ad esempio, la PCR, come la qPCR). In un'amplificazione quantitativa, la quantità di prodotto di amplificazione è proporzionale alla quantità di templato nel campione originale. Il confronto con controlli appropriati fornisce una misura del livello di espressione del gene, che corrisponde alla sonda specifica utilizzata, secondo i principi qui descritti. Metodi di qPCR in tempo reale impiegando sonde TaqMan sono ben noti nello stato dell’arte. Protocolli dettagliati per la qPCR in tempo reale sono messi a disposizione, ad esempio, in Gibson et al., Genome Res. 6: 995-1001 (1996), e in Heid et al., Genome Res. 6: 986-994 (1996), il contenuto di ciascuno dei quali è qui incorporato come citazione nella sua interezza. I livelli di espressione genica come qui descritto possono essere determinati mediante la tecnologia RT-PCR. Le sonde impiegate per la PCR possono essere marcate con un marcatore rilevabile, quale, ad esempio, un radioisotopo, un composto fluorescente, un composto bioluminescente, un composto chemiluminescente, un chelante metallico o un enzima.
Rilevamento delle proteine
L'espressione transgenica può anche essere determinata misurando la concentrazione o la quantità relativa di un corrispondente prodotto proteico (ad esempio, CASQ2) codificato da un gene di interesse. I livelli delle proteine possono essere stimati usando tecniche standard di rilevamento note nello stato dell’arte. Saggi di espressione proteica idonei per l'impiego con le composizioni e i metodi qui descritti includono approcci di proteomica, analisi immunoistochimica e/o western blot, immunoprecipitazione, saggi di legame molecolare, ELISA, saggio di immunofiltrazione legato ad enzima (ELIFA), spettrometria di massa, immunodosaggio di spettrometria di massa, e saggi biochimici di attività enzimatica. In particolare, i metodi di proteomica possono essere impiegati per generare serie di dati di espressione proteica su larga scala in formato multiplo. I metodi proteomici possono utilizzare la spettrometria di massa per rilevare e quantificare i polipeptidi (ad esempio le proteine) e/o microarray peptidici che impiegano reagenti di cattura (ad esempio, anticorpi) specifici per un gruppo di proteine bersaglio al fine di identificare e misurare i livelli di espressione delle proteine espresse in un campione (ad esempio, un campione a singola cellula o una popolazione multicellulare).
Microarray peptidici esemplificativi posseggono una pluralità di polipeptidi legati al substrato, essendo rilevabile separatamente il legame di un oligonucleotide, un peptide o una proteina a ciascuno della pluralità dei polipeptidi legati. Alternativamente, il microarray peptidico può contenere una pluralità di leganti, ivi inclusi, ma non limitati a, anticorpi monoclonali, anticorpi policlonali, leganti phage display, leganti yeast two-hybrid, aptameri, i quali possono rilevare specificamente il legame di specifici oligonucleotidi, peptidi o proteine. Esempi di array peptidici possono rinvenirsi nei brevetti U.S. No.
6,268,210, 5,766,960 e 5,143,854, il contenuto di ciascuno dei quali è qui incorporato come citazione nella sua interezza.
La spettrometria di massa (MS) può essere impiegata in congiunzione con i metodi qui descritti per identificare e caratterizzare l'espressione di un transgene in una cellula di un paziente (ad esempio un paziente umano) dopo il trasferimento del transgene. Qualsiasi metodica MS della tecnica nota può essere impiegata per determinare, rilevare e/o misurare una proteina o un frammento peptidico di interesse, per esempio la LC-MS, ESI-MS, ESI-MS / MS, MALDI-TOF-MS, MALDI-TOF / TOF-MS, tandem MS e simili. Gli spettrometri di massa generalmente contengono una sorgente ionica e un'ottica, un analizzatore di massa e un'elettronica per l’elaborazione dei dati. Tra gli analizzatori di massa sono inclusi gli spettrometri di massa a scansione e a fascio ionico, quali ad esempio a tempo di volo (TOF) e quadruplo (Q), e spettrometri di massa a trappola, quali a trappola ionica (IT), Orbitrap e a risonanza ionica ciclotronica a trasformata di Fourier (FT -ICR), possono essere impiegati nei metodi qui descritti. Dettagli relativi alle diverse metodiche MS possono essere rinvenuti in letteratura. Si veda, per esempio, Yates et al., Annu. Rev. Biomed. Ing. 11: 49-79, 2009, il cui contenuto è qui incorporato come citazione nella sua interezza.
Prima dell'analisi MS, le proteine in un campione ottenuto dal paziente possono essere inizialmente digerite in peptidi più piccoli mediante digestione chimica (ad esempio mediante taglio con bromuro di cianogeno) o enzimatica (ad esempio, tripsina). Campioni peptidici complessi beneficiano anche dell'uso di tecniche di separazione front-end, ad esempio 2D-PAGE, HPLC, RPLC e cromatografia di affinità. Il campione digerito, e opzionalmente sottoposto a separazione, viene quindi ionizzato usando una sorgente di ioni al fine di generare molecole cariche per l’analisi successiva. La ionizzazione del campione può essere eseguita, ad esempio, mediante ionizzazione per elettronebulizzazione (ESI), ionizzazione chimica in pressione atmosferica (APCI), fotoionizzazione, ionizzazione elettronica, bombardamento con atomi veloci (FAB) / ionizzazione di massa liquida secondaria (LSIMS), desorbimento laser e ionizzazione assistita dalla matrice (MALDI), ionizzazione di campo, desorbimento di campo, ionizzazione a termonebulizzazione/plasmaspray matrici e ionizzazione con fascio di particelle. Ulteriori informazioni relative alla scelta del metodo di ionizzazione sono note agli esperti nel settore.
Dopo la ionizzazione, i peptidi digeriti possono poi essere frammentati per generare spettri MS/MS distintivi. La spettrometria di massa tandem (Tandem MS), nota anche come MS / MS, può essere particolarmente utile per l'analisi di miscele complesse. La Tandem MS prevede fasi multiple di selezione MS, con una qualche forma di frammentazione ionica che si verifica tra le fasi, che può essere compiuta con componenti di spettrometria di massa individuali separati nello spazio o usando un singolo spettrometro di massa con le fasi MS separate nel tempo. Nella spettrometria di massa tandem separata nello spazio, i componenti sono fisicamente separati e distinti, con una connessione fisica tra gli elementi per mantenere un alto vuoto. Nella spettrometria di massa tandem separata nel tempo, la separazione viene raggiunta mediante ioni intrappolati nel medesimo posto, con il verificarsi di più passaggi di separazione nel tempo. Gli spettri distintivi MS/MS possono poi essere confrontati con un database di sequenze peptidiche (ad esempio, SEQUEST). Possono anche essere determinate modifiche post-traduzionali dei peptidi mediante ricerca degli spettri, ad esempio, contro un database consentendo modifiche specifiche del peptide.
Composizioni Farmaceutiche
I transgeni CASQ2 qui descritti possono essere incorporati in un veicolo per la somministrazione ad un paziente, quale un paziente umano affetto da CPVT dominante, come descritto qui. Le composizioni farmaceutiche contenenti vettori, quali i vettori virali, che contengono il transgene CASQ2 possono essere preparate usando metodi noti dello stato dell’arte. Ad esempio, tali composizioni possono essere preparate usando, per esempio, veicoli, eccipienti o stabilizzanti fisiologicamente accettabili (Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edizione, Osol, A.Ed. (1980), incorporato qui come citazione), e in una forma desiderata, per esempio sotto forma di formulazioni liofilizzate o soluzioni acquose.
Miscele degli acidi nucleici e dei vettori virali qui descritti possono essere preparate in acqua opportunamente miscelata con uno o più eccipienti, veicoli, o diluenti. Possono anche essere preparate dispersioni in glicerolo, polietilenglicoli liquidi e loro miscele e in oli. Nelle normali condizioni di conservazione e utilizzo, queste preparazioni possono contenere un conservante al fine di prevenire la crescita di microrganismi. Le forme farmaceutiche idonee per l'uso iniettabile includono soluzioni o dispersioni acquose sterili e polveri sterili per la preparazione estemporanea di soluzioni o dispersioni sterili iniettabili (descritte in US 5,466,468, il cui contenuto è qui incorporato come citazione). In ogni caso la formulazione può essere sterile e può essere fluida nella misura in cui esiste una facile siringabilità. Le formulazioni possono essere stabili nelle condizioni di produzione e conservazione e possono essere preservate dall'azione contaminante di microrganismi, come batteri e funghi. Il veicolo può essere un mezzo solvente o di dispersione contenente, ad esempio, acqua, etanolo, poliolo (ad esempio glicerolo, glicole propilenico e glicole polietilenico liquido, e simili), loro miscele idonee, e/o oli vegetali. Una corretta fluidità può essere mantenuta, ad esempio, mediante l'uso di un rivestimento, come la lecitina, mediante il mantenimento della dimensione richiesta delle particelle nel caso di una dispersione e mediante l'uso di tensioattivi. La prevenzione dell'azione dei microrganismi può essere realizzata mediante diversi agenti antibatterici e antifungini, ad esempio i parabeni, il clorobutanolo, il fenolo, l’acido sorbico, il thimerosal, e simili. In molti casi, sarà preferibile includere agenti isotonici, ad esempio zuccheri o cloruro di sodio. L'assorbimento prolungato delle composizioni iniettabili può essere realizzato impiegando nelle composizioni agenti ritardanti l'assorbimento, ad esempio alluminio monostearato e gelatina.
Ad esempio, una soluzione contenente una composizione farmaceutica qui descritta può essere opportunamente tamponata, se necessario, e il diluente liquido reso prima isotonico con sufficiente soluzione salina o glucosio. Queste particolari soluzioni acquose sono particolarmente idonee per la somministrazione endovenosa, intramuscolare, sottocutanea e intraperitoneale. A questo riguardo, i mezzi acquosi sterili che possono essere impiegati saranno noti agli esperti del ramo alla luce della presente descrizione. Ad esempio, una dose può essere disciolta in 1 ml di soluzione isotonica di NaCl e aggiunta a 1000 ml di fluido per ipodermoclisi o iniettata nel sito di infusione proposto. Alcune variazioni nel dosaggio si verificano necessariamente a seconda delle condizioni del soggetto trattato. La persona responsabile della somministrazione determinerà, in ogni caso, la dose appropriata per il singolo soggetto. Inoltre, per la somministrazione nell’uomo, le preparazioni possono soddisfare gli standard di sterilità, pirogenicità, sicurezza generale e purezza richiesti dagli standard dell'FDA Office of Biologics.
Vie di Somministrazione e Dosaggio
Vettori virali, quali i vettori AAV e altri qui descritti, contenenti il transgene possono essere somministrati a un paziente (ad esempio un paziente umano) mediante una varietà di vie di somministrazione. La via di somministrazione può variare, ad esempio, con l'insorgenza e la gravità della malattia e può includere, per esempio, la somministrazione intravenosa, intradermica, transdermica, parenterale, intramuscolare, intranasale, sottocutanea, percutanea, intratracheale, intraperitoneale, intra-arteriosa, intravascolare, inalatoria, per perfusione, mediante lavanda e orale. La somministrazione intravascolare include il rilascio all’interno del sistema vascolare di un paziente. In alcune forme di realizzazione, la somministrazione è all’interno di un vaso sanguigno considerato essere una vena (endovenosa) e, in alcune somministrazioni, la somministrazione è all’interno di un vaso sanguigno considerato essere un'arteria (intra-arteriosa). Le vene includono, ma non sono limitate a, la vena giugulare interna, una vena periferica, una vena coronaria, una vena epatica, la vena porta, la grande vena safena, la vena polmonare, la vena cava superiore, la vena cava inferiore, una vena gastrica, una vena splenica, una vena mesenterica inferiore, una vena mesenterica superiore, una vena cefalica e/o una vena femorale. Le arterie includono, ma non sono limitate a, l'arteria coronaria, l'arteria polmonare, l'arteria brachiale, l'arteria carotide interna, l'arco aortico, l'arteria femorale, l'arteria periferica e/o l'arteria ciliare. Viene contemplato che la somministrazione possa avvenire attraverso o verso un'arteriola o un capillare.
I regimi di trattamento possono variare, e spesso dipendono dalla gravità della malattia e dall'età, peso e sesso del paziente. Il trattamento può includere la somministrazione dei vettori (per esempio, vettori virali) o altri agenti qui descritti come utili per l'introduzione di un transgene in una cellula bersaglio in varie dosi unitarie. Ciascuna dose unitaria contiene in genere una quantità predeterminata della composizione terapeutica.
Nei casi in cui il transgene è somministrato al paziente mediante terapia genica virale (ad esempio, mediante la somministrazione di un vettore AAV qui descritto, quale ad esempio un vettore AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh74, AAV2/8, o AAV2/9), il vettore virale può essere somministrato al paziente, per esempio, ad una dose da circa 1 x 10<6 >copie di genoma (GC)/kg a circa 1 x 10<18 >GC/kg (ad esempio, ad una dose di circa 1 x 10<6 >GC/kg, 2 x 10<6 >GC/kg, 3 x 10<6 >GC/kg, 4 x 10<6 >GC/kg, 5 x 10<6 >GC/kg, 6 x 10<6 >GC/kg, 7 x 10<6 >GC/kg, 8 x 10<6 >GC/kg, 9 x 10<6 >GC/kg, 1 x 10<7 >GC/kg, 2 x 10<7 >GC/kg, 3 x 10<7 >GC/kg, 4 x 10<7 >GC/kg, 5 x 10<7 >GC/kg, 6 x 10<7 >GC/kg, 7 x 10<7 >GC/kg, 8 x 10<7 >GC/kg, 9 x 10<7 >GC/kg, 1 x 10<8 >GC/kg, 2 x 10<8 >GC/kg, 3 x 10<8 >GC/kg, 4 x 10<8 >GC/kg, 5 x 10<8 >GC/kg, 6 x 10<8 >GC/kg, 7 x 10<8 >GC/kg, 8 x 10<8 >GC/kg, 9 x 10<8 >GC/kg, 1 x 10<9 >GC/kg, 2 x 10<9 >GC/kg, 3 x 10<9 >GC/kg, 4 x 10<9 >GC/kg, 5 x 10<9 >GC/kg, 6 x 10<9 >GC/kg, 7 x 10<9 >GC/kg, 8 x 10<9 >GC/kg, 9 x 10<9 >GC/kg, 1 x 10<10 >GC/kg, 2 x 10<10 >GC/kg, 3 x 10<10 >GC/kg, 4 x 10<10 >GC/kg, 5 x 10<10 >GC/kg, 6 x 10<10 >GC/kg, 7 x 10<10 >GC/kg, 8 x 10<10 >GC/kg, 9 x 10<10 >GC/kg, 1 x 10<11 >GC/kg, 2 x 10<11 >GC/kg, 3 x 10<11 >GC/kg, 4 x 10<11 >GC/kg, 5 x 10<11 >GC/kg, 6 x 10<11 >GC/kg, 7 x 10<11 >GC/kg, 8 x 10<11 >GC/kg, 9 x 10<11 >GC/kg, 1 x 10<12 >GC/kg, 2 x 10<12 >GC/kg, 3 x 10<12 >GC/kg, 4 x 10<12 >GC/kg, 5 x 10<12 >GC/kg, 6 x 10<12 >GC/kg, 7 x 10<12 >GC/kg, 8 x 10<12 >GC/kg, 9 x 10<12 >GC/kg, 1 x 10<13 >GC/kg, 2 x 10<13 >GC/kg, 3 x 10<13 >GC/kg, 4 x 10<13 >GC/kg, 5 x 10<13 >GC/kg, 6 x 10<13 >GC/kg, 7 x 10<13 >GC/kg, 8 x 10<13 >GC/kg, 9 x 10<13 >GC/kg, 1 x 10<14 >GC/kg, 2 x 10<14 >GC/kg, 3 x 10<14 >GC/kg, 4 x 10<14 >GC/kg, 5 x 10<14 >GC/kg, 6 x 10<14 >GC/kg, 7 x 10<14 >GC/kg, 8 x 10<14 >GC/kg, 9 x 10<14 >GC/kg, 1 x 10<15 >GC/kg, 2 x 10<15 >GC/kg, 3 x 10<15 >GC/kg, 4 x 10<15 >GC/kg, 5 x 10<15 >GC/kg, 6 x 10<15 >GC/kg, 7 x 10<15 >GC/kg, 8 x 10<15 >GC/kg, 9 x 10<15 >GC/kg, 1 x 10<16 >GC/kg, 2 x 10<16 >GC/kg, 3 x 10<16 >GC/kg, 4 x 10<16 >GC/kg, 5 x 10<16 >GC/kg, 6 x 10<16 >GC/kg, 7 x 10<16 >GC/kg, 8 x 10<16 >GC/kg, 9 x 10<16 >GC/kg, 1 x 10<17 >GC/kg, 2 x 10<17 >GC/kg, 3 x 10<17 >GC/kg, 4 x 10<17 >GC/kg, 5 x 10<17 >GC/kg, 6 x 10<17 >GC/kg, 7 x 10<17 >GC/kg, 8 x 10<17 >GC/kg, 9 x 10<17 >GC/kg, or 1 x 10<18 >GC/kg). In alcune forme di realizzazione, il vettore è somministrato al paziente ad una dose da circa 1 x 10<8 >GC/kg a circa 1 x 10<16 >GC/kg (ad esempio, ad una dose di circa 1 x 10<8 >GC/kg, 2 x 10<8 >GC/kg, 3 x 10<8 >GC/kg, 4 x 10<8 >GC/kg, 5 x 10<8 >GC/kg, 6 x 10<8 >GC/kg, 7 x 10<8 >GC/kg, 8 x 10<8 >GC/kg, 9 x 10<8 >GC/kg, 1 x 10<9 >GC/kg, 2 x 10<9 >GC/kg, 3 x 10<9 >GC/kg, 4 x 10<9 >GC/kg, 5 x 10<9 >GC/kg, 6 x 10<9 >GC/kg, 7 x 10<9 >GC/kg, 8 x 10<9 >GC/kg, 9 x 10<9 >GC/kg, 1 x 10<10 >GC/kg, 2 x 10<10 >GC/kg, 3 x 10<10 >GC/kg, 4 x 10<10 >GC/kg, 5 x 10<10 >GC/kg, 6 x 10<10 >GC/kg, 7 x 10<10 >GC/kg, 8 x 10<10 >GC/kg, 9 x 10<10 >GC/kg, 1 x 10<11 >GC/kg, 2 x 10<11 >GC/kg, 3 x 10<11 >GC/kg, 4 x 10<11 >GC/kg, 5 x 10<11 >GC/kg, 6 x 10<11 >GC/kg, 7 x 10<11 >GC/kg, 8 x 10<11 >GC/kg, 9 x 10<11 >GC/kg, 1 x 10<12 >GC/kg, 2 x 10<12 >GC/kg, 3 x 10<12 >GC/kg, 4 x 10<12 >GC/kg, 5 x 10<12 >GC/kg, 6 x 10<12 >GC/kg, 7 x 10<12 >GC/kg, 8 x 10<12 >GC/kg, 9 x 10<12 >GC/kg, 1 x 10<13 >GC/kg, 2 x 10<13 >GC/kg, 3 x 10<13 >GC/kg, 4 x 10<13 >GC/kg, 5 x 10<13 >GC/kg, 6 x 10<13 >GC/kg, 7 x 10<13 >GC/kg, 8 x 10<13 >GC/kg, 9 x 10<13 >GC/kg, 1 x 10<14 >GC/kg, 2 x 10<14 >GC/kg, 3 x 10<14 >GC/kg, 4 x 10<14 >GC/kg, 5 x 10<14 >GC/kg, 6 x 10<14 >GC/kg, 7 x 10<14 >GC/kg, 8 x 10<14 >GC/kg, 9 x 10<14 >GC/kg, 1 x 10<15 >GC/kg, 2 x 10<15 >GC/kg, 3 x 10<15 >GC/kg, 4 x 10<15 >GC/kg, 5 x 10<15 >GC/kg, 6 x 10<15 >GC/kg, 7 x 10<15 >GC/kg, 8 x 10<15 >GC/kg, 9 x 10<15 >GC/kg, or 1 x 10<16 >GC/kg). In alcune forme di realizzazione, il vettore è somministrato al paziente ad una dose da circa 1 x 10<10 >GC/kg a circa 1 x 10<14 >GC/kg (ad esempio, ad una dose di circa 1 x 10<10 >GC/kg, 2 x 10<10 >GC/kg, 3 x 10<10 >GC/kg, 4 x 10<10 >GC/kg, 5 x 10<10 >GC/kg, 6 x 10<10 >GC/kg, 7 x 10<10 >GC/kg, 8 x 10<10 >GC/kg, 9 x 10<10 >GC/kg, 1 x 10<11 >GC/kg, 2 x 10<11 >GC/kg, 3 x 10<11 >GC/kg, 4 x 10<11 >GC/kg, 5 x 10<11 >GC/kg, 6 x 10<11 >GC/kg, 7 x 10<11 >GC/kg, 8 x 10<11 >GC/kg, 9 x 10<11 >GC/kg, 1 x 10<12 >GC/kg, 2 x 10<12 >GC/kg, 3 x 10<12 >GC/kg, 4 x 10<12 >GC/kg, 5 x 10<12 >GC/kg, 6 x 10<12 >GC/kg, 7 x 10<12 >GC/kg, 8 x 10<12 >GC/kg, 9 x 10<12 >GC/kg, 1 x 10<13 >GC/kg, 2 x 10<13 >GC/kg, 3 x 10<13 >GC/kg, 4 x 10<13 >GC/kg, 5 x 10<13 >GC/kg, 6 x 10<13 >GC/kg, 7 x 10<13 >GC/kg, 8 x 10<13 >GC/kg, 9 x 10<13 >GC/kg, or 1 x 10<14 >GC/kg).
Esempi
I seguenti esempi vengono presentati in modo tale da fornire al tecnico medio del settore una descrizione di come le composizioni e i metodi qui descritti possono essere impiegati, realizzati e valutati, e sono intesi essere puramente esemplificativi dell'invenzione e non sono intesi essere limitativi della portata di ciò che gli inventori considerano come la loro invenzione.
Esempio 1. La somministrazione di CASQ2 ai topi eterozigoti RYR 4496C/+ sopprime l’aritmia in modo indipendente dall’espressione di RYR2, triadina, e giuntina
Materiali e Metodi
Impiego degli animali
Gli animali sono stati mantenuti e allevati presso i Charles River Laboratories di Calco, in Italia, e trasferiti all'ICS Maugeri Spa-SB per la caratterizzazione del fenotipo. Gli animali sono stati mantenuti e studiati secondo i protocolli approvati dal comitato per il benessere degli animali dall'Università di Pavia.
Generazione del modello murino knock-in R4496C RYR2 Gli esperimenti descritti in questo esempio hanno impiegato un modello murino knock-in eterozigote RYR2 <R4496C/+ >della CPVT dominante, che replica il fenotipo della mutazione umana RYR2 R4997C. Dettagli riguardanti la produzione di questo modello di topo sono forniti nel brevetto US 7,741,529, il cui contenuto è qui incorporato come riferimento per quanto attiene la generazione del modello knock-in RYR2 <R4496C/+>.
Progettazione e produzione del vettore
Una descrizione dettagliata della progettazione del vettore impiegato in questi esperimenti è fornita nel brevetto US No. 8,859,517. In breve, è stato generato un vettore adeno-associato sierotipo 9 pseudotipizzato (AAV2 / 9) contenente la sequenza codificante di CASQ2 murino wild-type (sequenza di riferimento NCBI n. NM_009814.2), privo delle sequenze UTR. CASQ2 murino wild-type è stato clonato nel vettore pGEM-T-Easy (Promega). Mediante digestione enzimatica con EcoRI, l'inserto corrispondente al transgene CASQ2 è stato escisso dal vettore pGEM e sotto-clonato nel vettore biscistronico pIRES (BD Biosciences, Cat. No: 631605, Clontech Palo Alto CA, USA). Successivamente, il frammento corrispondente al transgene CASQ2 seguito dalla sequenza IRES è stato sotto-clonato tramite amplificazione PCR utilizzando primer specifici (Diretto: 5'-CACAGCGGCCGCACAATGAAGAGGATTTACCTGCTCATGG-3 ' (SEQ ID NO: 5) e Inverso 5'-CGAAGCATTAACCCTCACTAAAGGG-3' (SEQ ID NO: 6) contenenti il sito enzimatico NotI. Il prodotto di amplificazione è stato inserito mediante digestione enzimatica con NotI nel vettore con scheletro di adenovirus pAAV-2.1-eGFP, sierotipo 9 (contenente una sequenza poliA dell'ormone della crescita bovino (BGH) e un promotore del CMV), fornito dalla Adeno-Associated Virus (AAV) vector Core facility (Tigem, Napoli, Italia). Tutti i plasmidi sono stati sequenziati.
La produzione di AAV è stata realizzata in collaborazione con l’AAV Vector core facility del Tigem. I vettori AAV sono stati generati utilizzando una trasfezione transiente di 3 plasmidi in cellule HEK 293: pAd helper, pAAV rep-cap (impacchettamento), pAAV Cis (che include l'inserto CASQ2, clonato nel plasmide pAAV2.1-CMV-eGFP MCS). Sono state condotte analisi PCR in tempo reale e dot blot al fine di stimare il titolo virale, ed è stato effettuato SDS PAGE seguito dalla colorazione di Coomassie al fine di valutare la presenza e la purezza delle proteine del capside. Sono stati anche valutati l'infettività e la sterilità. Il servizio ha fornito una preparazione virale in PBS con una resa totale superiore a 1 x 10<12 >copie genomiche. Tutti gli stock di AAV2/9-WT-mCASQ2-IRES-eGFP sono stati congelati a - 80°C in aliquote singole e scongelati durante la procedura chirurgica.
PCR quantitativa in tempo reale
L'RNA totale dal tessuto cardiaco dei topi RyR2
R4496C/+ e dai topi knock-in eterozigoti RyR2 <R4496C/+ >infettati con il vettore virale AAV9-WT-mCASQ2-IRES-eGFP è stato purificato con il kit RNeasy mini (Qiagen). Per il saggio RT-PCR eseguito con il kit iScript cDNA Synthesis (Bio-Rad Laboratories, Inc., USA) è stata utilizzata una quantità totale di 1 μg di RNA templato per reazione. La quantificazione in tempo reale degli mRNA dei diversi geni di interesse (RyR2 CASQ2, Triadina, Giuntina) e del gene di riferimento (GAPDH) è stata eseguita in piastre ottiche a 96 pozzetti utilizzando il modulo di rilevamento CFX96 (Bio-Rad Laboratories, Inc.). Tutti i campioni sono stati analizzati in triplice copia con SsoFast EvaGreen Supermix utilizzando una miscela di primer specifici e 20 ng di di cDNA templato con i primer precedentemente riportati (Denegri et al., Circulation 129: 267381 (2014)). La PCR in tempo reale è stata condotta utilizzando il sistema di rilevazione PCR in tempo reale CFX96 e analizzata utilizzando il Software Bio-Rad CFX96 Manager (Version 1.5).
Esperimenti In vivo
Il vettore AAV contenente il costrutto illustrato in FIG. 1 è stato somministrato a n = 4 topi neonati mediante iniezione intraperitoneale di 100 μl di virus purificato ad una dose di 6,4 x 10<11 >copie genomiche con una siringa da 25 gauge nell'ottavo giorno postnatale (P8). Un totale di n = 5 della stessa nidiata non sono stati trattati.
A 7 settimane di età, i monitor per l’elettrocardiografia (ECG) e radiotelemetria (Data Sciences International) sono stati impiantati in tutti i topi per via sottocutanea in anestesia generale (Isoflurano 1,5-3%). Dopo 72 ore di recupero dall’intervento, è stata eseguita la caratterizzazione del fenotipo. È stato registrato l'ECG basale per determinare la presenza di aritmie spontanee. Immediatamente dopo, è stata testata la suscettibilità dei topi ad aritmie indotte da stimolazione adrenergica mediante somministrazione di epinefrina (2 mg/kg) e caffeina (120 mg/kg) tramite iniezione intraperitoneale (Cerrone et al., M, Circulation Research 96: e77-e82 (2005), Liu et al., Circulation Research 99: 292-298 (2006)). Tutti gli animali erano liberi di muoversi mentre venivano eseguite le registrazioni ECG.
Risultati
Come mostrato in FIG. 2, la somministrazione di un vettore AAV codificante per il transgene CASQ2 a topi RYR2 <R4996C/+ >ha provocato una completa soppressione dell'aritmia indotta da caffeina ed epinefrina. In seguito alla stimolazione βadrenergica, nessuno dei 4 topi trattati con AVV CASQ2 ha mostrato attività aritmica, mentre tutti i 5 topi non sottoposti a trattatamento hanno dimostrato aritmia. Inoltre, gli effetti terapeutici della somministrazione di CASQ2 nei topi RYR2 <R4996C/+ >non erano dipendenti dall'attività di RYR2 o delle proteine associate alla membrana, triadina e giuntina. Come mostrato nella FIG. 3, la somministrazione del vettore AQ CASQ2 ha provocato un'espressione elevata di CASQ2 nei miociti cardiaci, ma non ha alterato sostanzialmente l'espressione di RYR2, triadina o giuntina in tali cellule.
Nel loro insieme, questi risultati dimostrano che la somministrazione del transgene CASQ2 in modelli murini della CPVT dominante favorisce la correzione di aritmie bidirezionali e polimorfe. Sorprendentemente, è stato trovato che la somministrazione del gene CASQ2 da solo, senza la necessità della somministrazione di RYR2, previene il ritmo sinusale fisiologico che scatena aritmie dovute all'attivazione adrenergica. La terapia genica CASQ2 nei modelli murini di CPVT dominante ha provocato un aumento dell'espressione di CASQ2 nei miociti cardiaci e ha ripristinato la funzione contrattile cardiaca antiaritmica.
Alla luce di questi risultati e della descrizione qui fornita, la terapia genica CASQ2 può essere impiegata come paradigma per il trattamento della CPVT dominante, come illustrato nell'Esempio 2, di seguito.
Esempio 2. Trattamento della CPVT dominante in un paziente umano mediante somministrazione di un vettore virale contenente un transgene CASQ2
Mediante impiego di tecniche convenzionali di biologia molecolare note nello stato dell’arte, un gene codificante per una proteina CASQ2, quale la proteina CASQ2 wild-type umana avente la sequenza amminoacidica di SEQ ID NO: 1 (o una sua variante avente almeno l'85% di identità di sequenza con la sequenza amminoacidica di SEQ ID NO: 1), può essere incorporato in un vettore virale e formulato per la somministrazione a un paziente umano. Ad esempio, ad un paziente affetto da CPVT dominante, può essere somministrato un vettore AAV contenente un transgene CASQ2 sotto il controllo di un elemento regolatore trascrizionale che promuove l'espressione di CASQ2 nei miociti cardiaci. Il vettore AAV può essere un vettore pseudotipizzato che incorpora il transgene CASQ2 tra le sequenze ripetute invertite ai terminali 5 'e 3' di AAV2 e che è incapsidato dalle proteine capsidiche di AAV8 o AAV9 (ad esempio, un vettore AAV2/8 o AAV2/9). Il vettore AAV può essere somministrato al soggetto mediante diverse vie di somministrazione, quali ad esempio la via endovenosa, intramuscolare o sottocutanea, tra le altre.
Dopo la somministrazione del vettore a un paziente, un professionista esperto nel settore può monitorare l'espressione del gene CASQ2, e il miglioramento del paziente in risposta alla terapia, con una molteplicità di metodi. Ad esempio, un medico può monitorare la funzione cardiaca del paziente analizzando la quantità o la frequenza degli eventi di aritmia mostrati dal paziente dopo la somministrazione del transgene. Una constatazione che il paziente mostra una minore o assente attività di aritmia in un periodo di tempo determinato successivamente alla somministrazione del transgene CASQ2, rispetto a un equivalente periodo di tempo esaminato prima della somministrazione del transgene può essere indicativa del fatto che il paziente sta rispondendo favorevolmente al trattamento. Le dosi successive possono essere determinate e somministrate secondo necessità.
Altre Forme di Realizzazione
Tutte le pubblicazioni, i brevetti e le domande di brevetto menzionate in questa descrizione sono qui incorporate come citazione come se ciascuna pubblicazione o domanda di brevetto indipendente fosse specificatamente e individualmente indicata come incorporata come citazione.
Sebbene l'invenzione sia stata descritta in relazione a sue specifiche forme di realizzazione, va compreso che essa è suscettibile di ulteriori modificazioni e che questa domanda è intesa coprire qualsiasi variazione, uso o adattamento dell'invenzione seguendo, in generale, i principi dell’invenzione e includendo deviazioni dall'invenzione che rientrano nella pratica nota o consueta nel settore a cui l'invenzione appartiene e possono essere applicata alle caratteristiche essenziali qui esposte, e seguono nella portata delle rivendicazioni.
Ulteriori forme di realizzazione sono ricomprese nelle rivendicazioni.

Claims (31)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Metodo per il trattamento della tachicardia ventricolare polimorfa catecolaminergica (CPVT) dominante in un paziente umano che ne ha necessità, il metodo comprendendo somministrare al paziente una quantità terapeuticamente efficace di una composizione comprendente un transgene codificante la calsequestrina 2 (CASQ2).
  2. 2. Metodo secondo la rivendicazione 1, in cui il paziente presenta una mutazione con guadagno di funzione in un gene endogeno codificante per il recettore 2 della rianodina (RYR2), in cui la mutazione in RYR2 produce preferibilmente un aumento del rilascio di calcio citosolico in un miocita cardiaco che è posto a contatto con un agonista di RYR2 rispetto a un miocita cardiaco che non è posto a contatto con l'agonista di RYR2, in cui la mutazione in RYR2 è scelta più preferibilmente tra R4497C, N4104K, N4895D, R176Q, G178A, R420W, L433P, P1067S, S2246L, G2273R, F2307L, E2311D, L2344P, R2474S, T2504M, K3717R, L3778F, G3926D, G3946S, Q4159P, V4319-K4324dup, R4651I, V4771I, F4851L, A4860G, I4867M, P4902S, e/o R4959Q.
  3. 3. Metodo secondo la rivendicazione 1, in cui il paziente presenta una mutazione in un gene endogeno codificante per una calmodulina, in cui la calmodulina è preferibilmente CALM1.
  4. 4. Metodo secondo la rivendicazione 3, in cui la mutazione riduce l'inibizione di CALM1 del rilascio di calcio dal reticolo sarcoplasmatico di un miocita cardiaco
  5. 5. Metodo secondo la rivendicazione 3, in cui la CALM1 che porta la mutazione attiva direttamente il rilascio di calcio dal reticolo sarcoplasmatico di un miocita cardiaco.
  6. 6. Metodo secondo la rivendicazione 3, in cui la mutazione aumenta la stabilità di una conformazione aperta di RYR2 in un complesso CALM1-RYR2 presente in una soluzione acquosa avente una concentrazione di Ca<2+ >da circa 50 nM a circa 5 μM.
  7. 7. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 3-6, in cui la mutazione in CALM1 è N97S o N53I.
  8. 8. Metodo secondo la rivendicazione 3, in cui la calmodulina è CALM3.
  9. 9. Metodo secondo la rivendicazione 8, in cui la CALM3 che porta la mutazione attiva direttamente il rilascio di calcio dal reticolo sarcoplasmatico di un miocita cardiaco.
  10. 10. Metodo secondo la rivendicazione 8 o 9, in cui la mutazione in CALM3 è A103V.
  11. 11. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-10, in cui la mutazione è eterozigote.
  12. 12. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-11, in cui il transgene CASQ2 codifica per una proteina avente una sequenza amminoacidica che è identica almeno per l’85% alla sequenza amminoacidica di SEQ ID NO: 1, o identica almeno per il 90% alla sequenza amminoacidica di SEQ ID NO: 1, o identica almeno per il 95% alla sequenza amminoacidica di SEQ ID NO: 1.
  13. 13. Metodo secondo la rivendicazione 12, in cui il transgene CASQ2 codifica per una proteina avente la sequenza amminoacidica di SEQ ID NO: 1.
  14. 14. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-12, in cui il transgene CASQ2 ha una sequenza di acido nucleico che è identica almeno per l’85% alla sequenza di acido nucleico di SEQ ID NO: 2, o identica almeno per il 90% alla sequenza di acido nucleico di SEQ ID NO: 2, o identica almeno per il 95% alla sequenza di acido nucleico di SEQ ID NO: 2.
  15. 15. Metodo secondo la rivendicazione 14, in cui il transgene CASQ2 ha la sequenza di acido nucleico di SEQ ID NO: 2.
  16. 16. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-15, in cui la composizione è un vettore, preferibilmente un vettore virale, più preferibilmente un vettore virale scelto dal gruppo che consiste di virus adeno-associato (AAV), adenovirus, lentivirus, retrovirus, poxvirus, baculovirus, virus herpes simplex, virus del vaccino, e un virus sintetico.
  17. 17. Metodo secondo la rivendicazione 16, in cui il virus sintetico è un virus chimerico, virus mosaico, o virus pseudotipizzato, e/o comprende una proteina estranea, polimero sintetico, nanoparticella, o piccola molecola.
  18. 18. Metodo secondo la rivendicazione 16, in cui il vettore virale è un AAV, preferibilmente un sierotipo AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, o AAVrh74.
  19. 19. Metodo secondo la rivendicazione 16, in cui il vettore virale è un AAV pseudotipizzato, preferibilmente in cui l’AAV pseudotipizzato è AAV2/8 o AAV2/9.
  20. 20. Metodo secondo la rivendicazione 16, in cui l’AAV comprende una proteina capsidica ricombinante.
  21. 21. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-15, in cui la composizione è un liposoma, vescicola, vescicola sintetica, esosoma, esosoma sintetico, dendrimero o nanoparticella.
  22. 22. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-21, in cui il transgene è collegato operativamente a un promotore che induce l’espressione del CASQ2 in un miocita cardiaco, in cui il promotore è preferibilmente scelto dal gruppo che consiste del promotore di citomegalovirus, promotore della catena leggera della miosina 2, il promotore dell’alfa actina, il promotore della troponina 1, il promotore dello scambiatore Na<+>/Ca<2+>, il promotore della distrofina, il promotore della creatina chinasi, il promotore della integrina alfa 7, il promotore del peptide natriuretico cerebrale, il promotore della alfa B-cristallina/piccola proteina da shock termico, il promotore della catena pesante della miosina alfa, il promotore del fattore natriuretico atriale, e il promotore della desmina.
  23. 23. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-22, in cui dopo la somministrazione della composizione al paziente, l’espressione di CASQ2 aumenta in una cellula cardiaca nel paziente, in cui la cellula cardiaca è preferibilmente un miocita cardiaco.
  24. 24. Metodo secondo la rivendicazione 22 o 23, in cui l’espressione di CASQ2 viene stimata misurando la proteina CASQ2 nella cellula o l’espressione di CASQ2 viene stimata misurando l’mRNA di CASQ2 nella cellula.
  25. 25. Metodo secondo la rivendicazione 24, in cui l’espressione dell’mRNA di CASQ2 aumenta da circa 1,5 volte a circa 3,5 volte, preferibilmente da circa 2 volte a circa 3 volte nella cellula, più preferibilmente da circa 2,5 volte a circa 3 volte nella cellula.
  26. 26. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 25, in cui dopo la somministrazione della composizione al paziente, l’espressione di RYR2, triadina, e/o giuntina non è sostanzialmente alterata in una cellula cardiaca nel paziente.
  27. 27. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-26, in cui la composizione è somministrata al paziente per via di somministrazione intravenosa, intradermica, transdermica, parenterale, intramuscolare, intranasale, sottocutanea, percutanea, intratracheale, intraperitoneale, intraarteriosa, intravascolare, inalatoria, per perfusione, mediante lavanda e orale.
  28. 28. Kit comprendente una composizione comprendente un transgene che codifica per CASQ2 e un foglietto illustrativo, in cui il foglietto illustrativo fornisce istruzioni ad un utente del kit di somministrare la composizione a un paziente affetto da CPVT dominante secondo il metodo di una qualsiasi delle rivendicazioni 1-27.
  29. 29. Kit secondo la rivendicazione 28, in cui la composizione è un vettore, preferibilmente un vettore virale, più preferibilmente un vettore virale scelto dal gruppo che consiste di virus adenoassociato (AAV), adenovirus, lentivirus, retrovirus, poxvirus, baculovirus, virus herpes simplex, e un virus del vaccino.
  30. 30. Kit secondo la rivendicazione 29, in cui il vettore virale è un AAV, preferibilmente un sierotipo AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, o AAVrh74.
  31. 31. Kit secondo la rivendicazione 30, in cui il vettore virale è un AAV pseudotipizzato, preferibilmente AAV2/8 o AAV2/9.
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