CN111527201A - 修饰的病毒载体及其制备和使用方法 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及细小病毒载体的产生，以产生用于基因疗法的腺相关病毒(AAV)。具体而言，本公开涉及细小病毒载体的改进，其提高AAV病毒体的包装容量、产生效率和感染性，这对于为了临床目的而大规模制造AAV是必需的。

Description

修饰的病毒载体及其制备和使用方法
本发明总体上涉及产生用于将核酸递送至外来宿主和用于基因治疗的细小病毒载体的领域。更具体地说，本发明涉及在昆虫细胞中大规模产生细小病毒颗粒的改进。
背景技术
腺相关病毒(AAV)可以被认为是对于人类基因治疗最有希望的病毒载体之一。AAV具有有效感染分裂和非分裂人类细胞的能力，AAV的病毒基因组整合到宿主细胞基因组中的单个染色体位点，而且最重要的是，即使AAV存在于许多人类中，也从未与任何疾病相关。鉴于这些优点，在针对B型血友病、恶性黑色素瘤、囊性纤维化和其他疾病的临床试验中进行着重组腺相关病毒(rAAV)疗法的评估。基因疗法药物的许多临床试验和批准，例如Alipogene tiparvovec(
Figure BDA0002559346240000011
uniQure)和最近的Voretigene neparvovec-rzyl(
Figure BDA0002559346240000012
Spark Therapeutics)，都表明AAV将成为临床实践的主要内容。
尽管AAV基因疗法是有希望的，已经确定了AAV的临床应用的两个限制。首先，难以实现大规模一致地产生感染性AAV颗粒。其次，AAV的衣壳尺寸小是对于大基因相关的人类疾病(如A型血友病和囊性纤维化)的临床应用的主要限制。
扩大用于基因疗法的AAV的产生并非易事，而且大规模AAV必须满足制备和临床实践的严格要求。通常，重组AAV的产生系统主要有两种。一方面是在哺乳动物细胞类型(例如293细胞、COS细胞、HeLa细胞、KB细胞)中的常规产生系统，以及另一方面是使用昆虫细胞的产生系统。
哺乳动物的产生系统具有几个缺点，其中可能包括每个细胞生成的rAAV颗粒数量有限以及繁琐的大规模制备。通常参见Clark等，Kidney Int.61:9–15(2002)。对于临床研究，可能需要超过1015个rAAV颗粒。产生此数量的rAAV颗粒需要转染和培养大约1011个培养的人293细胞，相当于5000个175-cm2烧瓶的细胞。这使得为临床试验做准备费力且不切实际，并且表明使用哺乳动物培养物进行商业化所需的扩大将实际上是不可行的。此外，在哺乳动物培养物中产生的载体总是存在被哺乳动物宿主细胞中存在的不期望的、可能是致病的材料污染的风险。
在昆虫细胞中产生rAAV是解决哺乳动物培养的许多限制的替代选择。参见例如Urabe等,Hum.Gene Ther.13:1935–1943(2002)；US 20030148506，以及US 20040197895。然而，至少部分地由于用于在昆虫系统中表达的病毒载体的不稳定性，也难以扩大在昆虫细胞中产生AAV。参见Kohlbrenner等,Mol.Ther.12:1217-25(2005)；WO2005/072364)。尽管已经为改善稳定性做出了尝试(例如，通过从两个单独的病毒载体表达Rep52和Rep78)，在多次培养传代中持续产生rAAV仍然是困难的。此外，在这些培养物中产生的rAAV可能具有较少的传染性或没有传染性(参见，例如，Kohlbrenner等(2005，同上))，因此限制在昆虫细胞中产生的一些rAAV的治疗功用。
对衣壳蛋白VP1、VP2和VP3在AAV装配和感染性中的特定作用的不完全了解，进一步限制AAV的商业规模产生的改善。Muzyczka等,Chapter 69:Parvoviridae:The virusesand their replication in FIELDS VIROLOGY(4th ed.,2001)。野生型AAV衣壳由以化学计量比分别为约1：1：10的大约60个总衣壳VP1、VP2和VP3蛋白的组合组成。常规上，认为衣壳蛋白的化学计量对于实现良好的效力和转导效率是重要的。实际上，当在昆虫细胞中产生rAAV时，本领域经常集中于尝试维持衣壳蛋白的精确的、天然存在的比例。参见Urabe等(2002，同上)；WO2007/046703以及。尽管已经为改变在昆虫细胞中表达的rAAV的组成做出尝试，这些尝试表明VP2是昆虫细胞中衣壳形成所需的。Ruffing等,J.Virol.,66(12):6922-30(1992)；Grieger等,J.Virol.,79(15):9933-44(2005)。
因此，在本领域中仍然需要改进rAAV的产生，这将允许有效地商业化扩大治疗上有用的rAAV。本公开满足这些需求。
发明内容
本文描述了缺乏VP2衣壳(“无VP2”)并在昆虫细胞中产生的重组腺相关病毒(rAAV)，以及其制备和使用方法。这些无VP2的rAAV可以有效地扩大商业产生、与含VP2衣壳蛋白的rAAV相比具有增加的净负载容量(payload capacity)、并保持感染性，这使得它们适合于治疗目的。
一方面，本公开提供表达AAV VP1蛋白和AAV VP3蛋白但不表达AAV VP2蛋白的昆虫细胞。
在一些实施方案中，昆虫细胞可以包含编码AAV VP1蛋白和AAV VP3蛋白的单个核苷酸序列，而在一些实施方案中，昆虫细胞可以包含编码AAV VP1蛋白的第一核苷酸序列和编码AAV VP3蛋白的单独的第二核苷酸序列。例如，当VP1和VP3都在单个核苷酸序列中编码时，所述核苷酸序列可以包含编码AAV VP1蛋白的开放阅读框和编码AAV VP3蛋白的开放阅读框。
在一些实施方案中，昆虫细胞可以包含编码腺相关病毒(AAV)VP2蛋白的核苷酸序列，但是VP2起始密码子已经被失活。
在一些实施方案中，昆虫细胞可以进一步包含这样的核苷酸序列，其包含至少一个AAV的末端反向重复(ITR)核苷酸序列和/或至少一个编码感兴趣的基因产物的核苷酸序列。在一些实施方案中，昆虫细胞可以进一步包含这样的核苷酸序列，其包含与用于在昆虫细胞中表达的表达控制序列可操作地连接的Rep78或Rep68编码序列。在一些实施方案中，昆虫细胞可以进一步包含这样的核苷酸序列，其包含与用于在昆虫细胞中表达的表达控制序列可操作地连接的Rep52或Rep40编码序列。
在一些实施方案中，AAV VP1蛋白和AAV VP3蛋白均由第一核酸构建体编码。第一核酸构建体可额外包含与用于在昆虫细胞中表达的表达控制序列可操作地连接的Rep78或Rep68编码序列。额外地或可选地，第一核酸构建体还可额外包含与用于在昆虫细胞中表达的表达控制序列可操作地连接的Rep52或Rep40编码序列。在一些实施方案中，昆虫细胞可以进一步包含含有第二核苷酸序列的第二核酸构建体，所述第二核苷酸序列包含例如至少一个AAV末端反向重复(ITR)核苷酸序列和/或至少一个编码感兴趣的基因产物的核苷酸序列。在一些实施方案中，第一和/或第二核酸构建体可以是昆虫细胞相容性载体，例如杆状病毒载体。
在另一方面，本公开提供了包含编码AAV VP1蛋白和AAV VP3蛋白的核苷酸序列的核酸构建体，其中所述核酸构建体不表达AAV VP2蛋白，并且其中核酸序列与用于在昆虫细胞中表达的表达控制序列可操作地连接。
在一些实施方案中，核酸构建体可进一步包含与用于在昆虫细胞中表达的表达控制序列可操作地连接的Rep78或Rep68编码序列。在一些实施方案中，核酸构建体可进一步包含与用于在昆虫细胞中表达的表达控制序列可操作地连接的Rep52或Rep40编码序列。
在一些实施方案中，编码AAV VP1蛋白和AAV VP3蛋白的核苷酸序列可以被密码子优化用于在昆虫细胞中表达。
在另一方面，本公开提供了增加AAV基因疗法载体的容量的方法，所述方法包括在昆虫细胞中表达编码AAV VP1和AAV VP3而不编码AAV VP2的核酸构建体，从而相对于包含VP1、VP2和VP3衣壳蛋白的AAV病毒体，增加AAV基因疗法载体的容量。
在另一方面，本公开提供了提高AAV基因疗法载体的基因组拷贝(gc)滴度的方法，所述方法包括在昆虫细胞中表达编码AAV VP1和AAV VP3而不编码AAV VP2的核酸构建体，从而相对于包含VP1、VP2和VP3衣壳蛋白的AAV病毒体，提高AAV基因疗法载体的拷贝数滴度。从这个意义上讲，基因组拷贝滴度是指携带rAAV载体基因组的基因组拷贝的AAV衣壳颗粒的数量，如通过本领域已知的定量方法，例如通过qPCR所确定的。
在另一方面，本公开提供了核酸构建体，其包含：包含编码AAV VP1蛋白的开放阅读框的核苷酸序列；和包含编码AAV VP3蛋白的开放阅读框的核苷酸序列；其中编码AAVVP1蛋白和AAV VP3蛋白的开放阅读框与用于在昆虫细胞中表达的表达控制序列可操作地连接，并且其中AAV VP2蛋白不由所述核酸构建体编码。
在一些实施方案中，编码AAV VP3蛋白的开放阅读框与编码AAV VP1蛋白的开放阅读框重叠。在一些实施方案中，编码AAV VP1蛋白和AAV VP3蛋白的开放阅读框被排列成使得AAV VP1蛋白和AAV VP3蛋白在表达时被转录为单个RNA转录物。在一些实施方案中，编码AAV VP3蛋白的开放阅读框和编码AAV VP1蛋白的开放阅读框是从分开的表达盒转录的。在一些实施方案中，编码AAV VP3蛋白的开放阅读框和编码AAV VP1蛋白的开放阅读框是从单个表达盒转录的。
在另一方面，本公开提供了增加AAV基因疗法载体的容量的方法，所述方法包括在昆虫细胞中表达核酸构建体，所述核酸构建体包含：包含编码AAV VP1蛋白的开放阅读框的核苷酸序列；和包含编码AAV VP3蛋白的开放阅读框的核苷酸序列；其中编码AAV VP1蛋白和AAV VP3蛋白的开放阅读框与用于在昆虫细胞中表达的表达控制序列可操作地连接，并且其中AAV VP2蛋白不由所述核酸构建体编码，从而相对于包含VP1、VP2和VP3衣壳蛋白的AAV病毒体，增加AAV基因疗法载体的容量。
在另一方面，本公开提供了提高AAV基因疗法载体的基因组拷贝滴度的方法，所述方法包括在昆虫细胞中表达核酸构建体，所述核酸构建体包含：包含编码AAV VP1蛋白的开放阅读框的核苷酸序列；和包含编码AAV VP3蛋白的开放阅读框的核苷酸序列；其中编码AAV VP1蛋白和AAV VP3蛋白的开放阅读框与用于在昆虫细胞中表达的表达控制序列可操作地连接，并且其中AAV VP2蛋白不由所述核酸构建体编码，从而相对于包含VP1、VP2和VP3衣壳蛋白的AAV病毒体，提高AAV基因疗法载体的基因组拷贝滴度。
在另一方面，本公开提供了在昆虫细胞中产生的AAV病毒体，所述昆虫细胞包含：编码至少一个感兴趣的基因产物和至少一个ITR的第一核酸序列；编码AAV VP1蛋白的第二核酸，所述第二核酸与用于在昆虫细胞中表达AAV VP1的表达控制序列可操作地连接；以及编码AAV VP3蛋白的第三核酸，所述第三核酸与用于在昆虫细胞中表达AAV VP3的表达控制序列可操作地连接；编码AAV Rep蛋白的第四核酸；其中所述AAV病毒体包含衣壳，所述衣壳包含AAV VP1蛋白和AAV VP3蛋白，但不包含AAV VP2蛋白。
在一些实施方案中，第一核苷酸序列位于两个AAV ITR核苷酸序列之间。
在一些实施方案中，感兴趣的基因是治疗性基因。例如，治疗性基因可以是编码因子VIII的基因或靶向致病基因的微小RNA、siRNA或shRNA。
在一些实施方案中，AAV病毒体选自由以下组成的组：AAV血清型1(AAV1)、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、和AAV11、AAV12和AAV13。在一些实施方案中，AAV病毒体是重组AAV(rAAV)，例如包含AAV2和AAV5的至少一部分的rAAV2/5。在一些实施方案中，AAV病毒体是嵌合AAV(AAVch)，例如嵌合AAV血清型5(AAV5ch)。在一些实施方案中，AAV病毒体是突变或变体AAV。
在一些实施方案中，VP1蛋白与VP3蛋白的比例在约1：5至约1:59之间。在一实施例中，VP1与VP3的比例大于1：59.0，或更具体地，VP1蛋白与VP3蛋白的比例可以为约1:10。VP1蛋白与VP3蛋白的比例可以优选为约1：5。VP1与VP3的比例可以通过在凝胶上检测VP1和VP3蛋白，例如用抗体或用通用蛋白染色，并测量代表蛋白量的染色的强度来容易地确定。同样，可以考虑直接液相色谱/质谱分析法或类似方法来确定VP1与VP3的比例(Jin等人，HumGene Ther Methods.2017Oct；28(5):255-267)。
在一些实施方案中，可以将所公开的AAV病毒体整合到药物组合物中。
在另一方面，本公开提供了在昆虫细胞中产生重组AAV病毒体的方法，所述方法包括：在允许产生重组AAV病毒体的条件下，培养表达AAV VP1蛋白和AAV VP3蛋白但不表达AAV VP2蛋白的昆虫细胞；以及从培养物中回收重组AAV病毒体。
在一些实施方案中，相对于包含VP1、VP2和VP3衣壳蛋白的AAV病毒体，AAV病毒体的容量被增加。
在一些实施方案中，相对于通过在相同条件下培养包含VP1、VP2和VP3衣壳蛋白的AAV病毒体实现的基因组拷贝滴度，培养物具有升高的重组AAV病毒体的基因组拷贝滴度。
在一些实施方案中，培养物将产生这样的AAV病毒体，其具有的VP1蛋白与VP3蛋白的比例在约1：5至约1:20之间，或者，更具体地，其具有的VP1蛋白与VP3蛋白的比例为约1：5。
在另一方面，本公开提供了在对象中提高感兴趣的基因的表达的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗有效量的所公开的无VP2病毒体，从而提高AAV病毒体基因组中编码的感兴趣的基因的表达。
在一些实施方案中，感兴趣的基因是治疗性基因。
在一些实施方案中，所述对象是人类对象。
在另一方面，本公开提供了在对象中治疗遗传性疾病的方法，所述方法包括向患有遗传性疾病的对象施用治疗有效量的重组AAV病毒体，所述重组AAV病毒体在其基因组中包含编码至少一个治疗性基因的第一核酸序列；其中所述AAV病毒体包含衣壳，所述衣壳包含AAV VP1蛋白和AAV VP3蛋白，但不包含AAV VP2蛋白，并且其中所述AAV病毒体已经在昆虫细胞中产生。
在一些实施方案中，治疗性基因编码在遗传性疾病中突变或缺乏的蛋白质。在一些实施方案中，治疗性基因是靶向遗传性疾病致病基因的微小RNA、siRNA或shRNA。
在一些实施方案中，遗传性疾病可以是因子VIII缺乏症，并因此，治疗性基因可以是因子VIII基因。在一些实施方案中，遗传性疾病可以是血友病的形式(例如，A型血友病或B型血友病)或凝血障碍，并因此治疗性基因可以是编码在凝血障碍中缺乏或突变的凝血因子的基因。在一些实施方案中，遗传性疾病可以是亨廷顿(Huntington)氏病，并因此治疗性基因可以是靶向突变的亨廷顿基因的微小RNA、siRNA或shRNA。
在一些实施方案中，遗传性疾病可以选自急性间歇性卟啉症(AIP)、年龄相关性黄斑变性、阿尔茨海默氏病、关节炎、巴滕病(Batten disease)、卡纳万病(Canavandisease)、1型瓜氨酸血症、克里格勒-纳贾尔综合征(Crigler Najjar)、充血性心力衰竭、囊性纤维化、杜兴氏肌肉萎缩症(Duchene muscular dystrophy)、血脂异常、I型糖原贮积病(GSD-I)、A型血友病、B型血友病、遗传性肺气肿、纯合子家族性高胆固醇血症(HoFH)、亨廷顿氏病(HD)、雷伯氏先天性黑内障(Leber’s congenital amaurosis)、甲基丙二酸血症、鸟氨酸氨甲酰基转移酶缺乏症(OTC)(ornithine transcarbamylase deficiency)、帕金森氏病(Parkinson’s disease)、苯丙酮尿症(PKU)、脊髓性肌肉萎缩症、瘫痪、威尔逊病(Wilson disease)、癫痫症、庞贝病(Pompe disease)、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、泰-萨克斯病(Tay-Sachs disease)、高草酸尿症9PH-1)、1型脊髓小脑共济失调(SCA-1)、SCA-3、u-抗肌萎缩蛋白病(u-dystrophin)、II型或III型戈谢氏病(Gaucher’s types II or III)、致心律失常性右室心肌病(ARVC)、法布里氏病(Fabry disease)、家族性地中海热病(FMF)、丙酸血症、脆性X综合征、雷特综合征(Rett syndrome)、尼曼-匹克氏病(Niemann-Pick)和克拉伯病(Krabbe disease)。
以下详细描述是示例性和说明性的，并且旨在提供对本发明的进一步说明。
附图简述
图1示出与拥有完整衣壳的野生型AAV5(AAV 765)相比，缺失了VP1的AAV的包装容量显著增加，但是缺失了VP2的包装没有显著增加。图表示出AAV5、ΔVP1和ΔVP2针对不同大小的转基因在甲醛凝胶上检测到的最高谱带。使用的转基因是微小RNA(1kb、3.3kb、4.8kb)和因子VIII(7.2kB)。
图2示出当分泌型碱性磷酸酶(SEAP；2.8kB)是所使用的转基因时，与野生型AAV5(AAV 765)相比，缺失VP2并不会改变包装容量。
图3A-3B示出AAV5、ΔVP1、ΔVP2的甲醛凝胶。图3A示出包含SEAP转基因的AAV，且图3B示出包含FVIII转基因的AAV。
图4是图3A的过度曝光，其示出ΔVP1和ΔVP2可以包装相同的量并且明显多于765。
图5示出ΔVP1和ΔVP2具有比765更高的产生效率。如果转基因超过容量限度，则差异更为显著。示出具有微小RNA(1kb、3.3kb、4.8kb)和FVIII(7.2kB)的765、ΔVP1、ΔVP2的分离的AAV的滴度。
图6示出VP1的缺失导致效力完全丧失；而缺失VP2的病毒仍然有效并且能够转染。通过在Huh7细胞中进行SEAP测定来测量效力。图表示出有和没有VP1、VP2的AAV5的效力。
发明详述
本文描述了在昆虫细胞中产生的无VP2的rAAV，用于产生无VP2的rAAV的昆虫细胞，以及其制备和使用方法。所公开的组合物和方法是对现有技术水平的改进，因为它们提供了提高rAAV的产生效率和包装容量的手段，这将允许可行地商业化扩大维持治疗效力的病毒颗粒。
I.定义
在本文及其权利要求书和其项目中，动词“包括”及其变化形式以其非限制性意义使用，以表示包括该词之后的项目，但不排除未特别提及的项目。另外，不定冠词“一(a)”或“一(an)”所指的要素不排除存在不只一个要素的可能性，除非上下文明确要求存在一个且仅存在一个要素。因此，不定冠词“一(a)”或“一(an)”通常表示“至少一个”。
如本文所用，术语“衣壳”是指病毒或病毒载体的蛋白质外壳。术语“AAV衣壳”是指腺相关病毒(AAV)的蛋白质外壳，其由病毒蛋白1(VP1)、VP2和/或VP3的总共约60个亚基组成。
如本文所用，术语“约”应被本领域普通技术人员理解，并且根据在其中使用其的上下文而在一定程度上变化。如果在给定在其中使用其的上下文的情况下存在对本领域普通技术人员而言不清楚的该术语的使用，则“约”将表示特定术语的多达正负10％。
如本文所用，术语“重组细小病毒载体”、“重组腺相关病毒载体”和“rAAV载体”是指包含一个或多个侧翼有细小病毒或AAV核酸序列(例如Rep序列、ITP、VP基因等)的感兴趣的多核苷酸序列的载体。当存在于表达AAVrep和cap基因产物的昆虫宿主细胞中时，这些载体可以复制并包装成感染性病毒颗粒。当将rAAV载体整合到更大的核酸构建体(例如，用于克隆或转染的质粒或杆状病毒)中时，然后rAAV载体通常称为“前载体(pro-vector)”，其在存在AAV包装功能和必要的辅助功能的情况下可以通过复制和衣壳化被“挽救(rescue)”。
如本文所用，术语“可操作地连接”是指多核苷酸或多肽元件以功能性关系的连接。当使得一个核酸与另一核酸序列处于功能性关系时，核酸就被“可操作地连接”。例如，转录调节序列如果影响编码序列的转录，则其与所述编码序列可操作地连接。可操作地连接的核酸序列通常是连续的，并且在需要连接两个蛋白质编码区的情况下，可以在同一阅读框中。然而，本领域技术人员应理解，核酸序列也可以影响远端序列的转录。
如本文所用，术语“表达控制序列”是指调控表达控制序列可操作地连接的另一核苷酸序列的表达的核酸序列。当表达控制序列控制和/或调控核苷酸序列的转录和/或翻译时，所述表达控制序列与所述核苷酸序列“可操作地连接”。因此，表达控制序列可以包括启动子、增强子、内部核糖体进入位点(IRES)、转录终止子、蛋白质编码基因前面的起始密码子、对于内含子的剪接信号和终止密码子。术语“表达控制序列”可以包括但不限于其存在被设计为影响表达的序列，并且还可以包括额外的有利组件。例如，前导序列和融合伴侣序列是表达控制序列。该术语还可以包括核酸序列的设计，使得从序列中去除框内和框外的不希望的潜在起始密码子。它还可以包括核酸序列的设计，使得去除不希望的潜在剪接位点。它包括指导添加polyA尾的序列或多聚腺苷酸化序列(pA)，所述polyA尾为mRNA的3'末端的一串腺嘌呤残基，序列被称为polyA序列。它也可以设计成增强mRNA的稳定性。已知昆虫细胞中影响转录和翻译稳定性的表达控制序列，例如启动子，以及影响翻译的序列，例如科扎克(Kozak)序列。表达控制序列可以具有这样的性质，使得调节与之可操作地连接的核苷酸序列从而获得更低的表达水平或更高的表达水平。
如本文所用，术语“启动子”或“转录调控序列”是指起到控制一个或多个编码序列的转录的功能的核酸片段，并且所述核酸片段位于编码序列的转录起始位点的转录方向的上游，并且其在结构上通过以下识别：存在对于DNA依赖型RNA聚合酶的结合位点、转录起始位点和任何其他DNA序列，包括但不限于转录因子结合位点、抑制子和激活子蛋白结合位点和本领域技术人员已知的直接或间接作用以调控启动子转录量的任何其他核苷酸序列。组成型启动子是在大多数生理和发育条件下在大多数组织中有活性的启动子。诱导型启动子是受生理或发育调控(例如通过应用化学诱导物或特定条件(例如缺氧诱导启动子))的启动子。“组织特异型”启动子只在特定类型的组织或细胞中有活性。出于本公开的目的，已经考虑了这些特定启动子类型的每一种，并且可以将其整合到所公开的rAAV中，以便控制rAAV内一个或多个感兴趣的基因的转录。
如本文所用，术语“ITR”或“反向末端重复”是指存在于AAV和/或rAAV中的可以形成T形回文结构的核酸序列，其通常是完成AAV的裂解和潜伏生命周期所必需的。
如本文所用，术语“基因盒”是指携带并能够表达在一组或多组限制性位点之间的一个或多个感兴趣的基因或编码序列的DNA片段。通过使用限制性酶将片段“切出”并将其连接回到新的载体(例如新的质粒骨架)中，可以将基因盒从一个DNA序列(通常在质粒载体中)转移到另一个DNA序列中。
如本文所用，术语“治疗性基因”是指可用于在对象中治疗疾病的任何基因或核酸。治疗性基因可以编码对象中缺乏、突变、功能失调或其他异常的蛋白质，或者治疗性基因可以编码功能性核酸，例如短干扰RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)或短发夹状RNA(shRNA)，其可用于防止疾病中突变或病理性上调的基因的转录和/或翻译。
如本文所用，术语“对象”包括人类和非人类动物。非人类动物包括所有脊椎动物(例如，哺乳动物和非哺乳动物)，诸如非人类灵长类动物(例如，食蟹猴)、小鼠、大鼠、绵羊、狗、牛、鸡、两栖动物和爬行动物。除非特别指出，否则术语“患者”或“对象”在本文中可互换使用。
如本文所用，术语“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”任何疾病或病症是指减轻疾病或病症，例如通过减慢或阻止或减少疾病或其至少一种临床症状的发展。“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”还可以指缓解或减轻或改善与疾病有关的至少一种身体或生理参数，包括患者可能无法辨别的那些参数。因此，“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”可以指身体上(例如，可辨别症状的稳定)、生理上(例如，身体参数的稳定)或在这两者上调节疾病或病症。
如本文所用，短语“治疗有效量”是指这样的向对象施用的重组AAV病毒体的量，其对于被施用的AAV病毒体提供特定药理作用。要强调的是，治疗有效量的AAV病毒体将不总是有效地治疗给定对象的疾病或病症，即使本领域技术人员认为这样的浓度是治疗有效量。仅为了方便起见，下面提供示例性的量。
II.细小病毒科和AAV
细小病毒(Parvoviridae)科的病毒是小型DNA病毒。细小病毒科可被分为两个亚科：感染脊椎动物的细小病毒亚科(Parvovirinae)和感染昆虫的浓核病毒亚科(Densovirinae)。细小病毒亚科的成员在本文中被称为细小病毒并包括依赖病毒(Dependovirus)属。正如可从其属名推断的，依赖病毒的成员的独特在于它们通常需要与辅助病毒如腺病毒或疱疹病毒共感染以在细胞培养中产生感染。依赖病毒属包括通常感染人类(如血清型1、2、3A、3B、4、5和6)或灵长类动物(如血清型1和4)的AAV，和感染其他温血动物(例如，牛、狗、马等)的相关病毒。
所有已知的AAV血清型的基因组排列都非常相似，且因此公开的制备无VP2的AAV的方法可以应用于任何AAV血清型。AAV的基因组是长度小于约5,000个核苷酸的线性单链DNA分子。末端反向重复(ITR)位于非结构性复制(Rep)蛋白和结构(VP)蛋白的编码核苷酸序列的侧翼。VP蛋白(VP1、VP2和VP3)形成衣壳。末端的145个核苷酸是自身互补的并且被排列的使得可形成能量稳定的形成T形发夹的分子内双链。这些发夹结构具有病毒DNA复制原点的功能，充当细胞DNA聚合酶复合体的引物。野生型AAV感染哺乳动物细胞后，Rep基因(例如，Rep78和Rep52)分别由P5启动子和P19启动子表达，并且两个Rep蛋白都在病毒基因组复制中起作用。Rep ORF的剪接事件导致四个Rep蛋白(Rep78、Rep68、Rep52和Rep40)的表达。然而，已经表明，编码Rep78和Rep52蛋白的未剪接mRNA足以在哺乳动物和昆虫细胞中产生AAV载体。
III.在昆虫细胞中制备无VP2的AAV的方法
Warrington等,J Virol.78:6595-6609(2004)发现，在哺乳动物产生系统中可以形成缺失了VP2的AAV病毒体。然而，在昆虫细胞中，通常认为VP2对AAV衣壳的形成是必需的。参见Ruffing等,J.Virol.66:6922-6930(1992)。在Ruffing等(1992，同上)中，发现每当缺失VP2时，在昆虫细胞中就不会形成空的病毒样颗粒。这些研究表明，制备无VP2的AAV颗粒不会是在昆虫细胞中产生AAV的可行策略。然而，令人惊讶地，本公开揭示了可以在昆虫细胞中产生包含VP1和VP3而没有VP2的AAV颗粒，并且无VP2的AAV颗粒既具有增加的包装较大基因插入物的容量又具有提高的用于大规模制备的产生效率。进一步地，本公开表明在昆虫细胞中产生的无VP2的AAV的批次具有比包含VP1、VP2和VP3的AAV更均匀的衣壳(即，病毒衣壳的VP1和VP3蛋白的比例及组成更一致)。
可以通过应用诸如在Sambrook和Russell的“Molecular Cloning:A LaboratoryManual”(3rd edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y,2001)中描述的那些众所周知的基因工程技术来实现本文所述的AAV的病毒载体的各种修饰。各种编码区的进一步修饰是本领域技术人员已知的。
本领域技术人员已知的用于在昆虫宿主细胞中表达外源基因的技术可用于实施本公开的方法。对于在昆虫细胞中的分子工程和表达多肽的示例性方法在以下有所描述，如Summers和Smith，“A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and InsectCulture Procedures,”(Texas Agricultural Experimental Station Bull.No.7555,1986)；Luckow“Cloning and Expression of Heterologous Genes in Insect Cellswith Baculovirus Vectors'Recombinant DNA Technology and Applications,”(McGraw-Hill,N.Y.,1991)；King和Possee，“The Baculovirus Expression System,”(Chapman and Hall,1992)；O'Reilly等，“Baculovirus Expression Vectors:ALaboratory Manual,”(Oxford University Press,1993)；U.S.Pat.No.4,745,051；US2003/148506；以及WO03/074714。用于转录的合适的启动子可以包括但不限于LP1肝特异性启动子、P5、P19、P40、多角体(polyhedron)(PolH)、4xHsp27 EcRE+minimal Hsp70启动子、p10、p35、IE-1、ΔIE-1启动子以及以上参考文献中描述的其他启动子。
出于本公开的目的，昆虫细胞可包含编码AAV VP1和AAV VP3的单个核苷酸序列或编码AAV VP1和AAV VP3的不同的非连续核苷酸序列。在野生型AAV中，通过使用转录物的选择性mRNA剪接和选择性翻译起始密码子，以重叠的方式从cap开放阅读框来产生三种衣壳蛋白。所有三种蛋白质均使用共同的终止密码子。因此，单个起始密码子的定点突变可用于使AAV缺失单个VP1、VP2或VP3中的一个或多个的表达。因此，出于本公开的目的，昆虫细胞可以包含编码AAV VP2蛋白的核苷酸序列，只要VP2起始密码子失活或不起作用并且不产生VP2。失活可以包括将起始密码子改变为在昆虫细胞中不起起始密码子的作用的选择性密码子。失活可以包括将起始密码子改变为丙氨酸等的不起起始密码子的作用的密码子。
昆虫细胞可以包含两个分开的核酸构建体，每个分别用于第一核苷酸序列和第二核苷酸序列，或者昆虫细胞可以包含单一类型的核酸构建体，其包含第一核苷酸序列和第二核苷酸序列两者。因此，本公开的发明人发现，可以通过组合编码AAV VP1蛋白的第一核苷酸序列和分开的编码AAV VP3蛋白的第二核苷酸序列来制备无VP2的AAV。在一些实施方案中，本发明的昆虫细胞包含单个核苷酸序列，其包含编码AAV VP1蛋白的开放阅读框和编码AAV VP3蛋白的开放阅读框。
出于本公开的目的，在给定的一个或多个构建体中VP1编码序列和VP3编码序列的精确排列没有特别限制。在一些实施方案中，编码公开的无VP2的AAV的核酸构建体可包含：(a)包含编码AAV VP1的开放阅读框的核苷酸序列；和(b)包含编码AAV VP3的开放阅读框的核苷酸序列；其中编码AAV VP1和AAV VP3的开放阅读框与用于在昆虫细胞中表达的表达控制序列可操作地连接。可选地，在该核酸构建体中，编码AAV VP3的开放阅读框可以与编码AAV VP1的开放阅读框重叠，或编码AAV VP1和AAV VP3的开放阅读框可以被排列成使得AAVVP1和AAV VP3在表达时被转录为单个RNA转录物。在一些实施方案中，可以从分开的表达盒或从单个表达盒转录编码AAV VP3的开放阅读框和编码AAV VP1的开放阅读框。
AAV颗粒的感染性可能至少部分取决于AAV中存在的末端反向重复(ITR)序列，因为ITR对于完成AAV的裂解和潜伏生命周期是重要的。因此，本公开的发明人提供了一种昆虫细胞，其包含这样核苷酸序列，所述核苷酸序列包含至少一个AAV的末端反向重复(ITR)核苷酸序列和至少一个编码感兴趣的基因产物的核苷酸序列。
出于本公开的目的，用于在昆虫细胞中产生rAAV的载体通常是昆虫细胞相容性载体。“昆虫细胞相容性载体”是能够对昆虫或昆虫细胞产生转化或转染的核酸分子。示例性的生物学载体包括质粒、线性核酸分子和重组病毒。可以使用任何载体，只要它是昆虫细胞相容性的。载体可以整合到昆虫细胞基因组中，或者它可以是瞬时的。载体可以通过任何已知手段引入，例如通过细胞的化学处理、电穿孔或感染。在一些实施方案中，用于在昆虫细胞中产生AAV的载体是杆状病毒、病毒载体或质粒。杆状病毒载体及其使用方法是本领域众所周知的。参见例如Smith等,Mol.Ther.,17(11):1888-96(2009)。在一些实施方案中，使用诸如US 2016-0032254 A1中公开的方法，对编码VP1和VP3的核苷酸序列进行密码子优化用以在昆虫细胞中表达。
类似地，AAV的血清型的选择，尽管对于将基因成功地递送至对象中的特定靶器官和细胞是重要的，但对于公开的在昆虫细胞中制备无VP2的AAV的方法的目的没有特别限制。AAV的血清型可以确定AAV的内化和随后在特定器官和细胞中的转基因表达，因为AAV衣壳的表面在靶细胞结合、随后的内化和细胞内运输过程中起作用。AAV能够感染许多哺乳动物细胞，并且AAV的细胞嗜性(tropicity)在血清型之间有所不同。例如，例如在AAV2、AAV4和AAV5之间，哺乳动物CNS细胞的趋向性(tropism)和转导效率存在差异，并因此特定血清型的选择可能取决于打算治疗的疾病或靶细胞类型。AAV血清型也可能影响包装容量和产生效率(图7和8)，其中某些血清型在包装较小或较大的感兴趣的基因中更有效。
可用于在昆虫细胞中产生无VP2的AAV的AAV序列可源自任何AAV血清型的基因组。通常，AAV血清型在氨基酸和核酸水平上具有显著同源性的基因组序列，其执行相同的遗传功能组并产生在物理和功能上非常相似的病毒体。不同血清型的AAV也通过几乎相同的机制来复制和组装。所公开的AAV血清型的遗传序列信息是本领域众所周知的。参见例如GenBank登录号U89790；GenBank登录号J01901；GenBank登录号AF043303；GenBank登录号AF085716；Chlorini等,J.Virol.71:6823-33(1997)；Srivastava等,J.Vir.45:555-64(1983)；Chlorini等,J.Vir.73:1309-1319(1999)；Rutledge等,J.Vir.72:309-319(1998)；以及Wu等,J.Vir.74:8635-47(2000)。
因此，出于本公开的目的，无VP2的AAV可以选自由以下组成的组：AAV血清型1(AAV1)、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12和AAV13。在一些实施方案中，可以优选的是，无VP2的AAV衍生自AAV1或AAV5。在一些实施方案中，可以优选的是，无VP2的AAV衍生自AAV6、AAV7、AAV8、AAV9或AAV10。
除了上述自然进化的AAV血清型外，近年来还制定了几种工程化杂合AAV血清型载体的策略。例如，rAAV2/5包括AAV2和AAV5的至少一部分。具体而言，rAAV5可以包含包装在来自血清型5的衣壳中的血清型2的基因组。相似的AAV杂合体包括但不限于AAV2/8和AAV2/9。在一些实施方案中，公开的无VP2的AAV也可以是嵌合AAV(AAVch)，例如嵌合AAV血清型5(AAV5ch)。例如，AAV可包含来自一种血清型的VP1衣壳蛋白和来自另一种血清型的VP3衣壳蛋白。(参见例如Choi等,Curr Gene Ther.2005Jun；5(3):299–310)。上述的AAV病毒体也可以是突变或变体AAV。在一些实施方案中，所公开的无VP2的AAV可以是突变或变体AAV，其中相对于相应的野生型序列，至少一个核酸或氨基酸被取代、插入或缺失。在一个实施方案中，VP1蛋白是杂合VP1蛋白，其N末端衍生自一种血清型，而也包含在杂合VP1蛋白中的VP3蛋白序列来自另一种血清型。例如，可以将5型VP1的N末端部分替换为2型的等效部分，以产生感染性AAV5颗粒(Urabe等,J Virol.2006Feb；80(4):1874–1885)。
在一些实施方案中，无VP2的AAV病毒体可以在昆虫细胞中产生，所述昆虫细胞包含：编码至少一个感兴趣的基因产物的第一核酸序列；编码AAV VP1的第二核酸，所述第二核酸与用于在昆虫细胞中表达AAV VP1的表达控制序列可操作地连接；编码AAV VP3蛋白的第三核酸，所述第三核酸与用于在昆虫细胞中表达AAV VP3的表达控制序列可操作地连接；和编码AAV Rep蛋白的第四核酸，所述第四核酸与用于在昆虫细胞中表达的表达控制序列可操作地连接。因此，由所公开的昆虫细胞产生的AAV病毒体将具有包含VP1和VP3但不包含VP2的衣壳。在其他实施方案中，第一核苷酸序列可以位于两个AAV的末端反向重复序列之间。
本公开进一步提供了在昆虫细胞中产生重组AAV病毒体的方法，所述方法包括：在允许产生所述重组AAV病毒体的条件下，培养表达AAV VP1和AAV VP3但不表达AAV VP2的昆虫细胞；以及从培养物中回收所述重组AAV病毒体。所公开的方法允许产生重组AAV病毒体，其中相对于包含VP1、VP2和VP3衣壳蛋白的AAV病毒体，无VP2的AAV病毒体的包装容量和基因组拷贝滴度升高。在一些实施方案中，所公开的无VP2的AAV衣壳中的VP1与VP3的比例在约1：5与约1:10之间。更具体地说，VP1与VP3的比例可以是约1：5、约1：6、约1：7、约1：8、约1：9或约1:10。
IV.缺失VP2提高AAV的容量和产生效率
与具有由VP1、VP2和VP3组成的衣壳的野生型AAV5相比，公开的在昆虫细胞中产生的无VP2的AAV可以用其衣壳包装显著更多的基因组物质。缺失VP2不会增加AAV包装较大基因插入物的容量；相反，VP2缺失允许包装更大量的载体或全部遗传物质(图3和4)。确定的是，缺失VP1还可以增加包装更大基因和更多遗传物质的容量；然而，无VP1的AAV是非感染性的(图6)，因此限制它们作为基因疗法载体的潜在用途。相反，缺失VP2不会影响所得AAV病毒体的感染性。因此，公开的在昆虫细胞中产生的无VP2的AAV具有多种物理性质(即，增加的净负载容量和维持的感染性/效力)，这使得公开的无VP2的AAV很好地适合于基因疗法。
因此，本公开提供了增加AAV基因疗法载体的容量的方法，所述AAV基因疗法载体包含含有编码AAV VP1和AAV VP3的核苷酸序列的核酸构建体，其中所述核酸构建体不表达AAV VP2蛋白，并且其中核酸序列与用于在昆虫细胞中表达的表达控制序列可操作地连接。与具有包含VP1、VP2和VP3的衣壳的AAV病毒体相比，具有仅包含VP1和VP3的衣壳的AAV的容量提高(图4)。
此外，所公开的无VP2的AAV也可以比野生型AAV或无VP1的AAV更有效地产生。实际上，携带无VP2的AAV病毒载体之一的昆虫细胞产生的分离的AAV病毒体的滴度比具有由VP1、VP2和VP3组成的衣壳的AAV5的更高。当包装较大的转基因(如编码FVIII的基因(7.2kb))时，主要观察到这种作用，但结果却出乎意料，因为以前在哺乳动物表达系统中的研究未能产生容量增加的病毒体(Grieger(2005，同上))且以前的在昆虫细胞系统中产生无VP2的AAV病毒体的尝试完全失败了(Ruffing等(1992，同上)。
因为公开的无VP2的AAV的包装容量增加，包装在病毒体中的感兴趣的基因(一个或多个)的大小不受常规AAV的限制。例如，公开的无VP2的AAV可以包含一个或多个感兴趣的基因，所述一个或多个感兴趣的基因为约1.0、约1.1、约1.2、约1.3、约1.4、约1.5、约1.6、约1.7、约1.8、约1.9、约2.0、约2.1、约2.2、约2.3、约2.4、约2.5、约2.6、约2.7、约2.8、约2.9、约3.0、约3.1、约3.2、约3.3、约3.4、约3.5、约3.6、约3.7、约3.8、约3.9、约4.0、约4.1、约4.2、约4.3、约4.5、约4.6、约4.7、约4.8、约4.9、约5.0、约5.1、约5.2、约5.3、约5.4、约5.5、约5.6、约5.7、约5.8、约5.9、约6.0、约6.1、约6.2、约6.3、约6.4、约6.5、约6.6、约6.7、约6.8、约6.9、约7.0、约7.1、约7.2、约7.3、约7.4、约7.5、约7.6、约7.7、约7.8、约7.9、约8.0、约8.1、约8.2、约8.3、约8.4、约8.5、约8.6、约8.7、约8.8、约8.9、约9.0、约9.1、约9.2、约9.3、约9.4、约9.5、约9.6、约9.7、约9.8、约9.9或约10或更多的千碱基(kb)。
额外地，相对于野生型AAV，所公开的无VP2的AAV的产生效率显著提高。因此，在一些实施方案中，公开的在昆虫细胞中产生的无VP2的AAV的基因组拷贝滴度在相同或相似的培养条件下，可以比相应血清型的具有VP2的野生型AAV的基因组拷贝滴度高约1、约1.25、约1.5、约1.75、约2、约2.25、约2.5、约2.75，约3、约3.25或约3.5或更多对数。
所公开的在昆虫细胞中产生无VP2的AAV的方法的另一个优点是病毒体更均匀。在正常情况下，在带有包含所有三种衣壳蛋白的衣壳的野生型AAV中，衣壳中蛋白的分布通常分别大致为1：1：10(VP1：VP2：VP3)，但是精确的构成随泊松分布偶然地发生。这意味着1：1：10的比例可被视为平均衣壳组成。去除VP2降低潜在的组合结果，并从而导致AAV病毒体群体更加统一和均匀。从临床和监管的角度来看这都是有益的，因为始终希望能够产生出一致的、统一的治疗性产品的批次并限制批次之间的差异性。所公开的方法通过产生无VP2的AAV来实现此目的，其中衣壳中VP1与VP3的比例在约1：4至约1:59之间。例如，VP1与VP3的比例可以是约1：4、约1：5、约1：6、约1：7、约1：8、约1：9、约1:10和约1：11。因此，由于AAV衣壳由约60个VP蛋白组成，其中每个AAV衣壳的VP1蛋白的平均数目可以在每个衣壳1至15个的范围内。
V.用无VP2的AAV治疗疾病的方法
本公开还提供了使用公开的无VP2的AAV病毒体治疗人类疾病的方法。因此，在一些实施方案中，无VP2的AAV病毒体是药物组合物。所公开的治疗方法通常适用于人类对象，但是也可以扩展至非人类动物。
可以使用公开的无VP2的AAV治疗的疾病将通常是由缺陷或突变的基因或由缺陷或异常的基因表达引起的疾病。相对于给定基因的正常基因表达水平，缺陷基因的表达可以包括该基因的表达降低(即下调)或表达增加(即上调)。此外，缺陷基因的表达可以涉及诱导型或组织特异型基因无法响应应激活或失活基因表达的内部或外部生理信号。
当疾病是由靶基因的下调或基因产物的缺乏引起的时，本公开提供了一种提高对象中靶基因的表达的方法，所述方法包括向对象施用治疗有效量的在昆虫细胞中产生并包含感兴趣的基因的无VP2的AAV病毒体，从而导致对象中靶基因的表达提高。出于同样的原因，当疾病是由靶基因的上调或基因产物的过量引起的时，本公开提供了一种降低对象中靶基因的表达的方法，所述方法包括向对象施用治疗有效量的包含感兴趣的基因的无VP2的AAV病毒体，其中所述感兴趣的基因是治疗性RNA，其干扰靶基因的转录和/或翻译，导致对象中靶基因的表达降低。
通常，由公开的无VP2的AAV编码的感兴趣的基因是治疗性基因。治疗性基因可以对应于对象中病理性下调的基因或编码对象中缺乏或突变的蛋白质。可选地，治疗性基因可以编码微小RNA、siRNA或shRNA以干扰对象中过表达的基因、病理上过度活跃的蛋白质或过量表达的蛋白质的转录和/或翻译。
因此，出于本公开的目的，可以由所公开的无VP2的AAV在哺乳动物细胞中表达的感兴趣的基因产物可以编码治疗性基因产物。治疗性基因产物可以是多肽或RNAi试剂或其他基因产物，其在靶细胞中表达时提供期望的治疗效果，例如消除不期望的活性或补足遗传缺陷。RNAi试剂或“治疗性RNA”是能够进行RNA干扰的RNA分子，例如shRNA(短发夹状RNA)或siRNA(短干扰RNA)或miRNA(微小RNA)。siRNA，例如，通常包含在哺乳动物细胞中无毒的短长度双链RNA。治疗性多肽基因产物的实例包括但不限于囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)、因子IX、因子VIII、脂蛋白脂肪酶(LPL或LPL S447X；参见WO01/00220)、载脂蛋白A1、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶(UGT)、视网膜色素变性GTP酶调节物相互作用蛋白(RP-GRIP)和细胞因子或白介素(例如IL-10)、胆色素原脱氨酶(PBGD)以及丙氨酸：乙醛酸氨基转移酶。
除了通常具有遗传原因或基础之外，可以根据所公开的方法治疗的疾病没有特别限制。例如，可以用所公开的方法治疗的疾病可以包括但不限于急性间歇性卟啉症(AIP)、年龄相关性黄斑变性、阿尔茨海默氏病、关节炎、巴滕病、卡纳万病、1型瓜氨酸血症、克里格勒-纳贾尔综合征、充血性心力衰竭、囊性纤维化、杜兴氏肌肉萎缩症、血脂异常、I型糖原贮积病(GSD-I)、A型血友病、B型血友病、遗传性肺气肿、纯合子家族性高胆固醇血症(HoFH)、亨廷顿氏病(HD)、雷伯氏先天性黑内障、甲基丙二酸血症、鸟氨酸氨甲酰基转移酶缺乏症(OTC)、帕金森氏病、苯丙酮尿症(PKU)、脊髓性肌肉萎缩症、瘫痪、威尔逊病、癫痫症、庞贝病、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、泰-萨克斯病、高草酸尿症9PH-1)、1型脊髓小脑共济失调(SCA-1)、SCA-3、u-抗肌萎缩蛋白病、II型或III型戈谢氏病、致心律失常性右室心肌病(ARVC)、法布里氏病、家族性地中海热病(FMF)、丙酸血症、脆性X综合征、雷特综合征、尼曼-匹克氏病和克拉伯病。
本说明书中引用的所有专利和参考文献均通过引用以其整体并入本文。
项目：
1.一种表达腺相关病毒(AAV)VP1蛋白和AAV VP3蛋白的昆虫细胞，其中所述昆虫细胞不表达AAV VP2蛋白。
2.根据项目1所述的昆虫细胞，其包含：
a，编码AAV VP1蛋白和AAV VP3蛋白的单个核苷酸序列；和/或
b，编码AAV VP1蛋白的第一核苷酸序列和编码AAV VP3蛋白的分开的第二核苷酸序列。
3.根据项目2所述的昆虫细胞，其中，(a)中定义的所述核苷酸序列包含：
a，编码AAV VP1蛋白的开放阅读框；和
b，编码AAV VP3蛋白的开放阅读框。
4.根据项目1所述的昆虫细胞，其包含含有失活的VP2起始密码子的编码腺相关病毒(AAV)VP2蛋白的核苷酸序列。
5.根据项目1所述的昆虫细胞，其中所述昆虫细胞进一步包含含有至少一个AAV的末端反向重复(ITR)核苷酸序列和至少一个编码感兴趣的基因产物的核苷酸序列的核苷酸序列。
6.根据项目1所述的昆虫细胞，其中所述昆虫细胞进一步包含含有与用于在昆虫细胞中表达的表达控制序列可操作地连接的Rep78或Rep68编码序列的核苷酸序列。
7.根据项目1所述的昆虫细胞，其包含含有与用于在昆虫细胞中表达的表达控制序列可操作地连接的Rep52或Rep40编码序列的核苷酸序列。
8.根据项目1所述的昆虫细胞，其中所述AAV VP1蛋白和所述AAV VP3蛋白均由第一核酸构建体编码。
9.根据项目8所述的昆虫细胞，其中所述第一核酸构建体额外地包含与用于在昆虫细胞中表达的表达控制序列可操作地连接的Rep78或Rep68编码序列。
10.根据项目9所述的昆虫细胞，其中所述第一核酸构建体额外地包含与用于在昆虫细胞中表达的表达控制序列可操作地连接的Rep52或Rep40编码序列。
11.根据项目9所述的昆虫细胞，其进一步包含第二核酸构建体，所述第二核酸构建体包含含有至少一个AAV的末端反向重复(ITR)核苷酸序列和至少一个编码感兴趣的基因产物的核苷酸序列的第二核苷酸序列。
12.项目11的昆虫细胞，其中所述第二核酸构建体是昆虫细胞相容性载体。
13.项目12的昆虫细胞，其中所述昆虫细胞相容性载体是杆状病毒载体。
14.一种核酸构建体，其包含编码腺相关病毒(AAV)VP1蛋白和AAV VP3蛋白的核苷酸序列，其中所述核酸构建体不表达AAV VP2蛋白，并且其中核酸序列与用于在昆虫细胞中表达的表达控制序列可操作地连接。
15.根据项目14所述的核酸构建体，其进一步包含与用于在昆虫细胞中表达的表达控制序列可操作地连接的Rep78或Rep68编码序列。
16.根据项目15所述的核酸构建体，其进一步包含与用于在昆虫细胞中表达的表达控制序列可操作地连接的Rep52或Rep40编码序列。
17.根据项目14所述的核酸构建体，其中所述编码AAV VP1蛋白和/或AAV VP3蛋白的核苷酸序列被密码子优化以在昆虫细胞中表达。
18.一种增加AAV基因疗法载体的容量的方法，其包括在昆虫细胞中表达根据项目14的核酸构建体，从而相对于包含VP1、VP2和VP3衣壳蛋白的AAV病毒体，增加AAV基因疗法载体的容量。
19.一种提高AAV基因疗法载体的基因组拷贝滴度的方法，其包括在昆虫细胞中表达根据项目14的核酸构建体，从而相对于包含VP1、VP2和VP3衣壳蛋白的AAV病毒体，提高AAV基因疗法载体的基因组拷贝滴度。
20.一种核酸构建体，其包含：
a，包含编码腺相关病毒(AAV)VP1蛋白的开放阅读框的核苷酸序列；和
b，包含编码AAV VP3蛋白的开放阅读框的核苷酸序列；
其中所述编码AAV VP1蛋白和AAV VP3蛋白的开放阅读框与用于在昆虫细胞中表达的表达控制序列可操作地连接，并且其中AAV VP2蛋白不由所述核酸构建体编码。
21.根据项目20所述的核酸构建体，其中所述编码AAV VP3蛋白的开放阅读框与所述编码AAV VP1蛋白的开放阅读框重叠。
22.根据项目20所述的核酸构建体，其中所述编码AAV VP1蛋白和AAV VP3蛋白的开放阅读框被排列成使得所述AAV VP1蛋白和所述AAV VP3蛋白在表达时作为单个RNA转录物被转录。
23.根据项目20所述的核酸构建体，其中所述编码AAV VP3蛋白的开放阅读框和所述编码AAV VP1蛋白的开放阅读框从分开的表达盒转录。
24.根据项目20所述的核酸构建体，其中所述编码AAV VP3蛋白的开放阅读框和所述编码AAV VP1蛋白的开放阅读框从单个表达盒转录。
25.一种增加AAV基因疗法载体的容量的方法，其包括在昆虫细胞中表达根据项目20的核酸构建体，从而相对于包含VP1、VP2和VP3衣壳蛋白的AAV病毒体，增加AAV基因疗法载体的容量。
26.一种提高AAV基因疗法载体的基因组拷贝滴度的方法，其包括在昆虫细胞中表达根据项目20的核酸构建体，从而相对于包含VP1、VP2和VP3衣壳蛋白的AAV病毒体，提高AAV基因疗法载体的基因组拷贝滴度。
27.一种在昆虫细胞中产生的AAV病毒体，在其基因组中包含：
a，编码至少一个感兴趣的基因的第一核酸序列；
b，编码AAV VP1蛋白的第二核酸，所述第二核酸与用于在昆虫细胞中表达AAV VP1的表达控制序列可操作地连接；和
c，编码AAV VP3蛋白的第三核酸，所述第三核酸与用于在昆虫细胞中表达AAV VP3的表达控制序列可操作地连接；
其中所述AAV病毒体包含衣壳，所述衣壳包含AAV VP1蛋白和AAV VP3蛋白，但不包含AAV VP2蛋白。
28.根据项目27所述的AAV病毒体，其中所述第一核苷酸序列位于两个AAV ITR核苷酸序列之间。
29.根据项目27所述的AAV病毒体，其中所述感兴趣的基因是治疗性基因。
30.根据项目29所述的AAV病毒体，其中所述治疗性基因是因子VIII。
31.根据项目29所述的AAV病毒体，其中所述治疗性基因是靶向致病基因的微小RNA、siRNA或shRNA。
32.根据项目27所述的AAV病毒体，其中所述AAV选自由以下组成的组：AAV血清型1(AAV1)、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12和AAV13。
33.根据项目27所述的AAV病毒体，其中所述AAV是AAV1或AAV5。
34.根据项目27所述的AAV病毒体，其中所述AAV是AAV6、AAV7、AAV8、AAV9或AAV10。
35.根据项目27所述的AAV病毒体，其中所述AAV是重组AAV(rAAV)。
36.根据项目35所述的AAV病毒体，其中所述rAAV是rAAV2/5，其中所述rAAV2/5包含AAV2和AAV5的至少一部分。
37.根据项目27所述的AAV病毒体，其中所述AAV是嵌合AAV(AAVch)。
38.根据项目37所述的AAV病毒体，其中所述AAVch是嵌合AAV血清型5(AAV5ch)。
39.根据项目27所述的AAV病毒体，其中所述AAV是突变或变体AAV。
40.根据项目27所述的AAV病毒体，其中VP1蛋白与VP3蛋白的比例在约1：5至约1:10之间。
41.根据项目27所述的AAV病毒体，其中VP1蛋白与VP3蛋白的比例为约1：5。
42.一种药物组合物，其包含根据项目27所述的AAV病毒体。
43.一种在昆虫细胞中产生重组AAV病毒体的方法，其包括：
a，在允许产生所述重组AAV病毒体的条件下，培养项目1的昆虫细胞；和
b，从培养物中回收所述重组AAV病毒体。
44.项目43的方法，其中相对于包含VP1、VP2和VP3衣壳蛋白的AAV病毒体，所述AAV病毒体的容量是增加的。
45.项目43的方法，其中相对于通过在相同条件下培养包含VP1、VP2和VP3衣壳蛋白的AAV病毒体而获得的基因组拷贝滴度，在允许产生所述重组AAV病毒体的条件下培养项目1的昆虫细胞提高重组AAV病毒体的基因组拷贝滴度。
46.项目43的方法，其中VP1蛋白与VP3蛋白的比例在约1：4至约1:59之间。
47.项目43的方法，其中VP1蛋白与VP3蛋白的比例为约1：5。
48.一种提高对象中感兴趣的基因的表达的方法，其包括向所述对象施用治疗有效量的项目27的AAV病毒体，从而提高AAV病毒体基因组中编码的感兴趣的基因的表达。
49.如项目48所述的方法，其中所述感兴趣的基因是治疗性基因。
50.如项目48所述的方法，其中所述对象是人类对象。
51.一种治疗对象中的遗传性疾病的方法，其包括向患有遗传性疾病的对象施用治疗有效量的重组AAV病毒体，所述重组AAV病毒体在其基因组中包含编码至少一个治疗性基因的第一核酸序列；
其中所述AAV病毒体包含衣壳，所述衣壳包含AAV VP1蛋白和AAV VP3蛋白，但不包含AAV VP2蛋白。
52.项目51的方法，是一种编码在遗传性疾病中突变或缺乏的蛋白质的基因。
53.项目51的方法，其中所述治疗性基因是靶向遗传性疾病致病基因的微小RNA、siRNA或shRNA。
54.项目51的方法，其中所述遗传性疾病是因子VIII缺乏症。
55.项目52的方法，其中所述至少一个治疗性基因是因子VIII基因。
56.项目51的方法，其中所述遗传性疾病是血友病的形式或凝血障碍。
57.项目56的方法，其中所述至少一个治疗性基因是编码在凝血障碍中缺乏或突变的凝血因子的基因。
58.项目56的方法，其中所述血友病的形式是A型血友病或B型血友病。
59.项目51的方法，其中所述遗传性疾病是亨廷顿氏病。
60.项目59的方法，其中所述至少一个治疗性基因是靶向突变的亨廷顿基因的微小RNA、siRNA或shRNA。
61.项目51的方法，其中所述遗传性疾病选自急性间歇性卟啉症(AIP)、年龄相关性黄斑变性、阿尔茨海默氏病、关节炎、巴滕病、卡纳万病、1型瓜氨酸血症、克里格勒-纳贾尔综合征、充血性心力衰竭、囊性纤维化、杜兴氏肌肉萎缩症、血脂异常、I型糖原贮积病(GSD-I)、A型血友病、B型血友病、遗传性肺气肿、纯合子家族性高胆固醇血症(HoFH)、亨廷顿氏病(HD)、雷伯氏先天性黑内障、甲基丙二酸血症、鸟氨酸氨甲酰基转移酶缺乏症(OTC)、帕金森氏病、苯丙酮尿症(PKU)、脊髓性肌肉萎缩症、瘫痪、威尔逊病、癫痫症、庞贝病、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、泰-萨克斯病、高草酸尿症9PH-1)、1型脊髓小脑共济失调(SCA-1)、SCA-3、u-抗肌萎缩蛋白病、II型或III型戈谢氏病、致心律失常性右室心肌病(ARVC)、法布里氏病、家族性地中海热病(FMF)、丙酸血症、脆性X综合征、雷特综合征、尼曼-匹克氏病和克拉伯病。
提供以下实施例仅用于说明性目的，且无意以任何方式限制本发明的范围。
VI.实施例
实施例1无VP2的AAV病毒载体具有增加的容量
通过将不同大小的转基因插入VP2缺失的AAV5病毒载体，VP1缺失的AAV5载体和含有VP1、VP2和VP3的AAV5载体中来比较包装容量。如先前所述(WO2015/137802)进行载体产生，修饰765载体以使VP2或VP1起始密码子失活，并将载体产生与未修饰的765载体进行比较。所用转基因的大小为：1kb、3.3kb、4.8kb，其编码miRNA，以及具有7.2kB大小的因子VIII。图1显示VP1缺失增加容量以携带更大基因插入物，而缺失VP2并未增加容量以包装更大基因。与具有VP1、VP2和VP3的AAV相比，将转基因更改为较小的SEAP转基因(2.8kB)未增加无VP2的AAV的容量。图2。然而，图3和图4中的甲醛凝胶揭示无VP2的载体可以产生包装更大量的转基因的病毒体。甲醛凝胶通过以下制备：将(纯化的)重组AAV载体进行DNase处理，然后随后通过蛋白酶处理从衣壳分离DNA。然后将DNA结合到旋转柱上，并洗脱并加样到甲醛凝胶上。甲醛凝胶对于可视化单链DNA是理想的，并具有良好的大小间隔度。查看滴度(图5)和可比较的凝胶(图3)，您会看到VP2缺失产生更高的滴度，并且对于相当的体积，DNA的量更大(图3)。同样，下一个图(图4)是图3的过度曝光，它显示VP2缺失也可以包装用VP1缺失观察到的更高大小的DNA，但是量要低得多，而765完全不能包装该大小，从曝光过度的凝胶中可以看到(图4)。
实施例2无VP2的AAV比野生型具有更高的产生效率
具有编码微小RNA的大小为1kB，3.3kB，4.8kB的插入物或大小为7.2kB的因子VIII的，野生型AAV5、VP1缺失的AAV5和VP2缺失的AAV5的产生效率，即基因组拷贝滴度。对于高达4.8kB的插入物，野生型AAV5、VP1缺失的AAV5和VP2缺失的AAV5的产生效率是相同的。参见图5。但是，对于7.2kB大小的VIII因子插入物，相对于野生型样的衣壳，无VP1和无VP2的AAV具有更高的基因组拷贝滴度。通过DNA酶保护的片段的qPCR测量基因组拷贝滴度。衣壳内部的DNA被保护免受DNAse，并因此由周围漂浮的任何污染DNA被有效地量化。较高的滴度和基因组拷贝数表明形成了更多的病毒。从图5中可以看出，插入的DNA越大，对于VP1缺失和VP2缺失就越容易产生可接受的滴度，并且比正常AAV成功得多。VP2缺失的总体滴度高于包含VP1、VP2和VP3的wtAAV。
实施例3无VP2的AAV仍然具有感染性
为了比较野生型AAV5、VP1缺失的AAV5和VP2缺失的AAV5之间的感染性，在Huh7细胞中进行SEAP测定。参见图6。该测定表明，无VP2的AAV具有与野生型AAV5相同或非常相似的效力；相反，无VP1的AAV完全丧失感染性。将产生的AAV载体以3种不同的基因组拷贝浓度添加到Huh7细胞中，并用商业上可得的试剂盒(Roche)测量SEAP作为转基因的表达，其中底物被SEAP(碱性磷酸酶)转化为荧光终产物。

Claims (15)

1.一种表达腺相关病毒(AAV)VP1蛋白和AAV VP3蛋白的昆虫细胞，其中所述昆虫细胞不表达AAV VP2蛋白。
2.根据权利要求1的昆虫细胞，其包含：
a.编码AAV VP1蛋白和AAV VP3蛋白的核苷酸序列；和/或
b.编码AAV VP1蛋白的核苷酸序列和编码AAV VP3蛋白的核苷酸序列。
3.根据权利要求2的昆虫细胞，其中权利要求2的(a)中定义的核苷酸序列包含：
a.编码AAV VP1蛋白的开放阅读框；和
b.编码AAV VP3蛋白的开放阅读框。
4.根据前述权利要求中任一项的昆虫细胞，其包含含有失活的VP2起始密码子的编码腺相关病毒(AAV)VP2蛋白的核苷酸序列。
5.根据前述权利要求中任一项的昆虫细胞，其中所述昆虫细胞进一步包含：
a.第二核苷酸序列，所述第二核苷酸序列包含至少一个AAV末端反向重复(ITR)核苷酸序列和至少一个编码感兴趣的基因产物的核苷酸序列；
b.第三核苷酸序列，所述第三核苷酸序列包含与用于在昆虫细胞中表达的表达控制序列可操作地连接的Rep78或Rep68编码序列；
c.任选地，第四核苷酸序列，所述第四核苷酸序列包含与用于在昆虫细胞中表达的表达控制序列可操作地连接的Rep52或Rep40编码序列。
6.根据权利要求5的昆虫细胞，其中所述昆虫细胞包含：
a.第一核酸构建体，其包含权利要求2-4中任一项所定义的核苷酸序列以及权利要求5的(b)和(c)中所定义的第三核苷酸序列和任选的第四核苷酸序列；和，
b.第二核酸构建体，其包含权利要求5的(a)中定义的第二核苷酸序列，其中所述第二核酸构建体优选是昆虫细胞相容性载体，更优选杆状病毒载体。
7.一种在昆虫细胞中产生AAV的方法，其包括以下步骤：
a.在使得产生AAV的条件下培养权利要求5-6中任一项所定义的昆虫细胞；
b.任选地，回收所述AAV；以及任选地，
c.将所述AAV配制于药物组合物中。
8.一种核酸构建体，其包含：
a.包含编码腺相关病毒(AAV)VP1蛋白的开放阅读框的核苷酸序列；和，
b.包含编码AAV VP3蛋白的开放阅读框的核苷酸序列；
其中所述编码所述AAV VP1蛋白和所述AAV VP3蛋白的开放阅读框与用于在昆虫细胞中表达的表达控制序列可操作地连接，并且其中AAV VP2蛋白不能由所述核酸构建体表达。
9.根据权利要求8的核酸构建体，其中所述编码AAV VP3蛋白的开放阅读框与所述编码AAV VP1蛋白的开放阅读框重叠。
10.根据权利要求8的核酸构建体，其中所述编码AAV VP3蛋白的开放阅读框和所述编码AAV VP1蛋白的开放阅读框从分开的核苷酸序列转录。
11.一种在昆虫细胞中产生的AAV病毒体，所述AAV病毒体在其基因组中包含至少一个编码感兴趣的基因产物的核苷酸序列，其中所述至少一个核苷酸序列不是天然的AAV核苷酸序列，并且其中所述AAV病毒体包含AAV VP1蛋白和AAV VP3蛋白，并且不包含AAV VP2蛋白。
12.根据权利要求11的AAV病毒体，其中所述至少一个编码感兴趣的基因产物的核苷酸序列位于两个AAV ITR核苷酸序列之间。
13.一种药物组合物，其包含根据权利要求11-12中任一项的AAV病毒体。
14.根据权利要求11或12的AAV病毒体或根据权利要求13的药物组合物，其用于疗法。
15.根据权利要求11或12的AAV病毒体或根据权利要求13的药物组合物，其用于治疗选自由以下组成的组的病：充血性心力衰竭、急性间歇性卟啉症(AIP)、年龄相关性黄斑变性、阿尔茨海默氏病、关节炎、巴滕病、卡纳万病、1型瓜氨酸血症、克里格勒-纳贾尔综合征、充血性心力衰竭、囊性纤维化、杜兴氏肌肉萎缩症、血脂异常、I型糖原贮积病(GSD-I)、A型血友病、B型血友病、遗传性肺气肿、纯合子家族性高胆固醇血症(HoFH)、亨廷顿氏病(HD)、雷伯氏先天性黑内障、甲基丙二酸血症、鸟氨酸氨甲酰基转移酶缺乏症(OTC)、帕金森氏病、苯丙酮尿症(PKU)、脊髓性肌肉萎缩症、瘫痪、威尔逊病、癫痫症、庞贝病、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、泰-萨克斯病、高草酸尿症9PH-1)、1型脊髓小脑共济失调(SCA-1)、SCA-3、u-抗肌萎缩蛋白病、II型或III型戈谢氏病、致心律失常性右室心肌病(ARVC)、法布里氏病、家族性地中海热病(FMF)、丙酸血症、脆性X综合征、雷特综合征、尼曼-匹克氏病和克拉伯病。
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