JP2023544947A - 昆虫細胞内で重複オープンリーディングフレームを含む遺伝子を発現するための発現カセット及びその使用 - Google Patents
昆虫細胞内で重複オープンリーディングフレームを含む遺伝子を発現するための発現カセット及びその使用 Download PDFInfo
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Abstract
本発明は、遺伝子工学技術分野に属し、昆虫細胞内で重複オープンリーディングフレームを含む遺伝子を発現するための発現カセット及びその使用を開示する。この発現カセットは、５'から３'まで操作可能に結合した、操作可能に結合した、昆虫細胞内で転写を駆動可能なプロモーターと、人工的に構築した配列と、１番目の翻訳開始コドンのみが欠失した重複オープンリーディングフレームと、を含み、前記人工的に構築した配列は、昆虫細胞内でスプライシング活性を有する天然の又は人工的に改変されたイントロンを含み、前記イントロンは、翻訳開始コドンＡＴＧを含み、又は前記イントロンは、ＡＴＧにおける隣接する任意の２つのヌクレオチドの間に位置する。本発明では、この発現カセットを含む組換えアデノ随伴ウイルスベクターは、設計されたイントロン配列を利用し、イントロンスプライシング作用によりＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３タンパク質並びにＲｅｐ７８及びＲｅｐ５２タンパク質の相対発現を調節することにより、昆虫細胞内で高パッケージング率及び感染性を有するｒＡＡＶを大規模で生産することができる。【選択図】図２
Description
本発明は、遺伝子工学技術分野に属し、より具体的には、昆虫細胞内で重複オープンリーディングフレームを含む遺伝子を発現するための発現カセット及びその使用に関する。
アデノ随伴ウイルス（ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ，ＡＡＶ）（アデノ関連ウイルスとも呼ばれる）は、パルボウイルス科ディペンドウイルス属に属し、現在発現された構造が最も簡単な単一鎖ＤＮＡ欠損型ウイルスであり、複製にはヘルパーウイルス（通常、アデノウイルス）を必要とする。組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）は、宿主範囲が広く、免疫原性が低い、安全性が高く、動物内での外来遺伝子の長期で安定的な発現を媒介できるなどの利点を有するため、現在、遺伝子治療分野では最も有望なベクターの一つである。最初の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）媒介遺伝子治療薬が承認されて以来、大規模なＡＡＶベクター製造技術に対する需要がますます高まっている（Ｙｌａ－Ｈｅｒｔｔｕａｌａ Ｓ．，２０１２，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，２０：１８３１－１８３２）。
現在、ｒＡＡＶを生産するシステムは主に２つある。１つは、哺乳動物細胞（例えば、２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＫＢ細胞等）を用いる通常生産システムである。もう１つは、昆虫細胞を用いる生産システムである。哺乳動物細胞生産システムにおいて、単一細胞のｒＡＡＶ粒子の収量が低く、培養中で汚染のリスクが高い。これは、ｒＡＡＶの哺乳動物細胞での大規模生産及び応用を制限する。組換えアデノ随伴ウイルスゲノムにおいてｃａｐ遺伝子はウイルスＶＰカプシドタンパク質をコードし、３種類の構造タンパク質を含み、それぞれＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３である。野生型ウイルス由来のＡＡＶにおけるＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３の化学量論比は約１：１：１０である。このような化学量論比は、組換えＡＡＶの取得にとって非常に重要である。哺乳動物細胞培養系において、３種類のＡＡＶカプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３；化学量論比１：１：１０）を取得した。これは、哺乳動物細胞のイントロンの２つのスプライスアクセプター配列の交互使用及びＶＰ２次善開始コドンＡＣＧの使用に依存する。しかし、哺乳動物細胞と昆虫細胞は、イントロンのスプライシングメカニズムが異なるため、哺乳動物細胞に現れる発現態様が昆虫細胞内で複製されない。その結果、野生型ＡＡＶは、昆虫細胞内で適切なカプシドにパッケージングすることができない。
上記の問題を克服するために、Ｕｒａｂｅらは昆虫細胞の生産システムを開発した。具体的には、ＶＰ１の開始コドンＡＵＧを次善開始コドンＡＣＧで置換し、単一のポリシストロニックｍＲＮＡを構築する。このポリシストロニックｍＲＮＡは、スプライシングする必要がなく、３種類のＡＡＶ２のＶＰタンパク質を全て発現することができる（Ｕｒａｂｅら、２００２，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，１３：１９３５－１９４３）。しかし、ＡＡＶの血清型が多くて日々増えていき、Ｕｒａｂｅらの改変方法は全ての血清型に適用することができない。例えば、ＵｒａｂｅらがＡＣＧをＶＰ１カプシドタンパク質開始コドンとして用いたバキュロウイルス系で産生したＡＡＶ５粒子は、感染性が十分ではなかった。また、中国特許ＣＮ１０６５４４３２５Ａで提供される方法では、異なる次善開始コドンＣＴＧを用いてＶＰ１の発現を強化する。このような設計によりＡＡＶ５粒子の感染性が向上したが、ＶＰ１／ＶＰ２／ＶＰ３の相対含有量の調節には柔軟性が欠如する。また、この方法も血清型特異的配列調整に必要な柔軟性が欠如する。中国特許ＣＮ１０１５２２９０３Ａで提供される方法において、ｐｏｌｈプロモーター配列を含む人工イントロンをＶＰ１のオープンリーディングフレームに挿入し、２つのプロモーターによりＶＰ１及びＶＰ２／ＶＰ３をそれぞれ発現させる。このような設計により、同一のリーディングフレームでのＶＰ１／ＶＰ２／ＶＰ３の発現が実現され得るが、この方法は、ＶＰ１／ＶＰ２／ＶＰ３の相対量を効果的に調節することができないとともに、異なる血清型中のＶＰ１／ＶＰ２／ＶＰ３のカプシドタンパク質の違いが大きいことで生産効率が低下する。
ＡＡＶ昆虫細胞生産系において、ＵｒａｂｅらはＲｅｐ７８及びＲｅｐ５２の独立した２つの発現カセットを構築し、同一のバキュロウイルスベクターに挿入した。Ｒｅｐ７８の低発現がＡＡＶのパッケージングに有利であり、Ｒｅｐ５２はＰｏｌｈプロモーターを使用する一方、Ｒｅｐ７８はＰｏｌｈプロモーターよりも起動活性が低い△ＩＥ１プロモーターを使用する（Ｕｒａｂｅら、２００２，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，１３：１９３５－１９４３）。しかし、研究により、Ｕｒａｂｅらによって開発されたＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質発現方法には、バキュロウイルスベクターの継代が不安定であるとの問題が存在することが発見された。この問題を解決するために、中国特許ＣＮ１０３８４９６２９Ａには、ＡＡＶ Ｒｅｐ７８タンパク質の翻訳開始コドンをＡＣＧに置換する昆虫細胞内でのＡＡＶの産生方法が開示される。この方法は、同一のリーディングフレームでのＲｅｐ７８及びＲｅｐ５２タンパク質の発現を実現できるが、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２タンパク質の相対発現の調節作用が欠如する。
そこで、昆虫細胞内で組換えアデノ随伴ウイルスを安定して大規模で生産できる手段及び方法の開発は、非常に重要である。
従来技術の欠陥に対して、本発明の目的は、昆虫細胞内で重複オープンリーディングフレームを含む遺伝子を発現するための発現カセット及びその使用を提供することである。本発明では、イントロンの選択的スプライシング調節作用により、転写後修飾の過程においてＶＰ１タンパク質コード配列の翻訳開始コドンＡＵＧを選択的に保持、欠失又は形成し、昆虫細胞内でｃａｐ遺伝子重複オープンリーディングフレームにおいてＶＰタンパク質（ＶＰ１／ＶＰ２／ＶＰ３）が正確な化学量論で発現されることが実現される。同様に、イントロンの選択的スプライシング調節作用により、転写後修飾の過程においてＲｅｐ７８タンパク質コード配列の翻訳開始コドンＡＵＧを選択的に保持、欠失又は形成し、昆虫細胞内でｒｅｐ遺伝子重複オープンリーディングフレームにおいてＲｅｐタンパク質（Ｒｅｐ７８／Ｒｅｐ５２）が適切な比率で発現されることが実現される。昆虫細胞内で安定して大規模で高いパッケージング率及び感染活性を有する様々な血清型の組換えアデノ随伴ウイルスを生産する問題を解決することを目的とする。
上記の目的を達成するために、本発明では、昆虫細胞内で重複オープンリーディングフレームを含む遺伝子を発現するための発現カセットであって、
５'から３'まで操作可能に結合した、
昆虫細胞内で転写を駆動可能なプロモーターと、
人工的に構築した配列と、
１番目の翻訳開始コドンのみが欠失した重複オープンリーディングフレームと、
を含み、前記人工的に構築した配列は、昆虫細胞内でスプライシング活性を有する天然の又は人工的に改変されたイントロンを含み、前記イントロンは、翻訳開始コドンＡＴＧを含み、又は前記イントロンは、ＡＴＧにおける隣接する任意の２つのヌクレオチドの間に位置し、
転写後修飾の過程において、イントロンの選択的スプライシング作用により、前記人工的に構築した配列における翻訳開始コドンＡＵＧが保持又は欠失し、或いは前記人工的に構築した配列に翻訳開始コドンＡＵＧが形成され、これによって、前記重複オープンリーディングフレームにおける異なるタンパク質コード遺伝子の翻訳発現の調節が実現される、発現カセットが提供される。
５'から３'まで操作可能に結合した、
昆虫細胞内で転写を駆動可能なプロモーターと、
人工的に構築した配列と、
１番目の翻訳開始コドンのみが欠失した重複オープンリーディングフレームと、
を含み、前記人工的に構築した配列は、昆虫細胞内でスプライシング活性を有する天然の又は人工的に改変されたイントロンを含み、前記イントロンは、翻訳開始コドンＡＴＧを含み、又は前記イントロンは、ＡＴＧにおける隣接する任意の２つのヌクレオチドの間に位置し、
転写後修飾の過程において、イントロンの選択的スプライシング作用により、前記人工的に構築した配列における翻訳開始コドンＡＵＧが保持又は欠失し、或いは前記人工的に構築した配列に翻訳開始コドンＡＵＧが形成され、これによって、前記重複オープンリーディングフレームにおける異なるタンパク質コード遺伝子の翻訳発現の調節が実現される、発現カセットが提供される。
好ましくは、前記人工的に構築した配列は、５' ５'から３'まで操作可能に結合した、
前記イントロンの５'部分と、
翻訳開始コドンＡＴＧと、
前記イントロンの３'部分と、
２Ａ自己切断ペプチドをコードするヌクレオチド配列と、
を含む。
前記イントロンの５'部分と、
翻訳開始コドンＡＴＧと、
前記イントロンの３'部分と、
２Ａ自己切断ペプチドをコードするヌクレオチド配列と、
を含む。
好ましくは、前記２Ａ自己切断ペプチドは、Ｔ２Ａペプチド、Ｐ２Ａペプチド、Ｅ２Ａペプチド又はＦ２Ａペプチドである。
好ましくは、前記人工的に構築した配列は、５'から３'まで操作可能に結合した、
第１イントロンの５'部分と、
翻訳開始コドンＡＴＧと、
第２イントロンの５'部分と、
前記イントロンの３'部分と、
を含み、前記第２イントロンの５'部分の内部には、終止コドンがあり、前記終止コドンと前記翻訳開始コドンＡＴＧとの間のヌクレオチド数は、３の倍数である。
第１イントロンの５'部分と、
翻訳開始コドンＡＴＧと、
第２イントロンの５'部分と、
前記イントロンの３'部分と、
を含み、前記第２イントロンの５'部分の内部には、終止コドンがあり、前記終止コドンと前記翻訳開始コドンＡＴＧとの間のヌクレオチド数は、３の倍数である。
好ましくは、前記イントロンの５'端ヌクレオチドはＧＴＮＮであり、前記イントロンの３'端ヌクレオチドはＮＮＡＧであり、ＮはＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇの４種類のヌクレオチドのうちのいずれか１種である。
好ましくは、前記重複オープンリーディングフレームを含む遺伝子は、ＡＡＶのｃａｐ遺伝子又はＡＡＶのｒｅｐ遺伝子である。
好ましくは、前記プロモーターは、ｐｏｌｈプロモーター又はｐ１０プロモーターである。
好ましくは、前記重複オープンリーディングフレームを含む遺伝子は、ＡＡＶのｃａｐ遺伝子であり、前記プロモーターは、ｐ１０プロモーターである。
好ましくは、前記重複オープンリーディングフレームを含む遺伝子は、ＡＡＶのｒｅｐ遺伝子であり、前記プロモーターは、ｐｏｌｈプロモーターである。
本発明の別の態様において、第１発現カセットを含む核酸分子が提供される。前記第１発現カセットは、前記発現カセットである。
好ましくは、前記核酸分子は、第２発現カセットをさらに含む。前記第２発現カセットは、前記発現カセットであり、前記第２発現カセットで発現される遺伝子は、前記第１発現カセットで発現される遺伝子と異なる。
好ましくは、前記第２発現カセットは、前記第１発現カセットに対してアンチセンス方向である。
好ましくは、前記第２発現カセットは、前記第１発現カセットに対してセンス方向である。
好ましくは、前記核酸分子は、外来遺伝子と、前記外来遺伝子の両端に位置するＡＡＶ逆位末端反復配列（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）とをさらに含む。
好ましくは、前記外来遺伝子は、レポーター遺伝子であり、前記レポーター遺伝子は、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼコード遺伝子、β－ガラクトシダーゼコード遺伝子、β－グルクロニダーゼコード遺伝子、ウミシイタケルシフェラーゼコード遺伝子、アルカリホスファターゼコード遺伝子、ホタルルシフェラーゼコード遺伝子、緑色蛍光タンパク質コード遺伝子及び赤色蛍光タンパク質コード遺伝子のうちの少なくとも１種である。
好ましくは、前記外来遺伝子は、薬物ポリペプチドをコードする遺伝子である。前記薬物ポリペプチドは、リポタンパク質エステラーゼ、アポリポタンパク質、サイトカイン、インターロイキン及びインターフェロンのうちの少なくとも１種である。
本発明の別の態様において、前記発現カセットを含むベクターを提供する。
好ましくは、前記ベクターは、昆虫細胞適合性ベクターである。
好ましくは、前記ベクターは、プラスミド及びウイルスのうちの少なくとも１種である。
本発明の別の態様において、昆虫細胞内で組換えアデノ随伴ウイルスを製造するための前記ベクターの使用を提供する。
本発明の別の態様において、ＡＡＶカプシドのインビトロ製造における前記ベクターの使用が提供される。前記重複オープンリーディングフレームを含む遺伝子は、ＡＡＶのｃａｐ遺伝子である。
本発明の別の態様において、前記発現カセットを含む昆虫細胞が提供される。
好ましくは、前記発現カセットは、前記昆虫細胞のゲノムに組み込まれる。
好ましくは、前記昆虫細胞は、ツマジロクサヨトウ細胞、イラクサギンウワバ細胞、キイロショウジョウバエ細胞又は蚊細胞である。
本発明の別の態様において、前記昆虫細胞及び培地を含む細胞培養物が提供される。
好ましくは、前記培地は、ＡＡＶゲノムを含む。
本発明の別の態様において、組換えアデノ随伴ウイルス粒子を産生可能な条件下で前記昆虫細胞を培養して回収することにより製造された組換えアデノ随伴ウイルス粒子が提供される。
本発明は、従来技術に比べて以下の有益な効果を有する。
（１）本発明の発現カセットは、昆虫細胞内で重複オープンリーディングフレームを含む遺伝子によってコードされる様々なポリペプチド（例えば、組換えアデノ随伴ウイルスのＶＰタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３）及びＲｅｐタンパク質（Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ５２））を発現するために適用することができ、野生型ＡＡＶ中のＶＰ１タンパク質コード配列又はＲｅｐ７８タンパク質コード配列のオリジナルの翻訳開始コドンＡＴＧを改変する必要がなく、イントロン配列を人工に設計し、ＶＰタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３）又はＲｅｐタンパク質（Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ５２）を適切な比率で発現するように調節することにより、昆虫細胞内で安定して大規模で組換えアデノ随伴ウイルスを生産することが実現される。本発明は、ＶＰ１タンパク質オープンリーディングフレームにおける翻訳開始コドンの下流に昆虫細胞イントロンを挿入し、このイントロンにプロモーターを挿入し、４つのプロモーター（２つのｐ１０及び２つのｐｏｌｈプロモーター）を用いてそれぞれＶＰ１、ＶＰ２／ＶＰ３、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２タンパク質を転写して翻訳する中国特許ＣＮ１０１５２２９０３Ａ中と異なる。本発明で提供されるイントロン選択的スプライシング調節策略は、イントロンのスプライシング作用により転写後のｍＲＮＡを選択的にスプライシングし、適切な比率の２種以上のｍＲＮＡを取得し、それぞれＶＰ１、ＶＰ２／ＶＰ３、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２タンパク質に翻訳することである。本発明で提供される方法は、ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３タンパク質の化学量論比及びＲｅｐ７８／Ｒｅｐ５２の相対発現をより効果的に制御することができる。
（１）本発明の発現カセットは、昆虫細胞内で重複オープンリーディングフレームを含む遺伝子によってコードされる様々なポリペプチド（例えば、組換えアデノ随伴ウイルスのＶＰタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３）及びＲｅｐタンパク質（Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ５２））を発現するために適用することができ、野生型ＡＡＶ中のＶＰ１タンパク質コード配列又はＲｅｐ７８タンパク質コード配列のオリジナルの翻訳開始コドンＡＴＧを改変する必要がなく、イントロン配列を人工に設計し、ＶＰタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３）又はＲｅｐタンパク質（Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ５２）を適切な比率で発現するように調節することにより、昆虫細胞内で安定して大規模で組換えアデノ随伴ウイルスを生産することが実現される。本発明は、ＶＰ１タンパク質オープンリーディングフレームにおける翻訳開始コドンの下流に昆虫細胞イントロンを挿入し、このイントロンにプロモーターを挿入し、４つのプロモーター（２つのｐ１０及び２つのｐｏｌｈプロモーター）を用いてそれぞれＶＰ１、ＶＰ２／ＶＰ３、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２タンパク質を転写して翻訳する中国特許ＣＮ１０１５２２９０３Ａ中と異なる。本発明で提供されるイントロン選択的スプライシング調節策略は、イントロンのスプライシング作用により転写後のｍＲＮＡを選択的にスプライシングし、適切な比率の２種以上のｍＲＮＡを取得し、それぞれＶＰ１、ＶＰ２／ＶＰ３、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２タンパク質に翻訳することである。本発明で提供される方法は、ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３タンパク質の化学量論比及びＲｅｐ７８／Ｒｅｐ５２の相対発現をより効果的に制御することができる。
（２）本発明では、イントロン選択的スプライシング策略により、昆虫細胞内での組換えアデノ随伴ウイルスの生産を実現するとともに、様々なＡＡＶ血清型に適用することにより、ｒＡＡＶ製造の柔軟性がより高く、応用範囲がより広くなる。
（３）本発明では、ＡＡＶのｃａｐ遺伝子、ｒｅｐ遺伝子及び外来遺伝子を有するＩＴＲコア発現エレメントを同一の組換えバキュロウイルスベクターに構築し、このベクターを用いて昆虫宿主細胞にトランスフェクションすることにより、組換えＡＡＶウイルス粒子を安定的で高収率で生産することができる。ｃａｐ遺伝子発現カセットにおけるイントロン配列を調整することにより、ＶＰ１及びＶＰ２／ＶＰ３の相対発現量を調節し、異なるＶＰ１取り込み量のウイルス粒子を取得することができ、これによって、異なる需要に応じてｒＡＡＶウイルスの感染活性を調節することができる。
本発明の目的、技術的手段及び利点をより明確にするために、以下、図面及び実施例を参照しながら本発明をさらに詳しく説明する。以下の実施例は、本発明を説明するものに過ぎず、本発明を限定するものではない。
用語の説明
本明細書で使用される用語「操作可能に結合」とは、ポリヌクレオチド（又はポリペプチド）配列は、機能的関係で結合されることをいう。２つのヌクレオチド配列が機能的関係にある場合、この２つのヌクレオチド配列は、「操作可能に結合」されている。例えば、転写調節配列（例えば、プロモーター）は、ある遺伝子コード配列の転写に影響を与える場合、この遺伝子コード配列に操作可能に結合される。
用語「発現カセット」とは、宿主細胞に導入する際にコード配列と調節配列とを操作可能に結合した核酸構築体を指し、それぞれＲＮＡ又はポリペプチドの転写及び／又は翻訳をもたらす。発現カセットは、転写を開始させるプロモーター、標的遺伝子オープンリーディングフレーム及び転写ターミネーターを含むとして理解されるべきである。通常、プロモーター配列は、標的遺伝子の上流に位置し、標的遺伝子からの距離は、発現制御に適合である。
用語「オープンリーディングフレーム」（Ｏｐｅｎ Ｒｅａｄｉｎｇ Ｆｒａｍｅ，ＯＲＦ）は、構造遺伝子の正常ヌクレオチド配列であり、タンパク質又はポリペプチドをコードする機能を有し、開始コドンから始まって終止コドンで終わり、それらの間に翻訳を終了させる終止コドンが存在しない。１本のｍＲＮＡ鎖において、リボソームは開始コドンから翻訳し始め、ｍＲＮＡ配列に沿ってポリペプチド鎖を合成して伸長し続け、終止コドンに当たると、ポリペプチド鎖の伸長反応が終了する。
用語「ベクター」とは、遺伝物質を転送、転移及び／又は貯蔵し、並びに遺伝物質を発現させ、及び／又は遺伝物質を宿主細胞の染色体ＤＮＡに組み込むように設計される核酸分子（例えば、プラスミドベクター、コスミドベクター、人工染色体、ファージベクター及び他のウイルスベクター）を指す。ベクターは、通常、少なくとも３つの基本ユニット（即ち、複製起点、選択マーカー及びマルチクローニングサイト）から構成される。
用語「イントロン」は、介在配列とも呼ばれ、遺伝子又はｍＲＮＡ分子におけるコード機能を有しないセグメントを指し、真核生物細胞ＤＮＡにおける介在配列である。イントロン配列は、ｍＲＮＡ前駆体に転写され、スプライシングにより除去され、最終的に成熟ｍＲＮＡ分子に存在しない。スプライシング過程が自発的であるか又はスプライソソームの加工を必要とするかによって、イントロンをセルフスプライシングイントロン及びスプライソソームイントロンに分ける。セルフスプライシングイントロンは、リボザイムであり、自体の作用によって切除されてｍＲＮＡから分離できる特殊なイントロンである。本発明に係るイントロンは、スプライソソームイントロンである。このようなイントロンの除去は、スプライソソームの関与を必要とし、イントロン配列の両端にスプライスドナー配列及びスプライスアクセプター配列があり、それぞれ切断部位及び再結合部位に隣接する。スプライソソームは、核内低分子ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｎｕｃｌｅａｒＲＮＡ，ｓｎＲＮＡ）及びタンパク質因子から動的に構成されるリボ核タンパク質複合体である。スプライソソームは、ｍＲＮＡ前駆体のスプライス部位を認識し、スプライシング反応を触媒し、イントロンを完全に切除し、上下流のＲＮＡ配列を再結合する。
用語「ＡＡＶ血清型」：ＡＡＶが発見されて以来、１００種類以上のＡＡＶ血清型又は変異体は、アデノウイルス、ヒト又は霊長類、及び一部の哺乳類から分離されており、そのうち、主に使用されているのはＡＡＶ１－９である。このなる血清型のｒＡＡＶベクターは、主な違いがカプシドタンパク質にある。異なるＡＡＶ血清型は、感染効率及び組織特異性には違いがある。
全ての既知のアデノ随伴ウイルス血清型は、ゲノム構造が非常に類似する。ＡＡＶは、一本鎖ＤＮＡウイルスであり、ゲノム構造が簡単で、全長が約４．７ｋｂであり、図１に示すように、そのゲノムには、ｒｅｐ遺伝子発現カセット、ｃａｐ遺伝子発現カセット及びゲノムの両端に位置するＡＡＶ逆位末端反復配列（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔｓ，ＩＴＲ）が含まれる。ＩＴＲは、ゲノム両端にある１２５個のヌクレオチドの回文構造であり、能形成一个自己相補的な逆Ｔ型ヘアピン構造を形成することができ、ＤＮＡ複製の開始及び組換えＡＡＶゲノムを感染性ウイルス粒子にパッケージングするのに必要なシスエレメントである。ＡＡＶは、欠損型ウイルスとして、ヘルパーウイルスが存在しないと独立して複製することができない。したがって、ＡＡＶは宿主細胞の染色体にターゲット挿入されて潜伏状態となるしかできない。ヘルパーウイルスの存在下では、ｒｅｐ遺伝子の発現量の増加は、宿主細胞染色体に組み込まれた（導入された）ＡＡＶゲノムを救い出して大量に複製してＡＡＶ ＤＮＡを得ることができ、一本鎖ｒＡＡＶゲノムは、ＶＰカプシドタンパク質の作用下でパッケージングされて感染性を有するウイルス粒子となる。Ｃａｐ遺伝子は、構造的ＶＰカプシドタンパク質をコードし、３つの重複オープンリーディングフレームを含み、それぞれ３種類のサブユニットＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３をコードする。ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３は、異なる開始コドンを含み、１つの終止コドンを共用し、ＶＰ１とＶＰ２とはＶＰ３配列を共用する。ＶＰ１のＮ末端には１つの保存されたホスホリパーゼＡ２配列を有する。この配列は、ウイルスの体内からの逃避に関与し、その感染性にとって非常に重要である。ＶＰ２タンパク質は、組み立て又は感染にとっては不可欠なものではない。ＶＰ３タンパク質のコアは、保存されたβバレルモチーフからなり、異なる血清型ＡＡＶ及び宿主細胞作用受容体の違いを決定する。野生型ＡＡＶにおける３種類のタンパク質の正確な比率は３：３：５４、約１：１：１０である。Ｒｅｐ遺伝子は、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ４０の４つの重複多機能タンパク質をコードする。Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ６８タンパク質は、ＡＡＶの複製及び組み込みに関与し、ＩＴＲにおける特定の配列に結合することができる。Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ４０タンパク質は、ヘリカーゼ及びＡＴＰアーゼの活性を有し、一本鎖ゲノムの複製に関与するとともに、ウイルスの組み立てにも関与する。哺乳動物細胞や昆虫細胞にもかかわらず、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２タンパク質をコードするスプライシングされていないｍＲＮＡは、ｒＡＡＶ調製の需要を満たすのに十分である。
本発明でいう核酸分子は、ＤＮＡ分子であってもよく、ＲＮＡ分子であってもよい。当業者に知られているように、ＲＮＡ配列は、ＤＮＡ配列と基本的に同じであるか又はある程度の配列同一性を有し、ＤＮＡ配列中のチミン（Ｔ）は、ＲＮＡ配列中のウラシル（Ｕ）に同等であると考えられ得る。
本発明でいうイントロンは、天然イントロンであってもよく、人工的に改変されたイントロンであってもよい。昆虫細胞内でスプライシング活性を有するが、その由来は昆虫細胞に限定されない。
本発明で提供される昆虫細胞内で重複オープンリーディングフレームを含む遺伝子を発現する発現カセットは、５'から３'まで操作可能に結合した、
昆虫細胞内で転写を駆動可能なプロモーターと、
人工的に構築した配列と、
１番目の翻訳開始コドンのみが欠失した重複オープンリーディングフレームと、
を含む。
前記人工的に構築した配列は、昆虫細胞内でスプライシング活性を有する天然の又は人工的に改変されたイントロンを含み、前記イントロンは翻訳開始コドンＡＴＧを含むか、又は前記イントロンはＡＴＧにおける隣接する任意の２つのヌクレオチドの間に位置する。
転写後修飾の過程において、イントロンの選択的スプライシング作用により、前記人工的に構築した配列における翻訳開始コドンＡＵＧは保持又は欠失し、或いは前記人工的に構築した配列に翻訳開始コドンＡＵＧが形成されることで前記重複オープンリーディングフレームにおける異なるタンパク質コード遺伝子の翻訳発現の調節が実現される。
昆虫細胞内で転写を駆動可能なプロモーターと、
人工的に構築した配列と、
１番目の翻訳開始コドンのみが欠失した重複オープンリーディングフレームと、
を含む。
前記人工的に構築した配列は、昆虫細胞内でスプライシング活性を有する天然の又は人工的に改変されたイントロンを含み、前記イントロンは翻訳開始コドンＡＴＧを含むか、又は前記イントロンはＡＴＧにおける隣接する任意の２つのヌクレオチドの間に位置する。
転写後修飾の過程において、イントロンの選択的スプライシング作用により、前記人工的に構築した配列における翻訳開始コドンＡＵＧは保持又は欠失し、或いは前記人工的に構築した配列に翻訳開始コドンＡＵＧが形成されることで前記重複オープンリーディングフレームにおける異なるタンパク質コード遺伝子の翻訳発現の調節が実現される。
いくつかの実施例において、イントロン選択的スプライシング作用により、イントロンを含む発現カセットは、昆虫細胞におけるＡＡＶ ＶＰカプシドタンパク質の正確な発現又はＲｅｐタンパク質の優性発現に適用することができる。ここで、ｃａｐ遺伝子における重複オープンリーディングフレームは、ＡＡＶカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３をコードし、ｒｅｐ遺伝子における重複オープンリーディングフレームは、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２タンパク質をコードする。
いくつかの実施例において、イントロン選択的スプライシング作用により、イントロンを含む発現カセットは、昆虫細胞内で多種類のシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のＶＰカプシドタンパク質を発現するために適用できる。ＳＶ４０は、５．２ｋｂ共有結合閉環の環状ゲノムを有する二本鎖ＤＮＡウイルスであり、同様に３種類のカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３を含む。ＶＰ３タンパク質は、ＶＰ２タンパク質の短縮形であり、ＶＰ３とＶＰ２は終止コドンを共用する。ＶＰ１コード配列の５'部分とＶＰ２、ＶＰ３コード配列の３'部分とは重複するが、同じオープンリーディングフレームを有しない。哺乳細胞において、これらのＶＰタンパク質の発現は、イントロンスプライシングメカニズムによって調節される。本発明の発現カセットは、昆虫細胞内でＳＶ４０カプシドタンパク質を発現するために使用される場合、この発現カセットにおける１番目の翻訳開始コドンのみが欠失したＯＲＦは、ＶＰ２タンパク質翻訳開始コドンＡＴＧのみが欠失したＶＰタンパク質コード配列であり、ＶＰ２、ＶＰ３タンパク質の相対発現調節は、本発明のイントロンスプライシング策略により実現することができる。
いくつかの実施例において、前記重複オープンリーディングフレームを含む遺伝子は、ＡＡＶのｃａｐ遺伝子である。前記１番目の翻訳開始コドンのみが欠失した重複オープンリーディングフレームは、ＶＰ１タンパク質翻訳開始コドンＡＴＧのみが欠失したＶＰタンパク質コード配列である。前記人工的に構築した配列は、５'から３'まで操作可能に結合した
イントロンの５'部分と、
翻訳開始コドンＡＴＧと、
イントロンの３'部分と、
２Ａ自己切断ペプチドをコードするヌクレオチド配列と、
を含む。
イントロンの５'部分と、
翻訳開始コドンＡＴＧと、
イントロンの３'部分と、
２Ａ自己切断ペプチドをコードするヌクレオチド配列と、
を含む。
本発明では、野生型ＡＡＶ ＶＰ１タンパク質コード配列自体のＮ端のイントロンスプライス部位を変異させることにより、昆虫細胞中のスプライソソームは、このスプライス部位を認識することができず、開始コドンＡＴＧ下流のイントロンの５'部分（スプライスドナー配列又はスプライスアクセプター配列）とＡＴＧ下流のイントロンの３'部分（スプライスアクセプター配列又はスプライスドナー配列）は、完全なイントロンスプライス部位を形成する。図２に示すように、転写後修飾の過程において、昆虫細胞中のスプライソソームが第１イントロンスプライス部位を認識し、スプライシング反応を触媒する場合、ｍＲＮＡの最先端のＡＵＧ－開始部位が除去され、リボソームが５'から３'までＶＰ２タンパク質の開始コドンを認識する場合、ＶＰ２タンパク質は翻訳発現され得る。ＶＰ２開始コドンは準最適コドンＡＣＧであり、リボソームのスキャンニング漏れを引き起こすため、ＶＰ３タンパク質は翻訳発現され得る。イントロンスプライス部位が認識されない場合、ＡＵＧ－開始部位が除去されず、ｍＲＮＡが最初（１番目）のＡＵＧから翻訳し、ＶＰ１タンパク質が発現される。イントロンが一定の確率のスプライシング作用を有することで、カプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３の相対発現量が制御される。しかし、ＶＰ１タンパク質が翻訳発現されるときに、ｍＲＮＡにおける１番目のＡＵＧ開始コドンからＶＰ１タンパク質のＮ端配列までの別の配列（即ち、イントロン配列の一部）も翻訳されるため、ＶＰ１タンパク質の正常発現に影響を与える。そのため、本発明で提供される発現カセットに２Ａ自己切断ペプチド（２Ａ ｓｅｌｆ－ｃｌｅａｖｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ）のコード配列が導入されている。
２Ａ自己切断ペプチドは、長さが１８－２２アミノ酸残基のペプチド断片であり、細胞内に２Ａペプチドが含まれる組換えタンパク質の自己切断を誘導することができる。このようなペプチドは、配列モチーフを有し、通常、最後のグリシン（Ｇ）とプロリン（Ｐ）との結合箇所でリボソームが結合できないことで「切断」の効果が引き起こされ、２Ａ自己切断ペプチドのＣ端とＶＰ１タンパク質のＮ端は断裂して正常なＶＰ１タンパク質が得られる。異なるウイルスによって、現在一般的に使用されている２Ａペプチドは、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ及びＦ２Ａであり、それらのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号３６から配列番号３９に示される。これらの４つの２Ａペプチドは、いずれも本発明に適用できる。本発明の実施例ではＴ２Ａを例としている。
いくつかの実施例において、前記重複オープンリーディングフレームを含む遺伝子は、ＡＡＶのｃａｐ遺伝子である。前記１番目の翻訳開始コドンのみが欠失した重複オープンリーディングフレームは、ＶＰ１タンパク質翻訳開始コドンＡＴＧのみが欠失したＶＰタンパク質コード配列である。前記人工的に構築した配列は、５'から３'まで操作可能に結合した
第１イントロンの５'部分と、
翻訳開始コドンＡＴＧと、
第２イントロンの５'部分と、
イントロンの３'部分と、
を含む。
前記第２イントロンの５'部分の内部には終止コドンがあり、この終止コドンは、ＴＡＡ、ＴＡＧ又はＴＧＡであってもよい。終止コドンと前記翻訳開始コドンＡＴＧとの間のヌクレオチド数は３の倍数である。
第１イントロンの５'部分と、
翻訳開始コドンＡＴＧと、
第２イントロンの５'部分と、
イントロンの３'部分と、
を含む。
前記第２イントロンの５'部分の内部には終止コドンがあり、この終止コドンは、ＴＡＡ、ＴＡＧ又はＴＧＡであってもよい。終止コドンと前記翻訳開始コドンＡＴＧとの間のヌクレオチド数は３の倍数である。
本発明では、野生型ＡＡＶ ＶＰ１タンパク質コード配列自体のＮ末端のイントロンスプライス部位を変異させることにより、昆虫細胞中のスプライソソームは、このスプライス部位を認識することができず、開始コドンＡＴＧ上流の第１イントロンの５'部分とＡＴＧ下流のイントロンの３'部分とは完全な第１イントロンスプライス部位を形成し、ＡＴＧ下流の第２イントロンの５'部分とイントロンの３'部分とは完全な第２イントロンスプライス部位を形成する。図３に示すように、転写後修飾の過程において、昆虫細胞中のスプライソソームが第１イントロンスプライス部位を認識し、スプライシング反応を触媒する場合、ｍＲＮＡの最先端の開始部位が除去され、リボソームが５'から３'までＶＰ２タンパク質の開始コドンを認識する場合、ＶＰ２タンパク質は翻訳発現され得る。ＶＰ２開始コドンは準最適コドンＡＣＧであり、リボソームのスキャンニング漏れを引き起こすため、ＶＰ３タンパク質は翻訳発現され得る。昆虫細胞中のスプライソソームが第２イントロンスプライス部位を認識してスプライシング反応を触媒し、開始部位が除去されない場合、ｍＲＮＡは、最初（１番目）のＡＵＧから翻訳し、ＶＰ１タンパク質が発現される。昆虫細胞中のスプライソソームには、第１イントロンをスプライシングするスプライス部位も、第２イントロンをスプライシングするスプライス部位もない場合、ｍＲＮＡは１番目のＡＵＧから翻訳し始め、第２イントロンの５'部分内部の終止コドンに到達したら終止し、つまり、翻訳が途中で終止し、ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３タンパク質を翻訳しない。異なるイントロンの異なる確率のスプライシング作用により、カプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３の相対発現量を制御する。
いくつかの実施例において、前記重複オープンリーディングフレームを含む遺伝子は、ＡＡＶのｃａｐ遺伝子である。前記１番目の翻訳開始コドンのみが欠失した重複オープンリーディングフレームは、ＶＰ１タンパク質翻訳開始コドンＡＴＧのみが欠失したＶＰタンパク質コード配列である。前記人工的に構築した配列は、５'から３'まで操作可能に結合した
アデニンヌクレオチド（Ａ）、前記イントロン、チミンヌクレオチド（Ｔ）及びグアニンヌクレオチド（Ｇ）；或いは
アデニンヌクレオチド（Ａ）、チミンヌクレオチド（Ｔ）、前記イントロン及びグアニンヌクレオチド（Ｇ）を含む。
アデニンヌクレオチド（Ａ）、前記イントロン、チミンヌクレオチド（Ｔ）及びグアニンヌクレオチド（Ｇ）；或いは
アデニンヌクレオチド（Ａ）、チミンヌクレオチド（Ｔ）、前記イントロン及びグアニンヌクレオチド（Ｇ）を含む。
本発明では、野生型ＡＡＶ ＶＰ１タンパク質コード配列自体のＮ端のイントロンスプライス部位を変異させることにより、昆虫細胞中のスプライソソームはこのスプライス部位を認識することができず、図４に示すように（イントロンがＡＴＧのＡＴ間に挿入されることを例とする）、転写後修飾の過程において、昆虫細胞中のスプライソソームがＶＰ１タンパク質翻訳開始コドンＡＵＧに挿入されたイントロンスプライス部位を認識してスプライシング反応を触媒し、イントロンが切断されると、完全なＡＵＧ翻訳開始部位が形成され、ｍＲＮＡが１番目のＡＵＧから翻訳し始め、ＶＰ１タンパク質が発現される。イントロンスプライス部位が認識されない場合、イントロンは切断されず、完全なＡＵＧ翻訳開始部位が形成することができず、リボソームが５'から３'までＶＰ２タンパク質の開始コドンを認識する場合、ＶＰ２タンパク質は翻訳発現され得る。ＶＰ２開始コドンは、準最適コドンＡＣＧであり、リボソームのスキャンニング漏れを引き起こすため、ＶＰ３タンパク質は翻訳発現され得る。イントロンが一定の確率のスプライシング作用を有することで、カプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３の相対発現量が制御される。
いくつかの実施例において、いくつかの実施例において、前記重複オープンリーディングフレームを含む遺伝子は、ＡＡＶのｒｅｐ遺伝子であり、前記１番目の翻訳開始コドンのみが欠失した重複オープンリーディングフレームは、Ｒｅｐ７８タンパク質翻訳開始コドンＡＴＧのみが欠失したＲｅｐタンパク質コード配列であり、前記人工的に構築した配列は、５'から３'まで操作可能に結合した
イントロンの５'部分と、
翻訳開始コドンＡＴＧと、
イントロンの３'部分と、
２Ａ自己切断ペプチドをコードするヌクレオチド配列と、
を含む。
イントロンの５'部分と、
翻訳開始コドンＡＴＧと、
イントロンの３'部分と、
２Ａ自己切断ペプチドをコードするヌクレオチド配列と、
を含む。
本発明では、野生型ＡＡＶ Ｒｅｐ７８タンパク質コード配列中のＲｅｐ５２タンパク質翻訳開始コドン上流にある可能な１つ又は複数の翻訳開始部位を変異させることにより、昆虫細胞中のリボソームはこれらの部位を認識することができず、翻訳開始コドンＡＴＧ上流のイントロンの５'部分及びＡＴＧ下流のイントロンの３'部分は完全なイントロンスプライス部位を形成し、図５に示すように、転写後修飾の過程において、昆虫細胞中のスプライソソームがこのイントロンスプライス部位を認識してスプライシング反応を触媒すると、ｍＲＮＡの最先端のＡＵＧ－開始部位が除去され、リボソームは５'から３'までＲｅｐ５２タンパク質の開始コドンを認識し、Ｒｅｐ５２タンパク質は翻訳発現され得る。イントロンスプライス部位が認識されない場合、ＡＵＧ－開始部位は除去されず、ｍＲＮＡは１番目のＡＵＧから翻訳し始め、２Ａ自己切断ペプチドが自己せん断機能を有するため、２Ａ自己切断ペプチドのＣ端から断裂してＲｅｐ７８タンパク質が放出される。イントロンが一定の確率のスプライシング作用を有するため、Ｒｅｐ７８タンパク質及びＲｅｐ５２タンパク質の相対発現量は制御される。
いくつかの実施例において、いくつかの実施例において、前記重複オープンリーディングフレームを含む遺伝子は、ＡＡＶのｒｅｐ遺伝子であり、前記１番目の翻訳開始コドンのみが欠失した重複オープンリーディングフレームは、Ｒｅｐ７８タンパク質翻訳開始コドンＡＴＧのみが欠失したＲｅｐタンパク質コード配列であり、前記人工的に構築した配列は、５'から３'まで操作可能に結合した
第１イントロンの５'部分と、
翻訳開始コドンＡＴＧと、
第２イントロンの５'部分と、
イントロンの３'部分と、
を含む。
前記第２イントロンの５'部分内部には終止コドンがあり、この終止コドンはＴＡＡ、ＴＡＧ又はＴＧＡであってもよい。終止コドンと前記翻訳開始コドンＡＴＧとの間のヌクレオチド数は３の倍数である。
第１イントロンの５'部分と、
翻訳開始コドンＡＴＧと、
第２イントロンの５'部分と、
イントロンの３'部分と、
を含む。
前記第２イントロンの５'部分内部には終止コドンがあり、この終止コドンはＴＡＡ、ＴＡＧ又はＴＧＡであってもよい。終止コドンと前記翻訳開始コドンＡＴＧとの間のヌクレオチド数は３の倍数である。
本発明では、野生型ＡＡＶ Ｒｅｐ７８タンパク質コード配列におけるＲｅｐ５２タンパク質翻訳開始コドン上流の可能な１つ又は複数の翻訳開始部位を変異させることにより、昆虫細胞中のリボソームはこれらの部位を認識することができず、翻訳開始コドンＡＴＧ上流の第１イントロンの５'部分及びＡＴＧ下流のイントロンの３'部分は完全な第１イントロンスプライス部位を形成し、ＡＴＧ下流の第２イントロンの５'部分及びイントロンの３'部分は完全な第２イントロンスプライス部位を形成し、図６に示すように、転写後修飾の過程において、昆虫細胞中のスプライソソームが第１イントロンスプライス部位を認識してスプライシング反応を触媒すると、ｍＲＮＡの最先端のＡＵＧ－開始部位が除去され、リボソームは５'から３'までＲｅｐ５２タンパク質の開始コドンを認識する場合、Ｒｅｐ５２タンパク質は翻訳発現され得る。昆虫細胞中のスプライソソームが第２イントロンスプライス部位を認識してスプライシング反応を触媒し、ＡＵＧ－開始部位が除去されない場合、ｍＲＮＡは１番目のＡＵＧから翻訳し、Ｒｅｐ７８タンパク質は発現される。昆虫細胞中のスプライソソームには、第１イントロンをスプライシングするスプライス部位も第２イントロンスをスプライシングするプライス部位もない場合、ｍＲＮＡは１番目のＡＵＧから翻訳し始め、第２イントロンの５'部分内部の終止コドンに到達したら終止し、つまり、翻訳が途中で終止し、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２タンパク質を翻訳しない。異なるイントロンの異なる確率のスプライシング作用により、Ｒｅｐ７８タンパク質及びＲｅｐ５２タンパク質の相対発現量を制御する。
いくつかの実施例において、前記重複オープンリーディングフレームを含む遺伝子は、ＡＡＶのＲｅｐ遺伝子である。前記１番目の翻訳開始コドンのみが欠失した重複オープンリーディングフレームは、Ｒｅｐ７８タンパク質翻訳開始コドンＡＴＧのみが欠失したＲｅｐタンパク質コード配列である。前記人工的に構築した配列は、５'から３'まで操作可能に結合した
アデニンヌクレオチド（Ａ）、前記イントロン、チミンヌクレオチド（Ｔ）及びグアニンヌクレオチド（Ｇ）；或いは
アデニンヌクレオチド（Ａ）、チミンヌクレオチド（Ｔ）、前記イントロン及びグアニンヌクレオチド（Ｇ）を含む。
アデニンヌクレオチド（Ａ）、前記イントロン、チミンヌクレオチド（Ｔ）及びグアニンヌクレオチド（Ｇ）；或いは
アデニンヌクレオチド（Ａ）、チミンヌクレオチド（Ｔ）、前記イントロン及びグアニンヌクレオチド（Ｇ）を含む。
本発明では、野生型ＡＡＶ Ｒｅｐ７８タンパク質コード配列におけるＲｅｐ５２タンパク質翻訳開始コドン上流の可能な１つ又は複数の翻訳開始部位を変異させることにより、昆虫細胞中のリボソームはこれらの部位を認識することができず、図７に示すように（同図には、イントロンがＡＴＧのＡＴ間に挿入されたことを例とする）、転写後修飾の過程において、昆虫細胞中のスプライソソームがＲｅｐ７８タンパク質翻訳開始コドンＡＵＧに挿入されたイントロンスプライス部位を認識してスプライシング反応を触媒してイントロンに切断が発生すると、完全なＡＵＧ翻訳開始部位が形成され、ｍＲＮＡは１番目のＡＵＧから翻訳し始め、Ｒｅｐ７８タンパク質は発現される。イントロンスプライス部位が認識されず、イントロンが切断されない場合、完全なＡＵＧ翻訳開始部位が形成することができず、リボソームは５'から３'までＲｅｐ５２タンパク質の開始コドンを認識し、Ｒｅｐ５２タンパク質は翻訳発現され得る。イントロンが一定の確率のスプライシング作用を有することにより、Ｒｅｐ７８タンパク質及びＲｅｐ５２タンパク質の相対発現量が制御される。
いくつかの実施例において、好ましくは、前記イントロンの５'端のヌクレオチドはＧＴＮＮであり、前記イントロンの３'端のヌクレオチドはＮＮＡＧである。ここで、Ｎは、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇの４種類のヌクレオチドのうちのいずれか１種を示す。より具体的には、前記第１イントロンの５'端及び第２イントロンの５'端ヌクレオチドはいずれもＧＴＮＮであり、前記イントロンの３'端のヌクレオチドはＮＮＡＧである。このようにして、ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３タンパク質は、化学量論比により近い比率で翻訳発現されるように調節され得る。適切なカプシドへのパッケージングに有利である。同様に、Ｒｅｐ７８タンパク質の翻訳発現量はＲｅｐ５２タンパク質よりも低く、比較的高いベクター収量に有利である。
いくつかの実施例において、前記イントロンのヌクレオチド配列は、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号１５、配列番号１６、配列番号２０又は配列番号２１に示される配列である。当業者に知られるように、前記イントロン配列の変化形態は、本発明の技術的手段に適用できる。いくつかの構造において、本発明のイントロンヌクレオチド配列と同一性を有する配列を使用することができる。例えば、５'端が配列ＧＴＡＡＧＴＡＴＣＧと少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％若しくは９０％の同一性を有する配列、５'端が配列ＧＴＡＡＧＴＡＴＴＣと少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％若しくは９０％の同一性を有する配列、３'端が配列ＣＣＴＴＴＴＣＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＡＧと少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％若しくは９０％の同一性を有する配列、３'が配列ＡＡＡＣＡＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＴＧＣＡＧと少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％若しくは９０％の同一性を有する配列、又は３'端が配列ＣＡＴＴＴＴＧＧＡＴＡＴＴＧＴＴＴＣＡＧと４０％、５０％、６０％、７０％、８０％若しくは９０％の同一性を有する配列が挙げられる。
いくつかの実施例において、ｃａｐ遺伝子によってコードされるＶＰカプシドタンパク質は、任意のＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶ血清２型、ＡＡＶ血清５型、ＡＡＶ血清８型、ＡＡＶ血清９型などであってもよい。本発明に係るイントロン配列及びスプライシング策略は、従来の多種類のＡＡＶ血清型のＶＰカプシドタンパク質の正確な発現に適用できる。
いくつかの実施例において、昆虫細胞内でｃａｐ遺伝子及びｒｅｐ遺伝子の転写を駆動可能なプロモーターは、ｐｏｌｈプロモーター又はｐ１０プロモーターであってもよい。好ましくは、ｃａｐ遺伝子発現カセットは、ｐ１０プロモーターを使用し、ｒｅｐ遺伝子発現カセットは、ｐｏｌｈプロモーターを使用する。
本発明は、前記ｃａｐ遺伝子発現カセット及び／又はｒｅｐ遺伝子発現カセットを含む核酸分子をさらに提供する。核酸は、直列、即ち、同極性又はアンチセンス方向で配置される発現カセットを含んでもよい。そのため、ｃａｐ遺伝子発現カセットは、ｒｅｐ遺伝子発現カセットに対してアンチセンス方向であってもよく、ｒｅｐ遺伝子発現カセットに対してセンス方向であってもよい。
本発明は、組換えアデノ随伴ウイルスベクター、好ましくは、昆虫細胞に適合するベクターをさらに提供する。前記ベクターは、ｃａｐ遺伝子発現カセット及びｒｅｐ遺伝子発現カセットを含む。このｃａｐ遺伝子発現カセットは、好ましくは本発明で構築された発現カセットであり、ｒｅｐ遺伝子発現カセットは、好ましくは本発明で構築された遺伝子発現カセットである。理解できるように、このｒＡＡＶベクターは、外来遺伝子及び前記外来遺伝子の両端に位置するＡＡＶ逆位末端反復配列をさらに含む。ＩＴＲは、ＡＡＶの複製とパッケージング及びターゲット挿入（Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）に作用し、ベクターが宿主細胞内で安定した環状ポリマー及びクロマチン様構造を形成するのに役に立ち、宿主細胞内で長期的に安定して存在することができ、外来遺伝子も持続的で安定して発現することができる。前記外来遺伝子は、少なくとも興味のある遺伝子（Ｇｅｎｅ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＧＯＩ）産物をコードする１つのヌクレオチド配列であってもよい。前記興味のある遺伝子産物は、治療的遺伝子産物であってもよく、具体的には、ポリペプチド、ＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡ）又は他の遺伝子産物であってもよい。例えば、リポタンパク質エステラーゼ、アポリポタンパク質、サイトカイン、インターロイキン又はインターフェロンであってもよいが、これらに限定されない。ベクター変換及び発現を評価するレポータータンパク質、例えば、蛍光タンパク質（緑色蛍光タンパク質ＧＦＰ、赤色蛍光タンパク質ＲＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β－ガラクトシダーゼ、β－グルクロニダーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ或アルカリホスファターゼであってもよいが、これらに限定されない。
一方、本発明は、昆虫細胞での組換えアデノ随伴ウイルスの製造における前記組換えアデノ随伴ウイルスベクターの使用をさらに提供される。このベクターを昆虫細胞に導入することにより、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３タンパク質が正確な化学量論比１：１：１０で発現され、これによって、パッケージングして組換えアデノ随伴ウイルスが産生され、パッケージング率が高い。既知のＡＡＶ血清型はほとんど（例えば、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８及びＡＡＶ９）極めて優れた感染性を有し、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２タンパク質の発現量は合理的な範囲内に制御されることで、昆虫細胞内でＡＡＶベクターを安定して大量で産生することができる。また、ｃａｐ遺伝子発現カセットを含む組換えアデノ随伴ウイルスベクターは、インビトロでのＡＡＶカプシドの調製に適用できる。
一方、本発明は、昆虫細胞をさらに提供する。この昆虫細胞は、ＡＡＶのｃａｐ遺伝子及び／又はｒｅｐ遺伝子の発現カセットを含み、外来遺伝子の発現カセットをさらに含んでもよい。これらの発現カセットのうちの少なくとも１種は、宿主昆虫細胞のゲノムに組み込んで安定的に発現することができ、昆虫細胞にこれらの発現カセットを含む核酸を瞬時に運んでもよい。
いくつかの実施例において、前記昆虫細胞は、任意の昆虫細胞であってもよく、例えば、ツマジロクサヨトウ細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ ｃｅｌｌ）、イラクサギンウワバ細胞、キイロショウジョウバエ細胞又は蚊細胞であってもよいが、これらに限定されない。好ましくは、ツマジロクサヨトウ細胞ｓｆ９である。
一方、本発明は、前記昆虫細胞及び培地を含む細胞培養物をさらに提供する。
いくつかの実施例において、前記培地は、ＡＡＶゲノムを含む。
いくつかの実施例において、前記培地は、ＡＡＶゲノムを含む。
一方、本発明は、組換えアデノ随伴ウイルス粒子を産生可能な条件下で前記昆虫細胞を培養し、回収することにより製造される組換えアデノ随伴ウイルス粒子をさらに提供する。
以下、具体的な実施例により上記の技術的手段を詳しく説明する。
実施例１：ＡＡＶ血清９型ｃａｐ遺伝子発現カセットを含む組換えバキュロウイルスベクターの構築
（１）ｃａｐ遺伝子発現カセットＩの構築
図２に示すように、このｃａｐ遺伝子発現カセットＩは、５'から３'まで順にｐ１０プロモーターと、イントロンと、Ｔ２Ａペプチドをコードするヌクレオチド配列と、ＶＰ１タンパク質翻訳開始コドンＡＴＧのみが欠失したＡＡＶ血清９型ＶＰタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む。ｐ１０プロモーターのヌクレオチド配列は配列番号１に示される。ｃａｐ遺伝子発現カセットＩにおいて、本実施例では４種類のイントロンが提供され、そのヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号２から配列番号５に示される。これらのイントロンのいずれにも翻訳開始コドンＡＴＧが含まれる。Ｔ２Ａペプチドをコードするヌクレオチド配列は配列番号６に示される。ＡＡＶ血清９型ＶＰタンパク質をコードするヌクレオチド配列は配列番号７に示され、そのアミノ端には、コード配列内に存在する可能性がある切断部位を除去するために少なくとも１つのヌクレオチドの変異が存在する。前記配列を人工的に直接合成し、又は重複伸長ＰＣＲ法により増幅して結合することにより、それぞれ構築物９Ｋ－１、９Ｋ－２、９Ｋ－３及び９Ｋ－４を得た。それらのヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号８から１１に示される。
（１）ｃａｐ遺伝子発現カセットＩの構築
図２に示すように、このｃａｐ遺伝子発現カセットＩは、５'から３'まで順にｐ１０プロモーターと、イントロンと、Ｔ２Ａペプチドをコードするヌクレオチド配列と、ＶＰ１タンパク質翻訳開始コドンＡＴＧのみが欠失したＡＡＶ血清９型ＶＰタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む。ｐ１０プロモーターのヌクレオチド配列は配列番号１に示される。ｃａｐ遺伝子発現カセットＩにおいて、本実施例では４種類のイントロンが提供され、そのヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号２から配列番号５に示される。これらのイントロンのいずれにも翻訳開始コドンＡＴＧが含まれる。Ｔ２Ａペプチドをコードするヌクレオチド配列は配列番号６に示される。ＡＡＶ血清９型ＶＰタンパク質をコードするヌクレオチド配列は配列番号７に示され、そのアミノ端には、コード配列内に存在する可能性がある切断部位を除去するために少なくとも１つのヌクレオチドの変異が存在する。前記配列を人工的に直接合成し、又は重複伸長ＰＣＲ法により増幅して結合することにより、それぞれ構築物９Ｋ－１、９Ｋ－２、９Ｋ－３及び９Ｋ－４を得た。それらのヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号８から１１に示される。
（２）組換えバキュロウイルスベクターの構築
前記構築物９Ｋ－１をｐＦａｓｔＢａｃベクターにクローニングし、転移プラスミドを調製した。前記プラスミドをそれぞれＤＨ１０Ｂａｃ菌株に形質転換し、Ｔｎ７転位により組換えバキュロウイルスベクターＡｃ１を得た。同様に、９Ｋ－２を含む組換えバキュロウイルスベクターＡｃ２、９Ｋ－３を含む組換えバキュロウイルスベクターＡｃ３、及び９Ｋ－４を含む組換えバキュロウイルスベクターＡｃ４を得た。
前記構築物９Ｋ－１をｐＦａｓｔＢａｃベクターにクローニングし、転移プラスミドを調製した。前記プラスミドをそれぞれＤＨ１０Ｂａｃ菌株に形質転換し、Ｔｎ７転位により組換えバキュロウイルスベクターＡｃ１を得た。同様に、９Ｋ－２を含む組換えバキュロウイルスベクターＡｃ２、９Ｋ－３を含む組換えバキュロウイルスベクターＡｃ３、及び９Ｋ－４を含む組換えバキュロウイルスベクターＡｃ４を得た。
実施例２：ＡＡＶ血清２型ｒｅｐ遺伝子発現カセットＩを含む組換えバキュロウイルスベクターの構築
（１）ｒｅｐ遺伝子発現カセットＩの構築
図５に示すように、このｒｅｐ遺伝子発現カセットＩは、５'から３'まで順にｐｏｌｈプロモーターと、イントロンと、Ｔ２Ａペプチドをコードするヌクレオチド配列と、Ｒｅｐ７８タンパク質翻訳開始コドンＡＴＧのみが欠失したＡＡＶ血清２型Ｒｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む。ｐｏｌｈプロモーターのヌクレオチド配列は配列番号１２に示される。本実施例のｒｅｐ遺伝子発現カセットにおけるイントロンのヌクレオチド配列は配列番号５に示され、このイントロンには翻訳開始コドンＡＴＧが含まれる。Ｔ２Ａペプチドをコードするヌクレオチド配列は配列番号６に示される。ＡＡＶ血清２型Ｒｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列は配列番号１３に示され、そのＲｅｐ７８翻訳開始コドンとＲｅｐ５２翻訳開始コドンとの間には、この領域に存在する可能性がある翻訳開始部位を除去するために複数のヌクレオチドの変異が存在する。前記配列を人工的に直接合成し、又は重複伸長ＰＣＲ法により増幅して結合することにより、それぞれ構築物２Ｒ－１を得た。それらのヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号１４に示される。
（１）ｒｅｐ遺伝子発現カセットＩの構築
図５に示すように、このｒｅｐ遺伝子発現カセットＩは、５'から３'まで順にｐｏｌｈプロモーターと、イントロンと、Ｔ２Ａペプチドをコードするヌクレオチド配列と、Ｒｅｐ７８タンパク質翻訳開始コドンＡＴＧのみが欠失したＡＡＶ血清２型Ｒｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む。ｐｏｌｈプロモーターのヌクレオチド配列は配列番号１２に示される。本実施例のｒｅｐ遺伝子発現カセットにおけるイントロンのヌクレオチド配列は配列番号５に示され、このイントロンには翻訳開始コドンＡＴＧが含まれる。Ｔ２Ａペプチドをコードするヌクレオチド配列は配列番号６に示される。ＡＡＶ血清２型Ｒｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列は配列番号１３に示され、そのＲｅｐ７８翻訳開始コドンとＲｅｐ５２翻訳開始コドンとの間には、この領域に存在する可能性がある翻訳開始部位を除去するために複数のヌクレオチドの変異が存在する。前記配列を人工的に直接合成し、又は重複伸長ＰＣＲ法により増幅して結合することにより、それぞれ構築物２Ｒ－１を得た。それらのヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号１４に示される。
（２）組換えバキュロウイルスベクターの構築
実施例１のステップ（２）と同様に、２Ｒ－１を含む組換えバキュロウイルスベクターＡｃ５を製造した。
実施例１のステップ（２）と同様に、２Ｒ－１を含む組換えバキュロウイルスベクターＡｃ５を製造した。
実施例３：ＡＡＶ血清９型ｃａｐ遺伝子発現カセットＩＩを含む組換えバキュロウイルスベクターの構築
（１）ｃａｐ遺伝子発現カセットＩＩの構築
図３に示すように、このｃａｐ遺伝子発現カセットＩＩは、５'から３'まで順にｐ１０プロモーターと、人工的に構築した配列と、ＶＰ１タンパク質翻訳開始コドンＡＴＧのみが欠失したＡＡＶ血清９型ＶＰタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む。ｐ１０プロモーターのヌクレオチド配列は配列番号１に示される。ｃａｐ遺伝子発現カセットＩＩにおいて、本実施例では２種類の人工的に構築した配列が提供され、そのヌクレオチド配列はそれぞれ配列番号１５及び配列番号１６に示され、これらの人工的に構築した配列のいずれにも翻訳開始コドンＡＴＧが含まれ、また２つのイントロンスプライス部位が含まれる。ＡＡＶ血清９型ＶＰタンパク質をコードするヌクレオチド配列は配列番号７に示され、そのアミノ端には、コード配列内に存在する可能性がある切断部位を除去するために少なくとも１つのヌクレオチドの変異が存在する。前記配列を人工的に直接合成し、又は重複伸長ＰＣＲ法により増幅して結合することにより、それぞれ構築物９Ｋ－５及び９Ｋ－６を得た。それらのヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号１７及び１８に示される。
（１）ｃａｐ遺伝子発現カセットＩＩの構築
図３に示すように、このｃａｐ遺伝子発現カセットＩＩは、５'から３'まで順にｐ１０プロモーターと、人工的に構築した配列と、ＶＰ１タンパク質翻訳開始コドンＡＴＧのみが欠失したＡＡＶ血清９型ＶＰタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む。ｐ１０プロモーターのヌクレオチド配列は配列番号１に示される。ｃａｐ遺伝子発現カセットＩＩにおいて、本実施例では２種類の人工的に構築した配列が提供され、そのヌクレオチド配列はそれぞれ配列番号１５及び配列番号１６に示され、これらの人工的に構築した配列のいずれにも翻訳開始コドンＡＴＧが含まれ、また２つのイントロンスプライス部位が含まれる。ＡＡＶ血清９型ＶＰタンパク質をコードするヌクレオチド配列は配列番号７に示され、そのアミノ端には、コード配列内に存在する可能性がある切断部位を除去するために少なくとも１つのヌクレオチドの変異が存在する。前記配列を人工的に直接合成し、又は重複伸長ＰＣＲ法により増幅して結合することにより、それぞれ構築物９Ｋ－５及び９Ｋ－６を得た。それらのヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号１７及び１８に示される。
（２）組換えバキュロウイルスベクターの構築
実施例１のステップ（２）と同様に、それぞれ９Ｋ－５を含む組換えバキュロウイルスベクターＡｃ６及び９Ｋ－６を含む組換えバキュロウイルスベクターＡｃ７を製造した。
実施例１のステップ（２）と同様に、それぞれ９Ｋ－５を含む組換えバキュロウイルスベクターＡｃ６及び９Ｋ－６を含む組換えバキュロウイルスベクターＡｃ７を製造した。
実施例４：ＡＡＶ血清２型ｒｅｐ遺伝子発現カセットＩＩを含む組換えバキュロウイルスベクターの構築
（１）ｒｅｐ遺伝子発現カセットＩＩの構築
図６に示すように、このｒｅｐ遺伝子発現カセットＩＩは、５'から３'まで順にｐｏｌｈプロモーターと、人工的に構築した配列と、Ｒｅｐ７８タンパク質翻訳開始コドンＡＴＧのみが欠失したＡＡＶ血清２型Ｒｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む。ｐｏｌｈプロモーターのヌクレオチド配列は配列番号１２に示される。本実施例のｒｅｐ遺伝子発現カセットＩＩにおける人工的に構築した配列のヌクレオチド配列は配列番号１６に示される。この人工的に構築した配列には翻訳開始コドンＡＴＧが含まれ、また、２つのイントロンスプライス部位が含まれる。ＡＡＶ血清２型Ｒｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列は配列番号１３に示され、Ｒｅｐ７８翻訳開始コドンとＲｅｐ５２翻訳開始コドンとの間に、この領域に存在する可能性がある翻訳開始部位を除去するために複数のヌクレオチドの変異が存在する。前記配列を人工的に直接合成し、又は重複伸長ＰＣＲ法により増幅して結合することにより、構築物２Ｒ－２を得た。そのヌクレオチド配列は、配列番号１９に示される。
（１）ｒｅｐ遺伝子発現カセットＩＩの構築
図６に示すように、このｒｅｐ遺伝子発現カセットＩＩは、５'から３'まで順にｐｏｌｈプロモーターと、人工的に構築した配列と、Ｒｅｐ７８タンパク質翻訳開始コドンＡＴＧのみが欠失したＡＡＶ血清２型Ｒｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む。ｐｏｌｈプロモーターのヌクレオチド配列は配列番号１２に示される。本実施例のｒｅｐ遺伝子発現カセットＩＩにおける人工的に構築した配列のヌクレオチド配列は配列番号１６に示される。この人工的に構築した配列には翻訳開始コドンＡＴＧが含まれ、また、２つのイントロンスプライス部位が含まれる。ＡＡＶ血清２型Ｒｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列は配列番号１３に示され、Ｒｅｐ７８翻訳開始コドンとＲｅｐ５２翻訳開始コドンとの間に、この領域に存在する可能性がある翻訳開始部位を除去するために複数のヌクレオチドの変異が存在する。前記配列を人工的に直接合成し、又は重複伸長ＰＣＲ法により増幅して結合することにより、構築物２Ｒ－２を得た。そのヌクレオチド配列は、配列番号１９に示される。
（２）組換えバキュロウイルスベクターの構築
実施例１のステップ（２）と同様に製造して２Ｒ－２を含む組換えバキュロウイルスベクターＡｃ８を得た。
実施例１のステップ（２）と同様に製造して２Ｒ－２を含む組換えバキュロウイルスベクターＡｃ８を得た。
実施例５：ＡＡＶ血清９型ｃａｐ遺伝子発現カセットＩＩＩを含む組換えバキュロウイルスベクターの構築
（１）ｃａｐ遺伝子発現カセットＩＩＩの構築
図４に示すように、このｃａｐ遺伝子発現カセットＩＩＩは、５'から３'まで順にｐ１０プロモーターと、アデニンヌクレオチド（Ａ）と、イントロンと、チミンヌクレオチド（Ｔ）と、グアニンヌクレオチド（Ｇ）と、ＶＰ１タンパク質翻訳開始コドンＡＴＧのみが欠失したＡＡＶ血清９型ＶＰタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む。ｐ１０プロモーターのヌクレオチド配列は、配列番号１に示される。ｃａｐ遺伝子発現カセットＩＩＩにおいて、本実施例では２種類のイントロンが提供され、そのヌクレオチド配列はそれぞれ配列番号２０及び配列番号２１に示される。ＡＡＶ血清９型ＶＰタンパク質をコードするヌクレオチド配列は配列番号７に示され、そのアミノ端には、コード配列内に存在する可能性がある切断部位を除去するために少なくとも１つのヌクレオチドの変異が存在する。前記配列を人工的に直接合成し、又は重複伸長ＰＣＲ法により増幅して結合することにより、それぞれ構築物９Ｋ－７及び９Ｋ－８を得た。それらのヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号２２及び２３に示される。
（１）ｃａｐ遺伝子発現カセットＩＩＩの構築
図４に示すように、このｃａｐ遺伝子発現カセットＩＩＩは、５'から３'まで順にｐ１０プロモーターと、アデニンヌクレオチド（Ａ）と、イントロンと、チミンヌクレオチド（Ｔ）と、グアニンヌクレオチド（Ｇ）と、ＶＰ１タンパク質翻訳開始コドンＡＴＧのみが欠失したＡＡＶ血清９型ＶＰタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む。ｐ１０プロモーターのヌクレオチド配列は、配列番号１に示される。ｃａｐ遺伝子発現カセットＩＩＩにおいて、本実施例では２種類のイントロンが提供され、そのヌクレオチド配列はそれぞれ配列番号２０及び配列番号２１に示される。ＡＡＶ血清９型ＶＰタンパク質をコードするヌクレオチド配列は配列番号７に示され、そのアミノ端には、コード配列内に存在する可能性がある切断部位を除去するために少なくとも１つのヌクレオチドの変異が存在する。前記配列を人工的に直接合成し、又は重複伸長ＰＣＲ法により増幅して結合することにより、それぞれ構築物９Ｋ－７及び９Ｋ－８を得た。それらのヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号２２及び２３に示される。
（２）組換えバキュロウイルスベクターの構築
実施例１のステップ（２）と同様に、それぞれ９Ｋ－７を含む組換えバキュロウイルスベクターＡｃ９及び９Ｋ－８を含む組換えバキュロウイルスベクターＡｃ１０を製造した。
実施例１のステップ（２）と同様に、それぞれ９Ｋ－７を含む組換えバキュロウイルスベクターＡｃ９及び９Ｋ－８を含む組換えバキュロウイルスベクターＡｃ１０を製造した。
実施例６：ＡＡＶ血清２型ｒｅｐ遺伝子発現カセットＩＩＩを含む組換えバキュロウイルスベクターの構築
（１）ｒｅｐ遺伝子発現カセットＩＩＩの構築
図７に示すように、このｒｅｐ遺伝子発現カセットＩＩＩは、５'から３'まで順にｐｏｌｈプロモーターと、Ａと、イントロンと、ＴＧと、Ｒｅｐ７８タンパク質翻訳開始コドンＡＴＧのみが欠失したＡＡＶ血清２型Ｒｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む。ｐｏｌｈプロモーターのヌクレオチド配列は配列番号１２に示される。本実施例のｒｅｐ遺伝子発現カセットＩＩＩにおけるイントロンのヌクレオチド配列は配列番号２１に示される。ＡＡＶ血清２型Ｒｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列は配列番号１３に示され、Ｒｅｐ７８翻訳開始コドンとＲｅｐ５２翻訳開始コドンとの間には、この領域に存在する可能性がある翻訳開始部位を除去するために複数のヌクレオチドの変異が存在する。前記配列を人工的に直接合成し、又は重複伸長ＰＣＲ法により増幅して結合することにより、構築物２Ｒ－３を得た。そのヌクレオチド配列は、配列番号２４に示される。
（１）ｒｅｐ遺伝子発現カセットＩＩＩの構築
図７に示すように、このｒｅｐ遺伝子発現カセットＩＩＩは、５'から３'まで順にｐｏｌｈプロモーターと、Ａと、イントロンと、ＴＧと、Ｒｅｐ７８タンパク質翻訳開始コドンＡＴＧのみが欠失したＡＡＶ血清２型Ｒｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む。ｐｏｌｈプロモーターのヌクレオチド配列は配列番号１２に示される。本実施例のｒｅｐ遺伝子発現カセットＩＩＩにおけるイントロンのヌクレオチド配列は配列番号２１に示される。ＡＡＶ血清２型Ｒｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列は配列番号１３に示され、Ｒｅｐ７８翻訳開始コドンとＲｅｐ５２翻訳開始コドンとの間には、この領域に存在する可能性がある翻訳開始部位を除去するために複数のヌクレオチドの変異が存在する。前記配列を人工的に直接合成し、又は重複伸長ＰＣＲ法により増幅して結合することにより、構築物２Ｒ－３を得た。そのヌクレオチド配列は、配列番号２４に示される。
（２）組換えバキュロウイルスベクターの構築
実施例１のステップ（２）と同様に、２Ｒ－３を含む組換えバキュロウイルスベクターＡｃ１１を製造した。
実施例１のステップ（２）と同様に、２Ｒ－３を含む組換えバキュロウイルスベクターＡｃ１１を製造した。
比較例：組換えバキュロウイルスベクターＡｃ０及びｒｅｐ遺伝子発現カセットの構築
（１）ｃａｐ遺伝子発現カセットの構築
本比較例では、Ｕｒａｂｅら（Ｕｒａｂｅら、２００２，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，１３：１９３５－１９４３）の方法に従ってｃａｐ遺伝子発現カセットを構築した。このｃａｐ遺伝子発現カセットのプロモーターとして、ｐ１０プロモーターを使用し、発現カセットにおけるｃａｐ遺伝子はＡＡＶ血清９型ＶＰタンパク質をコードし、コード配列におけるＶＰ１の翻訳開始コドンＡＴＧを準最適コドンＡＣＧに変異させた。このｃａｐ遺伝子発現カセットは、番号が９Ｋ－０であり、そのヌクレオチド配列が配列番号２５に示される。
（１）ｃａｐ遺伝子発現カセットの構築
本比較例では、Ｕｒａｂｅら（Ｕｒａｂｅら、２００２，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，１３：１９３５－１９４３）の方法に従ってｃａｐ遺伝子発現カセットを構築した。このｃａｐ遺伝子発現カセットのプロモーターとして、ｐ１０プロモーターを使用し、発現カセットにおけるｃａｐ遺伝子はＡＡＶ血清９型ＶＰタンパク質をコードし、コード配列におけるＶＰ１の翻訳開始コドンＡＴＧを準最適コドンＡＣＧに変異させた。このｃａｐ遺伝子発現カセットは、番号が９Ｋ－０であり、そのヌクレオチド配列が配列番号２５に示される。
（２）組換えバキュロウイルスベクターの構築
実施例１のステップ（２）と同様に９Ｋ－０を含む組換えバキュロウイルスベクターＡｃ０を製造した。
実施例１のステップ（２）と同様に９Ｋ－０を含む組換えバキュロウイルスベクターＡｃ０を製造した。
（３）ｒｅｐ遺伝子発現カセットの構築
中国特許ＣＮ１０３８４９６２９Ａの方法に従ってｒｅｐ遺伝子発現カセットを構築し、このｒｅｐ遺伝子発現カセットのプロモーターとしてｐｏｌｈプロモーターを使用し、発現カセットにおけるｒｅｐ遺伝子は、ＡＡＶ血清２型Ｒｅｐタンパク質をコードし、ＡＡＶ Ｒｅｐ７８タンパク質のオリジナルの翻訳開始コドンＡＴＧをＡＣＧに置換した。このｒｅｐ遺伝子発現カセットの番号は２Ｒ－０である。
中国特許ＣＮ１０３８４９６２９Ａの方法に従ってｒｅｐ遺伝子発現カセットを構築し、このｒｅｐ遺伝子発現カセットのプロモーターとしてｐｏｌｈプロモーターを使用し、発現カセットにおけるｒｅｐ遺伝子は、ＡＡＶ血清２型Ｒｅｐタンパク質をコードし、ＡＡＶ Ｒｅｐ７８タンパク質のオリジナルの翻訳開始コドンＡＴＧをＡＣＧに置換した。このｒｅｐ遺伝子発現カセットの番号は２Ｒ－０である。
実施例７：ＶＰタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３）及びＲｅｐタンパク質（Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ５２）の発現状況の検出
実施例１－６及び比較例で製造された組換えバキュロウイルスベクターＡｃ０、Ａｃ１、Ａｃ２、Ａｃ３、Ａｃ４、Ａｃ５、Ａｃ６、Ａｃ７、Ａｃ８、Ａｃ９、Ａｃ１０及びＡｃ１１をそれぞれ宿主細胞系にトランスフェクションして培養することで組換えバキュロウイルスを得た。ＶＰタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３）及びＲｅｐタンパク質（Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ５２）の発現を検出した。具体的な操作手順は以下の通りである。
前記組換えバキュロウイルスベクターＤＮＡを抽出してＳｆ９昆虫細胞にトランスフェクションし、組換えバキュロウイルスＢＥＶを調製した。トランスフェクション後のＳｆ９昆虫細胞は、ＢＥＶを成功に産生した。大量に複製増殖したＢＥＶは、さらに感染することでＳｆ９細胞に顕著な細胞変性効果（ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ ｅｆｆｅｃｔ，ＣＰＥ）が発生した。ＣＰＥが発生したＳｆ９細胞の培養上清を収集した。培養上清に大量のＢＥＶ（０世代目ＢＥＶ（Ｐ０））が含まれる。また、大量のｒＡＡＶを含むＳｆ９細胞を収集した。調製されたＢＥＶ－Ｐ０を感染多重度（ＭＯＩ＝１）で浮遊培養されたＳｆ９細胞に感染させ、感染の７２時間後に、細胞活性は５０％以下に低下した。細胞培養液を１０００ｇで５ｍｉｎ遠心分離し、培養上清及び細胞沈殿をそれぞれ収集し、上清を１世代目ＢＥＶ－Ｐ１として標識した。引き続き拡大培養し、調製されたＢＥＶ－Ｐ１を感染多重度（ＭＯＩ＝１）で浮遊培養されたＳｆ９細胞に感染させ、感染の７２時間後に、細胞活性は５０％以下にて低下した。細胞培養液を１０００ｇで５ｍｉｎ遠心分離し、細胞沈殿を収集してＷｅｓｔｅｒｎ ＢｌｏｔによりＶＰタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３）及びＲｅｐタンパク質（Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ５２）の発現状況を検出した。
実施例１－６及び比較例で製造された組換えバキュロウイルスベクターＡｃ０、Ａｃ１、Ａｃ２、Ａｃ３、Ａｃ４、Ａｃ５、Ａｃ６、Ａｃ７、Ａｃ８、Ａｃ９、Ａｃ１０及びＡｃ１１をそれぞれ宿主細胞系にトランスフェクションして培養することで組換えバキュロウイルスを得た。ＶＰタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３）及びＲｅｐタンパク質（Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ５２）の発現を検出した。具体的な操作手順は以下の通りである。
前記組換えバキュロウイルスベクターＤＮＡを抽出してＳｆ９昆虫細胞にトランスフェクションし、組換えバキュロウイルスＢＥＶを調製した。トランスフェクション後のＳｆ９昆虫細胞は、ＢＥＶを成功に産生した。大量に複製増殖したＢＥＶは、さらに感染することでＳｆ９細胞に顕著な細胞変性効果（ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ ｅｆｆｅｃｔ，ＣＰＥ）が発生した。ＣＰＥが発生したＳｆ９細胞の培養上清を収集した。培養上清に大量のＢＥＶ（０世代目ＢＥＶ（Ｐ０））が含まれる。また、大量のｒＡＡＶを含むＳｆ９細胞を収集した。調製されたＢＥＶ－Ｐ０を感染多重度（ＭＯＩ＝１）で浮遊培養されたＳｆ９細胞に感染させ、感染の７２時間後に、細胞活性は５０％以下に低下した。細胞培養液を１０００ｇで５ｍｉｎ遠心分離し、培養上清及び細胞沈殿をそれぞれ収集し、上清を１世代目ＢＥＶ－Ｐ１として標識した。引き続き拡大培養し、調製されたＢＥＶ－Ｐ１を感染多重度（ＭＯＩ＝１）で浮遊培養されたＳｆ９細胞に感染させ、感染の７２時間後に、細胞活性は５０％以下にて低下した。細胞培養液を１０００ｇで５ｍｉｎ遠心分離し、細胞沈殿を収集してＷｅｓｔｅｒｎ ＢｌｏｔによりＶＰタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３）及びＲｅｐタンパク質（Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ５２）の発現状況を検出した。
図８は、ｃａｐ遺伝子発現カセットＩを含む組換えバキュロウイルスベクターＡｃ１、Ａｃ２、Ａｃ３、Ａｃ４及び対照組換えバキュロウイルスベクターＡｃ０のＶＰタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３）のＷｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ検出図である。同図から分かるように、上記の組換えバキュロウイルスベクターは、いずれも適切な比率でＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３を産生することができる。Ａｃ４は、Ａｃ１－Ａｃ３と比較してＶＰ１の産生がより高い。ＶＰ１の高い取り込みは、より高い感染活性を引き起こす可能性がある。より高いＶＰ１産生の原因は、Ａｃ４に含まれるイントロンが他のベクターよりも低いスプライシング活性を有するためである。
図９は、ｒｅｐ遺伝子発現カセットIを含む組換えバキュロウイルスベクターＡｃ５のＲｅｐタンパク質（Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２）のＷｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ検出図である。同図から分かるように、組換えバキュロウイルスベクターＡｃ５は、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２タンパク質を産生することができ、Ｒｅｐ７８タンパク質の発現量は、Ｒｅｐ５２タンパク質よりも低い。
図１０は、ｃａｐ遺伝子発現カセットＩＩを含む組換えバキュロウイルスベクターＡｃ６、Ａｃ７及び対照組換えバキュロウイルスベクターＡｃ０のＶＰタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３）のＷｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ検出図である。同図から分かるように、Ａｃ０、Ａｃ６及びＡｃ７はいずれも適切な比率でＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３を産生することができる。Ａｃ７は、Ａｃ６と比較してＶＰ１の生産がより高い。ＶＰ１の高い取り込みは、より高い感染活性を引き起こす可能性がある。より高いＶＰ１産生の原因は、Ａｃ７に含まれる第２イントロンスプライスドナー及びイントロンスプライスアクセプターの選択的スプライシング活性がより高いためである。
図１１は、ｒｅｐ遺伝子発現カセットＩＩを含む組換えバキュロウイルスベクターＡｃ８のＲｅｐタンパク質（Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２）のＷｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ検出図である。同図から分かるように、組換えバキュロウイルスベクターＡｃ８は、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２タンパク質を産生することができる。
図１２は、ｃａｐ遺伝子発現カセットＩＩＩを含む組換えバキュロウイルスベクターＡｃ９、Ａｃ１０及び対照組換えバキュロＡｃ０のＶＰタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３）のＷｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ検出図である。同図から分かるように、Ａｃ０及びＡｃ９、Ａｃ１０は、いずれも適切な比率でＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３を産生することができる。Ａｃ１０は、Ａｃ９と比較してＶＰ１産生がより高い。ＶＰ１の高い取り込みは、より高い感染活性を引き起こす可能性がある。より高いＶＰ１産生の原因は、Ａｃ１０に含まれるイントロンのスプライシング活性がＡｃ９よりも高いためである。
図１３は、ｒｅｐ遺伝子発現カセットＩＩＩを含む組換えバキュロウイルスベクターＡｃ１１のＲｅｐタンパク質（Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２）のＷｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ検出図である。同図から分かるように、組換えバキュロウイルスベクターＡｃ１１は、適切なＲｅｐ７８及びＲｅｐ５２タンパク質を産生することができる。
実施例８：昆虫細胞内でＡＡＶウイルスを生産するための組換えＡＡＶバクミドの構築
本実施例では、昆虫細胞内でＡＡＶウイルスを生産するための組換えＡＡＶバクミドの構築方法は、本社の特許ＣＮ１１２５５３２５７Ａに記載の実施例１に従う。手順は以下の通りである。
（１）ＡＡＶ必須機能エレメントｃａｐ及びｒｅｐ遺伝子発現カセットを含む相同組換えベクターを構築し、次にＲｅｄ相同組換えにより大腸菌においてこの相同組換えベクターにおける必須機能エレメントをバキュロウイルスゲノムにおける必須遺伝子Ａｃ１３５（１１６４９２．．．１１７３９１）のＣ末端に挿入し、ｃａｐ及びｒｅｐ遺伝子発現カセットを含む組換えバキュロウイルスベクター（番号：Ｂａｃ－Ｃａｐ－Ｒｅｐ）を得た。
（２）ＩＴＲコアエレメント（ＩＴＲ－ＧＯＩ）を含むシャトルベクターの構築
ＩＴＲコアエレメントの番号はＩ－Ｇ－１であり、そのヌクレオチド配列は、配列番号２６に示される。本実施例において、ＩＴＲコアエレメントにおけるＧＯＩとして、赤色蛍光タンパク質ｍｃｈｅｒｒｙ遺伝子発現カセットを使用し、即ち、ｍｉｎｉＥｆ１ａプロモーターによりｍｃｈｅｒｒｙ発現を制御し、これによってｒＡＡＶの活性検出に便利である。ＩＴＲ及び赤色蛍光タンパク質発現カセットをシャトルベクターｐＦａｓｔＤｕａｌ上に構築した。
（３）前記ステップ（２）で構築されたシャトルベクターを用いてＢａｃ－Ｃａｐ－Ｒｅｐ組換えバクミドを含むコンピテントセルを形質転換し、Ｔｎ７組換えによりＩＴＲ－ＧＯＩをＢａｃ－Ｃａｐ－Ｒｅｐ組換えバクミドにおけるＴｎ７部位に挿入し、最終的にｒＡＡＶの生産に必要な機能タンパク質成分及びＩＴＲコアエレメントを含む組換えバキュロウイルスゲノムの組換えバクミド（番号：Ｂａｃ－Ｃａｐ－Ｒｅｐ－ＩＴＲ－ＧＯＩ）を得た。
本実施例で構築された異なる９種類の組換えＡＡＶバクミドは、いずれもｃａｐ遺伝子発現カセット、ｒｅｐ遺伝子発現カセット及びＩＴＲコアエレメントを含む。詳細を表１に示す。
本実施例では、昆虫細胞内でＡＡＶウイルスを生産するための組換えＡＡＶバクミドの構築方法は、本社の特許ＣＮ１１２５５３２５７Ａに記載の実施例１に従う。手順は以下の通りである。
（１）ＡＡＶ必須機能エレメントｃａｐ及びｒｅｐ遺伝子発現カセットを含む相同組換えベクターを構築し、次にＲｅｄ相同組換えにより大腸菌においてこの相同組換えベクターにおける必須機能エレメントをバキュロウイルスゲノムにおける必須遺伝子Ａｃ１３５（１１６４９２．．．１１７３９１）のＣ末端に挿入し、ｃａｐ及びｒｅｐ遺伝子発現カセットを含む組換えバキュロウイルスベクター（番号：Ｂａｃ－Ｃａｐ－Ｒｅｐ）を得た。
（２）ＩＴＲコアエレメント（ＩＴＲ－ＧＯＩ）を含むシャトルベクターの構築
ＩＴＲコアエレメントの番号はＩ－Ｇ－１であり、そのヌクレオチド配列は、配列番号２６に示される。本実施例において、ＩＴＲコアエレメントにおけるＧＯＩとして、赤色蛍光タンパク質ｍｃｈｅｒｒｙ遺伝子発現カセットを使用し、即ち、ｍｉｎｉＥｆ１ａプロモーターによりｍｃｈｅｒｒｙ発現を制御し、これによってｒＡＡＶの活性検出に便利である。ＩＴＲ及び赤色蛍光タンパク質発現カセットをシャトルベクターｐＦａｓｔＤｕａｌ上に構築した。
（３）前記ステップ（２）で構築されたシャトルベクターを用いてＢａｃ－Ｃａｐ－Ｒｅｐ組換えバクミドを含むコンピテントセルを形質転換し、Ｔｎ７組換えによりＩＴＲ－ＧＯＩをＢａｃ－Ｃａｐ－Ｒｅｐ組換えバクミドにおけるＴｎ７部位に挿入し、最終的にｒＡＡＶの生産に必要な機能タンパク質成分及びＩＴＲコアエレメントを含む組換えバキュロウイルスゲノムの組換えバクミド（番号：Ｂａｃ－Ｃａｐ－Ｒｅｐ－ＩＴＲ－ＧＯＩ）を得た。
本実施例で構築された異なる９種類の組換えＡＡＶバクミドは、いずれもｃａｐ遺伝子発現カセット、ｒｅｐ遺伝子発現カセット及びＩＴＲコアエレメントを含む。詳細を表１に示す。
実施例９：ＡＡＶ組換えバキュロウイルスの調製
実施例４で調製された組換えＡＡＶバクミドＣＲＩ－０、ＣＲＩ－１、ＣＲＩ－２、ＣＲＩ－３、ＣＲＩ－４、ＣＲＩ－５、ＣＲＩ－６、ＣＲＩ－７及びＣＲＩ－８をそれぞれ宿主細胞系にトランスフェクションして培養し、ＡＡＶ組換えバキュロウイルスを得た。
前記組換えバクミドＤＮＡを抽出し、Ｓｆ９昆虫細胞にトランスフェクションし、組換えバキュロウイルスＢＥＶ及びｒＡＡＶを調製した。トランスフェクション後のＳｆ９昆虫細胞は、ＢＥＶを成功に産生した。大量に複製増殖したＢＥＶのさらなる感染によりＳｆ９細胞に顕著な細胞変性効果（ＣＰＥ）が発生した。ＣＰＥが発生したＳｆ９細胞の培養上清を収集し、そこに大量のＢＥＶ（即ち、０世代目ＢＥＶ（Ｐ０））が含まれる。また、大量のｒＡＡＶを含むＳｆ９細胞を収集した。調製されたＢＥＶ－Ｐ０を感染多重度（ＭＯＩ＝１）で浮遊培養されたＳｆ９細胞に感染させ、感染の７２時間後に、細胞活性は５０％以下に低下した。細胞培養液を１０００ｇで５ｍｉｎ遠心分離し、培養上清及び細胞沈殿をそれぞれ収集した。上清を１世代目ＢＥＶ－Ｐ１として標識し、細胞をＢＥＶ－Ｐ０でパッケージングしたｒＡＡＶとして標識した。
実施例４で調製された組換えＡＡＶバクミドＣＲＩ－０、ＣＲＩ－１、ＣＲＩ－２、ＣＲＩ－３、ＣＲＩ－４、ＣＲＩ－５、ＣＲＩ－６、ＣＲＩ－７及びＣＲＩ－８をそれぞれ宿主細胞系にトランスフェクションして培養し、ＡＡＶ組換えバキュロウイルスを得た。
前記組換えバクミドＤＮＡを抽出し、Ｓｆ９昆虫細胞にトランスフェクションし、組換えバキュロウイルスＢＥＶ及びｒＡＡＶを調製した。トランスフェクション後のＳｆ９昆虫細胞は、ＢＥＶを成功に産生した。大量に複製増殖したＢＥＶのさらなる感染によりＳｆ９細胞に顕著な細胞変性効果（ＣＰＥ）が発生した。ＣＰＥが発生したＳｆ９細胞の培養上清を収集し、そこに大量のＢＥＶ（即ち、０世代目ＢＥＶ（Ｐ０））が含まれる。また、大量のｒＡＡＶを含むＳｆ９細胞を収集した。調製されたＢＥＶ－Ｐ０を感染多重度（ＭＯＩ＝１）で浮遊培養されたＳｆ９細胞に感染させ、感染の７２時間後に、細胞活性は５０％以下に低下した。細胞培養液を１０００ｇで５ｍｉｎ遠心分離し、培養上清及び細胞沈殿をそれぞれ収集した。上清を１世代目ＢＥＶ－Ｐ１として標識し、細胞をＢＥＶ－Ｐ０でパッケージングしたｒＡＡＶとして標識した。
実施例１０：組換えＡＡＶウイルス粒子の精製及びそのパッケージング率、ウイルス力価の検出
実施例９の操作に従って、ＢＥＶ－Ｐ２の種ウイルスを用いて感染多重度（ＭＯＩ＝１）で浮遊培養されたＳｆ９細胞に感染させてｒＡＡＶのパッケージングを行い、パッケージング体積が３００ｍＬ－４００ｍＬとなるまで引き続き拡大培養した。感染した３日後、細胞活性を監視した結果、活性は５０％未満であった。遠心分離してそれぞれ細胞沈殿及び上清を得た。得られた細胞沈殿及び上清をそれぞれ精製し、細胞を３回繰り返して凍結融解して分解させて溶解させ、５０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離し、上清を収集し、上清にヌクレアーゼ（Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ）を加え、３７℃の水浴で６０ｍｉｎ処理した後、５０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離した。収集した細胞溶解液及び収集した上清をＰＥＧで沈殿させ、再懸濁させた後、イオジキサノールで密度勾配遠心分離により精製した（Ａｓｌａｎｉｄｉら，２００９，Ｐｒｏｃ．ＮａｔｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２０６：５０５９－５０６４）。最終的に精製した製品ウイルスを８０μＬ－１９０μＬのＰＢＳで再懸濁させ、精製した製品ウイルスを１０μＬ取り、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルにかけ、銀染色を行った。
実施例９の操作に従って、ＢＥＶ－Ｐ２の種ウイルスを用いて感染多重度（ＭＯＩ＝１）で浮遊培養されたＳｆ９細胞に感染させてｒＡＡＶのパッケージングを行い、パッケージング体積が３００ｍＬ－４００ｍＬとなるまで引き続き拡大培養した。感染した３日後、細胞活性を監視した結果、活性は５０％未満であった。遠心分離してそれぞれ細胞沈殿及び上清を得た。得られた細胞沈殿及び上清をそれぞれ精製し、細胞を３回繰り返して凍結融解して分解させて溶解させ、５０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離し、上清を収集し、上清にヌクレアーゼ（Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ）を加え、３７℃の水浴で６０ｍｉｎ処理した後、５０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離した。収集した細胞溶解液及び収集した上清をＰＥＧで沈殿させ、再懸濁させた後、イオジキサノールで密度勾配遠心分離により精製した（Ａｓｌａｎｉｄｉら，２００９，Ｐｒｏｃ．ＮａｔｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２０６：５０５９－５０６４）。最終的に精製した製品ウイルスを８０μＬ－１９０μＬのＰＢＳで再懸濁させ、精製した製品ウイルスを１０μＬ取り、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルにかけ、銀染色を行った。
図１４Ａ、１４Ｂ、１４Ｃは、組換えＡＡＶバクミドＣＲＩ－０、ＣＲＩ－１、ＣＲＩ－２、ＣＲＩ－３、ＣＲＩ－４、ＣＲＩ－５、ＣＲＩ－６、ＣＲＩ－７及びＣＲＩ－８を宿主細胞にトランスフェクションした後、精製した組換えＡＡＶウイルスをＳＤＳ－ＰＡＧＥ銀染色した検出図である。結果から分かるように、本発明で構築された組換えＡＡＶバクミドは、イントロンスプライシング調節作用により昆虫細胞内でのＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３タンパク質の適切な比率での発現が達成され、これによってウイルス粒子にパッケージングすることができる。ここで、ＣＲＩ－４、ＣＲＩ－６及びＣＲＩ－７のウイルス粒子は、それぞれＣＲＩ－３、ＣＲＩ－５及びＣＲＩ－８に対してより高いＶＰ１タンパク質の取り込み量を有する。この現象を引き起こす原因は、ＶＰ１タンパク質の発現量が比較的高いためである。ＶＰ１タンパク質の相対発現量は、イントロンのスプライシング効率に依存する。イントロンの配列を調整し、イントロンのスプライシング効率を変化させることにより、異なるＶＰ１取り込み量のウイルス粒子を得ることができる。
本実施例では、Ｑ－ＰＣＲにより得られたｒＡＡＶウイルスのパッケージング率を検出した。ｒＡＡＶパッケージング率の検出は、ＩＴＲ配列を標的とする１対のプライマー（Ｑ－ＩＴＲ－Ｆ： ＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴ及びＱ－ＩＴＲ－Ｒ：ＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡ）を用いて行った。ｒＡＡＶ感染力価の検出は、本社の特許ＣＮ１１２２８０８０１Ａに記載の検出方法により行った。具体的な操作方法は、同特許に記載のプラスミドによるＡＡＶ感染力価の検出方法をご参照されたい。検出結果を表２に示す。
表２及び図１５から分かるように、本発明で調製された組換えＡＡＶバクミドＣＲＩ－１からＣＲＩ－８を昆虫細胞にトランスフェクションすることによって、組換えバキュロウイルスにパッケージングすることができ、パッケージング率及びウイルスの感染力価は高かった。また、対照ｃａｐ遺伝子発現カセットを含む組換えＡＡＶバクミドＣＲＩ－０が生産したウイルス粒子に相当し、又は対照ＣＲＩ－０よりも高かった。ＣＲＩ－４、ＣＲＩ－６及びＣＲＩ－７は、それぞれＣＲＩ－３、ＣＲＩ－５及びＣＲＩ－８に対してより高いウイルス感染力価を有し、それらのＶＰ１取り込み量も比較的高かった。
実施例１１：異なるＡＡＶ血清型のイントロン調節作用の検証
上記のイントロン調節方式が異なるＡＡＶ血清型中において作用できることを検証した。実施例１の方法によりそれぞれＡＡＶ血清２型のｃａｐ遺伝子発現カセット２Ｋ－１、ＡＡＶ血清５型のｃａｐ遺伝子発現カセット５Ｋ－１及びＡＡＶ血清８型のｃａｐ遺伝子発現カセット８Ｋ－１を構築した。実施例３の方法によりそれぞれＡＡＶ血清２型のｃａｐ遺伝子発現カセット２Ｋ－２、ＡＡＶ血清５型のｃａｐ遺伝子発現カセット５Ｋ－２及びＡＡＶ血清８型のｃａｐ遺伝子発現カセット８Ｋ－２を構築した。実施例５の方法によりそれぞれＡＡＶ血清２型のｃａｐ遺伝子発現カセット２Ｋ－３、ＡＡＶ血清５型のｃａｐ遺伝子発現カセット５Ｋ－３及びＡＡＶ血清８型のｃａｐ遺伝子発現カセット８Ｋ－３を構築した。前記の構築物２Ｋ－１、２Ｋ－２、２Ｋ－３、５Ｋ－１、５Ｋ－２、５Ｋ－３、８Ｋ－１、８Ｋ－２及び８Ｋ－３のヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号２７から配列番号３５に示される。ＡＡＶ血清２型のＲｅｐタンパク質が様々な血清型ｒＡＡＶの調製に適用できるためであるため、本実施例では、ｒｅｐ遺伝子発現カセットとしてＡＡＶ血清２型を使用した。
上記のイントロン調節方式が異なるＡＡＶ血清型中において作用できることを検証した。実施例１の方法によりそれぞれＡＡＶ血清２型のｃａｐ遺伝子発現カセット２Ｋ－１、ＡＡＶ血清５型のｃａｐ遺伝子発現カセット５Ｋ－１及びＡＡＶ血清８型のｃａｐ遺伝子発現カセット８Ｋ－１を構築した。実施例３の方法によりそれぞれＡＡＶ血清２型のｃａｐ遺伝子発現カセット２Ｋ－２、ＡＡＶ血清５型のｃａｐ遺伝子発現カセット５Ｋ－２及びＡＡＶ血清８型のｃａｐ遺伝子発現カセット８Ｋ－２を構築した。実施例５の方法によりそれぞれＡＡＶ血清２型のｃａｐ遺伝子発現カセット２Ｋ－３、ＡＡＶ血清５型のｃａｐ遺伝子発現カセット５Ｋ－３及びＡＡＶ血清８型のｃａｐ遺伝子発現カセット８Ｋ－３を構築した。前記の構築物２Ｋ－１、２Ｋ－２、２Ｋ－３、５Ｋ－１、５Ｋ－２、５Ｋ－３、８Ｋ－１、８Ｋ－２及び８Ｋ－３のヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号２７から配列番号３５に示される。ＡＡＶ血清２型のＲｅｐタンパク質が様々な血清型ｒＡＡＶの調製に適用できるためであるため、本実施例では、ｒｅｐ遺伝子発現カセットとしてＡＡＶ血清２型を使用した。
本実施例では、実施例８を参照して９種類の異なる組換えＡＡＶバクミドを構築した。それらはいずれもｃａｐ遺伝子発現カセット、ｒｅｐ遺伝子発現カセット及びＩＴＲコアエレメントを含む。詳細を表３に示す。
本実施例では、実施例９及び実施例１０を参照して前記組換えＡＡＶバクミドを宿主細胞にトランスフェクションし、精製して得られた組換えＡＡＶウイルス粒子をＳＤＳ－ＰＡＧＥ銀染色により検出した。実験結果を図１６Ａ、１６Ｂ、１６Ｃに示す。異なる血清型の組換えＡＡＶバクミドで産生したｒＡＡＶの細胞パッケージング率及びウイルス感染力価を検出した。検出結果を表４に示す。
表４及び図１７の結果から分かるように、本発明では、イントロンスプライシング作用により昆虫細胞におけるＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３タンパク質の相対的に適切な比率での発現を調節し、様々なＡＡＶ血清型に適用し、いずれもｒＡＡＶウイルス粒子を大規模に生産することができる。
上記は本発明の好ましい実施例にすぎず、本発明を制限するものではなく、本発明の趣旨及び原則内で行った任意の修正、同等置換及び改良などは、いずれも本発明の保護範囲内に含まれることを当業者が理解できる。
Claims (27)
- 昆虫細胞内で重複オープンリーディングフレームを含む遺伝子を発現するための発現カセットであって、
５'から３'まで操作可能に結合した、
昆虫細胞内で転写を駆動可能なプロモーターと、
人工的に構築した配列と、
１番目の翻訳開始コドンのみが欠失した重複オープンリーディングフレームと、
を含み、前記人工的に構築した配列は、昆虫細胞内でスプライシング活性を有する天然の又は人工的に改変されたイントロンを含み、前記イントロンは、翻訳開始コドンＡＴＧを含み、又は前記イントロンは、ＡＴＧにおける隣接する任意の２つのヌクレオチドの間に位置し、
転写後修飾の過程において、イントロンの選択的スプライシング作用により、前記人工的に構築した配列における翻訳開始コドンＡＵＧが保持又は欠失し、或いは前記人工的に構築した配列に翻訳開始コドンＡＵＧが形成され、これによって、前記重複オープンリーディングフレームにおける異なるタンパク質コード遺伝子の翻訳発現の調節が実現されることを特徴とする、発現カセット。 - 前記人工的に構築した配列は、５'から３'まで操作可能に結合した、
前記イントロンの５'部分と、
翻訳開始コドンＡＴＧと、
前記イントロンの３'部分と、
２Ａ自己切断ペプチドをコードするヌクレオチド配列と、
を含むことを特徴とする、請求項１に記載の発現カセット。 - 前記２Ａ自己切断ペプチドは、Ｔ２Ａペプチド、Ｐ２Ａペプチド、Ｅ２Ａペプチド又はＦ２Ａペプチドであることを特徴とする、請求項２に記載の発現カセット。
- 前記人工的に構築した配列は、５'から３'まで操作可能に結合した、
第１イントロンの５'部分と、
翻訳開始コドンＡＴＧと、
第２イントロンの５'部分と、
前記イントロンの３'部分と、
を含み、前記第２イントロンの５'部分の内部には、終止コドンがあり、前記終止コドンと前記翻訳開始コドンＡＴＧとの間のヌクレオチド数は、３の倍数であることを特徴とする、請求項１に記載の発現カセット。 - 前記イントロンの５'端ヌクレオチドは、ＧＴＮＮであり、前記イントロンの３'端ヌクレオチドは、ＮＮＡＧであり、ＮはＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇの４種類のヌクレオチドのうちのいずれか１種であることを特徴とする、請求項１に記載の発現カセット。
- 前記重複オープンリーディングフレームを含む遺伝子は、ＡＡＶのｃａｐ遺伝子又はＡＡＶのｒｅｐ遺伝子であることを特徴とする、請求項１に記載の発現カセット。
- 前記プロモーターは、ｐｏｌｈプロモーター又はｐ１０プロモーターであることを特徴とする、請求項１に記載の発現カセット。
- 前記重複オープンリーディングフレームを含む遺伝子は、ＡＡＶのｃａｐ遺伝子であり、前記プロモーターは、ｐ１０プロモーターであることを特徴とする、請求項７に記載の発現カセット。
- 前記重複オープンリーディングフレームを含む遺伝子は、ＡＡＶのｒｅｐ遺伝子であり、前記プロモーターは、ｐｏｌｈプロモーターであることを特徴とする、請求項７に記載の発現カセット。
- 第１発現カセットを含む核酸分子であって、
前記第１発現カセットは、請求項１から９のいずれか１項に記載の発現カセットであることを特徴とする、核酸分子。 - 第２発現カセットをさらに含み、前記第２発現カセットは、請求項１から９のいずれか１項に記載の発現カセットであり、前記第２発現カセットによって発現される遺伝子は、前記第１発現カセットによって発現される遺伝子と異なることを特徴とする、請求項１０に記載の核酸分子。
- 前記第２発現カセットは、前記第１発現カセットに対してアンチセンス方向であることを特徴とする、請求項１１に記載の核酸分子。
- 前記第２発現カセットは、前記第１発現カセットに対してセンス方向であることを特徴とする、請求項１１に記載の核酸分子。
- 外来遺伝子、及び前記外来遺伝子の両端に位置するＡＡＶ逆位末端反復配列をさらに含むことを特徴とする、請求項１０に記載の核酸分子。
- 前記外来遺伝子は、レポーター遺伝子であり、
前記レポーター遺伝子は、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼコード遺伝子、β－ガラクトシダーゼコード遺伝子、β－グルクロニダーゼコード遺伝子、ウミシイタケルシフェラーゼコード遺伝子、アルカリホスファターゼコード遺伝子、ホタルルシフェラーゼコード遺伝子、緑色蛍光タンパク質コード遺伝子及び赤色蛍光タンパク質コード遺伝子のうちの少なくとも１種であることを特徴とする、請求項１４に記載の核酸分子。 - 前記外来遺伝子は、薬物ポリペプチドをコードする遺伝子であり、前記薬物ポリペプチドは、リポタンパク質エステラーゼ、アポリポタンパク質、サイトカイン、インターロイキン及びインターフェロンのうちの少なくとも１種であることを特徴とする、請求項１４に記載の核酸分子。
- 請求項１から９のいずれか１項に記載の発現カセットを含むことを特徴とする、ベクター。
- 前記ベクターは、昆虫細胞適合性ベクターであることを特徴とする、請求項１７に記載のベクター。
- 前記ベクターは、プラスミド及びウイルスのうちの少なくとも１種であることを特徴とする、請求項１７に記載のベクター。
- 昆虫細胞内で組換えアデノ随伴ウイルスを調製するための請求項１７に記載のベクターの使用。
- インビトロでのＡＡＶカプシドの調製における請求項１７に記載のベクターの使用であって、
前記重複オープンリーディングフレームを含む遺伝子は、ＡＡＶのｃａｐ遺伝子であることを特徴とする、使用。 - 請求項１から９のいずれか１項に記載の発現カセットを含むことを特徴とする、昆虫細胞。
- 前記発現カセットは、前記昆虫細胞のゲノムに組み込まれることを特徴とする、請求項２２に記載の昆虫細胞。
- 前記昆虫細胞は、ツマジロクサヨトウ細胞、イラクサギンウワバ細胞、キイロショウジョウバエ細胞又は蚊細胞であることを特徴とする、請求項２２に記載の昆虫細胞。
- 請求項２２に記載の昆虫細胞及び培地を含むことを特徴とする、細胞培養物。
- 前記培地は、ＡＡＶゲノムを含むことを特徴とする、請求項２５に記載の細胞培養物
- 組換えアデノ随伴ウイルス粒子を産生可能な条件下で請求項２２に記載の昆虫細胞を培養し、その後、回収することにより調製されることを特徴とする、組換えアデノ随伴ウイルス粒子。
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